Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - FBMC

Genómica Aplicada
Guía de Trabajos Prácticos 2012
Alberto Prina
Alejandra Landau
Ana Julia Distéfano
Andrea Puebla
Carlos Manacorda
Carolina Martínez
Cecilia Rodríguez
Cintia Acuña
Daniela Tosto
Daniel Corach
Daniel Grasso
Fabiana Bigi
Docentes responsables e invitados:
Fernando Carrari
Gabriela Llauger
Guido König
Laura Kamenetzky
Laura Klepp
Lidia Poggio
Mariana López
Mario Poli
Martín Vázquez
Máximo Rivarola
Natalia Aguirre
Norma Paniego
Pamela Villalba
Paola Talia
Paula Fernández
Ruth Heinz
Sebastián Asurmendi
Sergio Rodríguez Gil
Silvina Wilkowsky
Vanesa Mongelli
Verónica Lía
Verónica Nishinakamasu
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Referente a la permanencia y desarrollo del curso:
El uso de guardapolvo es obligatorio en las áreas de laboratorio y prohibido en las áreas de cocina y administrativa. Los alumnos
deberán traer sus propios guardapolvos.
El uso de guantes descartables (serán provistos) es obligatorio al momento de realizar los experimentos pero deberán descartarlos al
salir del laboratorio y/o al operar las computadoras afectadas a los equipos.
No está permitido ingresar con alimentos o bebidas a los laboratorios ni a la sala de teóricos ni a la de computadoras.
Está prohibido fumar en todas la áreas del instituto.
Los alumnos deberán usar calzado cerrado adecuado.
En las guías de cada trabajo práctico se detallan cuales reactivos serán manipulados solamente por los docentes y ayudantes a cargo.
Prestar especial atención a estas notas.
El uso del equipamiento de laboratorio se realizará solamente con supervisión de los docentes y ayudantes a cargo.
Todos los solventes se manipularán solamente bajo campana.
Los tips y tubos epps usados se descartan en botellas de plástico
rotuladas para tal fin.
Todos los elementos personales (por ejemplo: abrigos, mochilas,
carteras, etc.) no deben ser ingresados a los laboratorios.
Lavarse las manos antes de ingresar y salir de los laboratorios.
Si bien es potable, se recomienda no beber agua de las canillas
de los laboratorios. Usar los dispensadores de los pasillos.
Los alumnos podrán traer sus propias computadoras (notebooks)
para los trabajos prácticos que lo requieran.
A fin de una mejor orientación de los alumnos, se incluyen en
esta guía un esquema de la planta del edificio donde se desarrollará
el curso indicando las aulas y laboratorios para tal fin.
Información adicional acerca de los laboratorios de TP y
aula de teóricos en el Instituto de Biotecnología.
-Se solicita a los alumnos permanecer en el auditorio o laboratorio
destinado a las clases del presente curso durante los horarios
establecidos. A los efectos de una mejor ubicación en el Instituto se recomienda consultar el esquema de la planta del Instituto.
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TP 1: Búsqueda bioinformática de microsatélites y SNPs en secuencias funcionales depositadas en bases de datos:
Aplicaciones en especies vegetales. Diseño: Corina Fusari – Cintia Acuña
Participan como docentes: Máximo Rivarola, Pamela Villalba, Jeremías Zubrzycky, Carla Filippi, Cintia Acuña
Introducción
Uno de los desafíos de la biología contemporánea es la caracterización funcional y la identificación de las variantes alélicas
que afectan la expresión fenotípica de caracteres agronómicos de interés. Por su parte, los motivos que definen estas variantes
alélicas emergen como una nueva generación de marcadores, conocidos como marcadores funcionales, que constituyen
un complemento contundente a los marcadores neutros como microsatélites (SSR) y AFLPs para alcanzar el ligamiento
completo entre éstos y los fenotipos expresados (Andersen y Lubberstedt 2003).
La secuenciación completa de los genomas de especies modelo o parcial de especies de interés a través de iniciativas como
la secuenciación de transcriptos conocidos como ESTs (Expressed Sequence Tags) y, más recientemente, isotigs, RNAseq o
secuencias genómicas de una sola lectura conocidas como GSS (Genome Survey Sequences), ha generado una rápida acumulación
de información biológica que es depositada en bases de datos genómicas y es fácilmente accesible a través de
Internet. Esta información, que deriva en muchos casos de la caracterización de líneas elite de una misma especie, de especies
de un mismo género o distintas fuentes relacionadas, constituye el recurso que permite sistematizar el desarrollo de los
SNPs, que en general pueden estar presentes dentro o cerca de genes que afectan la variación fenotípica para un determinado
carácter (Brookes, 1999).
En general la identificación de polimorfismos por nucleótido simple (SNPs) o de pequeñas inserciones/deleciones (Indels)
se ve favorecida por la abundancia, ubicuidad y dispersión de este tipo de polimorfismos presente en los genomas y en el
caso de las plantas cultivadas, también por la disponibilidad de líneas endocriadas que facilitan la tarea de asociación entre
haplotipos de un gen candidato definidos por un grupo de SNPs con fenotipos determinados, debido a que en estos materiales
la cantidad de desequilibrios de ligamiento (LD) se ve aumentado por los procesos de presión de selección que han atravesado
(Rafalski, 2002).
La tecnología de SNPs evidencia un gran potencial para la caracterización de las formas alélicas que controlan procesos
biológicos complejos como la resistencia a los estreses biológicos y ambientales que afectan la productividad de los cultivos.
Estos procesos son muy heterogéneos y de naturaleza poligénica, por lo cual es importante a su vez, tratar de caracterizar
otros polimorfismos con probable impacto sobre la expresión de determinado fenotipo. Estudios recientes sobre LD en
poblaciones humanas avalan la ventaja del análisis de haplotipos basados en SNPs más que el uso de SNPs aislados para
estudios de genética de asociación (Remington y colaboradores, 2001).
Los microsatélites (repeticiones en tandem de mono, di, tri, tetra o pentanucleótidos) son herramientas muy útiles como
marcadores genotípicos debido a que son relativamente abundantes, multialélicos (hipervariables con respecto al número de
repeticiones), heredados en forma estable, y codominantes (se distinguen los alelos de un locus), permitiendo distinguir
materiales estrechamente relacionados. Desde el punto de vista metodológico, son fáciles de detectar mediante PCR, requiriendo
poca cantidad de ADN para el análisis y poco equipamiento.
En principio, se creía que los microsatélites eran marcadores neutros ubicados en secuencias fundamentalmente intergénicas
no codificantes y se desconocía su función específica. Sin embargo, recientemente se han encontraron microsatélites dentro
de genes, los cuales proporcionaron información útil para el estudio de las posibles funciones de los mismos en el genoma
de los organismos.
Diversos estudios mostraron la presencia de SSR dentro de secuencias expresadas (ESTs e isotigs) y en los genes incluyendo
las regiones codificantes para proteínas, las no codificantes (extremos 3'-UTRs y 5'-UTRs) e intrones. Se demostró que
la distribución de los SSR no es azarosa, encontrándose mayormente en regiones UTRs e intrones. Los datos indican que las
extensiones y/o las contracciones de SSR en regiones codificantes para la proteína pueden llevar a un aumento o a una pérdida
de función del gen debido a cambios en los marcos de lectura o la amplificación de mRNA “tóxico”. Las variaciones
en el número de repeticiones de los SSRs en extremos 5'-UTRs podrían regular la expresión de los genes afectando a la
transcripción y traducción. Las extensiones de SSR en extremos 3'-UTR causan un desplazamiento de la transcripción, produciendo
moléculas de mRNA expandidas, que se pueden acumular como focos nucleares y pueden modificar el “splicing”
y, posiblemente, interrumpir otras funciones celulares. Por último, los SSRs en intrones pueden afectar a la transcripción del
gen, al splicing del mRNA o a la exportación al citoplasma.
Todos estos efectos causados por extensiones o contracciones de SSR dentro de genes pueden llevar eventualmente a cambios
fenotípicos, los cuales están sujetos a una presión selectiva más fuerte que otras regiones genómicas debido a su importancia
funcional. Estos SSRs pueden proporcionar una base molecular para la adaptación rápida a los cambios ambientales
en organismos procariotas y eucariotas (Li et al., 2004).
PARTE A: Búsqueda de SNPs en Girasol
Objetivos
- Utilizar el programa AutoSNP como herramientas bioin-formáticas para detectar SNPs dentro de un conjunto de secuencias
depositadas en GeneBank.
- Identificar los datos pedidos y archivos pedidos por el programa y los datos arrojados luego de que corra.
- Analizar los datos obtenidos.
- Identificar los sitios variables dentro del conjunto de individuos para cada región, clasificarlos y asignarles función.
Actividades
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1. Se trabajará con los datos generados a partir del software AutoSNP para distintas especies disponibles en la página
web http://autosnpdb.appliedbioinformatics.com.au/
2. En la pestaña SEARCH deberá colocar la especie de interés (p. ej. BARLEY (cebada) / WHEAT (trigo)).
3. Seleccione la acción: Search in the Database using Keyword (seleccionar en la base de datos usando palabras claves).
4. Deje las pestañas abiertas por defecto e ingrese a continuación alguna de las siguientes keywords (“defence”, “rubisco”,
“vernalization”, “cold”, “stress”) y presione “GO”.
5. Se indicará debajo si existen contigs que tengan en su descripción esa palabra clave. Observe cuántos contigs aparecen
en cada caso y anote cuántas secuencias formaron ese contig. Especifique SNPs e Indels dentro de cada contig
6. Entre a alguno de los contigs que armó el programa. Presione el “+” ¿Qué se observa en la tabla? ¿Qué información
brinda cada una de las columnas?
7. Mire también el alineamiento y compruebe los SNPs descriptos en la tabla llegando a las posiciones correspondientes
dentro del alineamiento.
El Min. Informative es la cantidad de secuencias que presentan ese mismo polimorfismo.
El dato de Cosegregation se refiere a la cantidad de SNPs o polimorfismos que comparten en mismo patrón de variación.
El dato de Weighted Cosegregation tiene en cuenta si faltan datos como para que se sesgue el resultado de co-segregación.
8. Conociendo esto, ¿Qué SNPs podrían ser verdaderos y cuáles falsos?
9. ¿Por qué en el análisis de ESTs podemos encontrar SNPs falsos?
10. ¿Qué haría Ud para tratar de corroborar/validar si los SNPs encontrados existen en una población perteneciente a la
especie? Describa alguna metodología.
PARTE B: Búsqueda de SSRs en secuencias ESTs de eucaliptos disponibles en GenBank
Objetivos:
- Utilizar una base de datos pública para la obtención de secuencias ESTs disponibles.
- Identificar regiones repetitivas de tipo SSR en las secuen-cias seleccionadas mediante software de libre acceso.
- Analizar los resultados de los SSR obtenidos.
- Asignar función probable a los ESTs que contienen SSR y analizar los datos.
Actividades:
1. Se analizarán los ESTs disponibles en GenBank, ingresando al sitio del NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
2. Se realizará la búsqueda de los ESTs de la especie Eucalyptus tereticornis. Para ello elija la opción “EST” en el campo
SEARCH y en el campo FOR, escriba Eucalyptus tereticornis [orgn]. ¿Cuántos ESTs obtuvo?
3. En el campo SEND TO, elegir la opción “FILE” y luego “FASTA”, seleccionar “create file”. Se guarda automáticamente
el archivo generado.
Se utilizará el archivo .fasta generado para la búsqueda de regiones microsatélites. Ingresar al sitio del Genome Database
for Rosaceae http://www.rosaceae.org/ Elegir TOOLS, SSR.
4. El servidor enviará un correo electrónico a la casilla indicada, con los links a los files generados. El mismo, tendrá el
siguiente formato:
5. Agregar mail y título al proyecto.
6. Ubicar el archivo FASTA con las secuencias de Eucaliptus para hacer el análsis.
7. En el archivo Excel generado, observe los datos estadísticos de los tipos de microsatélites encontrados. ¿Qué tipo de
microsatélite esperaría encontrar en mayor proporción? ¿Por qué? ¿Coinciden los resultados obtenidos con los esperados?
8. Abrir el último archivo .txt (SSR containing sequences), eliminar el encabezado para que sólo queden las secuencias en
formato fasta. Guardar archivo.
9. Se estudiará el nivel de identidad de estas secuencias de ADN con otras secuencias de proteínas depositadas en bases de
datos públicas, mediante BlastX. Para ello vaya hasta el sitio de Arabidopsis: http://www.arabidopsis.org, tools, BLAST.
Abra el archivo .txt bajado del análisis de SSRs, selecciones algunas secuencais y péguelo en el espacio INPUT, elija
BLASTX (query NT, AA db). Abra la pestaña de parameters options y elija “10” en Max Scores y “10” en Max alignments.
Luego RUN BLAST ¿A qué funciones se corresponden los ESTs?
TP Nº 2: Secuenciación por Electroforesis Capilar de Fragmentos Marcados con Partículas Fluorescentes
Docentes: Verónica Nishikamasu, Pablo Vera y Natalia Aguirre Diseño: Andrea Puebla
Las estrategias de secuenciación basadas en el método de terminación de la cadena por incorporación de nucleótidos dideoxi
(ddNTPs) desarrollado por Sanger mas de 30 años atrás han sufrido un proceso de cambio y superación continuo
desde la detección de moléculas radioactivas en geles hasta la actual detección fluorescente mediante secuenciación en paralelo
en microcapilares o las estrategias de secuenciación en fase sólida basada en chips (Tabla 1). La incorporación de
sistemas de detección fluorescerente en la década del 80 permitió el inicio de la secuenciación genómica y la entrada, en la
década del 90, en la era genómica, con los reportes de los primeros genomas completos de E.coli y C. elegans y el inicio del
proyecto Genoma Humano cuyo borrador fue liberado en 2001 y finalizado oficialmente en Abril 2003.
El desarrollo de secuenciadores automáticos basados en electroforesisis capilar, el perfeccionamiento de los sistemas de
detección fluorescentes y el desarrollo de herramientas de análisis de secuencias a gran escala posibilitaron el desarrollo de
estrategias de secuenciación más eficientes con el consiguiente abaratamiento de costos unitarios, y el concomitante desarrollo
de números proyectos de genomas de organismos complejos. Hoy, con la difusión de mas de 1000 genomas completos
de diversos organismos (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/genome) y el inicio de otros tantos, con mas de 150 billones
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de pares de bases depositadas en GenBank, estamos transitando la era post genómica, iniciada a mediados de la década del
2000. Actualmente el énfasis esta puesto no solo en la secuenciación de genomas de especies aun no descifrados total o
parcialmente sino en la resecuenciación de genomas conocidos, para la identificación de variantes alélicas asociadas a diversidad
fenotípica, en distintas especies de importancia económica, con importantes avances para el genoma humano (The
International HapMap Consortium, 2003, 2005; The ENCODE Project Consortium, 2004). Esto es posible gracias al desarrollo
de diferentes tecnologías e instrumental en continuo proceso de actualización (ver ej. en Tabla 1).
La secuenciación capilar con equipos como el Applied Biosystems Incorporated (ABI) 3130 que se utilizará en esta práctica,
permite la lectura simultánea de distintas muestras (16, para este equipo), con muy buena resolución y lecturas largas
de hasta 800 bp, utilizando distintos fluoróforos. Los fluoróforos mas comúnmente usados son los basados en el colorante
rodamina (R110, REG, TAMRA and ROX) que son excitados a una longitud de onda de 488 nm y emiten fluorescencia a
distintas longitudes de onda (Figura 1a). ABI desarrolló un sistema de terminadores llamados “Big Dye terminators” que
son utilizados en la secuenciación automática (Figura 1b)
Figura 1
Parte A: Ensayo de secuenciación de ADN con Terminadores
fluorescentes y secuenciador automático
Objetivo:
Cuantificar ADN por fotometría y fluorometría (Spectra Max
Gemini EM)
Realizar una reacción de secuenciación de ADN utilizando diferentes
templados (plásmidos, productos de PCR y BAC/COS).
Purificar por precipitación las reacciones de secuenciación.
Preparar las muestras manualmente y con estación de trabajo para
análisis en secuenciador automático.
Realizar la electroforesis capilar de los productos de secuenciación en secuenciador automático (Genetic Analyzer
3130xl, Applied Biosystems)
Materiales:
ADN (distintos templados).
Iniciadores universales y específicos para cada templado particular.
Fluoróforo para cuantificación por fluorometría (Hoechst en buffer TNE)
ADN control de timo de ternera para la curva estándar.
Kit de secuenciación con terminadores fluorescentes (Big Dye Terminador v3.1, Applied Biosystems).
EDTA 125 mM, etanol absoluto y etanol 70% para precipitación.
Formamida HiDi.
Polímero comercial para la electroforesis capilar de fragmentos de ADN.
Buffer con EDTA para electroforesis capilar.
Equipamiento:
Espectrofotómetro: Nanodrop ND-1000 (Thermo scientific).
Espectrofluorómetro: Spectra Max Gemini EM.
Termociclador de 96 pocillos: GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems)
Sistemas automatizados para manejo de líquidos: Biomek FX (Beckman Coulter).
Secuenciador automático de 16 capilares: Genetic Analyzer 3130xl (Applied Biosystems)
Equipamiento general de biología molecular
Actividades
1) Cuantificación de ADN
Tipo de templados y concentración requerida:
cc
350
300
250
200
150
100
50
0
Cuant HOECHST - SEQ#08y09 - 20/01/2009
y = 0,2591x
R 2 = 0,9954
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
F
Curva Std Promedio
[cc] F
15 19
27 106
57 193
116 428
150 542
215 842
305 1197
Templado Concentración
Productos de PCR
100-200 pb 5 ng/ul
200-500 pb 15 ng/ul
500-1000 pb 30 ng/ul
1000-2000 pb 60 ng/ul
mayor a 2000 pb 75 ng/ul
ADN doble cadena 200 ng/ul
ADN simple cadena 100 ng/ul
BAC/Cósmidos 200 ng/ul
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2) Reacción de secuenciación y purificación
Preparación de la Mix de seq
Elongación en termociladores
96°C 1 min.
25 ciclos
96°C 10 seg.
50°C 5 seg.
60°C 4 min.
Purificación por precipitación
Agregar: 2,5 l EDTA 125 mM + 30 l etanol absoluto.
Reacción ¼ X Volúmen
BDT v3.1 1 ul
5 x Seq Buffer 1.5 ul
Primer 5 mM (5 pmol)
Templado (conc. vs) 2ul
Agua calidad ultrapura hasta 10ul VF
Centrifugar 45 min a Max veloc. (4.000 rpm) en centrífuga de placas. Eliminar solventes por inversión.
Agregar: 120 l Etanol 70%.
Centrifugar 15 min a Max veloc. (4.000 rpm) en centrífuga de placas. Eliminar solventes por inversión.
Secar precipitados a 37ºC por 30 min.
3) Preparación de muestras para electroforesis en secuenciador automático con sistemas automatizados para manejo de
líquidos
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4) Electroforesis capilar en secuenciador automático con sistemas
automatizados para manejo de líquido
PARTE B: Análisis de Secuencias de ADN utilizando el programa
Sequencing Analysis 5.1
Sequencing Analysis
Objetivo: Analizar los resultados de las corridas electroforéticas de
secuencias de ADN provenientes de distintos tipos de templados,
editar los resultados obtenidos y discutir la calidad de los mismos.
Materiales:
Archivos de las corridas electroforéticas de secuencias de ADN realizadas
en el secuenciador autómatico ABI 3130 xl con el programa
Data Collection 3.0 (CD).
Computadora con el programa Sequencing Análisis 5.1
Actividades
PROYECTO 1
1. Adicionar muestras al programa en Sample Manager.
TABLA 1 (adaptada de Mitchelson et
al 2007. En: New High throughthput
Technologies for DNA sequencing
and Genomics. Ed K. Mitchelson ,
Elservier, UK)
1 2 3 4
C15 C15 Muestra1 Muestra9
C27 C27 Muestra2 Muestra10
C57 C57 Muestra3 Muestra11
C116 C116 Muestra4 Muestra12
C150 C150 Muestra5 Muestra13
C215 C215 Muestra6 Muestra14
C305 C305 Muestra7 Muestra15
C0 C0 Muestra8 Muestra16
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2. Setear Analysis Protocol para este proyecto:
a. General:
Nombre
Seq File Format: Write Standard Chromatogram Format File
b. Basecalling:
a. KB.bcp
b. POP7.BDTv3.mob
c. True Profile
d. Ending base: After 1000bp
e. Quality Threshold: Do not assign N’s to Basecalls.
c. Mixed Bases: Desactivado
d. Clear Range: Desactivado
3. Apply to all Samples Done
4. Indicar analisis de Base Calling (BC)
5. Revisar:
Raw
EPT
Annotation:
o Sample Name
o Capillary
o Bases detected
o Average Signal Intensity
o Simple Store
ANALIZAR
Sequence View: Barras de Calidad e Indice de Phred
Electropherogram View: editar bases
GUARDAR
PROYECTO 2 Y 3:
Cambiar seteo:
Base calling: Quality Threshold: Assign N’s to Basecalls.
Mixed Bases
Clear Range
Reanalizar los datos y discutir diferencias
TP N o 3: Bioinformática: búsqueda de motivos y dominios proteicos
Docentes: Paula Fernández, Guido König y Ana Distéfano Diseño: Paula Fernández- Ruth Heinz
OBJETIVOS:
Familiarizarse con el uso de programas de alineamiento múltiple de secuencias, sus bondades y limitaciones en la identificación
de regiones consenso.
Entrenarse en la búsqueda e identificación de motivos proteicos utilizando bases de datos públicas de motivos y perfiles.
Entrenarse en sistemas de búsquedas integrales de bases de datos
INTRODUCCION
Genes de resistencia especifica en plantas
Los genes de resistencia específica (R) en plantas, involucrados en la respuesta de tipo gen-por-gen, han sido identificados
en numerosas especies vegetales (Dangl y Jones 2001) y codifican proteínas que presentan dominios comunes. La mayoría
de las proteínas R caracterizadas hasta el momento presentan dos dominios característicos: uno de unión a nucleótidos
(NBS) en posición N terminal y un dominio rico en leucinas (LLR) en el extremo C terminal. Pero estas proteínas R presentan
variantes que permiten clasificarlas en dos grandes subgrupos: uno con un domino N terminal con similitud al domino
Toll/interlekin-1 receptor (TIR) y uno que carece de este domino (No TIR) en el N terminal, presentando usualmente un
dominio Coiled-coil (CC). A su vez estos dominios presentan distintos motivos, algunos compartidos por ambos subgrupos
y otros característicos de los TIR o No TIR. Por ejemplo el dominio NBS presenta diferentes motivos, algunos de ellos han
sido caracterizados por similitud a motivos descriptos en otras proteínas: P loop, kinase 2, RNBS-B, GLPL, MHDV (Meyers
y col. 2003).
En la especie modelo Arabidopsis thaliana, se han identificado 150 secuencias génicas que codifican dominios característicos
de las proteínas R, tanto de tipo TIR como No TIR Meyers y col. 2003). La Figura 1 muestra un esquema de la estructura
génica de genes R de esta especie, correspondiente a los dos subgrupos. En ella están representados los dominios y
motivos proteicos codificados por estas secuencias.
Figura 1 (adaptada de Meyers et al 2003). Organización génica de genes R y motivos proteicos codificados por ellos en Arabidopsis.
A: genes de tipo TIR, B: genes de tipo No TIR o CC
El cuadro lateralr muestra las referencias de representación
de dominios y motivos codificados por los distintos
genes. La tercer columna (# in Col-0) indica cuantos
miembros de cada secuencia génica han sido identificados
en un cultivar de esta especie y la cuarta columna
indica el numero de identificación de la secuencia en
bases de datos. En los casos de genes de función confirmada, se indica el nombre del mismo.
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Identificación y caracterización bioinformática de secuencias desconocidas
Alineamiento múltiple
Una de las maneras más frecuentes de obtener información sobre una secuencia o un grupo de secuencias incógnitas,
es mediante la búsqueda comparativa utilizando la información depositada en distintas bases de datos.
La búsqueda comparativa puede realizarse comparando secuencias de a pares o comparando secuencias múltiples.
El alineamiento múltiple de secuencias juega un papel importante a partir de la necesidad de procesamiento de la información
proveniente de los proyectos genómicos de secuenciación masiva. Tanto la anotación funcional de dichas
secuencias como las herramientas de análisis dependen de alineamientos múltiples adecuados. El análisis de familias
proteicas, la identificación de dominios y motivos, la predicción de su estructura secundaria, la estimación de los diferentes
tipos de plegamientos así como la detección de homólogos entre especies distantes como pasos intermedios en
la construcción de árboles filogenéticos, se han constituido en principales objetivos de este tipo de alineamiento.
El alineamiento múltiple de secuencias puede ser visto como una generalización del alineamiento de pares de secuencias,
donde la complejidad de esta aproximación crece exponencialmente con el número de secuencias que intervienen.
El alineamiento múltiple puede dividirse en dos categorías principales: aquellos métodos de alineamiento de secuencias
en toda su extensión (globales) y aquellos métodos que alinean regiones con alta similitud (locales). Tradicionalmente,
se ha focalizado en los métodos globales, que son aplicables a casos en los que las secuencias comparadas
tienen extensiones similares. Sin embargo más recientemente se ha puesto mayor interés en los métodos de alineamiento
múltiple local para el alineamientos de secuencias derivadas de proyectos geonómicos que sólo alinean
secuencias parcialmente (Paniego y col. 2004).
En los métodos de alineamiento global, la solución clásica se basa en la formación de agrupamientos (“clusters”) de
secuencias, los cuales se resuelven progresivamente. Para ello, dada una medida de similitud entre dos secuencias, se
elige aquel par correspondiente al valor más alto y se alinean y agrupan entre sí para formar un único grupo o cluster
de secuencias. A partir de este momento este cluster será tratado como una sola secuencia, y el proceso se repetirá
hasta tener un solo cluster con todas las secuencias que intervenían en el alineamiento múltiple. El programa más difundido
de este tipo es el CLUSTALW en su última versión (Thompson y col.994). La calidad de los alineamientos es
aceptable, y permite alinear algunos pocos cientos de secuencias. En contraste, los algoritmos de comparación múltiple
local, alinean segmentos completos en vez de residuos simples, como el DIALIGN (Morgenstern B 1999). Otros
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programas como el T-Coffee (Notredame y col. 2000) combinan alineamientos múltiples globales y locales, realizando
primero una comparación de a pares global utilizando el algoritmo CLUSTAL W y luego una comparación local
utilizando FASTA. Mas recientemente se desarrollaron programas como el COBALT (Papadopoulos y Agarwala
2007) que realizan una comparación basada en dominios conservados en una primera etapa y un alineamiento múltiple,
en una segunda etapa.
Bases de dominios y motivos proteicos
Aparte de las bases generales de datos de secuencias nucleotidicas y proteicas accesibles a través de distintos portales
