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80 contra PFR3 de T. cruzi con lisados de células de T. brucei 9 . El porcentaje de homología entre la proteína PFR3 de T. brucei y otras secuencias de PRF disponibles de T. brucei y T. cruzi es inferior al 22% (figura 2B). Al igual que ocurre con otros miembros de las familias de proteínas de filamento paraflagelar, las divergencias entre las proteínas PFR3 de T. brucei y T. cruzi se acumulan en los extremos amino y carboxilo, compartiendo sólo 3/10 aa en el término NH 2 y 1/11 aa en el término extremo carboxilo (fig. 2A). Además, se observa que la proteína PFR3 de T. brucei contiene una isoleucina en la posición dos que no está presente en la proteína homóloga de T. cruzi y que carece de los cuatro últimos aminoácidos del extremo carboxilo de la proteína PFR3 de T. cruzi. Sin embargo, en contraste con lo descrito para los miembros de la familia de proteínas de filamento paraflagelar 9 , y como se muestra en la figura 2A, se produce una gran divergencia en la región central de la proteína, con una similitud del 38% en 200 aminoácidos. Como se ha descrito que esta región central conforma una es- A Ars Pharm 2005; 46 (1): 73-84. MORELL M, GARCÍA-PÉREZ JL, THOMAS MC, LÓPEZ MC Figure Figure 2: 2: Deduced Deduced amino amino acid acid se- sesequence quence quence of of the the T. T. T. T. T. brucei brucei brucei brucei brucei PFR3 PFR3 protein protein. protein (A) Alignment of the deduced amino acid sequence of T. cruzi (P3Tc) and T. brucei (P3Tb) PFR3 proteins. Black shade indicates identical residues and grey shade indicates conservative amino acids. Amino acid position is enumerated for each sequence at the left-hand side. Underlined sequence in P3Tc indicates the sequence of the T. cruzi PFR3 cyto- 164-171 toxic peptide18 . (B) Comparison of deduced amino acid sequences among T. cruzi and T. brucei paraflagellar rod protein family members. Identity of P3Tb with others PFR proteins is indicated on light grey boxes, and homology between P3Tb and P3Tc is shown on a dark grey box with white letters. Copy Copy number number estimation estimation of of PFR3 PFR3 PFR3 PFR3 PFR3 gene gene in in T. T. T. T. T. brucei brucei brucei brucei brucei genome: genome: genome: Using a similar stra- tegy to that used for copy number estimation of a retroposon in the T. cruzi genome 19 , we determined the copy number of the T. brucei PFR3 gene in the genome of the parasite. For this purpose, and although T. brucei database P3Tb 1 M IE V QLNS FNLLPPEYPRR L VQ E EEENHRA V AAL IEL A ET AIATAENY SGYVD S RL L PLS P3Tc 1 M .T V YHEQ FALVPPQYPRR A VQ . EAENHRA L AAL YEL V EN AIATAENY VAYTE G RL V PLS P3Tb 61 SRG F DLRS AAS EMC ERY K HEAPCGWTE EKVM RF CEQEVT R E KIAELL S RQPLDV RQPLDV VAV VAV E E SI SI P3Tc 59 SRG S ELLA ASK ELR ERY R HEAPCGWTE QKV M QH CEQEVT V E EMAELL L RPPLDV AGI R SI P3Tb 121 L STL R DS TVEF PRGRFLL LR E NL NI LKPHQP RDIIRDLS EL CGALYEIQ FVDL LG K MREE P3Tc 119 L RTL Q ET RTQL PRGRFLL MR D NL SA LKPHQP PDLARDLS DV CGALYEIQ YVDL MA E LRAE P3Tb 181 L AE F D PPL DAAKK KVQ DAI EAHK RAV VG GDV LEVER THRQLIAARYE L VEV CA QR LK AF L P3Tc 17 9 L SE L D GER DKVQE KLK DAI HLYE RAV AK GDV VEVER AHRQLIAARYE F VNA CA KL MH QI L P3Tb 241 SQN L EN QE KGF IAE LQ AL ERD SL EAL QQ FT D YHSNQ RDVIQE DIKKC SD KL LQ E GA T H EK P3Tc 239 GED M AS QE SGF AAE ME AL RRD AA DSI SR FA E ALHER RQAFRN DLHNC DK KR LE E DG N H QK P3Tb 301 CLE E Y KVK ERE MKD NL YA VI SA K QKLVEE I QR KA AEL VQ LTAKQREIVDEQIKAKKE EE R P3Tc 299 CLE V Y NAE ERE TAA QI GQ IV IV EQ EQ K K KKLVEE KKLVEE L L RQ RQ KA KA REL REL RD RD ITLKQKEMVEAQVRAKRA ITLKQKEMVEAQVRAKRA ITLKQKEMVEAQVRAKRAEE EE E E P3Tb 361 RITT YNEF ANM GT QQK Q RLL K CL EYC E RVLS VVPG IK SYV G EMV KRLPWQK LR DARNE VN P3Tc 359 RVTA YNEF VNM EE QQK H RLL R CL AYF D GMEE LTAD LR SYV D EMV TRIPQQN LR QVLDQ LN P3Tb 421 D TEAE GFM EAY DP FV E CCGELTVKKMHR HDTL SRQ S RL VEHNR N SSMESLDPNM NNYR AE P3Tc 419 D IEAE VFM NAY GG FV S CCGELTVKKMHR LDTL ERQ A RL LEHNR D SAMESLDPNM SNYR LE P3Tb 481 L EEL IEQMKGV TGVINALNATQDAGEQLF L SVEK AI LE KYER A A TPFVHPLQ VH GV KSVE P3Tc 479 L DDI IEQMKGV SGVINALNATQDAGEQLF Q SVEK GV LA KYER S G TP FVHPLQ EY GI KSVE P3Tb 541 ER D RFV N RSM Q YVE DEERKVLEK KSVL ERMR RAVE G EETA V EL AIR D I PVGR A *~~~~ P3Tc 539 ER N RFV D RSM H YVE NEERKVLEK RNVL NRMR QAVE E DEAA T ES AIR N L NEEP A APEY*
