Cinética y capacidad neutralizante de los anticuerpos homólogos y ...
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Materiales y Métodos<br />
preparado en el laboratorio <strong>de</strong> Producción <strong>de</strong>l Dpto. <strong>de</strong> Virología <strong>de</strong>l Instituto <strong>de</strong><br />
Medicina Tropical “Pedro Kourí”.<br />
5. Cuando la multiplicación viral fue confirmada, <strong>los</strong> frascos fueron congelados a –86ºC<br />
previa adición <strong>de</strong> SFBI al 2%. Finalmente, <strong>los</strong> cultivos fueron <strong>de</strong>scongelados <strong>de</strong> forma<br />
rápida a 37ºC y distribuidos en alícuotas <strong>de</strong> 200 μl. El título viral se <strong>de</strong>terminó mediante<br />
la técnica <strong>de</strong> titulación viral por placas empleando células BHK-21 clono 15 (82).<br />
Titulación por Placas<br />
1. Se prepararon diluciones seriadas en base 10 <strong>de</strong> <strong>los</strong> virus <strong>de</strong>s<strong>de</strong> 10-1 hasta 10-7.<br />
2. Se añadieron 0.5 ml <strong>de</strong> la suspensión <strong>de</strong> células BHK21 a cada pozo <strong>de</strong> la placa <strong>de</strong> 24<br />
pocil<strong>los</strong> y se <strong>de</strong>jaron en reposo por 1 hora a temperatura ambiente.<br />
3. Se inocularon 50 ul <strong>de</strong> cada dilución viral a las células incubándose por 4 horas a 37ºC<br />
en incubadora <strong>de</strong> CO2, al 5%.<br />
4. Se añadieron 0.5 ml <strong>de</strong> medio recubrimiento “overlay”, incubándose a 37ºC por 5 días<br />
para el virus DEN-2, 6 días para el virus DEN-4 y 7 días para <strong>los</strong> virus DEN-1 y DEN-<br />
3, en incubadora <strong>de</strong> CO2 al 5%.<br />
5. Luego <strong>de</strong> la incubación se <strong>de</strong>scartó el medio y se lavaron las monocapas celulares con<br />
agua <strong>de</strong> la pila. A cada pozo <strong>de</strong> la placa le fue añadido 0,5 ml <strong>de</strong> una solución <strong>de</strong>l<br />
colorante Napthol Blue Black (Acido Acético 60 ml, Napthol Blue Black 1g y 13,6 g<br />
Acetato <strong>de</strong> Sodio).<br />
6. Para conocer el título infectivo <strong>de</strong> <strong>los</strong> virus titulados se aplicó la siguiente formula:<br />
P x 20 x 10X = ufp/mL<br />
Don<strong>de</strong>:<br />
P: Promedio <strong>de</strong>l número <strong>de</strong> placas obtenido en la dilución en que se contaron las placas.<br />
20: Factor <strong>de</strong> corrección para expresar el título en ufp/ml (1000ul/Volumen Inóculo).<br />
10X: Representa la dilución en que se contaron las placas (Factor <strong>de</strong> Dilución).<br />
Neutralización por Reducción <strong>de</strong>l Número <strong>de</strong> Placas (NRNP)<br />
1. Los sueros a estudiar fueron inicialmente tratados con cloroformo y posteriormente se<br />
realizaron diluciones en base 10 (1/10-1/1000000) utilizando medio <strong>de</strong> mantenimiento.<br />
Los sueros controles negativos y positivos se emplearon a la dilución 1/10.<br />
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