BASES MOLECULARES DEL DOLOR NEUROPÁTICO: UNA ...

BASES MOLECULARES DEL DOLOR NEUROPÁTICO: UNA
APROXIMACIÓN INTEGRADA PARA EL ANÁLISIS DEL
GRUPO III DE LOS RECEPTORES METABOTRÓPICOS DE
GLUTAMATO
Investigadores principales:
Dr. Jesús Giraldo Arjonilla
Institut de Neurociències. Facultat de Medicina. UAB
Dr. Jean Philippe Pin
Institut de Génomique Fonctionnelle. U. Montpellier
Dr. Amadeu Llebaria Soldevila
Institut de Química Avançada de Catalunya
Dr. Joaquim Ariño Carmona
Facultat de Veterinària. UAB
Duración: 3 años
1

1. Resumen
La neurotransmisión del glutamato desempeña funciones fundamentales en
el sistema nervioso central. El glutamato actúa sobre los receptores
ionotrópicos y los metabotrópicos (mGluR), los últimos acoplados a
proteínas G. Los mGluR son dianas excelentes para el desarrollo
farmacológico, puesto que modulan, ya sea presinápticamente como
postsinápticamente, la transmisión glutamatérgica. Hallazgos recientes
indican que un grupo de los mGluR (especialmente el mGluR4 y el mGluR7)
tiene efectos beneficiosos en los dolores neuropáticos e inflamatorios. Sin
embargo, se han identificado hasta ahora muy pocos compuestos que
actúen sobre estos receptores. Es por ello que el objetivo de este proyecto
es identificar nuevos compuestos que activen o modulen estos receptores y
evaluar su potencial terapéutico.
Este proyecto ha sido llevado a cabo por 4 equipos, el primero de los cuales
está formado por dos subequipos: 1a) un farmacólogo molecular,
responsable de la puesta a punto de ensayos funcionales basados en BRET
y FRET y la caracterización farmacológica de los compuestos y 1b) un
experto en el estudio fundamental y clínico del dolor, responsable de las
pruebas de eficacia terapéutica de los compuestos seleccionados; 2) un
químico, que ha generado una biblioteca de análogos usando química
combinatoria; 3) un biólogo molecular especialista en levadura, que ha
trabajado en la puesta en marcha de un sistema de análisis basado en la
expresión de estos receptores en levadura, y 4) un bioinformático, que ha
generado modelos de los compuestos en sus centros de unión para el
cribado in silico y el diseño de fármacos.
Este programa ha producido una generación de ensayos nuevos y originales
para identificar compuestos activos en mGluR, lo cual producirá información
novedosa importante sobre los mecanismos de acción de varios tipos de
moléculas actuando en estos receptores y ha identificado nuevos
compuestos actuando en mGluR4 con acciones beneficiosas en dolor
crónico.
2

2. Resultados
Subproyecto I. Farmacología de los ligandos del grupo III de los
receptores metabotrópicos de glutamato
1) Establecimiento de ensayos funcionales
El primer paso de nuestro proyecto fue poner a punto un ensayo funcional
robusto y eficiente para cribar los moduladores alostéricos positivos (PAM)
de los mGluR. Con este objetivo, decidimos usar una versión truncada del
receptor mGlu4. Nuestro equipo mostró previamente que, mientras la
mayoría de PAM carece de actividad agonista intrínseca en el receptor
nativo de longitud completa, los mGluR truncados son activados
directamente por PAM. Optimizamos la construcción del mGluR4 truncado
en términos de su expresión en la superficie celular y generamos líneas
celulares estables expresando este receptor modificado. Luego, usamos
conjuntamente una proteína G quimérica optimizada que permite que un
receptor acoplado a la proteína Gi active la cascada de señalización
PLC/IP3/Ca. Ciertamente, nosotros y otros hemos mostrado que ensayos
midiendo la vía PLC son más fácilmente manipulables y dan resultados más
rigurosos que las medidas clásicas de la inhibición de la actividad del
adenilato-ciclasa activada por forskolina y, además, la farmacología de los
receptores no es alterada. Finalmente, hemos establecido que el ensayo
funcional mejor adaptado para los mGluR4 truncados y la proteína G
quimérica es un ensayo basado en FRET que mide la producción de IP. Este
ensayo fue usado para cribar los PAM de mGluR4.
2) Caracterización farmacológica de nuevos ligandos activos en los mGluR
del grupo III
Uno de los objetivos de este proyecto de colaboración era el descubrimiento
de nuevos PAM del mGluR4 y la elucidación de su mecanismo de acción.
Con esta finalidad, cribamos las bibliotecas de PAM generadas mediante
química combinatoria por el equipo 2 usando un PAM prototípico,
VU0155041 (véase la figura 1) como compuesto cabeza de serie. Una
primera parte de este trabajo nos permitió identificar el enantiómero activo
de este compuesto (Christov et al., Chem Med Chem, 2011). En total,
3

