UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID - Biblioteca de la ...

- 35 ciclos de las siguientes etapas:
Desnaturalización a 95ºC, 30 segundos.
Hibridación a 58ºC, 20 segundos.
Extensión a 72ºC, 30 segundos.
- Extensión final a 72ºC, 10 minutos.
5.2.2. Controles de amplificación
Posteriormente, se realiza un análisis electroforético
de los amplificados siguiendo las indicaciones
expuestas en el apartado 4.1.4. En la figura 28 se
muestra un ejemplo de una amplificación para los genes
DRB1+3+4+5.
5.2.3. Oligotipaje de los loci HLA-DRB y -DQB1
El oligotipaje reverso se realizó mediante el aparato
auto-LiPA, sistema automatizado capaz de analizar 30
muestras simultáneamente, y que consiste en un baño
termo-regulable al que se adapta una bandeja con 30
compartimentos estancos, y un brazo multi-dispensador
que va recorriendo la bandeja.
El auto-LiPA está diseñado para llevar a cabo los
pasos de hibridación, lavados y detección por color,
Figura 28. Productos de amplificación para los loci HLA-
DRB1+3+4+5 (calles 1-14), un control negativo (C-) y un
marcador de masa molecular (M).
calentando y enfriando soluciones, así como
dispensando y aspirando las mismas.
Previo al análisis en el auto-LiPA se realiza lo
siguiente:
1. Desnaturalización de los productos de PCR. Se
realiza en la bandeja-soporte mezclando 10 µl del
producto amplificado y 10 µl de solución
desnaturalizante proporcionada por el sistema
comercial. Se deja incubar 10 min a temperatura
ambiente.
2. Se preparan los siguientes reactivos:
- Solución de lavado rinse solution. Se diluye el stock
5x de esta solución con agua bidestilada para obtener un
volumen final a concentración 1x.
- Solución de conjugado. Se diluye el stock 100x
Eduardo Gómez Casado
Material y Métodos 67
Figura 27. Fundamento del tipaje genético de los
alelos HLA-DRB y DQB1 mediante dot-blot reverso.
de esta solución con diluyente de conjugado para
obtener un volumen final a concentración 1x.
- Solución de sustrato. Se diluye el stock 100x de esta
solución con diluyente de sustrato para obtener un
volumen final a concentración 1x.
Se colocan en el aparato la bandeja y los reactivos
en los correspondientes conductos. Se arranca el
programa pregrabado deseado para realizar el análisis.
En la figura 29 se muestra un ejemplo para DRB1,
así como del tipaje obtenido con el programa
informático facilitado por el distribuidor.
En el caso de obtener un patrón de bandas de
hibridación anormal, advertido por el programa
informático, llevaríamos a cabo el proceso de
secuenciación del DNA.
6. SECUENCIACIÓN DE DNA.
(Sambrook y col. 1989).
Se realizó sólo en aquellos casos en los que se
obtuvieron resultados ambiguos por oligotipaje directo
o reverso.
6.1. SECUENCIACIÓN MEDIANTE CLONAJE.
Este procedimiento se llevó a cabo teniendo en
cuenta las siguientes premisas para los diferentes loci
HLA:
- en todos los casos para HLA-A.
- para HLA-B, en aquellos DNAs que tengan alelos
que pertenecen al mismo grupo de amplificación
(grupos TA y CG, ver Tabla 5).