bioinformáticos (por ejemplo NCBI, EBI, DDBJ) y de bases especificas por organismos, existe otro conjunto de bases
de datos denominadas secundarias porque derivan de las bases de datos generales, entre ellas las bases de motivos
estructurales y funcionales. Estas bases de datos introducen el concepto de patrones y perfiles de secuencias. Los patrones
definen secuencias cortas de amino ácidos conservados que corresponden a sitios activos, sitios de unión, etc.
Al ser regiones acotadas, no dan cuenta del resto de la secuencia adyacente y son muy poco sensibles al momento de
encontrar secuencias relacionadas que presenten una divergencia mínima en la región definida por el patrón. Los perfiles
compensan esta debilidad, dado que cubren áreas más largas de la secuencia a través de la representación numérica
de los posiciones conservadas en un alineamiento múltiple. En otras palabras, los perfiles representan las posiciones
comunes y características de aminoácidos de
una colección particular de secuencias, frecuentemente
de una familia de proteínas.
Usando perfiles es posible encontrar miembros
muy divergentes de familias de proteínas que
presenten muy baja identidad de secuencia
(Mudler y Apweiler 2001)
Dentro de este grupo de bases de datos que
proveen información para la búsqueda de secuencias
con similitud remota utilizadas para
la predicción de función se incluyen Prosite,
PRINT-S, Pfam, SMART , TIGRfam y Blocks,
entre otras.
Existen asimismo programas que permiten
identificar motivos conservados para un conjunto
de secuencias proteicas. Un ejemplo es
el programa MEME
(http://meme.nbcr.net/meme4/cgibin/meme.cgi)
Buscadores de bases integradas
El buscador Entrez del portal NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/ ) permite realizar búsquedas avanzadas ya
que incorpora relaciones lógicas o nexos entre las entradas individuales de datos en distintas bases de datos públicas.
De esta forma es posible relacionar información de secuencias nucelotidicas, proteicas, genómicas, alineamientos de a
pares y múltiples, localización génica, variantes alélicas, dominios, motivos conservados, secuencias homologas, expresión
génica, estructura proteica, etc.
DESARROLLO DEL TRABAJO PRÁCTICO
Los alumnos trabajarán en grupos de dos o tres personas y cada grupo dispondrá de una computadora con conexión a
INTERNET. Los alumnos analizarán 6 secuencias proteicas correspondientes a genes de resistencia (R) a patógenos,
tres del grupo TIR y 3 del grupo No TIR o CC, aislados de A. thaliana y una secuencia proteica deducida de la misma
especie con similitud a proteínas R.
Las secuencias están disponibles en la carpeta de la materia, en el TP de alineamiento múltiple. Las mismas están organizadas
en tres archivos de texto en formato FASTA, con los nombres:
Secuencias Grupo A (No TIR o CC)
Secuencias Grupo B (TIR)
Secuencia incógnita
Alineamiento múltiple y búsqueda de motivos conservados
a. Realizar el alineamiento múltiple de todas las secuencias utilizando el programa CLUSTAL W
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)
b. Analizar la similitud entre las secuencias evaluadas, en base a las identidad y similitud de aminoácidos conservados
Figura 2 (adaptada de Meyers et al 2003)
Lista de motivos conservados identificados utilizando el programa MEME, para cada dominio de proteínas R analizadas para
Arabidopsis.
c. Identificar motivos conservados entre todas las secuencias analizas, resaltando los mismos con distintos colores
d. Identificar con que secuencias, la secuencia incógnita, presenta mayor similitud
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e. Comparar los motivos conservados identificados, con los motivos listados en la Figura 2, correspondientes a un
análisis basado en la comparación de secuencias proteicas de proteínas R
f. Realizar ahora los alineamientos múltiples utilizando el programa CLUSTAL para los grupo A y B por separados,
incluyendo la secuencia incógnita en el grupo para el cual presentó mayor similitud
g. Realizar la búsqueda de motivos conservados utilizando el programa MEME http://meme.nbcr.net/meme4/cgibin/meme.cgi
para todas las secuencias juntas y para los dos grupos A y B en forma separada.
Cuestionario:
1. A que grupo de proteínas R pertenece la secuencia incógnita?
2. Que diferencias observa entre el análisis múltiple realizado para todas las secuencias y el análisis múltiple realizado
por grupo de secuencias. A que atribuiría esta diferencias?
3. Pudo identificar todos los motivos conservados listados en la Figura 2
4. Cuantos motivos conservados pudo identificar utilizando el programa MEME para todas las secuencias?.Y para el
análisis de los dos grupos individuales?
5. Identificó los mismos motivos utilizando exprograma MEME y el alineamiento múltiple?
Identificación de dominios funcionales en la secuencia proteica incógnita
Para la determinación de la presencia de dominios proteicos en la secuencia incógnita, comparar la misma contra la
base de datos de proteínas Pfam http://pfam.sanger.ac.uk/search, integrada por familias proteicas derivadas de alineamiento
mutile. Se determinara presencia y número de dominios funcionales en la secuencia incógnita
Cuestionario
6. Cuantos dominios integran la proteína incógnita?
7. Coincide esta información con la deducción que Ud. realizó en base al alineamiento múltiple?
Exploración del portal NCBI utilizando el buscador Entrez
Utilizando el sitio de inicio del buscador (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/ ) explore la infracción disponible para la
secuencia incógnita
a. Entre el número de acceso de la secuencia incógnita (at5g66900) en la búsqueda de bases integrada (entrez crossdata
base search)
b. Entre en la base protein y seleccione la secuencia correspondiente
c. Explore la información desplegada para esa secuencias
d. Identifique conecciones o links a otras bases de datos como X ref, TAIR, UniGene, ArrayExpress, InterPro, términos
GO asociados, conserved domains, genes
e. Explore que información brindan esas bases
f. Regrese a la pagina original (entrez cross-data base search) y entre en la base Genome. Seleccione la secuencia
disponible y explore la herramienta map view
que se despliega.
g. Identifique en que cromosoma está localizado el gen que codifica a la proteína incógnita. Explore las conexiones
a las que puede acceder desde este sitio, especialmente TIGR, TAIR, SIGnsl, hm
h. Regrese a la pagina original (entrez cross-data base search) y explore la base GEO.
i. Entre ahora al programa COBALT accesible a través del sitio BLAST de NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
tools/cobalt/cobalt.cgi?link_loc=BlastHomeAd, y explore esta herramienta de alineamiento múltiple, comparándola
con los alineamientos que realizara con el programa CLUSTAL W
Cuestionario
8. Compare la información obtenida de la exploración de bases de datos interconectas con la información obtenida
previamente. Que información adicional obtuvo?
9. Respecto al análisis múltiple utilizando el programa CLUSTAL W y el programa COBALT, les brindan ambos la
misma información?
Al final del práctico se discutirá en forma conjunta los resultados, interpretación, limitaciones y posibles aplicaciones
de las estrategias bioinformáticas utilizadas.
Referencias bibliográficas
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through sequence weighting position specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680
TP 4: Bioinformática Tutorial bases de datos
Ana Distéfano, Paula Fernández, Norma Paniego
Tutorial bases de datos
1) Uso de ENTREZ
a) Utilizando ENTREZ, encontrá cuántas proteínas humanas tienen un dominio WAP
Tipear human [orgn] AND WAP domain
b) Acotar la búsqueda para encontrar cuantas proteínas con este tipo de dominio están localizadas en el cromosoma 20.
Usar el buscador en la página principal de ENTREZ y tipear: 20 [chromosome] or [chr] AND human [organism] or
[orgn] and WAP domain.
2) Estamos trabajando con el cDNA AF217525. Utilizá ENTREZ para obtener la secuencia FASTA y encontrar la siguiente
información:
a) ¿Cuál gen está codificado por este cDNA?
b) ¿Cuántos aminoácidos tiene la traducción?
c) ¿Cuáles son los IDs de RefSeqs y confirmar si el gen fue manual o automáticamente curado (NM o XM)?
d) ¿Qué dominios Pfam contiene la proteína?
e) Utilizando NCBI Blast, ¿cuál es el número de acceso manualmente curado por RefSeq que tiene una identidad del
100% a este cDNA? ¿Por qué hay un gap en el match contra sí mismo?
f) ¿Cuál es el número de acceso de RefSeq y el cDNA que tiene mejor similitud con ratón?
URLs
Entrez: http://www.ncbi.nlm.nih.gob./Entrez/
Blast searches: http://www.ncbi.nlm.nih.gob./BLAST
Tutorial BLAST
Objetivo
Familiarizarse con el uso de herramientas bioinformáticas y consulta de bases de datos disponibles a través de internet,
empleadas frecuentemente en el estudio molecular de genomas virales.
Desarrollo
Se analizarán cuatro clones obtenidos a partir de una genoteca del MRCV, estudiando el nivel de identidad con otras
secuencias depositadas en bases de datos públicas y ubicando la posición de los clones en el genoma del virus.
1. Identificar la carpeta Practica bioinformática en el Escritorio de la computadora. Abrirla y localizar los archivos
Clon A.txt, clon B.txt, clon C.txt, clon D.txt, allí se encuentran la secuencia de cuatro clones correspondiente a la
genoteca del MRCV. Abrir dichos archivos con el block de notas, WordPad o Word.
2. Buscar en la base de datos Genbank utilizando el programa BLAST la identidad de los cuatro clones. A la secuencia
enviada, la denominaremos secuencia query. Para ello acceder a través de la página del National Center for Biotechnology
Information (NCBI) http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, Seleccionar Nucleotide blast (blastn).
3. Copiar la secuencia de cada archivo y pegarla en la ventana del BLAST “enter query sequence”. En programme
selection elegir “somewhat similar sequence (Blastn)”. Enviar búsqueda (click en “blast”).
4. Interpretar, analizar y discutir el resultado de las búsquedas con los docentes.
Clon A
CCCGTTCGGCAAAGTCACAGCGAAAGAAAAATTTCTTGATATTGAAAAGAATATGTTACAA-
GTATGGCAGAATCAAGCTCTTAACTGAAAGCGAATACGCCTCCAAATTACTATTGAAAGAA-
AGTGCTATGGATGGGATAATTGCCAATGCCGTTAGAGATTAGAAAAACATTATTTGGAGAA-
ATACGGTTAACCACAGAAATAATTGAATCATAATTAAAAGACATTGCTTTAGTTCTCAA-
TAATGCTAGCGATTTAATTTTAAAACTATTCGAAAACGACGGTGGTATTGAAAAATCTTGCAT-
CATTCCAATTTCAGTAATTGAAAAAGACATTTTTGGCGTACTACATCCGATTG
Clon B
TTGAAAAAGACATTTTTGGCGTACTACATCCGATTGAAATCTTTGATTTTAATGCTTTT-
GGTATCGATGAAGTTAACAATTTAGCTATAAATCCTAAAATCCGTTACCTGCCAAATT-
GCATTGTTCAGAAATTTAGAGATACCATAGATAACTTAAAAGATGAAAGTTCATATGT-
TAAAGCTAAATCATTGTCAAAAGAATATGGTATAGTTTGTAATTGAATGAAAAGACAATAGT-
TAATTGGCGTAGATAGAATGTTTAATAAGTTAAGTATTCAGCATAGGTTTGGAACTTTTGAA-
AGTCAAATGTTTAGAAGTTTTCTTATGAGGCAAATTCTTACAGAGGATCAGTCATATGTTAAT-
TAACCAGAATGTGTCTCGAAGAAAAGTATTCAGAAGCGTGGTGTTGATACTGTTTGTTGGCAA-
AATTTACGTGAAATTGTACATCATAATGGTTCCTTTCCATTTTATCATCATACACATAGTT-
CAAATTTTGGAGTCTAAGATAGTACTCGTATTTCAATCCACACTGATAA
Clon C
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ATAATCTCAATAAATATTTGGATGGAAATCGTGTATTGATGAGTTAAAATAGTATTGCTGTGC-
TACGTTCCCGCAAAATTGAAGTTTCATTTGGACTCATGTATGTCAATCATAATCGATCGAA-
AATTGATCAATCCTTGACAGTAAGAACTGAATCATTGGAAGAGCGATTATCTTTGGATTCAA-
TATTCTTGAAACATGTATTATATTACAAAAAGGTTCCCAGTGATATTGAAGTTCTGAA-
GACGCACGCGCTTTGTTCAGTTAGATTGAGACGATATGGTGACTTTGATTACGCAGTT-
GAGCACGACGGATTAATTCAACCTAGTGAAGATTCGAGGTTTAATGTAATTTTACCATTTT-
TACCCGGATATCATTTAAATAGTTCTTACGGAAAGCTTTTCTTATATTCTAGTTTACCAA-
CGGTGCATGACAGAGACATCTCAGGAACTTTAGGAGAGATTACAGGATCATTAGGAGCAGCT-
TATGATGTTGATTCAGCAGTAGAGTTTGGAGCACATGTATATAATATAAATCCTAGTTTAGTT-
GATGCTGCTGGTGCCGCTATTGGTATACCTCAAAGTTTACTTAAAAATTATAAAAATTTAGTT-
GATGCTTTCATTACGAACAATTTTAATCTAAAATATCATTCAATTTTTCAGAATGTTAAATA-
CAATGGTTTAAATGGCAGTTTGAATCTATTCTCATCATTTGGCGATTATTCCAGTAGAC-
TAGTACGGTTTGACGTGATTATAAAATTGTCAAAGTTTCATTTTGTA
Clon D
TGTTTTCAAGACTAAAAACGTTTTTAGAAATTGCCGCTAATTGTAATCTT-
GTAATGCGAGGTTGTCGTACAAAGCCACTTTCTATAGAATACGAAAATACAGCTATTTCAA-
AGAAACTTGCAGGTAAAAAGATACTTTATAATGACAGAGCGCACATAATATTTAATGGAATA-
TATCATGCAGTTACTCCATTTATGAATAAAATCAATGATATGTTGATGGATGGTAATACTGAA-
ATTAATTTTGATCAGATTTACAAATTCGGAAGAACGATAATTACAAAAATTAATACATATGA-
TATGGTTTGTAAAGGTTATAGTAATATTGATCAGTTCACAGCATATTTAGTCAATCAA-
GCTACTCAACGAGTTATTGACAACAGAATGACAGCTAATAAATATAAAAC
TP 6: Hibridación in situ (FISH)
Docentes: Paola Talia, Sergio Rodríguez Gil, Ruth Heinz Diseñado por Paola Talia
Introducción
La hibridación in situ tiene distintas aplicaciones genómicas y está siendo utilizada para: facilitar el mapeo cromosómico,
integrar mapas genéticos y físicos (Cheng et al., 2001), asociar bandas cromosómicas con datos de secuencias
(Jiang y Gill, 1994), medir gaps de los mapas existentes (Jackson et al., 1998), detección de secuencias de ADN ribosomal,
ADN altamente y poco repetitivo (Ambros et al., 1986, Moscone et al., 1996; Mouras y Negrutiu 1989; Mouras
et al., 1987), detección de secuencias de bajo número de copias o de copia única (Lapitan et al., 1997; Wang y Chen.,
2005), detección de transgenes, este tipo de ensayo comenzó en plantas de petunia (Hoopen et al., 1996) y luego se
extendió a muchos cereales (Carlson et al., 2001; Pederssen et al., 1997; Salvo-Garrido et al., 2001).
La técnica de FISH consiste en el apareamiento de un determinado segmento de ADN o ARN a una secuencia de nucleótidos
complementarios dentro de la célula, permitiendo verificar si la célula contiene esa secuencia y observar su
exacta localización.
Esta técnica utiliza fluorocromos conjugados a anticuerpos. En un solo preparado pueden ser detectadas simultáneamente
varias sondas, cada sonda puede ser visualizada con un color diferente empleando un microscopio de fluorescencia.
Las sondas para FISH son marcadas con biotina o digoxigenina, y estas moléculas no fluorescentes son detectadas
mediante fluorocromos conjugados con anticuerpos anti-biotina o anti-digoxigenina, o con estreptoavidina. Uno de los
problemas inherentes a este método es su alta detección de ruido de fondo producido debido a la unión inespecífica del
anticuerpo o la estreptoavidina a la superficie celular. Otro problema es que sustancias de alto peso molecular, tales
como los anticuerpos o la estreptoavidina, no penetran bien dentro del citoplasma o en cromosomas condensados.
Debido a estos inconvenientes, la señal suele ser muy variable de célula a célula.
La sensibilidad de la técnica de FISH en plantas es baja, comparada con la observada en animales, incluyendo humanos.
Esta diferencia se debe a la presencia de pared celular y citoplasma en los preparados cromosómicos, lo cual inhibe
la penetración de la sonda y genera ruido de fondo (background) (Jiang y Gill, 1994).
La técnica de GISH se basa en el mismo principio que la técnica de FISH, sólo que en este caso la sonda consiste de
ADN genómico total de una especie. Esta técnica ha sido usada exitosamente en diversas especies de plantas para
evaluar la introgresión de especies silvestres en plantas cultivadas (Benabdelmouna et al., 2003; Shigyo et al., 2003;
Wei et al., 2003) así como en estudios evolutivos usando poliploides silvestres (Bennett, 1995; Poggio et al., 1999).
Objetivos
1) Familiarizarse con las técnicas de FISH y GISH y sus aplicaciones.
2) Entrenarse en la interpretación de resultados de hibridación in situ.
3) Familiarizarse en el uso del microscopio de fluorescencia.
Desarrollo del Trabajo Práctico
1) Realizar ejercicios de interpretación de imágenes de FISH y GISH, a partir de láminas con datos relevantes del
trabajo a partir de las cuales deberán sacar conclusiones. Luego cada grupo expondrá sus conclusiones al resto de sus
compañeros y los docentes compararan lo discutido en cada grupo con los datos publicados en el correspondiente trabajo.
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2) Los alumnos recibirán preparados de diferentes especies vegetales (Helianthus y tricepiro [¿no se llama Triticale?]
híbrido centeno-trigo) hibridados mediante las técnicas de FISH y GISH y los observarán al microscopio de epifluorescencia
(Leica DMLB). (Nota: la preparación de los portaobjetos con los preparados cromosómicos es similar a la
ya vista en los TPs de Genética I y otras materias y el proceso de hibridación de las sondas será sólo explicada porque
no se diferencia conceptualmente de otras hibridaciones tipo Southern blot también muy conocidas).
Referencias Bibliográficas
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Moscone, E.A., Matzke, M.A. and Matzke, A.J.M. (1996) The use of combined FISH/GISH in conjunction with DAPI counterstaining to identify
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Shigyo, M., Wako, T., Kojima, A., Yamauchi, N. and Tashiro, Y. (2003) Transmission of alien chromosomes from selfed progenies of a complete
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TP 7: Filogeografía y su aplicación al control de plagas: un ejemplo en el insecto plaga del algodón Anthonomus
grandis (“picudo del algodonero”)
Los métodos filogeográficos constituyen en una valiosa herramienta para el control de plagas, ya que permiten
establecer el lugar de origen de las poblaciones invasoras, el grado de aislamiento entre ellas y los procesos
históricos que tuvieron lugar durante su evolución en el tiempo y el espacio (Confalonieri et al., 1998, 2002;
Lanteri, 1999; Scataglini et al., 2000; Lanteri & Confalonieri, 2003). El “picudo del algodonero”, Anthonomus grandis,
es la plaga con mayor impacto sobre el cultivo de algodón en el continente Americano. Los daños ocasionados
por su presencia fueron detectados ya desde inicios del siglo XX en el cinturón algodonero del sur de
Estados Unidos, y su ingreso en Brasil en el año 1983 tuvo como consecuencia la infección de un 90% de los
cultivos de algodón del país.
En los años posteriores, el insecto continuó
expandiéndose hacia Paraguay (1991), Argentina
(1993) y Bolivia (1997) colonizando tanto
áreas cultivadas como no-cultivadas (Lanteri et
al., 2003).
Según la hipótesis de Burke et al. (1986) la
llegada del picudo a Estados Unidos habría
tenido lugar en el Pleistoceno y se explicaría
por una dispersión natural desde las selvas del
sur de México a través de una serie de plantas
nativas de la familia de las Malváceas. Por
su parte, la presencia de A. grandis en distintos
países de América del Sur ha sido considerada
un fenómeno reciente como resultado
de introducciones sucesivas a causa del comercio
del algodón (Manessi, 1997). La secuencia
temporal de las apariciones registradas
llevó a proponer que los picudos de Brasil ha-
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ían ingresado desde Venezuela o directamente desde Estados Unidos.
Una década después de ser registrado por primera vez en la Argentina, el insecto llegó al Chaco, provincia cuya
economía se sustenta básicamente en la producción de algodón. Los departamentos de Primero de Mayo,
Bermejo y Libertad fueron declarados en “emergencia” por resolución 262/03 del Boletín Oficial del “Servicio
Nacional de Sanidad Agroalimentaria” (SENASA), y en consecuencia, se inició una nueva etapa en la lucha contra
la plaga (Lanteri et al., 2003).
Con el fin de lograr una caracterización genética de las poblaciones detectadas en nuestro país, identificar su origen
y establecer las principales vías de dispersión del insecto se llevó a cabo un análisis de diversidad y estructura
poblacional a través de la técnica de RAPDs y un estudio filogeográfico en base a secuencias mitocondriales
correspondientes a los genes Citocromo oxidasa I (COI) y Citocromo oxidasa II (COII) (Scataglini et al., 2000;
Scataglini et al., 2006; Guzman et al., 2007).
Objetivo
Introducir los conceptos y herramientas básicas para el desarrollo de un estudio filogeográfico y su aplicación
al control de plagas.
Desarrollo del TP
En este trabajo práctico se utilizarán las secuencias de COI halladas en 7 poblaciones de A. grandis originarias
de Estados Unidos, México, Brasil, Paraguay y Argentina para la reconstrucción de una red de haplotipos mediante
el método de máxima parsimonia. Los resultados obtenidos se discutirán en el contexto de evidencias genéticas
provenientes de otros estudios a fin de poner a prueba las hipótesis de introducción planteadas.
En el archivo hapCOI.fas Ud. encontrará las secuencias nucleotídicas correspondientes a los 19 haplotipos hallados
en las poblaciones de A. grandis que se detallan en la Tabla 1 (Datos tomados de Scataglini et al., 2006).
1. Realizar el alineamiento de las secuencias utilizando el programa ClustalX (Thompson et al., 1997) que se encuentra
en la carpeta Filogeografía en el Escritorio de su PC.
a) Ejecutar el ClustalX. Hacer clic en la opción Load Sequence del menú File e indicar la localización del
archivo hapCOI.fas.
b) Seleccionar la opción Output format options del menú Aligment y tildar el casillero correspondiente al formato
GDE. Cerrar la ventana.
c) Seleccionar la opción Do Complete Alignment del menú Aligment. Clickear Align. Los resultados aparecerán
en pantalla y serán guardados en un archivo con extensión GDE en la misma carpeta en donde se encontraban los
datos originales.
d) Inspeccionar el alineamiento e identificar las posiciones variables. d) Cerrar el programa ClustalX.
2. Obtener el árbol de máxima parsimonia utilizando el archivo generado en el punto anterior el programa de reconstrucción
filogenética TNT.
a) Modificar el archivo hapCOI.gde de acuerdo al formato que se muestra a continuación y guardarlo bajo el
nombre hapCOI.tnt. xread 279 19
Lo2:ataagattttggctattacccccatctttaacccttttaattttaagaataattgtaagaaaaggaactggaacaggatgaacagtttaccccccactctcttctaattta
gctcatgaaggagcttctgttgatttagctatttttagccttcatatagccggaatttcttcaattctcggagctataaattttatttcaacagtcctaaatataaagccctcaagaagaagcttagaacaaatacctttatttgtatgagctgtaaaaattacagct
Lo1:atcagattttggctattacccccatctttaacccttttaattttaagaataattgtaagaaaaggaactggaacaggatgaacagtttaccccccactctcttctaatttag
ctcatgaaggagcttctgttgattgagctatttttagccttcatatagccggaatttcttcaattctcggagctataaattttatttcaacagtcctaaatataaagccctcaagaataagcttagaacaaatacctttatttgtatgagctgtaaaaattacagct
b) Ejecutar el programa TNT cuyo icono se encuentra en la carpeta del mismo nombre dentro de Filogeografía.
c) Una vez que haya ingresado al programa seleccionar la opción DNA de la pestaña Data Format del menú
Format. Esto permitirá al programa reconocer las secuencias nucleotidicas contenidas en el archivo de datos.
d) Abrir el archivo generado en el punto 2.a. (hapCOI.tnt) seleccionando la ruta con la opción Open Input File
del menú File.
e) Corroborar que los datos hayan sido leídos correctamente utilizando el comando Show Matrix del menú Data.
f) Obtener el/los árboles de máxima parsimonia mediante la opción Implicit enumeration del menú Analyze.
Este comando permite realizar una búsqueda exacta reconstruyendo todos los árboles posibles y seleccionando
aquellos de longitud mínima, procedimiento que se conoce como enumeración implícita. Dado que el número
de árboles posibles crece exponencialmente con el número de terminales incluidas en el mismo, sólo es
posible aplicar este tipo de búsqueda cuando se trabaja con números relativamente pequeños de terminales
(en nuestro caso 19).
¿Cuántos árboles se obtuvieron? ¿Cuál es su longitud?
g) Visualizar los resultados con el comando View del menú Trees. Puede pasar de un árbol a otro utilizando
las flechas que se encuentran en el extremo derecho de la barra de herramientas.
¿Cuál es la diferencia entre los árboles obtenidos?
h) Visualizar el número de pasos mutacionales entre haplotipos utilizando la opción Branch lengths del menú
Optimize.
3. Convertir el árbol de máxima parsimonia en una red haplotipos
como la que se presenta a continuación (Figura 1, Scataglini et
al. 2006). Para ello deberá identificar aquellos haplotipos que
no presenten cambios mutacionales respecto de los nodos inmediatamente
anteriores y ubicarlos en los nodos de la red.
Figura 1.
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) Interprete los resultados obtenidos teniendo en cuenta la hipótesis de dispersión planteada y:
-la localización geográfica de las poblaciones
-la frecuencia de los haplotipos en cada una de ellas.
-el número de cambios mutacionales entre haplotipos de una misma población.
4. A continuación se presentan los datos de
diversidad nucleotidica obtenidos para los genes
COI y COII en las poblaciones analizadas y
las estimas de diversidad genética provenientes
de estudios previos con la técnica de RAPDs
(Datos tomados de Scataglini et al., 2000, Scataglini
et al, 2006).
P= porcentaje de loci polimorficos
¿Son consistentes los resultados entre marcadores?
¿Coinciden los niveles de variabilidad hallados
con lo esperado según la hipótesis de introducción
reciente? ¿Todas las poblaciones exhiben
el mismo patrón?
5. Considerando todas las evidencias presentadas
¿Podría proponerse una hipótesis de introducción
alternativa? Explique.
TABLA 1
Población
Origen
Divesidad Nucleotidica
COI
Diversidad
Nucleotidica
COII
Diversidad
Genética
RAPDs (P)
TX (USA) Algodón 0.009 0.003 53.66
Te (México) Algodón 0.015 - 60.98
Lo (Brasil) Algodón 0.006 0.005 26.83
Ca (Paraguay) Algodón 0 0 51.22
Nn (Argentina) Algodón 0 0.003 43.90
Pe (Argentina) Intermedia 0.006 0.003 41.46
Ig (Argentina) Vegetación
Nativa
0.071 0.093 60.98
Agradecemos a las Dras. V. Confalonieri, A. Scataglini y A. Lanteri por ceder las secuencias para la
realización de este trabajo práctico.
Bibliografía
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TP 8: Transcriptómica: Análisis transcriptómico y genómico comparativo de especies del complejo Mycobacterium
tuberculosis Preparado por Fabiana Bigi
Docentes: Karina Caimi/Fabiana Bigi
Objetivo general: lograr entrenamiento d e m o s t r a t i v o en la marcación, hibridación y análisis de microarreglos
de ADN.
Objetivo particular: comparar los genomas y los transcriptomas de las especies Mycobacterium bovis y Mycobacterium
tuberculosis mediante la técnica de microarreglos de ADN.
Introducción
Mycobacterium tuberculosis, agente etiológico de la tuberculosis humana (TB), infecta una tercera parte de la población
mundial y mata 3 millones de personas todos los años. Según la Organización mundial de la Salud, la tuberculosis
es el principal problema de Salud en Latinoamérica, Asia y África. La tuberculosis bovina es una enfermedad
enzoótica importante en muchos países del mundo. Esta enfermedad es un problema para la salud pública y
la causa de importantes pérdidas económicas. Mycobacterium bovis, el agente causal de la tuberculosis bovina,
infecta a animales de importancia agropecuaria y reservorios salvajes que dificultan los programas de control de
esta enfermedad. M. tuberculosis y M. bovis forman un grupo taxonómico, junto con otras especies, dentro del
género micobacteria (MTC) debido a que son organismos altamente relacionados a nivel genético. También, la fisiopatología
de M. tuberculosis en humanos y aquella de M.bovis en bovinos es similar. Brosh et al. (2002).
Fig. 1: Esquema representando el camino evolutivo propuesto para el bacilo de la tuberculosis, ilustrando las sucesi-
Página 16 de 40