fueron ensayados 115 posibles PAM de mGluR4, correspondientes a siete
series diferentes. Esto nos permitió realizar un estudio de relaciones
estructura-actividad (SAR) de PAM de mGluR4. Los datos fueron usados por
el equipo 4 para el modelado matemático y la construcción de un modelo
3D del dominio transmembrana del mGluR4. Estamos usando este modelo
3D para el acoplamiento in silico en combinación con mutagénesis dirigida
para identificar el centro de unión de los PAM de mGluR4. Aunque ha
finalizado ya el período de financiación del proyecto, este trabajo sigue en
curso. Los resultados hasta la fecha son de gran interés y este trabajo
debería permitirnos entender el modo de unión de los PAM en este receptor.
Esta información, a su vez, debería ser de gran interés para el desarrollo
futuro de PAM selectivos de mGluR4.
3) Validación del mGluR4 como una diana terapéutica de interés en dolor
crónico
Al comienzo de este proyecto de colaboración, teníamos resultados
preliminares que mostraban que la activación de los mGluR del grupo III
inhibe la hiperalgesia observada en modelos animales de dolor inflamatorio
y neuropático. En aquel entonces, la identidad del subtipo de receptor
implicado en la modulación de la percepción del dolor (mGluR4, 7 u 8) era
desconocida. Ahora tenemos una serie de argumentos que subrayan el
papel importante y específico del mGluR4 en esta regulación. Primero,
hemos observado por inmunofluorescencia que el mGluR4 se expresa en el
asta dorsal de la médula espinal, que es una localización fundamental para
la regulación de la percepción del dolor. Es remarcable señalar que usando
agentes farmacológicos (PAM o agonistas) que activaban el mGluR4 se
suprime la hiperalgesia en modelos de dolor neuropático o inflamatorio,
similarmente a lo que ocurre con agonistas no selectivos de mGluR del
grupo III tales como ACPT-I. Más aún, hay una pérdida significativa de
antihiperalgesia, tanto de agonistas selectivos de mGluR4, como agonistas
del grupo III no selectivos en animales pretratados con oligonucleótidos
antisentido selectivos que regulan negativamente el mGluR4. Finalmente,
hay una pérdida completa de antihiperalgesia inducida por agonistas de
mGluR4 selectivos o agonistas del grupo III no selectivos en ratones KO de
4

mGluR4. Es importan señalar que la electrofisiología sobre cortes de médula
espinal ha revelado que la activación de mGluR4 por agonistas selectivos
modula negativamente la neurotransmisión en cortes de animales sanos y
que este efecto mejora en tejidos de animales inflamados. En su conjunto,
estos resultados muestran una tendencia a validar el mGluR4 como una
diana de interés para el tratamiento del dolor inflamatorio o neuropático.
Subproyecto II. Síntesis de bibliotecas combinatorias
El diseño de los nuevos compuestos ha resultado en varias series dirigidas
al mGluR4 y basadas principalmente en la estructura del PAM de referencia
VU0155041 (figura 1). Hemos empleado para la síntesis una aproximación
modular con un espaciador amida uniendo dos anillos que pueden ser
aromáticos o alifáticos. De esta manera creemos que la correlación de la
actividad con la estructura química de los compuestos y la mejora de las
propiedades de los mismos en sucesivas generaciones serán más directa.
Usando esta aproximación hemos obtenido unos dos centenares de
compuestos combinando un ácido con una amina. Estos compuestos han
sido probados, pero ninguno ha mejorado la potencia del compuesto de
partida.
Hemos tenido éxito en la síntesis de los enantiómeros de VU0155041.
También hemos sintetizado y ensayado los diasterómeros racémicos cis y
trans (VU0155040) (véase la figura 1 para detalles estructurales).
5

