13.05.2013 Views

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID - Biblioteca de la ...

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID - Biblioteca de la ...

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID - Biblioteca de la ...

SHOW MORE
SHOW LESS

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.

clonaje dos reacciones <strong>de</strong> ligado control que nos<br />

indiquen <strong>la</strong> estabilidad <strong>de</strong>l vector y <strong>la</strong> actividad <strong>de</strong> <strong>la</strong> T4<br />

DNA ligasa. En el primer caso, se sustituye el producto<br />

<strong>de</strong> PCR por agua bi<strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da. En el segundo control se<br />

incluye 2 µl <strong>de</strong> un fragmento con extremos 3'-dA y 1 µl<br />

extra <strong>de</strong> agua bi<strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da con el fin <strong>de</strong> que <strong>la</strong> suma <strong>de</strong><br />

volúmenes sea 10 µl.<br />

Las reacciones <strong>de</strong> ligado se incuban a 15ºC durante<br />

una noche, y posteriormente se guardan a -20ºC.<br />

6.1.3. Transformación <strong>de</strong> bacterias competentes.<br />

El sistema "pMOSBlue T-vector" contiene una cepa<br />

<strong>de</strong> bacterias E. Coli ya competentes, <strong>de</strong>nominada<br />

INVαF'. La transformación se realiza <strong>de</strong> <strong>la</strong> siguiente<br />

manera:<br />

- Desconge<strong>la</strong>r en baño <strong>de</strong> hielo los tubos necesarios con<br />

bacterias competentes (20 µl).<br />

- Colocar en este baño <strong>la</strong>s reacciones <strong>de</strong> ligado.<br />

- Añadir 1 µl <strong>de</strong> reacción <strong>de</strong> ligado a cada tubo <strong>de</strong><br />

bacterias competentes. Agitar los tubos suavemente con<br />

los <strong>de</strong>dos para homogeneizar <strong>la</strong>s mezc<strong>la</strong>s.<br />

- Incubar durante 30 min en el hielo.<br />

- Incubar en un baño a 42ºC durante 40 segundos.<br />

- Pasar <strong>de</strong> nuevo a hielo. Incubar 2 minutos.<br />

- Añadir 80 ml <strong>de</strong> un medio rico (SOC) a temperatura<br />

ambiente. Este medio es proporcionado por el kit.<br />

- Agitar en un incubador a 37ºC, una hora y a 225 rpm.<br />

- Preparar p<strong>la</strong>cas <strong>de</strong> Petri con agar LB, ampicilina (50<br />

mg/ml), X-gal (50 mg/ml) e IPTG (100 mM). Se pue<strong>de</strong><br />

preparar con anterioridad 40 p<strong>la</strong>cas <strong>de</strong> siembra (ver<br />

Soluciones Empleadas).<br />

- Poner en hielo los viales <strong>de</strong> célu<strong>la</strong>s transformadas.<br />

- Exten<strong>de</strong>r 50 ml <strong>de</strong> <strong>la</strong> suspensión bacteriana en cada<br />

p<strong>la</strong>ca <strong>de</strong> Petri convenientemente i<strong>de</strong>ntificada.<br />

- Incubar invertidas en una estufa a 37ºC, hasta el día<br />

siguiente.<br />

Para evaluar <strong>la</strong> eficiencia <strong>de</strong> <strong>la</strong>s bacterias<br />

competentes se realiza un control <strong>de</strong> transformación <strong>de</strong><br />

bacterias, usando 1 µl <strong>de</strong> un plásmido superenrol<strong>la</strong>do<br />

control (proporcionado por el kit) y con resistencia a<br />

ampicilina.<br />

6.1.4. Selección, confirmación y crecimiento <strong>de</strong> clones<br />

recombinantes.<br />

Con <strong>la</strong> introducción <strong>de</strong> ampicilina y X-gal en <strong>la</strong>s<br />

p<strong>la</strong>cas <strong>de</strong> cultivo, es posible hacer una selección <strong>de</strong> <strong>la</strong>s<br />

bacterias transformadas, y <strong>de</strong> entre el<strong>la</strong>s, elegir <strong>la</strong>s que<br />

poseen el plásmido recombinante por presentar un color<br />

b<strong>la</strong>nquecino frente a los clones no recombinantes. A<br />

estos últimos, <strong>la</strong> integridad <strong>de</strong>l gen cuya proteína<br />

metaboliza el X-gal les confiere un color ver<strong>de</strong>-azu<strong>la</strong>do.<br />

