Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - FBMC

ían ingresado desde Venezuela o directamente desde Estados Unidos.
Una década después de ser registrado por primera vez en la Argentina, el insecto llegó al Chaco, provincia cuya
economía se sustenta básicamente en la producción de algodón. Los departamentos de Primero de Mayo,
Bermejo y Libertad fueron declarados en “emergencia” por resolución 262/03 del Boletín Oficial del “Servicio
Nacional de Sanidad Agroalimentaria” (SENASA), y en consecuencia, se inició una nueva etapa en la lucha contra
la plaga (Lanteri et al., 2003).
Con el fin de lograr una caracterización genética de las poblaciones detectadas en nuestro país, identificar su origen
y establecer las principales vías de dispersión del insecto se llevó a cabo un análisis de diversidad y estructura
poblacional a través de la técnica de RAPDs y un estudio filogeográfico en base a secuencias mitocondriales
correspondientes a los genes Citocromo oxidasa I (COI) y Citocromo oxidasa II (COII) (Scataglini et al., 2000;
Scataglini et al., 2006; Guzman et al., 2007).
Objetivo
Introducir los conceptos y herramientas básicas para el desarrollo de un estudio filogeográfico y su aplicación
al control de plagas.
Desarrollo del TP
En este trabajo práctico se utilizarán las secuencias de COI halladas en 7 poblaciones de A. grandis originarias
de Estados Unidos, México, Brasil, Paraguay y Argentina para la reconstrucción de una red de haplotipos mediante
el método de máxima parsimonia. Los resultados obtenidos se discutirán en el contexto de evidencias genéticas
provenientes de otros estudios a fin de poner a prueba las hipótesis de introducción planteadas.
En el archivo hapCOI.fas Ud. encontrará las secuencias nucleotídicas correspondientes a los 19 haplotipos hallados
en las poblaciones de A. grandis que se detallan en la Tabla 1 (Datos tomados de Scataglini et al., 2006).
1. Realizar el alineamiento de las secuencias utilizando el programa ClustalX (Thompson et al., 1997) que se encuentra
en la carpeta Filogeografía en el Escritorio de su PC.
a) Ejecutar el ClustalX. Hacer clic en la opción Load Sequence del menú File e indicar la localización del
archivo hapCOI.fas.
b) Seleccionar la opción Output format options del menú Aligment y tildar el casillero correspondiente al formato
GDE. Cerrar la ventana.
c) Seleccionar la opción Do Complete Alignment del menú Aligment. Clickear Align. Los resultados aparecerán
en pantalla y serán guardados en un archivo con extensión GDE en la misma carpeta en donde se encontraban los
datos originales.
d) Inspeccionar el alineamiento e identificar las posiciones variables. d) Cerrar el programa ClustalX.
2. Obtener el árbol de máxima parsimonia utilizando el archivo generado en el punto anterior el programa de reconstrucción
filogenética TNT.
a) Modificar el archivo hapCOI.gde de acuerdo al formato que se muestra a continuación y guardarlo bajo el
nombre hapCOI.tnt. xread 279 19
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gctcatgaaggagcttctgttgatttagctatttttagccttcatatagccggaatttcttcaattctcggagctataaattttatttcaacagtcctaaatataaagccctcaagaagaagcttagaacaaatacctttatttgtatgagctgtaaaaattacagct
Lo1:atcagattttggctattacccccatctttaacccttttaattttaagaataattgtaagaaaaggaactggaacaggatgaacagtttaccccccactctcttctaatttag
ctcatgaaggagcttctgttgattgagctatttttagccttcatatagccggaatttcttcaattctcggagctataaattttatttcaacagtcctaaatataaagccctcaagaataagcttagaacaaatacctttatttgtatgagctgtaaaaattacagct
b) Ejecutar el programa TNT cuyo icono se encuentra en la carpeta del mismo nombre dentro de Filogeografía.
c) Una vez que haya ingresado al programa seleccionar la opción DNA de la pestaña Data Format del menú
Format. Esto permitirá al programa reconocer las secuencias nucleotidicas contenidas en el archivo de datos.
d) Abrir el archivo generado en el punto 2.a. (hapCOI.tnt) seleccionando la ruta con la opción Open Input File
del menú File.
e) Corroborar que los datos hayan sido leídos correctamente utilizando el comando Show Matrix del menú Data.
f) Obtener el/los árboles de máxima parsimonia mediante la opción Implicit enumeration del menú Analyze.
Este comando permite realizar una búsqueda exacta reconstruyendo todos los árboles posibles y seleccionando
aquellos de longitud mínima, procedimiento que se conoce como enumeración implícita. Dado que el número
de árboles posibles crece exponencialmente con el número de terminales incluidas en el mismo, sólo es
posible aplicar este tipo de búsqueda cuando se trabaja con números relativamente pequeños de terminales
(en nuestro caso 19).
¿Cuántos árboles se obtuvieron? ¿Cuál es su longitud?
g) Visualizar los resultados con el comando View del menú Trees. Puede pasar de un árbol a otro utilizando
las flechas que se encuentran en el extremo derecho de la barra de herramientas.
¿Cuál es la diferencia entre los árboles obtenidos?
h) Visualizar el número de pasos mutacionales entre haplotipos utilizando la opción Branch lengths del menú
Optimize.
3. Convertir el árbol de máxima parsimonia en una red haplotipos
como la que se presenta a continuación (Figura 1, Scataglini et
al. 2006). Para ello deberá identificar aquellos haplotipos que
no presenten cambios mutacionales respecto de los nodos inmediatamente
anteriores y ubicarlos en los nodos de la red.
Figura 1.
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