Figura 1. Estructuras moleculares de los enantiómeros de los diasterómeros cis VU0155041
(rac-2) y trans VU0155040 (rac-3) del compuesto padre VU0003423.
La síntesis se describe en el esquema 1.
Esquema 1. Síntesis de los enantiómeros de VU0155041. Los detalles de la síntesis pueden
encontrarse en Christov et al., Chem Med Chem, 2011, 6, 131-40.
Cuando se ensayaron en el receptor mGluR4 por el equipo 1, el
enantiómero (1R, 2S)-2 demostró ser más activo que el (1S, 2R)-2, que en
nuestro ensayo fue prácticamente inactivo en la figura 2 (Christov et al.,
6

Chem Med Chem, 2011, 6, 131-40). El enantiómero activo es un PAM de
este receptor. El compuesto racémico cis (rac-2) es también un PAM,
aunque menos potente que el enantiómero activo, de acuerdo con la
actividad medida para los enantiómeros individuales. El compuesto trans
racémico (rac-3) muestra un efecto débil como PAM. La actividad diferente
de los enantiómeros está en conflicto con un estudio anterior que describía
una actividad similar para ambos enantiómeros (Niswender et al., Mol.
Pharmacol, 2008, 74, 1345-1358). No tenemos una explicación definitiva
para esta discrepancia, pero parece que la racemización en estos sistemas
es factible bajo las condiciones del ensayo.
Figura 2. Resultados de las pruebas de actividad sobre el receptor mGluR4 de cis
VU0155041 (rac-2), trans VU0155040 (rac-3) y los enantiómeros (1R, 2S)-2 y (1S, 2R)-2
del diasterómero cis.
Para definir un farmacóforo PAM mGluR4 a partir de los datos anteriores de
estructura-actividad, el equipo 4 caracterizó un conjunto de conformaciones
de los diasterómeros cis y trans. En particular, para el enantiómero activo
(1R, 2S)-2 se obtuvieron dos conformaciones [(1Ra, 2Se)-2 y (1Ra, 2Se)-
2]. Sin embargo, debido a que la diferencia de energía fue muy pequeña
(0.8 kcal/mol), no se pudo elucidar la conformación activa (Christov et al.,
Chem Med Chem, 2011, 6, 131-40). A tal fin, decidimos restringir la
libertad conformacional del ciclohexano insertando un enlace C=C en
posiciones particulares del anillo.
7

Cuando se ensayaron en mGluR4, los derivados del ciclohexano mostraron
un perfil farmacológico diferente respecto al agonista selectivo del grupo III
de los mGluR L-AP4. Uno de los compuestos mostró un perfil modulador
similar al compuesto padre VU0155041. Los cálculos realizados por el
equipo 4 permitieron identificar la conformación activa posible del
enantiómero (1R,2S)-2.
Subproyecto III. Construcción de un modelo basado en levadura
para el estudio de la función de los receptores metabotrópicos de
glutamato y el cribado de alto rendimiento (HTS) de bibliotecas de
ligandos
1) Se construyeron varios vectores de expresión basados en el plásmido
pWS93, que incluye el promotor ADH1. Estos vectores expresaron las
formas truncadas de mGluR4 y mGluR7 (pWS93-mGlu4_ y pWS93-
mGlu7_). Se hicieron dos versiones de cada uno, una llevando la secuencia
líder humana y la otra llevando la secuencia líder STE2.
2) Se obtuvieron y ensayaron diversas cepas de levadura expresando
versiones modificadas de la proteína GPA1 para permitir la conexión
adecuada entre las vías transductoras de señal del receptor de mamífero y
de levadura.
3) Hemos llevado a cabo diversos experimentos de expresión mostrando la
producción de los receptores truncados en levadura, y hemos seguido la
trayectoria de las proteínas expresadas por fraccionamiento subcelular
seguida de inmunotransferencia y de inmunolocalización usando
microscopia de fluorescencia.
4) Hemos puesto a punto diversas pruebas de crecimiento para probar la
respuesta de las células de levadura modificadas mediante ingeniería al PAM
VU0155041.
8

