Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - FBMC

vas pérdidas de ADN (RD1- 14).
El origen de M. tuberculosis es muy antiguo. Se cree
que las bacterias del género Mycobacterium, como otros
actinomicetes, derivan de un ancestro común de vida
libre que se encontraba en el suelo y en el agua. Posiblemente
durante la especiación, los miembros del complejo
sufrieron un cuello de botella, ocurrido hace 15000-20000
años atrás (Sreevatsan, et al. 1997). Con las secuenciación
de genomas y la genómica comparativa se indentificaron
regiones variables entre los miembros del MTC.
Brosch y colaboradores, analizando 20 regiones de diferencia
(denominadas RD seguidas de un número) en
más de 100 cepas, identificaron delecciones en el genoma
de M. bovis con respecto a M. tuberculosis lo que
indica que el genoma de este último es mayor (Brosch, et
al. 2002). Encontraron evidencias de que la delección de ciertas regiones genómicas variables no ocurrió de manera
independiente en las diferentes cepas del complejo, lo que les permitió plantear un nuevo escenario para la evolución
del complejo M. tuberculosis y el origen de la TB humana (Figura 1). Parecería que M. bovis (RD4, RD5,
RD7, RD8, RD9, RD10, RD12, RD13) es el último representante de un linaje junto con M. africanum (RD9) y
M. microti (RD7, RD8, RD9, RD10) que derivó del progenitor de M. tuberculosis antes de que ocurriera una delección
específica de tuberculosis TbD1 (Brosch, et al. 1999; 2002).
OBJETIVOS:
1) Identificar las regiones genómicas de diferencia entre M. tuberculosis y M. bovis.
2) Comparar los transcriptomas de ambas especies M. tuberculosis–M. bovis microarrays. Los microarreglos que se
emplearán fueron provistos por el Dr Glyn Hewinson en el Veterinary Laboratories Agency (Weybridge, UK). Los
mismos fueron diseñados originalmente por el Bacterial Microarray Group (BuG@S, St George‟s Hospital Medical
School, Londres, UK). El microarreglo consiste de 4410 productos de PCR (rango de tamaño 60–1000 bp) que representan
todos los genes de los genomas de las cepas H37Rv y CDC1551 de M. tuberculosis y la cepa AF2122
de M. bovis
MICROARRAY HYBRIDISATION PROTOCOL
Use the following Cy-dye labelled dCTP volumes for the
appropriate application:
Genomic DNA labelling
For each reaction:
2-5μg genomic DNA
1μl Random primers
to 41.5μl ddH2O
95˚C for 5min, snap cool on
ice and briefly centrifuge.
Then add:
5μl Klenow Buffer (10x)
1μl dNTPs (5mM each dA/G/TTP, 2mM dCTP)
1.5μl Cy3-dCTP
1μl Klenow fragment (5U/μl)
37˚C for 90min in the dark.
cDNA synthesis and labelling
For each sample:
5-10μg RNA
1.7μl Random primers
to 15.9μl RNase-free H2O
70˚C for 10min, snap cool on ice, spin down.
Then add (make a master mix for multiple labellings):
6μl 5x First StrandBuffer
3μl 100mM DTT
0.6μl dNTPs (25mM each dA/G/TTP, 10mM
dCTP)
2μl SuperScript II
2.5μl Cy5-dCTP
25˚C for 10 min in the dark.
42˚C for 110min in the dark.
Pre-hybridisation
Mix the prehybridisation solution in a coplin jar and incubate
at 65˚C during the labelling reaction to equilibrate.
Solution Prehybridisation
20x SSC 8.75ml (3.5x SSC)
20% SDS 250μl (0.1% SDS)
BSA (100mg/ml) 5ml (10mg/ml)
ddH2O to 50ml
Incubate the microarray slide in the pre-heated prehybridisation
solution for 20min
Wash in 400ml ddH2O for 1min
Wash in 400ml isopropanol for 1min
Dry by spinning in 50ml centrifuge tube at 1500rpm for
5min
Store slide in the dark, dust-free box until hybridisation
(