Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - FBMC

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TP 6: Hibridación in situ (FISH)
Docentes: Paola Talia, Sergio Rodríguez Gil, Ruth Heinz Diseñado por Paola Talia
Introducción
La hibridación in situ tiene distintas aplicaciones genómicas y está siendo utilizada para: facilitar el mapeo cromosómico,
integrar mapas genéticos y físicos (Cheng et al., 2001), asociar bandas cromosómicas con datos de secuencias
(Jiang y Gill, 1994), medir gaps de los mapas existentes (Jackson et al., 1998), detección de secuencias de ADN ribosomal,
ADN altamente y poco repetitivo (Ambros et al., 1986, Moscone et al., 1996; Mouras y Negrutiu 1989; Mouras
et al., 1987), detección de secuencias de bajo número de copias o de copia única (Lapitan et al., 1997; Wang y Chen.,
2005), detección de transgenes, este tipo de ensayo comenzó en plantas de petunia (Hoopen et al., 1996) y luego se
extendió a muchos cereales (Carlson et al., 2001; Pederssen et al., 1997; Salvo-Garrido et al., 2001).
La técnica de FISH consiste en el apareamiento de un determinado segmento de ADN o ARN a una secuencia de nucleótidos
complementarios dentro de la célula, permitiendo verificar si la célula contiene esa secuencia y observar su
exacta localización.
Esta técnica utiliza fluorocromos conjugados a anticuerpos. En un solo preparado pueden ser detectadas simultáneamente
varias sondas, cada sonda puede ser visualizada con un color diferente empleando un microscopio de fluorescencia.
Las sondas para FISH son marcadas con biotina o digoxigenina, y estas moléculas no fluorescentes son detectadas
mediante fluorocromos conjugados con anticuerpos anti-biotina o anti-digoxigenina, o con estreptoavidina. Uno de los
problemas inherentes a este método es su alta detección de ruido de fondo producido debido a la unión inespecífica del
anticuerpo o la estreptoavidina a la superficie celular. Otro problema es que sustancias de alto peso molecular, tales
como los anticuerpos o la estreptoavidina, no penetran bien dentro del citoplasma o en cromosomas condensados.
Debido a estos inconvenientes, la señal suele ser muy variable de célula a célula.
La sensibilidad de la técnica de FISH en plantas es baja, comparada con la observada en animales, incluyendo humanos.
Esta diferencia se debe a la presencia de pared celular y citoplasma en los preparados cromosómicos, lo cual inhibe
la penetración de la sonda y genera ruido de fondo (background) (Jiang y Gill, 1994).
La técnica de GISH se basa en el mismo principio que la técnica de FISH, sólo que en este caso la sonda consiste de
ADN genómico total de una especie. Esta técnica ha sido usada exitosamente en diversas especies de plantas para
evaluar la introgresión de especies silvestres en plantas cultivadas (Benabdelmouna et al., 2003; Shigyo et al., 2003;
Wei et al., 2003) así como en estudios evolutivos usando poliploides silvestres (Bennett, 1995; Poggio et al., 1999).
Objetivos
1) Familiarizarse con las técnicas de FISH y GISH y sus aplicaciones.
2) Entrenarse en la interpretación de resultados de hibridación in situ.
3) Familiarizarse en el uso del microscopio de fluorescencia.
Desarrollo del Trabajo Práctico
1) Realizar ejercicios de interpretación de imágenes de FISH y GISH, a partir de láminas con datos relevantes del
trabajo a partir de las cuales deberán sacar conclusiones. Luego cada grupo expondrá sus conclusiones al resto de sus
compañeros y los docentes compararan lo discutido en cada grupo con los datos publicados en el correspondiente trabajo.
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