Sin embargo, la falta de éxito para obtener la conexión adecuada entre la
activación putativa del receptor y la ruta de señalización, presumiblemente
causada por la localización anómala de las proteínas expresadas, no
permitió conseguir nuestro objetivo final, que era establecer un método de
cribado para los efectores o reguladores de mGlu en levadura.
Subproyecto IV. Análisis bioinformáticos de las relaciones
estructura-actividad del grupo III de los receptores metabotrópicos
de glutamato
1) Se ha construido un modelo preliminar del dominio transmembrana del
mGluR4. La caracterización del centro de unión para el reconocimiento de
PAM está en curso en colaboración con el equipo 1 (mutagénesis dirigida y
ensayos farmacológicos) y el equipo 2 (síntesis de nuevos ligandos). Una
vez finalizado, el modelo de centro de unión del mGluR4 permitirá realizar
cribados masivos in silico y diseñar fármacos basándose en la estructura.
Esperamos que la inclusión del receptor mejore nuestras tareas de diseño,
que hasta ahora se han llevado a cabo a partir de relaciones estructura-
actividad basadas únicamente en ligandos.
2) En colaboración estrecha con el equipo 2, se diseñó una biblioteca de 115
posibles PAM de mGluR4 pertenecientes a siete series. La síntesis de todos
los ligandos la hizo el equipo 2 y su actividad subsiguientemente la ensayó
el equipo 1. A pesar de no tener éxito en encontrar un PAM más activo que
el compuesto de referencia VU0155041, análisis detallados de estructura-
actividad de esta colección de compuestos nos permitirán establecer un
marco estructural más preciso para la investigación futura. En esta línea, el
modelo de centro de unión del receptor (en construcción) nos ayudará a
revelar las características estructurales responsables del orden de actividad
de los compuestos y a sugerir modificaciones estructurales sobre ellos.
3) Se estableció la importancia de la quiralidad de los PAM. Encontramos
(Christov et al., Chem Med Chem, 2011) que, contrariamente a resultados
publicados (Niswender et al., Mol. Pharmacol, 2008, 74, 1345-1358), la
actividad de VU0155041 reside en solo uno de los enantiómeros (1R,2S).
9

Éste es un resultado fundamental porque hace evidente que el receptor es
enantioselectivo y que es necesario un análisis separado de los
enantiómeros para cualquier molécula quiral que muestre actividad en este
receptor.
4) Cálculos de mecánica cuántica (QM) de alto nivel sobre los diasterómeros
de VU0003423 (figura 1) nos permitieron caracterizar energéticamente y
estructuralmente una colección de conformaciones para todas las
configuraciones de los compuestos. Se obtuvieron dos conformaciones para
el enantiómero activo (1R,2S)-2, una con el carboxilato en axial y el
diclorofenilcarbamoil en ecuatorial y la otra con las sustituciones opuestas.
Sin embargo, debido a que la diferencia de energía es muy baja (0.8
kcal/mol), no se pudo elucidar la conformación activa (Christov et al., Chem
Med Chem, 2011, 6, 131-40).
5) La quiralidad de los ligandos y la información recogida en el resultado 4
han sido usadas para progresar en el proceso del diseño de fármacos. Para
identificar la conformación activa del (1R,2S)-2 y diseñar nuevos
compuestos basados en conceptos conformacionales, se incluyó un enlace
C=C en diferentes posiciones del ciclohexano de VU0155041 para restringir
la flexibilidad conformacional del anillo. Los compuestos fueron sintetizados
por el equipo 2 y ensayados por el equipo 1. Se realizaron cálculos de QM
para los compuestos de ciclohexano al mismo nivel de teoría para poder
comparar adecuadamente con el resultado 4. La combinación de
características estructurales y energéticas de estos compuestos junto con
sus perfiles farmacológicos nos permitieron identificar la conformación
activa de VU0155041. Esperamos que el farmacóforo resultante de estos
estudios de estructura-actividad basados en conformaciones sea útil para el
diseño de nuevos PAM de mGluR4.
6) Se ha desarrollado una colección de modelos matemáticos para analizar
los muchos aspectos de la transducción de señales por los receptores. Estos
modelos serán útiles para construir un marco general en el cual los datos
generados de estructura-actividad serán racionalizados mecanísticamente.
10