vas pérdidas de ADN (RD1- 14).
El origen de M. tuberculosis es muy antiguo. Se cree
que las bacterias del género Mycobacterium, como otros
actinomicetes, derivan de un ancestro común de vida
libre que se encontraba en el suelo y en el agua. Posiblemente
durante la especiación, los miembros del complejo
sufrieron un cuello de botella, ocurrido hace 15000-20000
años atrás (Sreevatsan, et al. 1997). Con las secuenciación
de genomas y la genómica comparativa se indentificaron
regiones variables entre los miembros del MTC.
Brosch y colaboradores, analizando 20 regiones de diferencia
(denominadas RD seguidas de un número) en
más de 100 cepas, identificaron delecciones en el genoma
de M. bovis con respecto a M. tuberculosis lo que
indica que el genoma de este último es mayor (Brosch, et
al. 2002). Encontraron evidencias de que la delección de ciertas regiones genómicas variables no ocurrió de manera
independiente en las diferentes cepas del complejo, lo que les permitió plantear un nuevo escenario para la evolución
del complejo M. tuberculosis y el origen de la TB humana (Figura 1). Parecería que M. bovis (RD4, RD5,
RD7, RD8, RD9, RD10, RD12, RD13) es el último representante de un linaje junto con M. africanum (RD9) y
M. microti (RD7, RD8, RD9, RD10) que derivó del progenitor de M. tuberculosis antes de que ocurriera una delección
específica de tuberculosis TbD1 (Brosch, et al. 1999; 2002).
OBJETIVOS:
1) Identificar las regiones genómicas de diferencia entre M. tuberculosis y M. bovis.
2) Comparar los transcriptomas de ambas especies M. tuberculosis–M. bovis microarrays. Los microarreglos que se
emplearán fueron provistos por el Dr Glyn Hewinson en el Veterinary Laboratories Agency (Weybridge, UK). Los
mismos fueron diseñados originalmente por el Bacterial Microarray Group (BuG@S, St George‟s Hospital Medical
School, Londres, UK). El microarreglo consiste de 4410 productos de PCR (rango de tamaño 60–1000 bp) que representan
todos los genes de los genomas de las cepas H37Rv y CDC1551 de M. tuberculosis y la cepa AF2122
de M. bovis
MICROARRAY HYBRIDISATION PROTOCOL
Use the following Cy-dye labelled dCTP volumes for the
appropriate application:
Genomic DNA labelling
For each reaction:
2-5μg genomic DNA
1μl Random primers
to 41.5μl ddH2O
95˚C for 5min, snap cool on
ice and briefly centrifuge.
Then add:
5μl Klenow Buffer (10x)
1μl dNTPs (5mM each dA/G/TTP, 2mM dCTP)
1.5μl Cy3-dCTP
1μl Klenow fragment (5U/μl)
37˚C for 90min in the dark.
cDNA synthesis and labelling
For each sample:
5-10μg RNA
1.7μl Random primers
to 15.9μl RNase-free H2O
70˚C for 10min, snap cool on ice, spin down.
Then add (make a master mix for multiple labellings):
6μl 5x First StrandBuffer
3μl 100mM DTT
0.6μl dNTPs (25mM each dA/G/TTP, 10mM
dCTP)
2μl SuperScript II
2.5μl Cy5-dCTP
25˚C for 10 min in the dark.
42˚C for 110min in the dark.
Pre-hybridisation
Mix the prehybridisation solution in a coplin jar and incubate
at 65˚C during the labelling reaction to equilibrate.
Solution Prehybridisation
20x SSC 8.75ml (3.5x SSC)
20% SDS 250μl (0.1% SDS)
BSA (100mg/ml) 5ml (10mg/ml)
ddH2O to 50ml
Incubate the microarray slide in the pre-heated prehybridisation
solution for 20min
Wash in 400ml ddH2O for 1min
Wash in 400ml isopropanol for 1min
Dry by spinning in 50ml centrifuge tube at 1500rpm for
5min
Store slide in the dark, dust-free box until hybridisation
(

