UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID - Biblioteca de la ...

termolábiles), y que son capaces de incorporar
nucleótidos marcados con isótopos radiactivos o
fluoresceinados.
Para este trabajo se utilizó el sistema comercial
"ABI PRISM TM Dye Terminator" (Perkin Elmer, Foster
City, CA, EE.UU) que combina una enzima
termoestable modificada (AmpliTaq ® DNA polymerase,
FS) con dideoxiterminadores fluoresceinados. El
proceso de copia se realiza en un termociclador 9600,
mientras que la electroforesis y lectura láser de los
productos resultantes se realiza de forma automática en
un secuenciador de DNA modelo 373A (Perkin Elmer,
Foster City, CA, EE.UU) con capacidad para 48
muestras simultáneas.
6.3.1. Reacciones de secuenciación en el
termociclador.
En las reacciones de secuenciación se incorporan
los fluoróforos cada vez que se añade a la cadena un
dideoxinucleótido marcado y convenientemente
modificado ("dye-deoxi-terminator") para terminar la
reacción en lugar de un deoxinucleótido estándar.
De este modo, se generan de forma aleatoria copias
monocatenarias fluoresceinadas con tamaños que
difieren entre sí en una sola base de longitud. Estas
copias llevan como última base uno de los cuatro
posibles dideoxiterminadores.
Para la secuenciación de DNA plasmídico se
prepara la siguiente mezcla:
Pre-mezcla ........................ 8 µl
(mezcla de: dye terminadores (A, C, G y T ),
dITP, dATP, dCTP, dTTP, Tris-HCl pH 9.0,
MgCl2, pirofosfatasa termoestable y AmpliTaq
polimerasa FS)
Primer (3.2 pmoles/µl)...... 1µl
DNA .................................. 5 µl
Agua bidestilada ................ 6 µl
En la secuenciación directa de un producto de PCR la
mezcla es:
Pre-mezcla ........................ 8 µl
(igual que el anterior)
Primer (3.2 pmoles/µl)...... 1µl
Producto de PCR................ 11 µl
Los pasos que se programan en el termociclador son
los siguientes:
- Desnaturalización, 2 minutos a 95ºC.
- 25 ciclos de:
Desnaturalización, 10 segundos a 96ºC.
Hibridación, 5 segundos a 50ºC.
Extensión, 4 minutos a 60ºC.
Eduardo Gómez Casado
Material y Métodos 72
Los primers de secuenciación utilizados para HLA-A,
-B, -DQA1 y -DRB1se muestran en las tablas 4, 8 y 9,
respectivamente. Para el locus DQB1 se utilizaron los
primers de secuenciación universales M13 (ver apartado
6.1.4).
6.3.2. Purificación de las reacciones de secuenciación.
Este procedimiento de purificación es necesario con el
fin de eliminar el exceso de "terminadores" marcados no
incorporados a las secuencias. Para ello se siguieron los
pasos:
- Centrifugación del soporte de PCR con el fin de
recoger el volumen condensado sobre las paredes
superiores de los tubos.
- Tomamos todo el volumen del microtubo de PCR y
lo llevamos a un tubo tipo eppendorf.
- Añadimos 3 µl de acetato sódico 2M pH 4'5 y 60 µl
de etanol absoluto. Mezclamos por agitación.
- Incubamos en baño de hielo 10 minutos.
- Centrifugamos a 14000 rpm (4ºC) durante 20
minutos. Aspiramos el sobrenadante.
- Lavamos el precipitado con 250 µl de etanol al 70%
(-20ºC).
- Aspiramos el sobrenadante y secamos en centrífuga
de vacío. Los dideoxiterminadores no incorporados
son eliminados en la aspiración.
Las muestras pueden guardarse a -20ºC y en oscuridad
hasta su desarrollo electroforético.
6.4. DESARROLLO ELECTROFORÉTICO DE LOS
PRODUCTOS DE SECUENCIACIÓN; DETECCIÓN Y
OBTENCIÓN DE LAS SECUENCIAS.
Los cristales de secuenciación se lavan con
detergentes que no produzcan residuos y agua caliente,
frotando con un pedazo de papel blando (tissue). Se
aclaran abundantemente con agua del grifo y, cuando ya
no quedan restos de detergente, con agua bidestilada.
Finalmente se lavan con etanol al 95% y se dejan secar
en posición vertical.
Una vez secos, se prepara el sandwich cristalespaciadores-cristal.
Se sellan los laterales y el fondo
con cinta adhesiva plástica. A la solución de acrilamida
filtrada, se le añaden 500 µl de persulfato de amonio al
10% y 45 µl de TEMED. Se agita suavemente y se
carga entre los dos cristales, en posición vertical y
cuidando que no se formen burbujas. Cuando el interior
de los cristales está lleno hasta dos cm del borde
superior, se sitúan en posición horizontal, se coloca el
peine de secuenciación y se fija con tres pinzas
metálicas. El conjunto se deja polimerizar de 1 a 2
horas.
Una vez polimerizada la acrilamida, se retiran las
pinzas, el peine y la cinta adhesiva. Se lava
abundantemente con agua del grifo y finalmente con
etanol al 95%. A continuación se coloca en el interior