3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados
finales obtenidos
En conjunto, los resultados obtenidos en el marco de este proyecto
colaborativo de La Marató de TV3 validan el mGluR4 como una diana
terapéutica de interés en el tratamiento del dolor crónico. Los argumentos a
favor de un efecto beneficioso de actuar sobre el mGluR4 son:
1) El mGluR4 está localizado en el asta dorsal de la médula espinal, una
localización fundamental para regular la percepción del dolor.
2) La activación selectiva del mGluR4 por agonistas o PAM elimina el exceso
de percepción del dolor en modelos animales de dolor inflamatorio o
neuropático, dejando sin cambios la percepción del dolor en animales sanos.
3) La anulación selectiva del mGluR4 por una aproximación antisentido
elimina el efecto antihiperalgésico de los fármacos del grupo III o mGluR4
en un contexto inflamatorio o neuropático.
4) Los ratones mGluR4 KO son insensibles a la reducción de hiperalgesia
mediante PAM selectivos de mGluR4 o agonistas del grupo III de los mGluR
en un contexto inflamatorio o neuropático.
5) La modulación de la neurotransmisión por mGluR4 medida por
electrofisiología en cortes de médula espinal se refuerza en un contexto
patológico comparado con cortes de animales sanos.
Estos resultados, considerados en conjunto, refuerzan el interés en
desarrollar nuevos agentes farmacológicos que activen selectivamente el
mGluR4, en particular el PAM, que fue uno de los objetivos de nuestro
proyecto.
11

4. Publicaciones
1. Christov C, González-Bulnes P, Malhaire F, Karabencheva T, Goudet C,
Pin J-P, Llebaria A, and Giraldo J.
Integrated synthetic, pharmacological, and computational investigation of
cis-2-(3,5-dichlorophenylcarbamoyl)cyclohexanecarboxylic acid enantiomers
as positive allosteric modulators of metabotropic glutamate receptor
subtype 4.
ChemMedChem 2011; 6: 131-140
FI: 3,306
2. Brea J, Castro M, Giraldo J, López-Giménez JF, Padín JF, Quintián F,
Cadavid MI, Vilaró MT, Mengod G, Berg KA, Clarke WP, Vilardaga JP,
Milligan G, Loza MI
Evidence for distinct antagonist-revealed functional states of 5-
hydroxytryptamine(2A) receptor homodimers.
Mol Pharmacol. 2009; 75(6):1380-91
FI: 4,725
3. Rovira X, Vivó M, Serra J, Roche D, Strange PG, Giraldo J
Modelling the interdependence between the stoichiometry of receptor
oligomerization and ligand binding for a coexisting dimer/tetramer receptor
system.
Br J Pharmacol. 2009;156(1):28-35
FI: 4,925
4. Giraldo J.
On the fitting of binding data when receptor dimerization is suspected.
Br J Pharmacol. 2008;155(1):17-23
FI: 4,925
5. Giraldo J
How inverse can a neutral antagonist be? Strategic questions after the
rimonabant issue.
Drug Discov Today 2010;15(11-12):411-5 FI: 6,422
12

6. Rovira X, Pin JP, Giraldo J.
The asymmetric/symmetric activation of GPCR dimers as a possible
mechanistic rationale for multiple signalling pathways.
Trends Pharmacol Sci. 2010;31(1):15-21
FI: 11,050
13