Transfer column to a clean tube and spin for another 1
min at 13K
Transfer column to a clean tube and add add 20μl MilliQ
H2O pH 7-8.5 (when using
22x50mm LifterSlips). Wait 1 min. Spin 1 min at 13K.
Add another 20 μl MilliQ H2O, wait 1 min and then spin
at 13K for 1 min.
Hybridisation
Mix:
39.4μl purified labelled probe
12μl filtered 20x SSC 20% 9.2
8.2μl filtered 2% SDS 14% 6.4
Remove any dust from slide and cover slip using an air
duster
Place a 22x50mm LifterSlip over arrayed area of slide
Denature probe at 95ºC for 2 min
Towards end of 2 min incubation, place 30μl 3xSSC in
each well of the hybridisation cassette
Briefly spin down probe and immediately transfer to
arrayed area of slide, avoiding bubbles
Seal hybridisation chamber
Incubate in 65ºC water on top of plastic base inside bath
for 16-20 hrs
Washing
Solutions Wash A Wash B
20x SSC 20ml 2.4ml
20% SDS 1ml -
ddH2O to 400ml to 800ml
Pre-heat wash A (1xSSC, 0.05%SDS) at 65ºC
Add to pre-heated staining trough at 65ºC
Remove microarray slides from hybridisation cassette
and place them in slide rack Wash slides carefully
in staining trough of wash A at 65ºC to remove
LifterSlip Once LifterSlip is displaced continue
agitating in wash A for a further 2min
Transfer slides to new rack and wash in first trough of
Wash B (0.06xSSC) for 2min
Wash in second trough of Wash B for 2min
Dry by spinning in 50ml centrifuge tube at 1500rpm for
5min
Notes
General precautions and tips
• Minimise the exposure of Cy-dyes to the light.
• Use RNase-free pipette tips and H2O for RNA labelling
reaction.
• RNA preps should be at a concentration of at least
0.35-0.7 μg/μl and purified using Rnasy columns (Qiagen).
Labelling efficiency
• If the MinElute membrane remains white after
binding of cDNA do not proceed, your RNA did not
yield labelled cDNA. Check the quality of the RNA
and/or the other reaction components and store the
labelled gDNA at 20ºC for use in another hybridisation.
• If the column is purely red or blue after binding
Application Vol. Cy3- Vol. Cy5-dCTP
cDNA vs dCTP 1.5μl 2.5μl
cDNA vs ge- 1.5μl (gDNA) 2.5μl (cDNA)
nomic genomic vs 1.5μl 1.5μl
pooled genomic cDNA labellings elute and re-label the failed
reaction.
Hybridisation tips and tricks
• Once SDS has been added to the probe keep it at
room temperature to avoid precipitation.
• Transfer of the probe to the slide must be done carefully
but quickly to prevent re-naturation of probes and
extended evaporation of the sample.
• Prepare the slide and cover slip by removing any dust
with pressurised air
• Apply the probe as a line in the middle of the spotted
area avoiding touching the slide surface and bubble formation.
This is best achieved by not expelling the final
drop of liquid.
• Using curved-edge forceps place one edge of the cover
slip just outside the spotted area at an angle to the slide
surface. Hold a microspatula down on the slide surface
close to (or just touching) the cover slip to prevent it
from sliding away from the arrayed area. Carefully lower
the other edge of the cover slip down with the forceps
and lay it down on the probe, which should spread out
under the cover slip.
• Once in place do not move the cover slip (unless it is
misplaced accidentally).
• Small bubbles usually migrate out of the cover slip.
Check after a few minutes in the water bath and if necessary
gently tap the cover slip to dislodge any stubborn
ones.
• Wash the microspatula and forceps in between slides
if they come into contact with the probe.
Washing and drying slides
• Do not touch the arrayed area, even with gloves
• Wash by vigourously plunging the rack up and down
for the whole wash time
• Minimise exposure of the slide to the air during washing
• SDS is fluorescent - be particularly careful of what is
on your gloves.
TP 9: Demostración de electroforesis bidimensional de proteínas (demostrativo, no hay guía)
TP 10: Genómica funcional: Silenciamiento génico inducido por virus (VIGS)
Preparado y enseñado por Gabriela Llauger, María Cecilia Rodríguez, Carlos Manacorda
Introducción
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Genómica Aplicada
Verano 2012
El término VIGS (silenciamiento génico inducido por virus, por su sigla en inglés) se aplica a la técnica que emplea
virus recombinantes a fin de disminuir la expresión génica de un gen endógeno (knock down) como alternativa al clásico
método de reemplazo alélico (knock out). La construcción de vectores
virales que portan en su genoma insertos derivados de secuencias génicas
vegetales permite silenciar específicamente la secuencia endógena homóloga
al inserto introducido en el vector viral. VIGS es una metodología que no
requiere de transgénesis por lo tanto es rápida y versátil, siendo ideal para
estudios de genómica funcional, incluso a gran escala. Su mayor ventaja y
desventaja radica en que el nivel de silenciamiento puede ser variable (a
veces el silenciamiento total del gen es una desventaja) y que depende de la
especie a utilizar (Vázquez Rovere et al. 2010).
La técnica de VIGS ha sido comúnmente ensayada en la especie de tabaco
salvaje Nicotiana benthamiana ya que es altamente susceptible a infecciones
virales y permite estudiar eficientemente el silenciamiento génico. El virus
de mosaico del tabaco (TMV, por sus siglas en inglés) fue el primer virus de
ARN utilizado como vector de silenciamiento. Mediante transcriptos de
TMV recombinante portando una secuencia del gen de la fitoeno desaturasa
(phytoene desaturase o PDS) producidos in vitro e inoculados en plantas de
N. benthamiana se logra silenciar exitosamente la expresión de PDS (Godge
et al. 2007).
Fig 1: Vía biosintética de carotenos en plantas. A la izquierda, el arroz dorado
Objetivo
Mostrar el silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) del gen endógeno de fitoeno desaturasa (PDS) mediante
agroinfiltración de hojas de N. benthamiana con TRV recombinante. El gen PDS codifica para una enzima involucrada
en la biosíntesis de carotenos (importantes nutracéuticos precursores de vitamina A) y es uno de los genes utilizados
para desarrollar el arroz dorado, ver figura 1). Su falta de expresión da como resultado la ausencia de pigmentación.
Metodología de VIGS
El sistema de vectores de VIGS basados en el virus TRV (Tobacco rattle virus) utiliza cDNA del genoma de ARN
bipartito del TRV. El primer segmento genómico (RNA1) posee la RNA polimerasa RNA dependiente (RdRP) bajo el
control del promotor CaMV 35S y la proteína de movimiento (MP) así como una proteína de 16 kDa y una ribozima.
El segundo segmento genómico (RNA2) tiene un sitio de clonado múltiple río abajo del gen de la proteína de cápside
(CP) -también bajo el control del promotor CaMV 35S-, y una ribozima. El cDNA de ambos segmentos se introduce
en cassettes flanqueados por los bordes izquierdo y derecho de T-DNA, y son luego clonados en vectores binarios e
introducidos en Agrobacterium tumefaciens. Cultivos independientes de agrobacterias (uno con RNA1 y el otro con
RNA2 conteniendo la secuencia del gen objetivo –target-) son mezclados en una proporción 1:1 y utilizados para
agroinfiltrar hojas de N. benthamiana. Las células infectadas pueden sintetizar partículas virales completas y causar
dispersión sistémica del virus, desde el sitio de infiltración hacia las hojas superiores de la planta en crecimiento, disparando
el mecanismo de defensa de la planta que suprime tanto la replicación viral como la expresión del gen endógeno
target. Entre 3 y 4 semanas luego de la agroinfiltración, los fenotipos producidos por silenciamiento del gen
target pueden ser observados (Figura 2) (Godge et al. 2007).
Figura 2: Representación esquemática de las
etapas involucradas en VIGS con vectores
basados en TRV. Se identifica un gen candidato,
por ejemplo a partir de un pool de cDNA.
El gen es clonado en el vector basado en
RNA2 que contiene el gen de la proteína de
cápside viral (CP) bajo el control de un promotor
constitutivo. Por otra parte, el cassette
basado en el RNA1 viral (conteniendo los
genes para RdRP, MP, etc.) es clonado en otro
sistema de expresión T-DNA. Estos dos vectores
binarios (RNA1 y RNA2) son introducidos
en bacterias de Agrobacterium independientes.
Ambos cultivos de Agrobacterium son mezclados
con una relación 1:1 y son agroinfiltrados
en hojas de N. benthamiana. La infiltración de
vectores de VIGS lleva a la infección sistémica
de la planta y a la aparición de síntomas específicos.
Entre 3 y 4 semanas luego de la agroinfiltración,
los fenotipos producidos por silenciamiento
del gen target pueden ser observados
19

Genómica Aplicada
Verano 2012
(adaptado de Godge et al., 2007).
Preparación de las bacterias para infiltrar
1) Estriar las bacterias portando los distintos plásmidos en una placa de ágar LB conteniendo los antibióticos apropiados.
Incubar durante dos días a 28ºC.
2) Inocular con una colonia aislada 3-5 ml de medio de cultivo LB líquido conteniendo los antibióticos apropiados en
un tubo de ensayos. Incubar con agitación (200 revoluciones por minuto o r.p.m.) a 28ºC toda una noche (over night
O.N.) en un incubador con control de temperatura. Es importante que esta temperatura no supere 28°C porque las
agrobacterias pierden el plásmido.
3) Inocular usando 1 ml del cultivo obtenido a 10-15 ml de LB líquido y 20 µM de acetosiringona en un tubo plástico
de tipo Falcon® de 50 ml e incubar con agitación (200 r.p.m) O.N. a 28ºC.
4) Centrifugar el cultivo de bacterias durante 15 min a 4.000 r.p.m. en una centrífuga tipo Sorvall y a 4º C. Resuspender
las bacterias en Solución de MES. Llevar a OD600=0,8. Incubar las bacterias a temperatura ambiente al menos
durante 2 horas (puede ser O.N.). Para las co-infiltraciones se realizan mezclas de partes iguales de las agrobacterias
portando los distintos plásmidos.
Solución de MES + acetosiringona 100 µM
Preparación de MES:
Para 1 litro de MES: 2,14 gramos de MES
0,95 gramos de MgCl2
Nota: Al resuspender las bacterias con la solución de MES utilizando el mismo volumen que el de LB utilizado para
cultivarlas (en este caso 10 ml) se obtiene una suspensión bacteriana de OD600 ≈ 1.
5) Agroinfiltrar hojas en la cara abaxial con la suspensión bacteriana utilizando una jeringa (ver video en Bazzini et
al. 2007)
Material Vegetal
Plantas de N. benthamiana de aproximadamente un mes de edad. Deben ser plantas saludables en etapa vegetativa de
un estado intermedio de desarrollo.
Medios, soluciones necesarias y antibióticos necesarios
Solución de MES
MES (ácido N-morpholinoetanesulfónico) 10 mM
MgCI2 10 mM
Agua bidestilada
Autoclavar la solución (solo si no se va a usar en el momento)
Acetosiringona [200 mM]
Disolver 40 mg de acetosiringona en 1 ml de dimetil sulfóxido (DMSO). Conservar a -20°C.
Preguntas
1. ¿Qué otras técnicas además de VIGS conoce para inducir el PTGS en plantas?
2. ¿Qué ventajas posee VIGS sobre otras técnicas de knock out como el reemplazo alélico? ¿De qué forma puede
superarse la redundancia funcional en presencia de familias de genes?
3. ¿La expresión de las construcciones agroinfiltradas es transitoria o estable?
4. Una vez inducido, ¿el VIGS es estable?
Referencias
Vazquez Rovere, C.; Bazzini, A.; Rodríguez, C.; Almasia, N; Asurmendi, S. Métodos para generar y analizar diversidad. Usos del Silenciamiento
génico para el análisis funcional de genes candidatos. En: Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II - V. Echenique, C. Rubinstein, E.
Hopp y L. Mroginski (eds), Editorial INTA, 2010, en prensa.
Godge, M. R; Purkayastha, A; Dasgupta, I; Kumar, P. P. Virus-induced gene silencing for functional analysis of selected genes. Plant Cell
Rep. 2007. Volume 27, Number 2 (209-219).
Bazzini A.A, Mongelli V.C, Hopp H.E, Del Vas M, Asurmendi S (2007) A practical approach to the understanding and teaching of RNA
silencing in plants. Electronic Journal of Biotechnology 10 (2), 178-190.
TP 11: PCR en Tiempo Real
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
El fundamento de la PCR consiste en la multiplicación in vitro
de un fragmento de ADN, mediante un proceso denominado
amplificación, con el fin de aumentar su concentración hasta
obtener una cantidad de copias de ADN que permita ser detectado.
Para la reacción se requieren, además del ADN en estudio, los
4 nucleótidos (unidades constitutivas del ADN), una enzima
denominada Taq ADN polimerasa, que es la encargada de
sintetizar las millones de copias de un mismo fragmento de
ADN y por último un par de cebadores (primers en inglés) que
Fluorescencia
Ciclo de PCR
20

