UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID - Biblioteca de la ...

4.2.2. Marcaje no radiactivo de los oligonucleótidos.
Se utilizó el sistema comercial "Dig Oligonucleotide
3'-End Labelling Kit" (Boehringer Mannheim,
Mannheim, Alemania)
Se prepara la siguiente mezcla de reacción:
Tampón (5x)...................... 4 µl x N
CoCl2................................. 4 µl x N
Digoxigenina-ddUTP........ 1 µl x N
Terminal Transferasa......... 1 µl x N
donde N es el número de oligonucleótidos a marcar más
uno. Homogeneizamos la mezcla por pipeteo y
tomamos 10 µl de ésta y 10 µl (100 pmoles) de
oligonucleótido. Incubamos 20 min a 37ºC, y finalmente
guardamos a -20ºC el oligonucleótido marcado hasta su
uso.
4.2.3. Transferencia del producto de PCR a
membranas de nylon.
Los amplificados de los loci HLA-A y -B fueron
transferidos con el aparato "Lambda dot II 60 well"
(One Lambda, EE.UU) sobre membranas de nylon de 5
x 7 cm 2 (Hybond-N, Amersham, Buckinghamshire,
Inglaterra). Para ello se tomaron 50 µl del amplificado y
se situaron en un tubo Beckman (Robbins Scientific,
CA, EE.UU ) . Este paso se repite hasta un total de 60
muestras diferentes, que es el número máximo de
muestras que puede el aparato dispensar
automáticamente. Los tubos Beckman se sitúan en un
carrier adaptable al dispensador. Este se programó para
tomar 40 µl de cada tubo y dispensar 0.5 µl, de manera
que se pueden obtener hasta un total de 80 réplicas.
Posteriormente, las membranas se incuban con NaOH
0.4N durante 10 min para desnaturalizar el producto de
PCR bicatenario. Después, se incuba con acetato
amónico 2M durante 10 min para neutralizar los filtros.
Se dejan secar a temperatura ambiente y finalmente, se
exponen a luz ultravioleta (Stratalinker 2400,
Stratagene, Reino Unido) durante 45 segundos a un
gradiente decreciente de energía de 1200 julios.
4.2.4. Hibridación de las membranas de nylon.
Este es un procedimiento para hibridar una
oligosonda de DNA con los fragmentos de DNA
amplificados por la técnica de PCR y transferidos a
filtros de nylon. Se introdujo cada membrana rotulada
con lápiz en un tubo de 50 ml (Falcon) igualmente
identificado. Se añadió a cada tubo 10 ml de Solución
TMAC + 10 µl del correspondiente oligonucleótido
marcado. Todos los oligonucleótidos se incubaron
durante hora y media en un horno con rotación continua
a 54ºC, excepto dos oligonucleótidos de HLA-B (Bw4 y
Bw6, Tabla 7) que se incubaron a 56ºC.
Eduardo Gómez Casado
Material y Métodos 64
Posteriormente, se extrajeron las membranas de los
tubos y se colocaron en un recipiente plástico para la
realización de una serie de lavados, por los que se
eliminará el oligonucleótido no hibridado con el DNA
de la membrana. Estos fueron los siguientes:
- tres lavados de 5 min cada uno con una solución
compuesta de SDS al 0.1% + SSPE 2x.
- dos lavados de 15 min cada uno con solución
TMAC (500 ml) precalentada a 60ºC, en un baño
con agitación a la misma temperatura. Los
oligonucleótidos Bw4 y Bw6 se lavaron a 62ºC.
- tres lavados de 5 min cada uno a temperatura
ambiente con una solución formada por SSPE 2x.
Posteriormente, se realizan varias incubaciones con
el fin de preparar las membranas para la unión del
anticuerpo conjugado de la digoxigenina:
- un lavado de 5 min con tampón 1 a temperatura
ambiente.
- un lavado de 30 min con tampón 2 a temperatura
ambiente. Este lavado bloquea la membrana para
evitar las uniones inespecíficas del anticuerpo anti-
digoxigenina.
- un lavado de 1 min con tampón 1 a temperatura
ambiente.
- un lavado de 30 min a temperatura ambiente con
tampón 1 + gelatina al 0.25% + anticuerpo antidigoxigenina.
La proporción es de 5ml de tampón 1
+ gelatina por 1µl de anticuerpo, y se debe preparar
en el momento.
- dos lavados con tampón 1 de 15 min cada uno a
temperatura ambiente. Con este lavado eliminamos
el exceso de anticuerpo anti-digoxigenina.
Para el revelado se realizó lo siguiente:
- un lavado con tampón 3 (pH 9.5) de 5 min a
temperatura ambiente. Con este lavado
equilibramos las membranas a pH básico para que
la enzima actúe de forma eficaz.
- se prepara la solución sustrato (New England
Biolabs, CA, EE.UU) compuesta de diluyente de
sustrato (25x) y el propio sustrato (100x) a una
concentración final de 1x, teniendo en cuenta que
cada membrana requiere 2 ml de esta solución.
- se disponen las membranas en recipientes
plásticos individuales o alguna superficie
desechable no porosa.
- se añade la solución sustrato por encima de las
membranas. Un primer contacto es suficiente para
que comience la reacción de revelado.
- se colocan las membranas sobre papel secante
para quitar el exceso de solución sustrato pero
teniendo cuidado de que no se sobresequen.
Las membranas están listas para el revelado.
4.2.5. Exposición y revelado.