UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID - Biblioteca de la ...

6.1.5. Purificación de recombinantes.
La purificación de plásmidos a partir de pequeños
volúmenes de cultivos bacterianos se conoce con el
nombre de "minipreps". Los plásmidos de los cultivos
obtenidos de la última incubación se purificaron con un
sistema comercial llamado "QIAwell 8 plasmid Kit"
(QIAgen GmbH, Hilden, Alemania), que se basa en el
procedimiento de la "lisis alcalina" bacteriana y en la
retención del DNA plasmídico en una membrana en
función de la fuerza iónica. El procedimiento fue el
siguiente:
- Tomar 1.7 ml de cultivo bacteriano a un tubo de
microcentrífuga tipo eppendorf.
- Centrifugar a 14000 rpm, 2 minutos para bajar las
bacterias.
- Aspirar a vacío el sobrenadante.
- Añadir 300 µl de tampón P1 a 4ºC. Resuspender
las bacterias por agitación con vortex. El tampón P1
contiene RNAsa.
- Añadir 300 µl de tampón P2. Invertir los tubos 6
veces e incubar 5 minutos a temperatura ambiente.
En este paso se produce la lisis alcalina.
- Añadir 300 µl de tampón P3 a 4ºC. Invertir los
tubos 6 veces e incubar en baño de hielo durante 10
minutos. En este paso las proteínas precipitan.
- Centrifugar 30 minutos a 4ºC y 14000 rpm para
bajar el precipitado de proteínas. En el sobrenadante
queda el plásmido junto con sales y otras
impurezas.
- Se prepara un soporte de metacrilato (QIAvac 6S,
QIAgen, Hilden, Alemania) con capacidad para
adaptar hasta 96 columnas de purificación.
- Adaptamos tantas columnas de purificación como
muestras tengamos y aplicamos 850 µl del
sobrenadante obtenido en el paso anterior.
Conectamos el aparato a un sistema de vacío de
manera que se produce un flujo a través de la
columna, en la queda retenido el DNA plasmídico.
- Añadimos 2 ml de tampón de lavado a cada
columna.
- Se desconecta el vacío.
- Hasta ahora los líquidos eluídos recogidos en una
batea interna se desechan.
- Se sustituye esta batea interna por otra en la que se
incluyen tubos de recolección que se adaptan a cada
columna por su parte inferior.
- Añadimos 500 µl de tampón de elución a cada
columna y aplicamos de nuevo vacío.
- Precipitamos el DNA plasmídico eluído con 350
µl de isopropanol.
- Centrifugamos 15 minutos a 14000 rpm (4ºC) para
obtener el pellet de DNA plasmídico.
- Retiramos el sobrenadante por aspiración a vacío.
- Eliminamos el exceso de sales mediante un lavado
con 1 ml de etanol al 70% (-20ºC).
Eduardo Gómez Casado
Material y Métodos 71
- Centrifugamos 5 minutos a 14000 rpm (4ºC) para
fijar el pellet al fondo del tubo.
- Aspiramos el sobrenadante y secamos el DNA en
centrífuga de vacío.
- Resuspendemos el DNA en 25 µl de agua
bidestilada.
- El cálculo de concentración del DNA plasmídico
se realiza sobre una mezcla compuesta de 3 µl de
DNA y 297 µl de agua bidestilada (dilución 1/100).
Se mide la absorbancia de esta muestra a 260 y 280
nm. Se aplica la fórmula:
[DNA]= Factor de dilución x 50x A260
La relación A260/A280 nos indica la pureza del DNA
y debe comprender un valor entre 1'6-1'8.
6.2. SECUENCIACIÓN DIRECTA.
Se basa en la determinación de la secuencia de
nucleótidos de un fragmento de interés sin realizar
previamente, mediante el proceso de clonaje, el
aislamiento de cada una de las copias amplificadas de
dos genes, ya que esta separación se obtiene por el uso
de primers específicos de alelos o grupos de alelos.
Este procedimiento se aplicó a aquellos DNAs que
cumplían las siguientes características:
-DNAs con alelos HLA-B que pueden separarse por
amplificación especifica de grupo según la Tabla 5
(p. e.: B35 y B18).
-DNAs con alelos DRB1 que pueden separase por
amplificación específica de grupo, es decir, todos
aquellos DNAs con tipajes heterocigotos para DR1,
DR2, DR4 o DR52 asociados.
La mezcla de reacción y las condiciones del
termociclador utilizadas para la amplificación del locus
HLA-B fueron las que se describen en los apartados
4.1.2 y 4.1.3, respectivamente.
Para la obtención de amplificados del locus DRB1,
se aplicaron a un mismo DNA los primers específicos
de grupo (Tabla 9). Las mezclas de reacción y
condiciones aplicadas al termociclador fueron las
descritas en los apartados 4.1.3 y 6.1, respectivamente.
Los controles de amplificación se realizaron
siguiendo el apartado 4.1.4.
El proceso de purificación de productos de la PCR
se realizó como se describe en el apartado 6.1.1.
6.3. REACCIONES DE SECUENCIACIÓN.
Estas siguen básicamente el modelo descrito por
Sanger (Sanger y col. 1977). Sobre esta base se han
venido desarrollando diferentes químicas de
secuenciación que van desde el uso de enzimas
termoestables a enzimas más procesativas (pero