Genómica Aplicada
Verano 2012
son pequeñas secuencias de ADN de simple cadena de alrededor de 20 a 30 bases, los cuales se encargan de indicarle
a la enzima donde iniciar la síntesis nuevas copias de ADN.
La gran especificidad de la PCR se sustenta en la capacidad de los cebadores para reconocer por complementaridad de
las bases del ADN a una secuencia particular de ADN y para ello es necesario conocer, al menos parcialmente, la secuencia
de ADN de que se quiere detectar para diseñar los primers adecuados. La reacción ocurre en un equipo denominado
termociclador que regula los tiempos y temperaturas óptimos para que ocurra la reacción. La reacción tiene
tres etapas. Juntas forman un ciclo de PCR. Estos ciclos se repiten de 30 a 50 veces. Cada ciclo consta de:
Etapa de desnaturalización, donde se produce separación de las dos cadenas de ADN para obtener el ADN como
cadenas simples. Esta etapa ocurre a 94ºC o 95ºC.
Etapa de hibridación (annealing en inglés) donde ocurre el reconocimiento por parte de los primers de las secuencias
complementarias. Esta etapa se realiza a la temperatura
óptima para ese reconocimiento. Dicha temperatura varía de
acuerdo al diseño de los primers dentro de un rango que va
desde los 50 ºC hasta los 70 ºC. En esta etapa solo de produce
la hibridación si el ADN de la muestra que se estudia
contiene las secuencias buscadas. Si ellas no están presentes,
no habrá unión y por lo tanto, no habrá amplificación.
Etapa de elongación, donde ocurre la síntesis de dos
nuevas cadenas de ADN a partir de la original, mediante la
acción de la enzima ADN Taq polimerasa. Esto se desarrolla
a una temperatura de alrededor de 72º C, que es la temperatura
óptima de acción de la enzima.
Fuente: www.porquebiotecnologia.com.ar
La cinética de la PCR tiene 3 momentos o fases:
La fase inicial, donde hay pocas moléculas target (ADN) y alta concentración de los reactivos.
La fase exponencial, donde la eficiencia de la síntesis de las nuevas cadenas es máxima debido a que hay abundancia
de reactivos, de targets y de productos de PCR. En ella la relación entre producto de PCR formado y el número
inicial de moléculas de ADN presentes en la muestra es directamente proporcional.
La fase de plateau donde los reactivos se agotan y existe un exceso de producto amplificado. Allí la eficiencia de
síntesis decae.
Dentro de la metodología de PCR hay dos modalidades que son ampliamente utilizadas. Ellas son: PCR en tiempo
final y PCR en tiempo real. Ambas se realizan en un equipo denominado termociclador que es el que controla y regula
los tiempos y temperaturas óptimos para que ocurra la reacción. La diferencia que presentan estas dos modalidades se
halla en la forma y la fase en la cual se produce la detección del producto de amplificación y por lo tanto, el tipo de
resultados obtenidos.
PCR en tiempo final
En la PCR en tiempo final una vez concluida la reacción, los fragmentos amplificados son separados mediante electroforesis
en gel y visualizados bajo luz ultravioleta por medio de un colorante fluorescente. Se busca la presencia y/o
ausencia de bandas de un determinado peso molecular que se corresponden con el tamaño de los fragmentos amplificado.
La lectura del producto de amplificación ocurre en la fase de plateau de la PCR, por lo tanto, el tipo de resultados
obtenidos son de tipo cualitativo (ausencia o presencia de la secuencia de interés) o semicuantitativos (en rangos
de concentración). Para la obtención de resultados de
tipo cuantitativo se realiza el análisis individual de
distintos conjuntos de muestras y se tienen en cuenta
consideraciones estadísticas para el armado y cantidad
de conjuntos a analizar.
Fuente: www.porquebiotecnologia.com.ar
PCR en tiempo Real
La técnica de PCR en Tiempo Real es una alternativa
a la PCR convencional que permite la obtención de
resultados cuantitativos. La denominación de “tiempo real” se debe a que el ADN amplificado puede ser detectado
durante el proceso de PCR y no al final del mismo, como sucede con la PCR convencional. La PCR en tiempo real
combina el uso de un termociclador, un sistema de detección de fluorescencia y una computadora. El termociclador
tiene acoplado un sistema para la detección de fluorescencia. A medida que transcurre la reacción el equipo toma señales
de la fluorescencia generada y las analiza (en "tiempo real"). La señal de fluorescencia recolectada es directamente
proporcional a la cantidad de producto de PCR amplificado. Como la lectura de los datos se realiza durante la
fase exponencial de la reacción, se obtiene así una cuantificación más adecuada y precisa del producto amplificado.
21

Genómica Aplicada
Verano 2012
Esta metodología, siempre que sea adecuadamente diseñada y puesta a punto, permite obtener una mayor sensibilidad
y especificidad. Dado que la amplificación y la detección ocurren al mismo tiempo, el análisis es más rápido que en la
PCR en punto final. Además, como no es necesario, manipular los productos de PCR se reduce la posibilidad de contaminación
con estos productos. Entre las desventajas que presenta frente a la PCR en punto final se pueden señalar su
mayor costo, tanto en el equipo como en los reactivos utilizados, así como la complejidad del diseño de los primers y
sondas, que en muchos casos resultan más exigentes. Para la medición de la fluorescencia dos son las modalidades
más utilizadas: las sondas fluorescentes y los agentes intercalantes de ADN.
Las sondas son secuencias de oligonucleótidos que reaccionan por complementariedad de bases con un pequeño
fragmento de la secuencia a amplificar. Estas sondas están marcadas con moléculas que emiten fluorescencia cuando
se produce la amplificación específica. Las sondas se colocan en la reacción de PCR junto con los otros reactivos y
solamente se detecta fluorescencia, si la secuencia de interés está presente en la muestra y hay amplificación.
Entre las ventajas de estas sondas podemos mencionar la alta especificidad de la reacción, debido a que sólo se genera
fluorescencia si la reacción específica de la PCR ha ocurrido y la posibilidad de detectar y cuantificar múltiples targets
en una única reacción de PCR mediante el uso de varias sondas distintas en la misma reacción.
Entre las desventajas que presentan podemos señalar el diseño de las sondas que deben resultar específicas y no interferir
con los primers; la necesidad de sintetizar una sonda distinta para cada target que se quiere detectar; y por último
el mayor costo de la PCR debido a la incorporación de estas moléculas marcadas.
Existen distintos modelos de sondas. Las más utilizadas son las sondas de hidrólisis (sondas Taqman). Además se
pueden mencionar las sondas conformacionales (Molecular beacons, Scorpions, donde lo marcado son los primers) y
las sondas de hibridación.
El otro formato ampliamente utilizado son los agentes intercalantes de ADN. El más empleado es el SYBR Green.
El SYBR Green es una molécula que presenta la característica de no emitir fluorescencia cuando se encuentra en solución.
En presencia de ADN doble cadena, el SYBR Green se intercala entre las cadenas de ADN emitiendo así una
señal fluorescente. Este fluorocromo se agregar a la reacción de PCR junto con los otros reactivos. Si en la reacción de
PCR hay amplificación, el SYBR Green se une al ADN de doble cadena recién sintetizado en cada ciclo y va generando
un aumento en la señal de fluorescencia que es proporcional a la cantidad de producto generado durante la amplificación.
Hay que tener en cuenta que esta reactivo no es específico de una secuencia determinada y por lo tanto se intercala con
el ADN doble cadena que puede corresponder tanto a productos de amplificación específicos como inespecíficos. Para
evitar la generación de señal inespecífica, que llevará a resultados equivocados, es muy importante la optimización de
la reacción de PCR de manera tal de evitar la formación de los productos inespecíficos.
Entre las ventajas que presenta con respecto a las sondas se pueden mencionar que es un método más económico dado
que no necesita la síntesis de sondas marcadas. Por otro lado, puede ser utilizado para la detección y cuantificación de
diferentes secuencias sin necesidad de sintetizar sondas diseñadas específicamente para ello.
Entre las desventajas en comparación con las sondas fluorescentes podemos mencionar su menor especificidad y el
hecho de que no permite la cuantificación de diferentes targets en una única PCR.
Si bien generalmente se menciona que la especificidad es menor a la que se obtiene utilizando sondas fluorescentes, se
puede lograr alta especificidad. Para ello algunas de las estrategias a utilizar son:
La optimización de la reacción de PCR para la amplificación de un único producto, asegurándose la ausencia de
productos inespecíficos.
El análisis de los productos de amplificación a través de la lectura de la temperatura de fusión (melting point).
Esta temperatura (Tm) es aquella en la cual la mitad de las cadenas de ADN están como doble cadena y la otra mitad
está desnaturalizadas. Es propia y específica de cada producto de amplificación, dado que dependen del tamaño del
producto amplificado y de la composición de las bases del mismo. Para llevar a cabo este análisis, al final de la PCR
se programa el equipo para realizar un paso más. Este consiste en aumentar la temperatura muy despacio desde una
temperatura baja (60ºC) a una temperatura alta (95ºC). Durante todo el proceso se monitorea constantemente la fluorescencia
generada y esta señal es recolectada por el equipo. A bajas temperaturas todos los productos de PCR están
en la conformación de doble cadena, por lo tanto el SYBR Green se une a ellos y la emisión de fluorescencia es alta. A
altas temperaturas, los productos se encuentran desnaturalizados resultando en un rápido descenso en la señal de fluorescencia.
Al llegar a la temperatura de fusión, se produce un brusco descenso en la señal de fluorescencia. Este descenso es
detectado por el equipo y graficado. Así, se obtiene un gráfico de fluorescencia en función de la temperatura, donde se
observa un pico (la primera derivada de este gráfico) que corresponde a la temperatura de fusión del producto. Si la
reacción ha sido puesta a punto de manera adecuada, solo se espera ver la presencia de un pico que corresponde al
producto de interés.
Trabajo Práctico - Consideraciones generales
22

Genómica Aplicada
Verano 2012
El material de partida es cDNA sintetizado a partir ARN por RT-PCR. Generalmente entre un 10 al 30% del ARN
templado es transcripto reversamente a cDNA. Sin embargo el volumen de cDNA (de la reacción de RT) no debe
exceder el 10% del volumen final de la PCR en tiempo real.
Girasol: ARN de las líneas HA89 y RHA 801 a distintos tiempos post inoculación.
Papa: ARN líneas transgénicas sobre las que se quiere evaluar expresión
o silenciamiento del gen endógeno
PCR
en punto final
Diseño de primers
PCR
en tiempo real
Longitud 18-30 nucleotidos
Contenido
de GC
GIRASOL PAPA
Actina1 Actina upper
Oxox (oxalato oxidasa) Actina lower
EF 502 (LTP) Snakin Upper y
Lower
Número de ciclos
Por lo general los programas de PCR tienen de 35
a 45 ciclos, pudiéndose extender hasta 55 ciclos. Sin embargo, llevar a cabo tantos ciclos aumenta la posibilidad de
formación de productos inespecíficos. Esto llevará a una inadecuada cuantificación ya que con el método de SYBR
Green no es posible diferenciar los aporte a la señal de fluorescencia generada por los distintos productos (sean estos
específicos o inespecíficos).
Por otro lado, se puede observar si los productos generados son inespecíficos mediante el análisis de las curvas de
melting. Generalmente los productos inespecíficos formados presentan temperaturas de fusión (Tm), menores a la del
producto específico.
Generación de curvas estándar
Para generar una curva estándar se recomienda utilizar al menos 5 concentraciones distintas de la secuencia a detectar.
La concentración de la muestra desconocida debe caer dentro del rango de trabajo. Si la concentración es mayor a este
rango, se recomienda repetir el análisis realizando diluciones de la muestra para que se encuentre dentro del rango de
linealidad. Los estándares deben poseer el mismo sitio de unión al primer, la misma secuencia entre los sitios de unión
al primer, y las mismas secuencias río arriba y río abajo de la secuencia a amplificar que la muestra a ser cuantificada.
Si las muestras incógnita son ARN los estándares deben ser concentraciones conocidas de ARN, mientras que si son
cDNA o ADN pueden ser ADN plasmídico, fragmentos de PCR o ADN genómico.
Controles
Dada la alta sensibilidad de la técnica de PCR, es necesario siempre descartar la ausencia de contaminación. Para ello
se utilizan controles negativos para el control de contaminación de reactivos o de la matriz a analizar, así como para
chequear la ausencia de falsos positivos productos de reacciones inespecíficas. Para ello, se utilizarán como controles
de la reacción de PCR:
Control negativo de PCR. Este control contiene todos los componentes de la reacción excepto el templado (ADN o
cDNA). Este control debe dar negativo (ausencia de amplificación). Se lo utiliza para descartar la contaminación en
los reactivos utilizados.
Control de RT. Este control contiene todos los componentes de la reacción pero en lugar de templado (ADN o
cDNA) tiene ARN. Este control debe dar negativo (ausencia de amplificación). Se lo utiliza para detectar en el ARN
que fue utilizado como templado para la síntesis de cDNA por RT-PCR, la presencia de contaminación con ADN.
PROTOCOLO
40-60%
Tm= 2ºC x (nº de [ A+T] + 4ºC x ( nº de[ C+G] )
Tm La temperatura óptima de annealing debe ser unos
grados por debajo de la Tm (+/- 5ºC)
Longitud ideal del producto entre 100-150 pb.
Evitar complementariedad de 2 o mas bases en los
extremo 3´ de los pares de primers para reducir la
formación de dímeros.
Evitar seguidillas de 3 o más Guaninas en el extre-
Secuencia
mo 3´.
Evitar que el extremo 3´ termine con Timina ya que
tienen una alta tolerancia a los missmatch.
Evitar la complementariedad de secuencias dentro
de la secuencia del primer y entre los pares de primer.
Componentes
Volumen
para una
muestra
Concentración final
2x QuantiTect 10 µl 1X
23

1. Preparar la master mix para el total de las muestras
necesarias
*concentración de magnesio 2,5 mM MgCl2
2. Mezclar con cuidado la master mix y pipetar el volumen
adecuado dentro de los capilares de PCR.
3. Agregar el volumen de templado (≤ 1µg/reacción) en
cada capilar. Tapar los capilares y centrifugar a 3000
rpm durante aproximadamente 10 segundos.
Genómica Aplicada
Verano 2012
SYBR Green PCR
master MIX*
Primer F variable 0.5mM
Primer R variable 0.5 mM
H2O RNAsa-Free variable -
Templado variable ≤ 1µg/reaccion
Volumen Total 20 µl
4. Colocar los capilares en el carrusel y colocar el carrusel en el termociclador comenzando por la posición 1.
5. Seleccionar el programa de corrida
6. Poner los capilares en el rotor y comenzar la corrida de PCR.
7. Una vez finalizada la corrida de PCR realizar el análisis de los datos obtenidos.
8. Analizar la curva de melting para cada muestra.
Paso
Activación inicial de
Tiempo Temperat. Rampa Comentarios
PCR
Ciclo de 3 pasos
15 min. 95ºC 20ºC/seg Activación de la HotStart ADN polimerasa
Desnaturalización 15 seg 94ºC 20ºC/seg
Anillado
Extensión
Número de ciclos
Curva de Melting point
20-30seg 50-60ºC
10-30seg
35-55
ciclos
95ºC
60 ºC
95 ºC
40 ºC
72ºC
0 seg.
15 seg.
0 seg.
30 seg.
20ºC/seg
20ºC/seg
20ºC/seg
20ºC/seg
0,1ºC/seg
Entre 5º a 8ºC por debajo de la Tm de los primers
Llevar a cabo toma de datos. El tiempo de extensión depende
del largo del producto de amplificación. Generalmente,
se utiliza 5 seg cada 100 pb, con un mínimo de 10
seg de tiempo de extensión
El número exacto de ciclos depende del límite de detección
a alcanzar
Llevar a cabo la toma de datos de fluorescencia continuamente
TP 12 Interactómica: estudio de las interacciones proteína-proteína
Docentes: Laura Klepp y Laura Kamenetzky Diseñado por Laura Klepp y Esteban Hopp
Permite estudiar, a gran escala, la interacción entre proteínas como parte del proceso de transducción de señales y de
redes de interacción de proteínas.
Las interacciones entre proteínas son importantes, por ejemplo, para la señalización al interior de la célula de señales
procedentes del exterior. Este proceso, llamado transducción de señales, juega un papel fundamental en procesos biológicos
y enfermedades (ej. cáncer). En bacterias, tienen un papel preponderante en la interacción genotipo-ambiente
mediante el cual las células reaccionan ante estímulos ambientales. También son importantes en la determinación de
virulencia de cepas patogénicas. Las proteínas pueden interactuar formando un complejo o pueden transportar a otra
proteína desde el citoplasma al núcleo (en bacterias hacia el espacio extracelular) o viceversa (en el caso de las importinas
de los poros nucleares) o pueden interactuar con otra proteína para modificarla (por ejemplo, una proteína kinasa
puede fosforilar a una proteína objetivo). En definitiva, las interacciones proteína-proteína tienen una importancia
capital en prácticamente todos los procesos en una célula viva.
La técnica denominada sistema de dos híbridos o sistema del doble híbrido se utiliza para detectar interacciones entre
proteínas y ha sido especialmente útil para estudios a gran escala ya que permite analizar grandes conjuntos de proteínas
en un único experimento global. La más común de las técnicas de doble híbrido es la que se realiza en levaduras,
pero la de bacterias presenta otras ventajas (sencillez, costos, etc.) y resulta más apropiada para estudiar interacción de
proteínas procarióticas. Existen otras técnicas similares en protoplastos de plantas y células de mamíferos.
Principio
El sistema se basa en la reconstitución de la actividad de adenilato ciclasa (1) mediada por interacción entre 2 subunidades
artificialmente diseñadas. Para esto se aprovecha las características de la enzima de Bordetella pertussis (2) que
está conformada por 2 fragmentos complementarios, llamados T25 y T18 (ver Figura 1A), que no son activas cuando
están físicamente separadas (Figura 1B). Cuando estos 2 fragmentos se fusionan covalentemente a 2 polipéptidos capaces
de reconocerse entre sí (interactuantes) que llamaremos X e Y, la heterodimerización de estas proteínas de fusión
(también llamadas híbridas o quiméricas) resulta en la complementación funcional entre T25 y T18 (Figura 1C)
y, por lo tanto, en la síntesis de cAMP. El cAMP producido por la enzima quimérica reconstituida se une a la proteína
activadora por catabolito, CAP (también llamada CRP). El complejo cAMP/CAP es un regulador pleiotrópico de la
transcripción en E. coli y en particular del operón lactosa o del operón maltosa (Figura 1D) lo cual permite distinguirlas
en medios selectivos o conteniendo indicadores. Figura 1:
24

