Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - FBMC

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Transfer column to a clean tube and spin for another 1 min at 13K Transfer column to a clean tube and add add 20μl MilliQ H2O pH 7-8.5 (when using 22x50mm LifterSlips). Wait 1 min. Spin 1 min at 13K. Add another 20 μl MilliQ H2O, wait 1 min and then spin at 13K for 1 min. Hybridisation Mix: 39.4μl purified labelled probe 12μl filtered 20x SSC 20% 9.2 8.2μl filtered 2% SDS 14% 6.4 Remove any dust from slide and cover slip using an air duster Place a 22x50mm LifterSlip over arrayed area of slide Denature probe at 95ºC for 2 min Towards end of 2 min incubation, place 30μl 3xSSC in each well of the hybridisation cassette Briefly spin down probe and immediately transfer to arrayed area of slide, avoiding bubbles Seal hybridisation chamber Incubate in 65ºC water on top of plastic base inside bath for 16-20 hrs Washing Solutions Wash A Wash B 20x SSC 20ml 2.4ml 20% SDS 1ml - ddH2O to 400ml to 800ml Pre-heat wash A (1xSSC, 0.05%SDS) at 65ºC Add to pre-heated staining trough at 65ºC Remove microarray slides from hybridisation cassette and place them in slide rack Wash slides carefully in staining trough of wash A at 65ºC to remove LifterSlip Once LifterSlip is displaced continue agitating in wash A for a further 2min Transfer slides to new rack and wash in first trough of Wash B (0.06xSSC) for 2min Wash in second trough of Wash B for 2min Dry by spinning in 50ml centrifuge tube at 1500rpm for 5min Notes General precautions and tips • Minimise the exposure of Cy-dyes to the light. • Use RNase-free pipette tips and H2O for RNA labelling reaction. • RNA preps should be at a concentration of at least 0.35-0.7 μg/μl and purified using Rnasy columns (Qiagen). Labelling efficiency • If the MinElute membrane remains white after binding of cDNA do not proceed, your RNA did not yield labelled cDNA. Check the quality of the RNA and/or the other reaction components and store the labelled gDNA at 20ºC for use in another hybridisation. • If the column is purely red or blue after binding Application Vol. Cy3- Vol. Cy5-dCTP cDNA vs dCTP 1.5μl 2.5μl cDNA vs ge- 1.5μl (gDNA) 2.5μl (cDNA) nomic genomic vs 1.5μl 1.5μl pooled genomic cDNA labellings elute and re-label the failed reaction. Hybridisation tips and tricks • Once SDS has been added to the probe keep it at room temperature to avoid precipitation. • Transfer of the probe to the slide must be done carefully but quickly to prevent re-naturation of probes and extended evaporation of the sample. • Prepare the slide and cover slip by removing any dust with pressurised air • Apply the probe as a line in the middle of the spotted area avoiding touching the slide surface and bubble formation. This is best achieved by not expelling the final drop of liquid. • Using curved-edge forceps place one edge of the cover slip just outside the spotted area at an angle to the slide surface. Hold a microspatula down on the slide surface close to (or just touching) the cover slip to prevent it from sliding away from the arrayed area. Carefully lower the other edge of the cover slip down with the forceps and lay it down on the probe, which should spread out under the cover slip. • Once in place do not move the cover slip (unless it is misplaced accidentally). • Small bubbles usually migrate out of the cover slip. Check after a few minutes in the water bath and if necessary gently tap the cover slip to dislodge any stubborn ones. • Wash the microspatula and forceps in between slides if they come into contact with the probe. Washing and drying slides • Do not touch the arrayed area, even with gloves • Wash by vigourously plunging the rack up and down for the whole wash time • Minimise exposure of the slide to the air during washing • SDS is fluorescent - be particularly careful of what is on your gloves. TP 9: Demostración de electroforesis bidimensional de proteínas (demostrativo, no hay guía) TP 10: Genómica funcional: Silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) Preparado y enseñado por Gabriela Llauger, María Cecilia Rodríguez, Carlos Manacorda Introducción Página 18 de 40
