UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID - Biblioteca de la ...

Tabla 8. Oligonucleótidos empleados en la amplificación y detección de los alelos DQA1
Primers
2DQAAMP-A
2DQAAMP-B
Oligonucleótid
o
DQA 2501
DQA 2502
DQA 2503
DQA 3401
DQA 3402
DQA 3403
DQA 4101W
DQA 4102
DQA 4103W
DQA 5501
DQA 5502
DQA 5503
DQA 5504
DQA 6901
DQA 6902
DQA 6903
DQA 6904
DQA 7502
DQA 7504W
Codones
11-18
80-87
Codones
22-28
22-28
22-28
31-37
31-37
31-37
38-44
38-44
38-44
51-57
51-57
51-57
51-57
66-71
66-71
66-71
66-71
72-78
72-78
Este sistema es capaz de determinar la mayoría de los
alelos descritos para DRB1 (n=155) y DQB1 (n=27), de
acuerdo a la Nomenclatura Oficial (Bodmer y col.
1995).
5.2.1. Amplificación de los loci HLA-DRB y -DQB1
Para el tipaje de los alelos DRB, se realiza una
amplificación del exón 2 de los alelos de los loci DRB;
DRB1, DRB1 + DRB3, DRB1 +DRB4, o DRB1 +
DRB5. Este sistema contiene oligosondas distribuidas
en una tira para hibridar a 55ºC y otra tira para 63ºC,
resultando en una media-alta resolución. Cuando no se
obtiene la máxima resolución de los alelos DRB, el
programa de interpretación INNO-LiPA expert nos
indica que kit adicional debemos usar; INNO-LiPA
DRB1*04 para muestras DR4, INNO-LiPA
DRB1*15/16 para muestras DR2, o INNO-LiPA
decoder para el resto de muestras. Estos sistemas más
Eduardo Gómez Casado
Secuencia 5'!3'
AT GGT GTA AAC TTG TAC CAG T
TT GGT AGC AGC GGT AGA GTT
Secuencia 5'!3'
Especificidades DQA1
Material y Métodos 66
T GGC CAG TAC ACC CAT GA 0101+0102+0104+0401+05011+05012+05013
T GGC CAG TTC ACC CAT GA 0103+0201+0601
T GGG CAG TAC AGC CAT GA 03011+0302
GA GAT GAG GAG TTC TAC G 0101+0104
GA GAT GAG CAG TTC TAC G 0102+0103+05011+05012+05013
GA GAC GAG CAG TTC TAC G 0401+0601
AC CTG GAG AGG AAG GAG A 0101+0102+0104+0201+03011+0302
AC CTG GAG AAG AAG GAG A 0103
AC CTG GGG AGG AAG GAG A 0401+05011+05012+05013+0601
TC AGC AAA TTT GGA GGT T 0101+0102+0103+0104
TC CAC AGA CTT AGA TTT G 0201
TC CGC AGA TTT AGA AGA T 03011+0302
TC AGA CAA TTT AGA TTT G 0401+0601+05011+05012+05013
ATG GCT GTG GCA AAA CAC 0101+0102+0103+0104
ATC GCT GTG CTA AAA CAT 0201+03011+0302
ATC GCT GTC CTA AAA CAT 0302+05011+05012+05013
ATC GCT GTG ACA AAA CAC 0401+0601
C TTG AAC ATC CTG ATT AA 0201+0401+0601
C TTG AAC AGT CTG ATT AA 05011+05012+05013
específicos contienen las mismas oligosondas que kit el
inicial, pero se amplifica de forma específica los alelos
o grupos de alelos de interés. La información de la
composición de los primers y oligosondas no la
proporciona el fabricante.
De igual manera, la determinación por alta
resolución de los alelos DQB1 se realiza con el sistema
INNO-LiPA DQB1, previa amplificación del exón 2
polimórfico del locus DQB1 y posterior hibridación a
56ºC con 21 oligosondas fijas de forma paralela en una
tira.
Las condiciones para la amplificación de DRB y
DQB1 que se aplicaron en el termociclador PCR-9600
(Perkin Elmer Cetus) fueron:
- Desnaturalización previa a 95ºC durante 5 minutos.