Genómica Aplicada
Verano 2012
La detección de la interacción in vivo entre 2 proteínas
de interés requiere de la co-expresión de
estas proteínas como fusiones de los fragmentos
T25 y T18 en bacterias E. coli que carecen de actividad
de adenilato ciclasa endógena por deleción
de un nucleótido del gen correspondiente (∆cya).
Esto se consigue usando 2 vectores compatibles,
uno expresando la T25 (pKT25 o pKNT25) y el
otro expresando la fusión T18 (pUT18 o pUT18C).
Las bacterias se cotransforman con 2 plásmidos
recombinantes y plaquean sobre medios con indicadores
para revelar el fenotipo Cya + (Figura 2)
resultante de complementar y así revertir la deleción del gen cromosómico. La eficiencia de complementación entre 2
proteínas híbridas se visualiza a través de la detección de actividad β-galactosidasa (entre otros métodos posibles).
Figura 2:
Este procedimiento puede escalarse y robotizarse para el
paneo (prospección) a gran escala de proteínas que puedan
interactuar con una molécula señalizadora importante, como
por ejemplo, un factor de transcripción (ver Figura 3):
Procedimiento: Células competentes de E. coli
BTH101 (cya -) serán co-transformadas con los plásmidos
anzuelo (X-pKT25) y presa (Y-pUT18). En paralelo,
se llevaran a cabo los controles indicados en la tabla
1. Los plásmidos put18-Zip y pKT25-Zip contienen
proteínas capaces de interactuar y constituyen el control positivo del sistema.
Tabla
Tubo Plasmidos
1 X-pKT25 + Y-pUT18
2 X-pKT25 + pUT18 (control -)
3 pKT25 + Y-pUT18 (control -)
4 pKT25 + pUT18 (control -)
5 pKT25-Zip + pUT18-Zip (control +)
La transformación se realizará incubando en hielo 50 μl de células
competentes con 50 ng de cada plásmido durante 30 minutos.
Luego se incubara a 42°C durante 2 minutos e inmediatamente se
resuspenderán las células en 200 μl de medio LB. Se mantendrá
la mezcla en agitación a 37°C durante 30 minutos para permitir
la expresión de la resistencia a los respectivos antibióticos. La
selección de clones dobles transformantes se llevará a cabo en
medio LB conteniendo ampicilina (100 µg/ml) y kanamicina (50 µg/ml). Además, se le agregará X-Gal (5-bromo-4chloro-3-indolyl-b-D-galactopyranoside,
40 μg/ml en dimetil formamida) e IPTG (Isopropil-1-tio-β-D-galactósido,
1mM) a dicho medio con el objetivo de poder visualizar los clones con proteínas interactuantes.
Luego de 24 hs de incubación a 37°C se medirá la afinidad de la interacción contando el número de colonias
azules crecidas en dicho medio.
Hay dos maneras de detectar los clones que presentan interacciones, uno es seleccionar en medio mínimo suplementado
con lactosa con los antibióticos y con X-gal (no es tan necesario), el otro es plaquear los transformantes en medio
LB con los antibióticos y con X-gal. El primer método tiene la ventaja de ser selectivo y solo crecen los clones donde
hay interacción (en teoría) y el segundo tiene la ventaja de ser mas rápido (las colonias aparecen antes) pero a veces
dan un poco de coloración los controles negativos.
Preguntas: a) ¿Por qué el genotipo de bacterias debe ser ∆cya?
b) En el TP, la cuantificación de la afinidad de la interacción se cuantificó, contando el número de colonias azules. Es
esto correcto ¿qué significado tiene el número obtenido? ¿cómo corregiría esta situación?
c) ¿Considera que un resultado positivo con este sistema resulta totalmente conclusivo para demostrar una interacción?
Y un resultado negativo ¿es una indicación concluyente de la falta de interacción?
d) ¿Qué otro método se le ocurre que podría servir para detectar interacción positiva entre las 2 proteínas híbridas?
e) El genotipo de la bacteria utilizada en el TP es el siguiente: E. coli BTH101 (F- cya-99, Str r ). ¿Qué significan las
siglas?
25

Genómica Aplicada
Verano 2012
Trabajo Práctico 13: Perfiles metabólicos por cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de
masas (GC-MS) en tubérculos de papa.
Diseñado y enseñado por Mariana López, Fernando Carrari y Laura Kamenetzky
Bases y principios:
Los perfiles metabólicos obtenidos por distintas técnicas de separación (cromatografía líquida –LC- y gaseosa –GCen
sus diferentes variantes) y análisis (espectrometría de masas –MS- y resonancia magnética nuclear –NMR-) están
siendo ampliamente utilizados en estudios detallados y sistemáticos, denominados “aproximación dirigida” y “no
dirigida” respectivamente (por targeted and non-targeted approaches en inglés) para la resolución de problemas en
biología vegetal (Fernie et al, 2004). La obtención de muestras biológicas para el análisis de sus perfiles metabólicos,
como cualquier otra técnica que involucre la identificación y cuantificación de metabolitos, requiere la inactivación
inmediata del metabolismo de modo de evitar efectos de su manipulación sobre el mismo. La inhibición rápida del
metabolismo se logra mediante la disminución brusca de la temperatura ( -60°C) por inmersión de las muestras en N2
líquido. A su vez, los procedimientos posteriores de extracción requieren el uso de materiales (tales como tubos plásticos
o de vidrio) de alta calidad y pureza de modo de prevenir fuentes de eventuales contaminaciones. Además, dado
que una de las aplicaciones comunes de estas técnicas es la comparación del estado metabólico de organismos frente a
perturbaciones ambientales y/o a cambios en la constitución genética de los mismos, una necesidad básica es la consideracion
de controles tanto de los materiales “per se” como de las condiciones en las que las muestras son extraídas y
procesadas. Finalmente, la aplicación de algoritmos estadísticos a los datos obtenidos requiere la determinación del
grado de variación dentro de la población de muestras a ser analizadas.
A efectos explicativos, en este trabajo práctico nos concentraremos en un ejemplo de muestreo, acondicionamiento y
extracción de tubérculos de plantas de papa (Solanum tuberosum) para la obtención y posterior análisis de perfiles
metabólicos. Los mismos serán obtenidos mediante separación de los extractos vegetales en un cromatógrafo gaseoso
(Agilent) acoplado a un espectrómetro de masas en tiempo de vuelo (LECO Pegasus III). El momento del día para el
muestreo debe ser cuidadosamente controlado. Como regla general, la mitad del periodo de luz es el más indicado
debido a que numerosos reportes en la literatura dan cuenta de los ritmos diurnos en los cambios en la composición
metabólica de plantas. El otro punto importante a tener en cuenta es el estado fenológico de las plantas y los órganos a
muestrear. Una vez que los discos de tubérculos fueron muestreados, se debe registrar la masa exacta de la muestra y
congelarla inmediatamente. Las muestras deben mantenerse a la temperatura indicada durante todo el proceso de extracción.
Para este trabajo práctico, la cantidad de tejido a procesar será de aproximadamente 120 mg (peso fresco). La
muestra debe ser homogenizada en N2 líquido, las enzimas inactivadas mediante el agregado de metanol y al mismo
tiempo deben agregarse estándares internos (en concentraciones conocidas) no presentes en la muestra a analizar. La
extracción se realiza luego, calentando la muestra a 70°C con agitación constante. Si bien este protocolo puede aplicarse
a la obtención tanto de la fase polar como apolar, a los efectos de este trabajo práctico, los pasos siguientes se
concentran en la obtención de la fase polar. Mediante un paso de extracción con agua, las alícuotas de la fase polar son
concentradas y liofilizadas para su posterior derivatización.
La derivatización consiste en la modificación de las moléculas a fin de disminuir su polaridad y permitir la volatilización
de las mismas al momento de su sepración en fase gaseosa. Existen varios métodos y reactivos derivatizantes.
Entre los más usados para esta aplicación, el MSTFA (N-metil-N-trimetilsililtrifluoroacetamida) ha demostrado ser
uno de los más reactivos en reemplazar los hidrógenos lábiles de un amplio rango de compuestos polares por grupos
sililos y el hidroxicloruro de metoxiamina es usado en un segundo paso de derivatización a fin de proteger grupos aldehídos
y cetonas de las moléculas presentes en la matriz.
Los extractos así preparados son inmediatamente inyectados en el cromatógrafo acoplado al espectrómetro de masas.
Tanto las condiciones de corrida (tiempo, rampa de temperaturas, frecuencia de captura de datos, etc) como las especificaciones
de flujo de gas y columnas cromatográficas deben ser puestas a punto para cada aplicación particular. En
este sentido, en los últimos años se dispone de softwares específicos diseñados por los fabricantes de espectrómetros
(ChromaTOF) que controlan toda la operación, así como de programas de computación especialmente diseñados que
facilitan el procesamiento posterior de los datos (Lisec et al, 2006, Luedemann et al, 2008). A su vez, la disponibilidad
de colecciones de espectros de masas en bases de datos de acceso público (ver por ejemplo: The Golm Metabolome
DataBase) permite la rápida evaluación de los datos adquiridos.
Desarrollo del Trabajo Práctico
Preparación de extractos
1) Muestras discos de tubérculos de papa de plantas crecidas en invernáculo, registrar su masa exacta y colocarlos en
tubos epp de 2 ml. Congelarlos inmediatamente en N2 líquido. NOTA: EL N2 LIQUIDO SOLO SERÁ MANIPU-
LADO POR LOS DOCENTES A CARGO.
2) Homogeneizar la muestra en mortero con N2 líquido hasta obtener un polvo fino.
3) Agregar 1,4 ml de metanol (100 %) previamente enfriado y mantenido en hielo.
4) Agregar 60 µl de ribitol (concentración stock de 0.2 mg/ml en H20 bi-destilada calidad HPLC)
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Genómica Aplicada
Verano 2012
5) Transferir el homogenato a un tubo de vidrio de 10 ml (Schott GL14).
6) Incubar el homogenato durante 15 minutos a 70°C.
7) Agregar 1,5 ml de H20 bi-destilada calidad HPLC.
8) Centrifugar 15 minutos a 4000 rpm
9) Transferir una alicuota de 200 µl a un tubo epp de 2 ml y desecar los extractos en un desecador de vacio (tipo speed
vac) con rotación durante por lo menos 8 horas (aquí termina el primer día de práctico).
10) Al retirar los tubos, inyectar Argón para desplazar el Oxígeno y cerrarlos inmediatamente para evitar posibles
reacciones.
Derivatización de los extractos
11) Agregar 60 µl del primer derivatizante (hidroxicloruro de metoxiamina) preparado inmediatamente antes de uso
(30 mg/ml disuelto en piridina). NOTA: ESTA PARTE SERÁ DEMOSTRATIVA, LOS DERIVATIZANTES
SOLO PODRÁN SER MANIPULADOS POR LOS DOCENTES A CARGO.
12) Incubar con agitación constante a 37°C durante 2 horas.
13) Agregar 120 µl del segundo derivatizantes (MSTFA: N-metil-N-trimetilsililtrifluoroacetamida)
14) Agregar 10 µl de una solución de estándares de tiempo de retención (FAMES: fatty acid methyl esters).
15) Incubar con agitación constante a 37°C durante 30 minutos.
16) Inyectar en el GC-MS.
Análisis y procesamiento de los cromatogramas. Obtención de perfiles metabólicos.
Los datos obtenidos al final del análisis en el GC-MS se encuentran en forma de cromatograma, es decir un gráfico
que representa en el eje de las ordenadas la intensidad de la corriente iónica total (TIC) o de una relación m/z definida
vs el tiempo de corrida en el eje de las abscisas. Cada cromatograma corresponde a una de las muestras analizadas y se
encuentra en archivos (.peg) que sólo pueden visualizarse utilizando el programa ChromaTOF (Leco Instruments). La
obtención de los perfiles metabólicos de cada muestra implica individualizar los picos que forman el cromatograma e
identificar a qué compuesto corresponde cada uno. Esa tarea, si bien puede hacerse a mano, se ve facilitada por la utilización
de programas de computación específica y su desarrollo constituye una de las sub-areas de los que se denomina
“metabolómica“. Existen numerosos programas que han sido utilizados para obtener perfiles metabólicos (ChromaTOF,
MassLab, etc) mediatne algoritmos diferentes, pero el software TagFinder (Luedemann et al., 2008) ha sido
específicamente desarrollado para la obtención de perfiles metabólicos vegetales en aproximaciones “no dirigidas“.
17) Análisis de los cromatogramas
El primer paso para la obtención de los perfiles metabólicos es analizar la calidad de los cromatogramas obtenidos,
corregirlos y exportalos en un formato adecuado para el análisis con el TagFinder.
En este primer paso es necesario:
17.1) Importar los archivos .peg a analizar en el programa ChromaTOF. Para ello crear una nueva carpeta (utilizar el
nombre del experimento) dentro del directorio “Acquired Samples“. Dentro de la carpeta presionar el botón derecho
del mouse y seleccionar “Import“, elegir todos los archivos a importar y abrir.
17.2) Para visualizar mejor los cromatogramas hay que procesarlos –en este momento además, se exportan en el
formato adecuado para su análisis en el TagFinder. Seleccionar todos los cromatogramas dentro de la carpeta y presionar
botón derecho del mouse, elegir la opción“process data” (se abre una ventana donde aparecen todos los archivos
marcados), aceptar (OK) y elegir “peg to cdf” en la ventana nueva que se abre (OK). Esta opción convierte los archivos
.peg en .cdf (formato de TagFinder), corrige la línea de base de los cromatogramas (baseline correction) y suaviza
el trazado de los picos.
17.3) Otra herramienta que posee el ChromaTOF y que reulta útil para evaluar la calidad de los cromatogramas, es
la visualización de los espectros de cada pico. Para ello, seleccionar nuevamente todos los cromatogramas y elegir
dentro de process data “Afe methods“. Este procesamiento no afecta los archivos que analizaremos con el TagFinder
(.cdf) sólo permite la observación de los espectros.
18) Evaluación de la calidad de los cromatogramas:
18.1) Mirar el TIC del cromatograma y algunas masas específicas de compuestos conocidos, por ejemplo azúcares
(m/z: 307, 160, 361 para fructosa, glucosa y sacarosa respectivamente), citrato (m/z: 273), ácido fosfórico (m/z: 299) u
otras. Para modificar la masa que queremos visualizar hacer click en el recuadro que dice TIC debajo del cromatograma
y escribir la o las masas de interés (pueden visualizarse varias a la vez).
18.2) Mirar la forma de los picos (tanto en TIC como para las masas específicas), estos tienen que tener aspecto de
curvas gaussiana. Aumentar con el mouse algunos picos y ver su forma. Cuando el ápice de los picos está deformado
indica que ese compuesto está saturado dentro de la muestra. En el caso en que los picos presenten formas no gausianas
(picos divididos, por ej.) eliminar estos cromatogramas del análisis.
18.3) Al hacer click sobre el trazado de un pico podemos visualizar el espectro en ese punto, los espectros que definen
cada pico son los que se encuentran en el ápice del mismo, es decir donde la intensidad es máxima.
18.4) Es necesario, además, evaluar la cantidad de ruido que tiene un cromatograma, muchas veces hay factores
ajenos a la muestra que generan demasiado ruido, dificultando la identificación de la señal verdadera. Los cromato-
27

Genómica Aplicada
Verano 2012
gramas con demasiado ruido deben ser eliminados del análisis. Para evaluar la cantidad de ruido, utilizar el valor de
m/z: 355. El valor del ruido debe verse en la zona que no presenta picos y generalmente tiene una intensidad alrededor
de 100. Recordar este valor.
18.5) Otra cosa importante a tener en cuenta son los picos de los estándares de tiempo de retención (RT): alcanos
(m/z: 85) o FAMEs (m/z: 87) (estos últimos son los usados en este TP). Estos compuestos se utilizan para calcular el
índice de retención (es decir el tiempo de retención de un compuesto dentro de la columna cromatográfica corregido o
estandarizado) de cada pico, ya que este dato es necesario a posteriori para la identificación del compuesto correspondiente.
Evaluar que todos los estándares incorporados estén presentes en el cromatograma y la forma de los picos. En
este punto también es necesario tomar nota de los tiempos de inicio y fin de cada uno de los estándares, es decir la
amplitud de la curva, y la intensidad máxima. Esta información la utilizaremos más adelante para calcular los índices
de retención (RI) de cada pico. Es importante considerar la variabilidad que existe a lo largo de la corrida, por ello es
conveniente considerar la amplitud de los picos estándares en distintos cromatogramas.
19) Procesamiento de los datos
El paso siguiente es procesar la información contenida en los cromatogramas que ahora se encuentra en forma de archivo
.cdf. Esta tarea se realiza con el programa TagFinder, brevemente este es un software desarrollado para PC que
opera en lenguaje Java creando distintos espacios de trabajo. En primer lugar el programa “busca” los picos dentro de
los archivos .cdf y convierte la información de los espectros en archivos .txt. Los datos son importados y “sincronizados”,
para ello se identifican los estándares de RT y se calcula el RI de todos los picos. Toda esta información es utilizada
por el programa para buscar “mass spectral tags” o simplemente “tags” (marcas espectrales que „parecen‟ compuestos
químicos) y generar una matriz de datos con los resultados hallados. Finalmente los tags son comparados con
bibliotecas de metabolitos para identificarlos; si bien el resultado de esta comparación lo ofrece el programa, la identificación
final de los compuestos se realiza en forma manual mediante la evaluación de los espectros. A continuación
detallamos una guía práctica de uso para el análisis de los cromatogramas obtenidos en nuestro TP; la información
teórica de los comandos utilizados, así como otras implementaciones del programa pueden consultarse en Luedemann
et al (2008).
19.1) Creación de un nuevo espacio de trabajo (workspace). Para comenzar a trabajar en el TagFinder es necesario
crear un nuevo espacio de trabajo (wsp), que defina los parámetros de nuestro análisis. Para ello crear una carpeta con
el nombre de usuario dentro de la carpeta del TagFinder.
19.2) Abrir el TagFinder, en el menú TAG FINDER, seleccionar la opción “create new workspace” (o bien presio-
nar el icono que tiene una estrellita ). Se abre un cuadro que permite definir los parámetros del nuevo espacio de
trabajo
Crear el wsp en la carpeta correspondiente a cada usuario
20) Búsqueda de picos (obtención de archivos .txt)
20.1) Dentro del wsp abierto, ir al menú TOOLS, seleccionar
“external tools” (o bien presionar el ícono que tiene el
enchufe ). Se abre un cuadro de diálogo Jar Browser seleccionar
“select Jar file”, luego elegir “tagtools” open!. Se
despliega una lista de herramientas:
Seleccionar “cdftools.PeakFinder” Run!.Pregunta si estamos
seguros Yes!
Define el número de decimales del
workspace, depende de los estándares
de RT utilizados: 0 para FAMEs, 2
para Alcanos
Define el rango de masas a analizar,
los valores 70-600 incluyen todas las
masas de interés en este tipo de análisis
Elegir el directorio donde se va a
crear el wsp, p
28

