UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID - Biblioteca de la ...

Alemania). Este se basa en la adsorción del DNA
amplificado a una membrana de silica-gel fija en una
columna. La unión del DNA se produce a pH menor o
igual a 7'5 y alta concentración de sales, mientras los
contaminantes fluyen a través de la columna. El
desarrollo del proceso es el siguiente:
- Se prepara un gel de agarosa al 2% (ver Soluciones
Empleadas) al que se adapta un peine de 12 pocillos con
capacidad para cargar hasta 80 µl.
- Se somete a electroforesis el total del volumen de la
PCR. Se aplica un voltaje de 130 voltios durante 40
minutos. Las bandas de amplificación que queramos
purificar deben verse en el transiluminador claramente
separadas.
- Preparamos un baño de agua a 60ºC.
- Se recorta con un bisturí estéril el fragmento de
agarosa que contenga la banda que nos interese. El
fragmento recortado se debe aproximar lo más posible
al tamaño de la banda.
- Se introduce el fragmento recortado en tubo de 1'5 ml
tipo eppendorf.
- Añadimos 300 µl de tampón de solubilización.
- Introducimos los tubos en el baño de agua a 60ºC
durante 10 minutos, o hasta que la agarosa se haya
disuelto completamente. En este tiempo, agitamos en 2
ó 3 ocasiones ligeramente el tubo para mezclar.
- Preparamos las columnas de purificación. Estas van
sobre tubos de recolección de 2 ml.
- Aplicamos la mezcla a la columna y centrifugamos a
14000 rpm, 1 minuto. En este paso el DNA amplificado
queda retenido en la membrana de la columna y el resto
de componentes eluyen al tubo de recolección.
- Desechamos el eluído y aplicamos en la columna 500
µl más de tampón de solubilización. Se centrifuga a
14000 rpm, 1 minuto.
- Desechamos el eluído y aplicamos en la columna 750
µl de tampón de lavado. Esperamos 5 minutos y
centrifugamos en las mismas condiciones anteriores.
- Desechamos el eluído y centrifugamos de nuevo en las
mismas condiciones para eliminar los posibles restos de
etanol del tampón de lavado. El etanol es un inhibidor
de la Taq polimerasa.
- Colocamos la columna en un tubo de 1'5 ml tipo
eppendorf y aplicamos 50 µl de agua bidestilada al
centro de la membrana.
- Centrifugamos a 14000 rpm, 1 minuto. La solución
acuosa eluída contiene el producto de PCR purificado.
Antes de proseguir con cualquier reacción
enzimática sobre el purificado, es conveniente estimar
el rendimiento del proceso. Para ello preparamos una
mezcla de 5 µl del producto purificado y 2 µl de tampón
de carga. Se somete a electroforesis en el gel de agarosa
de purificación, si este se preparó con un peine más de
pocillos pequeños. La intensidad de la banda nos indica
la eficiencia del proceso de purificación.
Eduardo Gómez Casado
6.1.2. Ligado en el vector de clonaje.
Material y Métodos 69
Se llevó a cabo mediante el sistema comercial
"pMOSBlue T-vector" (Amersham LIFE SCIENCE,
Buckinghamshire, Inglaterra). Las estrategias de ligado
y clonaje de este sistema se basan en el
aprovechamiento de la capacidad de la Taq polimerasa,
independiente de sustrato, de añadir una deoxiadenosina
Sap I (2663)
Afl III (2546)
(2137)
II ( 1964)
ORI
Eam1105 I (1658)
Pfl1108 (1639)
Bsa I (1592)
Gsu I (1589)
lacZ
pMOSBlue
A M P
f1 origin
Hind III (45)
BspM I ( 50)
Sph I ( 55)
Sse8387 I ( 61)
Pst I ( 61)
Sal I (63)
Acc I (64)
Hinc II (65)
Xba I ( 69)
Spe I (81)
Nde I (88)
EcoR V (95)
BamH I (99)
Ava I (104)
Sma I (106)
Kpn I ( 112)
Sac I (118)
EcoR I (120)
Dra III (508)
BsaA I (508)
Drd II (513)
Bcc I (515)
Nae I (611)
Xmn I (1058)
BsaH I (1119)
Sca I (1177)
Figura 30. Vector utilizado para el clonaje de los
productos de PCR.
al extremo 3' de todas las moléculas de doble cadena
generadas en la reacción de PCR. Estos extremos 3'-dA
se usan para insertar el producto de la PCR directamente
en un vector específicamente diseñado con extremos 5'dT
en el lugar de inserción. La figura 30 representa el
mapa del vector utilizado.
Las reacciones de ligado se prepararon del siguiente
modo:
- 1 µl de tampón de ligado 10x.
- 0.5 µl 100mM DTT.
- 0.5 µl 10 mM ATP.
- 1.0 µl del vector (50ng/µl).
- 0.5 µl de T4 DNA ligasa (4u/ml).
- 3.5 µl de agua bidestilada estéril.
- 3 µl del producto de PCR purificado.
Es recomendable incluir en cada experimento de