El resultado <strong>de</strong> los controles <strong>de</strong> autoligado y<br />

transformación (citados anteriormente) nos orienta <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />

eficiencia <strong>de</strong>l experimento:<br />

Eduardo Gómez Casado<br />

Material y Métodos 70<br />

- La p<strong>la</strong>ca <strong>de</strong> autoligado <strong>de</strong>be contener sólo un 1-<br />

8% <strong>de</strong> colonias b<strong>la</strong>ncas.<br />

- La p<strong>la</strong>ca <strong>de</strong> control <strong>de</strong> inserto <strong>de</strong>be presentar un<br />

95% <strong>de</strong> colonias b<strong>la</strong>ncas recombinantes.<br />

- La p<strong>la</strong>ca <strong>de</strong> control <strong>de</strong> transformación <strong>de</strong>be<br />

presentar por cada 5 µl sembrados una eficiencia <strong>de</strong><br />

4x10 7 transformantes/µg <strong>de</strong> plásmido<br />

superenrol<strong>la</strong>do.<br />

Con el fin <strong>de</strong> asegurarnos que los clones <strong>de</strong> color<br />

b<strong>la</strong>nco son realmente recombinantes, realizamos con<br />

cada una <strong>de</strong> <strong>la</strong>s muestras el siguiente procedimiento en<br />

campana <strong>de</strong> flujo <strong>la</strong>minar:<br />

- Pinchamos entre 20 y 30 colonias b<strong>la</strong>ncas y una<br />

colonia azul por p<strong>la</strong>ca.<br />

- Se pincha <strong>la</strong> colonia b<strong>la</strong>nca con una punta estéril y<br />

se resuspen<strong>de</strong> por pipeteo en 10 µl <strong>de</strong> PBS.<br />

- Se toman 5 µl <strong>de</strong> <strong>la</strong> resuspensión y se llevan a 50<br />

µl <strong>de</strong> Tween 20 (0.01%) situados en tubos <strong>de</strong> PCR.<br />

- Estos tubos se colocan en el termocic<strong>la</strong>dor y se<br />

incuban a 100ºC durante 15 min. El resultado es un<br />

lisado bacteriano que <strong>de</strong>ja libre el DNA p<strong>la</strong>smídico.<br />

- Preparamos una mezc<strong>la</strong> <strong>de</strong> PCR como se <strong>de</strong>scribe<br />

en el apartado 4.1.3. Como primers <strong>de</strong><br />

amplificación se usaron:<br />

M13Forward: TGTAAAACGACGGCCAG y<br />

M13Reverse: CAGGAAACAGCTATGACC<br />

- Las condiciones <strong>de</strong> amplificación fueron <strong>la</strong>s<br />

siguientes:<br />

- <strong>de</strong>snaturalización previa, 1 min a 96ºC.<br />

- 30 ciclos <strong>de</strong> <strong>la</strong>s siguientes etapas:<br />

<strong>de</strong>snaturalización a 96ºC, 15 segundos.<br />

hibridación a 50ºC, 20 segundos.<br />

extensión a 72ºC, 40 segundos.<br />

- Extensión final a 72ºC, 40 segundos.<br />

El resultado <strong>de</strong> <strong>la</strong> amplificación se somete a<br />

electroforesis (ver apartado 4.1.4). Para un clon no<br />

recombinante es un tamaño pequeño <strong>de</strong> amplificación<br />

<strong>de</strong>limitado por <strong>la</strong> distancia en pb entre <strong>la</strong>s dianas <strong>de</strong><br />

M13. Por el contrario, el producto <strong>de</strong> PCR <strong>de</strong> un clon<br />

recombinante presenta un tamaño que es <strong>la</strong> suma <strong>de</strong>l<br />

caso anterior y <strong>de</strong>l tamaño <strong>de</strong>l fragmento insertado.<br />

En <strong>la</strong> PCR <strong>de</strong> control <strong>de</strong> inserto se incluye un<br />

control (todos los componentes sin lisado y con agua<br />

bi<strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da), si en <strong>la</strong> electroforesis no se observa<br />

amplificado entonces indica ausencia <strong>de</strong> contaminación.<br />

Para crecer <strong>la</strong> selección <strong>de</strong> clones recombinantes se<br />

prepara medio LB líquido con ampicilina (50 mg/ml), y<br />

se inocu<strong>la</strong>n los 5 µl restantes <strong>de</strong> suspensión <strong>de</strong>l clon en<br />

PBS. Se incuba toda <strong>la</strong> noche a 37ºC y en agitación a<br />

250 rpm.

Hooray! Your file is uploaded and ready to be published.

Saved successfully!

Ooh no, something went wrong!