IDENTIFICACIÓN IN SILICO, CARACTERIZACIÓN MOLECULAR Y ANÁLISIS DE EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA... SILICO IDENTIFICATION, MOLECULAR CHARACTERIZATION AND EXPRESSION ANALYSIS OF THE TRYPANOSOMA... B T. brucei T. cruzi tructura de filamento de doble espiral, un motivo común que se conserva en diversos filamentos citoesqueleto, entre los que se incluyen las proteínas de filamento paraflagelar descritas 5,9 , se supone que la proteína PFR3 de T. brucei podría tener una característica funcional específica. Por otra parte, es interesante observar que el péptido PFR3 64-171 de T. cruzi, descrito como un buen objetivo para los linfocitos T citotóxicos específicos inducidos como respuesta a las células infectadas por parásitos 18 , se conserva en la PFR3 de T. brucei (subrayado en la figura 2A). PFR1 PFR1 PFR2 63.3% PFR2 PFR3 19.3% 19.5% PFR3 PFR3 19.8% 20.3% 68.9% PFR3 PFR2 62.6% 90.2% 19.6% 19.9% PFR2 PFR1 87.6% 65.4% 20.4% 20.2% 65.9% PFR1 PFR4 23.6% 21.2% 22% 21.1% 21.2%22.5% Figura Figura 2: 2: Secuencia Secuencia Secuencia de de de aminoácidos aminoácidos aminoácidos deducida deducida de de la la proteína proteína PFR3 PFR3 de de T. T. T. T. T. brucei. brucei brucei brucei brucei . (A) (A) Alineación de la secuencia de aminoácidos deducida de las proteínas PFR3 de T. cruzi (P3Tc) y T. brucei (P3Tb). El sombreado negro indica residuos idénticos y el sombreado gris aminoácidos conservadores. En la parte izquierda se enumera la posición de los aminoácidos en cada secuencia. La secuencia subrayada de P3Tc indica la secuencia del péptido citotóxico18 del PFR3164- de T. cruzi. (B) Comparación de las se- 171 cuencias deducidas de aminoácidos de diferentes miembros de la familia de proteínas de filamento paraflagelar de T. cruzi y T. brucei. La identidad de P3Tb con otras proteínas PFR se indica en recuadros gris claro, y la homología entre P3Tb y P3Tc se muestra en un recuadro gris oscuro con letras blancas. Estimación Estimación de de número número de de de copias copias del del gen gen PFR3 PFR3 PFR3 PFR3 PFR3 en en el el genoma genoma de de T. T. T. T. T. brucei: brucei brucei brucei brucei Mediante una estrategia similar a la utilizada para la estimación del número de copias de un retroposon en el genoma de T. cruzi19 , determinamos el número de copias del gen PFR3 de T. brucei en el genoma del parásito. PFR4 does not cover the whole genome, we used the GSS database for estimating the copy number of a repeated sequence 20 . PFR1 and PFR2 proteins, are characterized for being arranged in a tandem manner in the genome of T. brucei, with 4 copies of each PFR gene per haploid genome 17 . Copy number estimation per haploid genome (CN) includes the number of GSS (GSS) homologous to the probe, the size of the probe (GS), the size of the haploid genome (HGS=40 Mb), and the number of GSS contained in the library (TGSS=47854): CN= (GSS x HGS)/ (TGSS x GS) 19,21 . BLAST analysis at NCBI against T. brucei database using T. brucei PFR3 coding sequence as a probe, indicated that the genome of T. brucei contains two copies per haploid genome (2 +/- 0.33). These data contrast with the ten copies described for T. cruzi PFR3 gene (Fouts et al., 1998) but is in accordance to those present for other T. brucei PFR proteins (four copies for PFR1/B and PFR2/D, respectively) 17 or for the T. cruzi PFR4 gene for which there is one or two copies per haploid genome 9 . Expression Expression of of the the transcripts transcripts of of T. T. T. T. T. brucei brucei brucei brucei brucei PFR3 PFR3 gene: gene: To evaluate the level of RNA transcripts of the T. brucei PFR3 gene, total RNA extracted from T. brucei procyclic and bloodstream forms was probed with an [α- 32 P]-labeled DNA fragment corresponding to 1.06 kb of T. brucei PFR3 coding region. Northern blot analysis (Fig. 3), evidenced a single hybridization band of approximately 3.6 kb in length in both forms of the parasite. Moreover, densitometry analysis showed that there were no differences in the level of T. brucei PFR3 transcripts from procyclic and bloodstream forms, in contrast to that described for T. cruzi PFR3 gene, where PFR3 trans- 81 Ars Pharm 2005; 46 (1): 73-84
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