Genómica Aplicada
Verano 2012
20.2) Ahora debemos definir los parámetros con los
cuales va a realizar la búsqueda de los picos
Utilizar los valores sugeridos en el cuadro de arriba. El parámetro
más crítico en este punto es “Low Intensity Threshold”,
y está relacionado con el ruido de los cromatogramas;
si el ruido es muy bajo (>50), utilizar un valor de threshold de
50 o 100; este valor es empírico para cada caso y se obtiene
testeando distintos valores: la idea es que los archivos .txt no
sean demasiado pesados porque ralentizan muchísimo el análisis
posterior. Como norma general, cuanto menor es el valor
de threshold utilizado, mayor es el tamaño de los archivos .txt
generados (incluyen más información). Lo esperado es obtener
archivos .txt con un tamaño entre 100-300 KB.
Seleccionar en “Output Path” el directorio donde se guardan
los archivos .txt (que será el wsp donde estamos trabajando).
Presionar “Add” y seleccionar los archivos .cdf que
vamos a convertir. Finalmente OK! Esta operación demora
unos segundos, revisar el tamaño de los archivos .txt
obtenidos, de ser necesario repetir la búsqueda de picos con
nuevos parámetros!
21) Importar espectros. Una vez que los picos fueron hallados
por el programa y convertidos .txt, debemos importar la
información para poder analizarla.
21.1) En el menú TAG FINDER, seleccionar la opción
“Import” (o bien presionar el ícono ). Se abre un cuadro de diálogo donde debemos seleccionar los parámetros
para importar archivos:
Solapas
Ventana de resultados
Utilizar los valores que figuran en el cuadro de arriba; “omit fragments with intensity lower than” es el parámetro
crítico y nuevamente define los datos que serán excluidos; este valor también hace referencia al ruido de nuestros datos
y se determina en forma experimental. Para los datos generados con nuestro GC-MS, el valor de 400 dio los mejores
resultados en cuanto a tiempo de análisis y cantidad de tags detectados. Menores valores ralentizan el análisis y no
redundan en una mayor calidad ni cantidad de información. Los parámetros de tiempo se refieren al lapso de corrida
que se desea importar, los va-lores usados indican que se importa la corrida completa.
Es necesario ahora, indicar los datos que van a ser importados; presionar “File…“ y seleccionar todos los archivos .txt
generados OK! Esta operación puede demorar unos minutos, el tiempo varía en función de la cantidad de archivos
que se desea importar y el valor de “omit fragments with intensity lower than” que hayamos utilizado. El programa
genera dos archivos spectra.tf y samples.tf (en la carpeta de nuestro wsp), que serán utilizados para los análisis posteriores.
Estos archivos NO pueden renombrarse y si decidimos volver a importar los .txt, los archivos se reemplazan,
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Genómica Aplicada
Verano 2012
perdiéndose la información inicial.
22) Sincronización. En este punto toda la información de nuestras muestras está cargada en el programa. Es necesario
ahora identificar los estándares de RT, calcular los RI y finalmente realizar la búsqueda de los tags.
22.1) Búsqueda de los estándares de RT: En el menú TICALC, seleccionar “Time Standard Finder Panel”, se abrirá
una ventana nueva, con una pequeña barra de herramientas… seleccionar el icono “abrir” ( ), buscar la carpeta
“exemplary files” dentro de la carpeta TagFinder- y abrir el archivo “rt search peak picking” adecuado según el sistema
RT utlizado (FAMEs).
22.2) La lista se cargará en la ventana, esta contiene el nombre del compuesto; la información de las masas únicas de
estos compuestos (m/z: 87 o 85) y su intensidad; la escala de intensidad, los RT de inicio y final de cada pico y el valor
de RI (Time Index) de cada uno. Este último dato es utilizado para calcular los RI de todos los tags de nuestra
muestra, estandarizarlos, para luego poder compararlos con las bibliotecas de metabolitos y lograr su identificación
(esta lista puede crearla cada usuario, para más información consultar a Luedemann et al, 2008).
Ahora debemos ajustar los valores de RT e intensidad de cada pico, a los que hallamos en nuestra corrida. Para esto
necesitamos la información que tomamos cuando analizamos los cromatogramas (los tiempos e intensidades de los
estándares). Reemplazar los tiempos de la tabla por los que cada uno midió en sus cromatogramas (utilizar los menores
y mayores valores medidos para cada pico). La intensidad observada en el CromaTOF, debe ser igual al producto
entre la intensidad de la masa específica y la escala de intensidad (es decir si el pico C8:0:1000 tiene una intensidad de
100.000, entonces “intensity scale” debe ser =100, -100x1000=100.000).Es importante que la intensidad elegida corresponda
al cromatograma que tiene MENOR intensidad para ese pico, ya que el programa buscará los picos que estén
por encima del valor indicado (recuerden que debían tomar los valores a partir de varios cromatogramas). Una
vez corregida la información, el programa debe identificar los estándares en nuestros datos; de a uno por vez. Para
esto:
-seleccionar una fila (es recomendable ir en orden!) y presionar el ícono . La operación demora unos segundos y el
resultado aparece en la parte de abajo de nuestra ventana… deberíamos obtener tantos picos como muestras estemos
analizando, y encontrar TODAS las muestras. Los resultados completos pueden verse en la solapa que dice “results”
(VER FIGURA SIGUIENTE).
Si el programa identifica menos muestras, es probable que el pico faltante tenga una intensidad menor a la elegida o
esté por fuera del rango de tiempo que hemos definido. Si aparece más de un pico para cada muestra, es probable que
hayamos sido demasiado flexibles con nuestros valores. En cualquier caso, identificar en qué muestra se produjo el
error y volver a analizar ese cromatograma para identificar el problema, corregir la tabla y volver a buscar los picos,
hasta obtener el resultado esperado.
Una vez obtenidos todos los resultados, debemos volcarlos en una
nueva tabla que contiene los datos de “nuestros” estándares. Armar
primero la tabla en la solapa “Time Points”, presionando el
ícono (“Init RP set”); luego seleccionar los datos obtenidos
en la solapa “Results” y presionar , revisar que los datos se
cargaron en la tabla, mirando nuevamente la solapa “Time
Points”. Repetir TODA la operación para cada uno de los estándares.
Una vez completa toda la tabla debemos guardarla, presionar
y salvar el archive con el nombre deseado en el wsp
(usualmente elegimos “rt found peak” y el nombre del experimento).
23) Cálculo del RI: Con los datos de RT obtenidos vamos a calcular los RI. En el menú TICALC seleccionar “Time
Index Calculation”, (nos pregunta si estamos seguros: YES), y luego debemos seleccionar el archivo que acabamos de
crear rt search peak… (o el nombre que hayan elegido) OPEN! Esta operación demora unos segundos y no se genera
ningún archivo visible!
24) Anotación de las muestras
En este paso debemos poner la información sobre nuestras muestras, para que el programa las llame como nosotros
queremos. Este paso puede hacerse en este momento o antes. Es necesario generar un archivo .txt al que llamaremos
“samplelist”. Para crearlo, armar una tabla en Excel con los números de cromatogramas en la primera columna (que
llamaremos RAWNAME), número de réplica o nombre de la muestra en la columna siguiente (SAMPLETEXT) y los
pesos frescos en la última (FW expresados en gramos). Es importante no formatear este archivo y guardarlo como .txt
(texto con tabulaciones), abrirlo y borrar los espacios de más que quedan al final (esto genera errores de lectura del
archivo!).
En el menú SAMPLES, seleccionar “Sample Group Annotator” (nos pregunta si estamos seguros: YES!) se abre una
ventana, con la lista de nombres de las columnas, elegir primero RAWNAME (o el que hayamos usado para la colum-
30

Genómica Aplicada
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na 1)OK!; luego SAMPLETEXT OK!
En la parte inferior de la ventana nos dirá si la anotación de las muestras fue correcta o hubo algún error.
Para verificar los datos, seleccionar “Sample Annotator Panel” del menú SAMPLES; debe aparecer la lista que creamos
(los pesos frescos no se verán aquí, pero aparecen en la tabla final!). Si la información es correcta, salvar la tabla
presionando . Aunque no se muestre ningun mensaje, los datos se han salvado!. La anotación puede generar muchos
errores, sobre todo si se arrastran formatos del Excel en el archivo de texto; por eso es MUY recomendable hacer la
lista ANTES de empezar con el TagFinder y tenerla guardada en la carpeta que utilizaremos como wsp, verificar que
no haya espacios de más. De todos modos si no logramos anotar los archivos como queremos, el programa utiliza los
números de cromatogramas para indicar las muestras, ¡el resto de la información tendremos que volver a escribirla!
25) Búsqueda de los “tags” (Tag Finder):
Ahora realizamos la búsqueda de “tags” (o “datos espectrales”) con similitud con compuestos cuyos espectros son
conocidos. Para esto debemos definir los parámetros de búsqueda y agrupamiento de los datos. Toda la información
sobre el significado de los parámetros puede consultarse en Luedemann et al (2008).
Para definir los parámetros, seleccionar “Settings” del menú TAGFINDER, o presionar el ícono del lápiz ( ). Utilizaremos
los valores que se indican en las siguientes figuras, que surgen de experiencias previas con datos generados
en nuestro (y otros) laboratorio/s.
PARÁMETROS BUSQUEDA DE TAGS
Es el parámetro más importante en la búsqueda de
tags; define el ancho –en tiempo- de los picos. El
valor sugerido ha dado los mejores resultados en
nuestra experiencia
Número de
réplicas del
experimento
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Genómica Aplicada
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Seleccionar el directorio donde se guarda el archivo con los tags, hacerlo en el directorio del wsp; poner el nombre del
usuario con extensión .tab. Además, debe señalarse la sample list utilizada para definir las muestras.
Una vez definidos TODOS los parámetros, presionar “Apply” (se pueden salvar estos parámetros para usos posterio-
res); ir al menú TAGFINDER y seleccionar “Run” o presionar el ícono .
Ahora ya tenemos nuestra matriz de datos con todos los tags encontrados en nuestra muestra. Ahora debemos identificar
los compuestos y obtener, finalmente, la lista de metabolitos identificados.
Nombre y
ubicación
del archivo
de salida
Sample list
26) Identificación de los tags
Identificar los tags, implica comparar la información de los espectros y RI con datos de bibliotecas de metabolitos. Ir
al menú TOOLS (o ícono correspondiente) y elegir la herramienta “pbuilder.TargetFinderPane” Run!.
Se abre una nueva ventana con una nueva barra de menú:
26.1) En primer lugar debemos elegir qué biblioteca de metabolitos vamos a usar, para ello ir al menú FILE y seleccionar
“open”. Buscar al carpeta “target_search_lists” (dentro de la carpeta TagFinder) y elegir “TFLIB (Version_20070220_05)_AFE_FEMS-Alexander-PHuc.txt”,
esta es nuestra biblioteca de metabolitos, que aparecerá ahora
en la ventana del programa.
26.2) En segundo lugar debemos cargar la matriz de datos que hemos generado con todos nuestros tags (archivo .tab),
para ello ir al menú FIND TARGETS y seleccionar “Load Tags”, elegir la matriz de datos OPEN!
Por último debemos definir los parámetros de comparación, ir al menú FIND TARGETS y seleccionar “Setup Target
Finder”, aparece una nueva ventana:
Utilizar los parámetros que figuran en la figura; puede testearse primero un valor de 5 para “Min Matching Mass
Pairs” y ver cuántos resultados encuentra. Una vez definidos los parámetros presionar OK!
Ir al menú EDIT, seleccionar “Select All”, aparecerá toda la biblioteca seleccionada; ir a FIND TARGETS y seleccionar
“Find Targets” Listo!!!! El número de tags encontrados aparece en la parte inferior de la ventana. En la solapa
32

“Results” podremos ver cada metabolito y la comparación de espectros.
Ordenar la tabla que aparece arriba a la izquierda ubicando primero la columna
“select” luego “time group” y finalmente “Name analyte”; estos son los datos
que van a ocuparnos para seleccionar los metabolitos.
Ir mirando espectro por espectro (molécula por molécula), revisar los espectros
(las barras rojas corresponden al espectro de la biblioteca y las azules al de las
muestras que estamos analizando) y los tiempos esperados de salida “time expected”.
Observar que hay varias opciones de visualización de espectros, las que
superpone ambos es la más informativa. Seleccionar los metabolitos con los mejores
espectros. Luego de revisar toda la lista de metabolitos y haber selecciona-
Genómica Aplicada
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do los mejores, debemos exportarlos presionando el ícono , nombrar el archivo
como “target results” + el nombre de usuario (.txt) y guardarlo en la carpeta
del wsp. Ya tenemos nuestra lista de moléculas identificadas !
27) Perfiles metabólicos y estadística
27.1) El archivo obtenido contiene todos los datos espectrales de cada metabolito, además de una valoración de si la
comparación resulta verdadera o no; muchas veces un espectro puede parecer muy bueno, pero luego algunas de las
masas más importantes no aparecen. Entonces debemos refinar nuestro análisis.
27.2) Abrir el archivo obtenido en Excel, activar filtros para las columnas y seleccionar aquellos metabolitos con
“true” para las columnas A y B; trabajaremos sobre estos metabolitos. Y vamos a centrarnos en las columnas D
(Analyte name), P (tag mass) y W (time group).
27.3) Como puede observarse el nombre de cada metabolito esta repetido muchas veces asociado a un mismo time
group, pero con distintas tag mass; esto representa las masas seleccionadas como “específicas” para ese metabolito.
Para cuantificarlo debemos elegir sólo una masa y para ello vamos a utilizar la tabla que les entregará el docente, con
las masas que se utilizan para este fin. Pero además vamos a verificar que las intensidades de las distintas masas correlacionan
(haciendo gráficos de dispersión), asegurándonos que se trata de un metabolito y que no hay contaminación o
co-elución de compuestos (si esto sucediera, y no existen masas únicas para cada metabolito, el o los compuestos no
pueden ser cuantificados y deben eliminarse del análisis).
27.4) Si algún metabolito aparece en más de un time group, debemos evaluar el tiempo de salida y su espectro (volviendo
al TagFinder; en esta parte del análisis es recomendable tener el TagFinder abierto como lo dejamos al final del
punto v) y seleccionar el mejor.
27.5) Debemos ubicar el estándar interno “Ribitol” (que usaremos para standarizar los datos) y seleccionar la masa
319.
27.6) Una vez que seleccionamos todas las masas, de todos los metabolitos y eliminamos aquellos que no podemos
analizar; procedemos a estandarizar los datos. Copiar las masas seleccionadas en una nueva hoja (dejar sólo los nom-
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bres de los metabolitos y sus intensidades); copiar los datos de cada muestra (los pesos frescos deberían aparecer debajo
del número de muestra) y ubicar los datos del ribitol en la primera fila. La estandarización se realiza: dividiendo el
valor de intensidad de cada metabolito por la intensidad del ribitol y multiplicando por el peso fresco de la muestra
(valor estandarizado = intensidad/int. Ribitol/ FW).
27.7) Una vez que todos los valores han sido estandarizados, se procede al análisis estadístico de los datos, calculando
la media y desviación estándar para cada muestra, y relativizando el nivel de cada metabolito al control. Recordar que
la aproximación propuesta en este trabajo NO permite la cuantificación absoluta de los compuestos, sino relativa al
control. Para obtener valores absolutos, es necesario realizar una curva patrón –con concentraciones conocidas del/los
compuesto/s que se desea cuantificar.
27.8) Finalmente puede utilizarse algún estadístico (una prueba de comparación de punto a punto --un test de Student-
) para evaluar las diferencias entre el control y las muestras.
Bibliografia recomendada:
Carrari F, Baxter C, Usadel B, Urbanczyk-Wochniak E, Zanor MI, Nunes-Nesi A, Nikiforova V, Centeno D, Ratzka A, Pauly M, Sweetlove
L, Fernie AR. 2006. Integrated Analysis of Metabolite and Transcript Levels Reveals the Metabolic Shifts that Underlie Tomato Fruit Development
and Highlight Regulatory Aspects of Metabolic Network Behavior. Plant Physiology 142(4):1380-1396.
Fernie AR, Trethewey RN, Krotzky AJ and Willmitzer L. (2004). Metabolite profiling: from diagnostics to systems biology. Nature Reviews
Molecular Cell Biology 5: 1-7.
Lisec J, Schauer N, Kopka J, Willmitzer L, Fernie AR. (2006). Gas chromatography mass spectrometry–based metabolite profiling in plants.
Nature Protocols 1: 387-396.
Luedemann A, Strassburg K, Erban A, Kopka J (2008) TagFinder for the quantitative analysis of gas chromatography - mass spectrometry
(GC-MS) based metabolite profiling experiments. Bioinformatics 24:732–737
Schauer N, Semel Y, Roessner U, Gur A, Balbo I, Carrari F, Pleban T, Perez-Melis A, Bruedigam C, Kopka J, Willmitzer L, Zamir D,.
Fernie AR. 2006. Comprehensive metabolic profiling and phenotyping of interspecific introgression lines for tomato improvement. Nature Biotechnology
24(4): 447-454
Trabajo Práctico 13: Hacia la biología de sistemas: integración de datos transcriptómicos y metabólicos para
el estudio de rutas metabólicas mediante redes neuronales
Docentes: Laura Kamenetzky y Mariana López Diseñado por. Laura Kamenetzky
Introducción
La gran cantidad de datos que se generan con las tecnologías “ómicas” requiere contar con herramientas para la integración
y análisis de datos heterogéneos (genómicos, transcriptómicos, metabolómicos, fenotípicos, fenómicos,
entre otros). La correlación resultante de la integración de este tipo de datos se interpreta, desde un punto de vista biológico,
como una regulación coordinada entre elementos de diferente origen (por ej transcriptos y metabolitos). Para la
integración se utilizan métodos de agrupamiento (clustering) donde se exploran los datos desde el punto de vista de la
existencia o no de relaciones y éstos se clasifican en clases. Existen diversos métodos de agrupamiento aplicables en el
área biológica, uno de los más usados es el agrupamiento jerárquico (hierarchical cluster, HC). Con este método los
resultados son representados en forma de dendograma que muestra las relaciones entre los datos generados por una
matriz de distancia. En cambio, para resultados obtenidos con algoritmos de tipo no-jerárquico, se calculan primero
las distancias a partir de un número predeterminado de grupos y luego se van colocando de forma iterativa los datos en
los diferentes grupos hasta minimizar la dispersión interna de cada uno. El algoritmo más representativo de este tipo
de agrupación es el de k-media. Para mejorar el desempeño de los algoritmos mencionados, se ha propuesto otro tipo
de métodos como son los basados en técnicas de inteligencia computacional y en particular las redes neuronales artificiales
del tipo mapas autoorganizativos (SOM del ingles Self-Organizing Maps) (Kohonen, 1982). Estos métodos han
probado ser adecuados para manejar grandes dimensiones como las que se generan a partir de un alto volumen de datos
y evidenciar, al mismo tiempo, patrones de relaciones ocultas en los datos (Hiraí el al., 2004). Especialmente en
cuanto a la integración de datos de diferentes tipos, recientemente se ha propuesto un modelo para la agrupación y
visualización de transcriptos y metabolitos en frutos de tomate de diferentes líneas de introgresión (IL) (Stegmayer et
al., 2009). Asimismo se ha desarrollado un software (Milone et al., 2010) que permite utilizar este modelo facilitando
la obtención de clusters (o neuronas) y a su vez permite visualizar los agrupamientos de manera de extraer la máxima
información de este tipo de datos (anotación de genes, rutas metabólicas, entre otros).
En este trabajo práctico se emplearán como datos de entrada los perfiles transcripcionales y metabólicos obtenidos
a partir de frutos de tomate de 21 líneas de introgresión (IL). Las ILs fueron obtenidas utilizando como parentales a la
especie cultivada Solanum lycopersicum y la especie silvestre Solanum pennelli (Eshed and Zamir, 1995). Estas ILs
contienen, en homocigosis, un segmento de cromosoma de la especie silvestre en el fondo genético de la especie cultivada.
Si se comparan estas líneas con el parental puede inferirse que los cambios son producto de la región introgresada.
Los perfiles metabólicos se obtuvieron mediante la técnica de GC-MS. Los datos de expresión de genes se obtuvieron
del laboratorio colaborador del Dr. Jim Giovanonni (Boyce Thompson Institute) utilizando la plataforma de TOM2
(http://ted.bti.cornell.edu/cgi-bin/TFGD/array/array_fabrication.cgi) que consiste en microarreglos de 12860 clones
EST que representan ~8,500 loci independientes de tomate. Los datos fueron filtrados por calidad de cada spot siguiendo
la metodología propuesta por Polanski and Kimmel (2007).
Objetivo
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Genómica Aplicada
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Aprender a usar una herramienta bioinformática que sirva para integrar y ayudar a interpretar biológicamente los datos
generados por las X-ómicas. En este ejemplo, los datos de transcriptómica y los de metabolómica provienen de frutos
de tomate de una población de líneas introgresadas caracterizada genéticamente.
Desarrollo del trabajo práctico
Instalación del software.
El software de integración de datos OmeSom v2.0 corre bajo otro programa. Seguir las instrucciones de instalación
siguientes:
1) Se utilizará el programa MATLAB en versión académica, ver (7). Las instrucciones de instalación y uso se resumen
en esta guía. Si desean ver información detallada del MATLAB se puede bajar un manual del programa desde (8).
Luego de arrancar el programa setup aparece una ventana para elegir la forma de instalación:
En la opcion “custom” desmarcar todo, dejar solo:
-Matlab Distributed……
-Matlab …
-Bioinformatics Toolbox
-Signal Processing toolbox
-Neural Networktoolbox
-Statistics toolbox
Copiar las carpetas de uso provistas por los docentes del omeSOM en la carpeta MATLAB.
Uso del software
1) Abrir el programa MATLAB (doble click en el icono)
2) En el panel escibir: c:\archivosdeprograma\MATLAB\omesom….. (directorio de uso del MATLAB)
3) Se habilita un cursor en la ventana “COMMAND WINDOW”, escribir: >>omesom
4) Desplegar la ventana del menu IL-SOM model
Abrir la solapa IL-SOM Model, clickear en “Create”
Seleccionar el file omesom….data
[Este file contiene los datos normalizados y relativizados al parental control (S. lycopersicum cultivado) de todos los
metabolitos y transcriptos detectados. En total son 1159 transcriptos y 70 metabolitos provenientes de 21 ILs.]
Aparece en la pantalla:
4.1) Elegir un mapa de dimensión 10 y la opción “patrones invertidos” (CLICKEAR DIRECTAMENTE OK). Que
significa esta opción para este tipo de datos. ¿Por qué es interesante analizarlos?
En la región inferior de la pantalla aparece el tiempo de ejecución “Training” en el panel de abajo a la derecha
Training: 0/ 30 s
Training: 1/ 39 s
Training: 1/ 43 s
……………………..
Training: 51/ 51 s
Cuando termina aparece la opción neighborhood [press Enter for 0]:
Apretar Enter
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Observar el mapa y verficar si tiene el mismo patron que el de la figura 1.
Repetir el procedimiento para un mapa de dimensión 30 (NO PONER EL NRO CLICKEAR DIRECTAMENTE EN-
TER).
¿Es esta imagen de mapa igual a la anterior. ¿Por qué?
#7
10x10
Figura 1. Mapa SOM obtenidos con los perfiles transcripcionales y metabólicos de 21 IL. Los recuadros negros indican cluster con
meabolitos y transcriptos Los rojos con transcriptos. Los azules con metabolitos. Los blancos son vacíos. El tamaño del recuadro
del color indica la cantidad de componentes agrupados. A mayor tamaño mayor cantidad de componentes. Se indica con una flecha
la neurona 7
5) En la región superior de la pantalla clickear “select neuron”
5.1) Aparece un cursor en forma de cruz, direccionar el centro de la cruz
sobre la neurona 7 (indicada en la figura 1). Registrar de que color es la neurona, anotar el código de los transcriptos
y metabolitos que co-varian en esa neurona. (figura 2)
Patrón de variación global
Neurona integradora
Link a proyecto
genoma
30x30
Patrón de
variación
particular
Figura 2. Arriba a la derecha: Perfil de intensidad o expresión de metabolitos y transcriptos. En el eje x se muestran los códigos de
las ILs en el eje y el nivel de cada componente relativo al control (S. lycopersicum cultivado). El recuadro de la derecha indica el
código de colores de la curva de cada transcripto (LE) o metabolito graficado. INV: los valores fueron tomados invertidos respecto
a los datos originales. Abajo a la derecha: Pefil de expresión del transcripto LE9H17. Se muestran los niveles desnormalizados
(eje y) y las ILs (eje x). Los círculos rojos indican inconsistencia entre los valores de las réplicas, los círculos verdes indican valores
aumentados o disminuidos respecto a la media +/- 3 SD de ese cluster.
36