Genómica Aplicada Verano 2012 El término VIGS (silenciamiento génico inducido por virus, por su sigla en inglés) se aplica a la técnica que emplea virus recombinantes a fin de disminuir la expresión génica de un gen endógeno (knock down) como alternativa al clásico método de reemplazo alélico (knock out). La construcción de vectores virales que portan en su genoma insertos derivados de secuencias génicas vegetales permite silenciar específicamente la secuencia endógena homóloga al inserto introducido en el vector viral. VIGS es una metodología que no requiere de transgénesis por lo tanto es rápida y versátil, siendo ideal para estudios de genómica funcional, incluso a gran escala. Su mayor ventaja y desventaja radica en que el nivel de silenciamiento puede ser variable (a veces el silenciamiento total del gen es una desventaja) y que depende de la especie a utilizar (Vázquez Rovere et al. 2010). La técnica de VIGS ha sido comúnmente ensayada en la especie de tabaco salvaje Nicotiana benthamiana ya que es altamente susceptible a infecciones virales y permite estudiar eficientemente el silenciamiento génico. El virus de mosaico del tabaco (TMV, por sus siglas en inglés) fue el primer virus de ARN utilizado como vector de silenciamiento. Mediante transcriptos de TMV recombinante portando una secuencia del gen de la fitoeno desaturasa (phytoene desaturase o PDS) producidos in vitro e inoculados en plantas de N. benthamiana se logra silenciar exitosamente la expresión de PDS (Godge et al. 2007). Fig 1: Vía biosintética de carotenos en plantas. A la izquierda, el arroz dorado Objetivo Mostrar el silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) del gen endógeno de fitoeno desaturasa (PDS) mediante agroinfiltración de hojas de N. benthamiana con TRV recombinante. El gen PDS codifica para una enzima involucrada en la biosíntesis de carotenos (importantes nutracéuticos precursores de vitamina A) y es uno de los genes utilizados para desarrollar el arroz dorado, ver figura 1). Su falta de expresión da como resultado la ausencia de pigmentación. Metodología de VIGS El sistema de vectores de VIGS basados en el virus TRV (Tobacco rattle virus) utiliza cDNA del genoma de ARN bipartito del TRV. El primer segmento genómico (RNA1) posee la RNA polimerasa RNA dependiente (RdRP) bajo el control del promotor CaMV 35S y la proteína de movimiento (MP) así como una proteína de 16 kDa y una ribozima. El segundo segmento genómico (RNA2) tiene un sitio de clonado múltiple río abajo del gen de la proteína de cápside (CP) -también bajo el control del promotor CaMV 35S-, y una ribozima. El cDNA de ambos segmentos se introduce en cassettes flanqueados por los bordes izquierdo y derecho de T-DNA, y son luego clonados en vectores binarios e introducidos en Agrobacterium tumefaciens. Cultivos independientes de agrobacterias (uno con RNA1 y el otro con RNA2 conteniendo la secuencia del gen objetivo –target-) son mezclados en una proporción 1:1 y utilizados para agroinfiltrar hojas de N. benthamiana. Las células infectadas pueden sintetizar partículas virales completas y causar dispersión sistémica del virus, desde el sitio de infiltración hacia las hojas superiores de la planta en crecimiento, disparando el mecanismo de defensa de la planta que suprime tanto la replicación viral como la expresión del gen endógeno target. Entre 3 y 4 semanas luego de la agroinfiltración, los fenotipos producidos por silenciamiento del gen target pueden ser observados (Figura 2) (Godge et al. 2007). Figura 2: Representación esquemática de las etapas involucradas en VIGS con vectores basados en TRV. Se identifica un gen candidato, por ejemplo a partir de un pool de cDNA. El gen es clonado en el vector basado en RNA2 que contiene el gen de la proteína de cápside viral (CP) bajo el control de un promotor constitutivo. Por otra parte, el cassette basado en el RNA1 viral (conteniendo los genes para RdRP, MP, etc.) es clonado en otro sistema de expresión T-DNA. Estos dos vectores binarios (RNA1 y RNA2) son introducidos en bacterias de Agrobacterium independientes. Ambos cultivos de Agrobacterium son mezclados con una relación 1:1 y son agroinfiltrados en hojas de N. benthamiana. La infiltración de vectores de VIGS lleva a la infección sistémica de la planta y a la aparición de síntomas específicos. Entre 3 y 4 semanas luego de la agroinfiltración, los fenotipos producidos por silenciamiento del gen target pueden ser observados 19
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