Cinética y capacidad neutralizante de los anticuerpos homólogos y ...

Materiales y Métodos
preparado en el laboratorio de Producción del Dpto. de Virología del Instituto de
Medicina Tropical “Pedro Kourí”.
5. Cuando la multiplicación viral fue confirmada, los frascos fueron congelados a –86ºC
previa adición de SFBI al 2%. Finalmente, los cultivos fueron descongelados de forma
rápida a 37ºC y distribuidos en alícuotas de 200 μl. El título viral se determinó mediante
la técnica de titulación viral por placas empleando células BHK-21 clono 15 (82).
Titulación por Placas
1. Se prepararon diluciones seriadas en base 10 de los virus desde 10-1 hasta 10-7.
2. Se añadieron 0.5 ml de la suspensión de células BHK21 a cada pozo de la placa de 24
pocillos y se dejaron en reposo por 1 hora a temperatura ambiente.
3. Se inocularon 50 ul de cada dilución viral a las células incubándose por 4 horas a 37ºC
en incubadora de CO2, al 5%.
4. Se añadieron 0.5 ml de medio recubrimiento “overlay”, incubándose a 37ºC por 5 días
para el virus DEN-2, 6 días para el virus DEN-4 y 7 días para los virus DEN-1 y DEN-
3, en incubadora de CO2 al 5%.
5. Luego de la incubación se descartó el medio y se lavaron las monocapas celulares con
agua de la pila. A cada pozo de la placa le fue añadido 0,5 ml de una solución del
colorante Napthol Blue Black (Acido Acético 60 ml, Napthol Blue Black 1g y 13,6 g
Acetato de Sodio).
6. Para conocer el título infectivo de los virus titulados se aplicó la siguiente formula:
P x 20 x 10X = ufp/mL
Donde:
P: Promedio del número de placas obtenido en la dilución en que se contaron las placas.
20: Factor de corrección para expresar el título en ufp/ml (1000ul/Volumen Inóculo).
10X: Representa la dilución en que se contaron las placas (Factor de Dilución).
Neutralización por Reducción del Número de Placas (NRNP)
1. Los sueros a estudiar fueron inicialmente tratados con cloroformo y posteriormente se
realizaron diluciones en base 10 (1/10-1/1000000) utilizando medio de mantenimiento.
Los sueros controles negativos y positivos se emplearon a la dilución 1/10.
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