6) Clickear sobre el nombre del primer componente,
observar el gráfico detallado de ese componente.
6.1) Registrar qué ILs tienen aumentado o disminuido
el nivel. Hacer lo mismo para cada
componente de la neurona 7.
6.2) Registrar la primer anotación que surge de
cada metabolito o transcripto en la ventana
inferior del omeSOM.
7) Abrir la solapa “Search pattern”. Buscar alguno
de los componentes de la neurona 7 por nombre
del metabolito y por nombre del transcriptos.
7.1) Registrar en qué neurona están localizados
los componentes, es más de una? Por qué?
Cerrar el *omesom (cerrando el MATLAB se
cierra todo)
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8) Abrir un navegador y pegar el URL obtenido en 7) para uno de los metabolitos
8.1) registrar en qué via metabólica está involucrado el componente. Repetir el procedimiento para todos los
metabolitos de la neurona 7.
9) Ir al sitio: http://www.genome.jp
Seleccionar en el casillero “search” la base de datos “Chemical reaction: KEGG ENZYME”. Copiar la descripción del
trancripto, por ej (para LE9H17): glutathione S-transferase. Aparece en la pantalla:
Clickear sobre el
código EC de la
enzima. Aparece
una descripción
detallada de la misma.
Clickear sobre
el primer código de
la seccion Pathway (ec00480). Aparece la via metabólica donde está involucrada la enzima:
9.1) Observar si algún paso de esta vía se
encuentra relacionada con alguna vía registrada
en 9.1) repetir el procedimiento para
todos los transcriptos de la neurona 7
10) Observar qué ILs son las que presentan
alterados los metabolitos y transcriptos.
¿Podría elegir alguna IL que muestre covariacion
entre componentes de una misma
vía? ¿Cuál?
Cuestionario:
1) ¿Qué limitaciones tiene esta aproximación
experimental en cuanto a las conclusiones que
se deducen después de establecer las asociaciones?
2) ¿Qué información previa y tecnologías establecidas
se requieren para utilizar esta herramienta?
¿Se requiere, por ejemplo, que los
genomas de las especies analizadas estén totalmente
secuenciados?
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Genómica Aplicada
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3) ¿Cuál es la ventaja de utilizar esta aproximación utilizando redes neuronales respecto a los métodos jerárquicos
(HC) y otros no jerárquicos (k-medias)?
Bibliografía y citas:
1- Kohonen, T. (1982). Self-organized Formation of Topologically Correct Feature Maps. Biological. Cybernetics, 43: 59–69.
2- Hirai, M., Klein, M., Fujikawa, Y., Yano, M., Goodenowe, D., & Yamazaki, Y. (2005). Elucidation of Gene-to-Gene and Metabolite-to-Gene
Networks in Arabidopsis by Integration of Metabolomics and Transcriptomics. The Journal of Biological Chemistry,
280: 25590–25595.
3- Stegmayer, G., Milone, D., Kamenetzky, L., Lopez, M., & Carrari, F. (2009). Neural Network Model for Integration and Visualization
of Introgressed Genome and Metabolite Data. In Internacional Joint Conference on Neural Networks Proceedings: 2983-
2989.
4- Milone D., Stegmayer, G., Kamenetzky, L., López, M., Lee, J.M., Giovannoni, J.J., Carrari, F,. (2010). *omeSOM: a software
for integration, clustering and visualization of transcriptional and metabolite data mined from interspecific crosses of crop plants.
BMC Bioinformatics, 11: 438.
5- Eshed, Y. and Zamir, D.(1995) An Introgression Line Population of Lycopersicon pennellii in the Cultivated Tomato Enables
the Identification and Fine Mapping of Yield-Associated QTL. Genetics, 141:1147-1162
6- Polanski, A., and Kimmel, M. (2007). Bioinformatics. New York: Springer-Verlag.
7- http://www.mathworks.com/programs/academia/eval.html
8- http://mat21.etsii.upm.es/ayudainf/aprendainf/Matlab70/matlab70primero.pdf
Algunas Reglas Básicas de Higiene y Seguridad en Laboratorios
Las medidas de Seguridad en Laboratorios son un conjunto de medidas preventivas destinadas a proteger la salud de los que allí se desempeñan
frente a los riesgos propios derivados de la actividad, para evitar accidentes y contaminaciones tanto dentro de su ámbito de trabajo, como hacia
el exterior.
Las reglas básicas aquí indicadas son un conjunto de prácticas de sentido común realizadas en forma rutinaria.
El elemento clave es la actitud proactiva hacia la seguridad y la información que permita reconocer y combatir los riesgos presentes en el laboratorio.
Será fundamental la realización meticulosa de cada técnica, pues ninguna medida, ni siquiera un equipo excelente puede sustituir el orden y
el cuidado con que se trabaja.
1. Se deberá conocer la ubicación de los elementos de seguridad en el lugar de trabajo, tales como: matafuegos, salidas de emergencia, mantas
ignífugas, lavaojos, gabinete para contener derrames, accionar alarmas, etc.
2. No se permitirá comer, beber, fumar o maquillarse.
3. No se deberán guardar alimentos en el laboratorio, ni en las heladeras que contengan drogas.
4. Se deberá utilizar vestimenta apropiada para realizar trabajos de laboratorio y cabello recogido (guardapolvo preferentemente de algodón y
de mangas largas, zapatos cerrados, evitando el uso de accesorios colgantes).
5. Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada persona es responsable directa de la zona que le ha sido asignada y de todos los
lugares comunes.
6. Las manos deben lavarse cuidadosamente después de cualquier manipulación de laboratorio y antes de retirarse del mismo.
7. Se deberán utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias química o material biológico. Toda persona cuyos guantes se
encuentren contaminados no deberá tocar objetos, ni superficies, tales como: teléfono, lapiceras, manijas de cajones o puertas, cuadernos, etc.
8. No se permitirá pipetear con la boca.
9. No se permitirá correr en los laboratorios.
10. Siempre que sea necesario proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos se utilizarán anteojos de seguridad, viseras o pantallas faciales
u otros dispositivos de protección. Cuando se manipulen productos químicos que emitan vapores o puedan provocar proyecciones, se evitará
el uso de lentes de contacto.
11. No se deben bloquear las rutas de escape o pasillos con equipos, máquinas u otros elementos que entorpezcan la correcta circulación.
12. Todo material corrosivo, tóxico, inflamable, oxidante, radiactivo, explosivo o nocivo deberá estar adecuadamente etiquetado.
13. No se permitirán instalaciones eléctricas precarias o provisorias. Se dará aviso inmediato a la Secretaría Técnica en caso de filtraciones o
goteras que puedan afectar las instalaciones o equipos y puedan provocar incendios por cortocircuitos (Interno 355).
14. Se requerirá el uso de mascarillas descartables cuando exista riesgo de producción de aerosoles (mezcla de partículas en medio líquido) o
polvos, durante operaciones de pesada de sustancias tóxicas o biopatógenas, apertura de recipientes con cultivos después de agitación, etc.
15. Las prácticas que produzcan gases, vapores, humos o partículas, aquellas que pueden ser riesgosas por inhalación deben llevarse a cabo bajo
campana.
16. Se deberá verificar la ausencia de vapores inflamables antes de encender una fuente de ignición. No se operará con materiales inflamables o
solventes sobre llamas directa o cerca de las mismas. Para calentamiento, sólo se utilizarán resistencias eléctricas o planchas calefactoras blindadas.
Se prestará especial atención al punto de inflamación y de autoignición del producto.
17. El material de vidrio roto no se depositará con los residuos comunes. Será conveniente ubicarlo en cajas resistentes, envuelto en papel y
dentro de bolsas plásticas. El que sea necesario reparar se entregará limpio al taller.
18. Será necesario que todo recipiente que hubiera contenido material inflamable, y deba ser descartado sea vaciado totalmente, escurrido, enjuagado
con un solvente apropiado y luego con agua varias veces.
19. Está prohibido descartar líquidos inflamables o tóxicos o corrosivos o material biológico por los desagües de las piletas, sanitarios o recientes
comunes para residuos. En cada caso se deberán seguir los procedimientos establecidos para la gestión de residuos. Consultar al Servicio de
Higiene y Seguridad (Interno 275).
20. Cuando sea necesario manipular grandes cantidades de materiales inflamables (más de 5 litros.) deberá tenerse a mano un extintor apropiado
para el material en cuestión.
21. Cuando se trasvase material combustible o inflamable de un tambor a un recipiente más pequeño, realice una conexión con una cadena del
tambor a tierra y con otra entre el tambor y el recipiente de manera de igualar potenciales y eliminar la posible carga estática.
22. Al almacenar sustancias químicas considere que hay cierto número de ellas que son incompatibles pues almacenadas juntas pueden dar lugar
a reacciones peligrosas. Ante dudas consultar al Servicio de Higiene y Seguridad (Interno 275).
23. No almacene en estantes sobre mesadas sustancias corrosivas, hágalo en estantes bajo mesadas y en caso de ácidos o álcalis concentrados
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Genómica Aplicada
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(mayor de 2N) deben ser mantenidas dentro de lo posible en bandejas de material adecuado.
24. Los cilindros de gases comprimidos y licuados deben asegurarse en posición vertical con pinzas, grampas y correas o cadenas a la pared en
sitios de poca circulación, protegidos de la humedad y fuentes de calor, de ser posible en el exterior.
25. Los laboratorios contarán con un botiquín de primeros auxilios con los elementos indispensables para atender casos de emergencia.
26. Se informará al Dpto. de Seguridad y Control cuando se necesiten dejar equipos funcionando en ausencia del personal del laboratorio.
27. Se anotará en un lugar visible desde el exterior los teléfonos de los responsables de cada laboratorio para que puedan ser consultados en caso
de alguna anomalía verificada por el personal de Seguridad y Control en su recorrida fuera de los horarios habituales de trabajo.
Procedimientos ante emergencias
Emergencias médicas
Si ocurre una emergencia tal como: cortes o abrasiones, quemaduras o ingestión accidental de algún producto químico, tóxico o peligroso, se
deberá proceder :
1. A los accidentados se les proveerán los primeros auxilios.
2. Simultáneamente se tomará contacto con el Servicio Médico (Interno 482), o al Servicio Médico de Deportes (784-4351 / 3948)
3. Avise al Jefe de Laboratorio o autoridad del Departamento, quienes solicitarán asistencia de la Secretaría Técnica (interno 380) para que
envíen personal del Dpto. de Mantenimiento, Seguridad y Control o Servicios Generales según correspondan.
4. El Jefe de Departamento notificará el accidente al Servicio de Higiene y Seguridad para su evaluación e informe, donde se determinarán las
causas y se elaborarán las propuestas para modificar dichas causas y evitar futuras repeticiones.
Centros para requerir ayuda médica: S.A.M.E. Teléfono 107
Hospital Pirovano Av. Monroe 3555 Tel. 4542-5552 / 9279
INTOXICACIONES:
Hospital de Niños. Dr. R. Gutiérrez
Sánchez de Bustamante 1399. Capital Federal. Tel: 4962-6666.
Hospital de Niños. Dr. P. de Elizalde Av. Montes de Oca 40 Tel. 4307-7491 Toxicología 4300-2115
QUEMADURAS :
Hospital de Quemados P. Goyena 369 Tel. 4923-4082 / 3022
OFTALMOLOGÍA
Hospital Santa Lucía San Juan 2021 Tel. 4941-7077
Hospital Dr. P. Lagleyze Av. Juan B. Justo 4151 Tel 4581-0645/ 2792
Incendio
1. Mantenga la calma. Lo mas importante es ponerse a salvo y dar aviso a los demás.
2. Si hay alarma, acciónela. Si no grite para alertar al resto.
3. Se dará aviso inmediatamente al Dpto. de Seguridad y Control (Interno 311) informando el lugar y las características del siniestro.
4. Si el fuego es pequeño y sabe utilizar un extintor, úselo. Si el fuego es de consideración, no se arriesgue y manteniendo la calma ponga en
marcha el plan de evacuación.
5. Si debe evacuar el sector apague los equipos eléctricos y cierre las llaves de gas y ventanas.
6. Evacúe la zona por la ruta asignada.
7. No corra, camine rápido, cerrando a su paso la mayor cantidad de puertas. No utilice ascensores. Descienda siempre que sea posible.
8. No lleve consigo objetos, pueden entorpecer su salida.
9. Si pudo salir por ninguna causa vuelva a entrar. Deje que los equipos especializados se encarguen.
Teléfonos útiles
BOMBEROS Teléfono 100
DIV.CENTRAL ALARMA: 3812222/3832222/3042222
CUARTEL V DE BELGRANO:
Obligado 2254 Capital Tel. 783-2222
BOMBEROS DE VICENTE LÓPEZ
Av. Maipú 1669 Vicente López. Tel. 795-2222
BOMBEROS DE SAN ISIDRO:
Santa Fe 650 Martínez. Tel. 747-2222
Derrame de productos químicos
1. Atender a cualquier persona que pueda haber sido afectada.
2. Notificar a las personas que se encuentren en las áreas cercanas acerca del derrame. Coloque la cinta de demarcación para advertir el peligro.
3. Evacuar a toda persona no esencial del área del derrame.
4. Si el derrame es de material inflamable, apagar las fuentes de ignición, y las fuentes de calor.
5. Evite respirar los vapores del material derramado, si es necesario utilizar una máscara respiratoria con filtros apropiados al tipo de derrame.
6. Ventilar la zona.
7. Utilizar los elementos de protección personal tales como equipo de ropa resistente a ácidos, bases y solventes orgánicos y guantes.
8. Confinar o contener el derrame, evitando que se extienda. Para ello extender los cordones en el contorno del derrame.
9. Luego absorber con los paños sobre el derrame.
10. Deje actuar y luego recoger con pala y colocar el residuo en la bolsa roja y ciérrela.
11. Comuníquese con el Servicio de Higiene y Seguridad para disponer la bolsa con los residuos.
12. Si el derrame es de algún elemento muy volátil deje dentro de la campana hasta que lo retire para su disposición.
13. Lave el área del derrame con agua y jabón. Seque bien.
14. Cuidadosamente retire y limpie todos los elementos que puedan haber sido salpicados por el derrame.
15. Lave los guantes, la máscara y ropa.
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CUPÓN PARA ENTREGAR AL DOCENTE
Fecha:
El/La alumno/a ...............................................
de la materia GENÓMICA APLICADA ha leído minuciosamente la guía de Normas Míninas de Seguridad
que acompaña esta guía.
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