UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID - Biblioteca de la ...

El proceso de revelado por quimioluminiscencia
conlleva los siguientes pasos:
- colocamos las membranas entre láminas de
plástico (de conservación de alimentos). Con la
superficie donde está situado el DNA hibridado
hacia arriba, se fija al interior de un chasis
radiográfico con papel adhesivo.
- bajo luz infrarroja, introducimos en el chasis una
placa de radiografía encima de las membranas.
- Dejamos exponer la lámina de radiografía un
tiempo inicial de 3 minutos.
- extraemos la placa de radiografía bajo luz
infrarroja y la revelamos con un procesador rápido
X-Omat (Kodak) en 2 ó 3 minutos. Si la señal
observada es débil (o muy fuerte) exponemos una
nueva placa de radiografía mayor tiempo (o menor
tiempo) hasta obtener una imagen clara (Figura 26).
Figura 26. Resultado obtenido del revelado de
una membrana con 60 amplificados para HLA-
A, identificados mediante números y letras.
Los puntos indican hibridación del amplificado
con el oligonucleótido URSTO 43, que detecta
A*1, A*3, A*11, A*29, A*31, A*32, A*33,
A*36, A*6802, A*74 y A*80.
4.2.6. Deshibridación de las membranas.
Eduardo Gómez Casado
Material y Métodos 65
Las membranas se pueden usar de nuevo tras dos
lavados a 70ºC con una solución de deshibridación.
5. AMPLIFICACIÓN Y OLIGOTIPAJE DE LOS
LOCI HLA DE CLASE II.
5.1. LOCUS HLA-DQA1
La caracterización de los alelos de este locus se
llevó a cabo con la información obtenida del 12º
Workshop Internacional de Histocompatibilidad
(Bignon y Fernandez-Viña 1997). En la Tabla 8 se
muestran las secuencias de oligonucleótidos para la
amplificación del exón 2 polimórfico y determinación
de los subtipos alélicos.
Las reacciones de amplificación del DNA se
prepararon como en el apartado 4.1.3., con las
siguientes condiciones aplicadas al termociclador PCR-
9600:
-Desnaturalización previa a 96ºC durante 5 minutos.
- 30 ciclos de las siguientes etapas:
Desnaturalización a 96ºC, 15 segundos.
Hibridación a 55ºC, 20 segundos.
Extensión a 72ºC, 30 segundos.
-Extensión final a 72ºC durante 10 minutos.
Sobre los productos obtenidos se realizaron
controles de amplificación como se describe en el
apartado 4.1.4. Posteriormente, se procedió al marcaje
no radiactivo de las oligosondas (ver apartado 4.2.2),
transferencia de los amplificados a membranas de nylon
(ver apartado 4.2.3), hibridación de las membranas con
las oligosondas (ver apartado 4.2.4), y finalmente el
revelado en placas de radiografía (ver apartado 4.2.5).
5.2. LOCI HLA-DRB Y -DQB1
La amplificación y detección de los alelos de los
loci de clase II HLA-DRB (DRB1, DRB3, DRB4,
DRB5) y DQB1 se llevó a cabo mediante el sistema
comercial INNO-LiPA (del inglés, Line Probe Assay).
Este sistema de tipaje se basa en el principio de
hibridación reversa (oligotipaje reverso o dot-blot
reverso). Los primers están biotinilados, y, por tanto, el
DNA amplificado también. Posteriormente, el DNA
amplificado se desnaturaliza y se hibrida con
oligosondas inmovilizadas sobre una membrana en
forma de tira. Después de la hibridación, se adiciona
streptavidina conjugado con fosfatasa alcalina. Una
incubación posterior con el cromógeno BCIP/NBT
resulta en un precipitado púrpura en aquellas líneas
donde el oligonucleótido hibridó específicamente con el
DNA amplificado (Figura 27).