UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID - Biblioteca de la ...

Tabla 5. Grupos de amplificación de los alelos HLA-B.
Grupo CG
Grupo TA
No clasificado
4.1.4. Controles de amplificación.
La alta sensibilidad de la técnica de la PCR (pueden
obtenerse más de un millón de copias de la región
flanqueada por los primers utilizados), hace necesario
un cuidado extremo en la manipulación de las muestras
para evitar contaminaciones.
Por ello en las reacciones se introduce un control
NEGATIVO, que consta de los mismos ingredientes
que una reacción estándar, sustituyendo el DNA
sustrato por agua bidestilada.
El control de amplificación se realizó por
electroforesis en un gel de agarosa a una concentración
del 2%.
La electroforesis se lleva a cabo en presencia de
tampón TEA 1x en una cubeta de electroforesis. En
cada pocillo se cargan 7 µl de la mezcla resultante de:
- 5 µl del producto de la PCR.
- 2 µl de tampón de carga.
Además, se incluye un marcador de masa molecular
(MW VI, Boehringer Mannheim) para identificar el
tamaño de amplificación de nuestras muestras. Este se
prepara tomando 2 µl del marcador, 2 µl de agua
bidestilada y 1 µl de tampón de carga.
Una vez cargadas las muestras y el marcador en los
pocillos, se someten a electroforesis durante 40 minutos
a 130 voltios, visualizándose finalmente el resultado en
un transiluminador ultravioleta (254 nm). El resultado
se recoge mediante un sistema de fotografía y es el que
se muestra en la figura 25.
4.2. OLIGOTIPAJE DE LOS LOCI HLA DE CLASE I
El tipaje genético mediante oligosondas de DNA se
denomina oligotipaje. Los oligonucleótidos se diseñan
con una secuencia complementaria a cada una de las
regiones polimórficas que definen alelos o grupos de
alelos HLA-A y -B en las regiones exónicas e intrónicas
amplificadas. La hibridación (o ausencia de hibridación)
con los amplificados de HLA-A y -B se detecta por
quimioluminiscencia. El conjunto de especificidades
definido por cada oligonucleótido positivo y negativo,
nos indicará qué antígenos HLA-A y -B presenta el
Eduardo Gómez Casado
individuo estudiado.
4.2.1. Oligonucleótidos empleados.
Material y Métodos 60
B*13, B*15 (-1522), B*18, B*27, B*37, B*40, B*41,
B*44, B*45, B*46, B*47, B*49, B*50, B*54, B*55,
B*56, B*57, B*59, B*82
B*7, B*8, B*14, B*1522, B*35, B*38, B*39, B*42,
B*48, B*51, B*52, B*53, B*58, B*67, B*78, B*81
B*73
Figura 25. Productos de amplificación para el locus
HLA-A. (calles 1-8, 9-10 y 11-13). Además, se
incluye un control negativo (C-) y un marcador de
masa molecular (M).
Para la determinación de alelos HLA-A se utilizaron
29 oligonucleótidos: 26 de ellos corresponden a los
exones 2 y 3 (Arguello y col. 1996), y el resto
reconocen secuencias del intrón 2 y fueron diseñados
para este trabajo (ver Tabla 6). Los alelos del locus
HLA-B (Tabla 7) se determinaron con la ayuda de 53
oligonucleótidos: 26 reconocen secuencias de los
exones 2 y 3 (Arguello y col. 1996), 2 oligonucleótidos
de secuencia previamente publicada (Yoshida y col.
1992) se pusieron a punto para reconocer
especificidades Bw4/Bw6, y 22 se diseñaron para este
trabajo, de los cuales 9 también reconocen secuencias
de los exones 2 y 3, y los 16 restantes identifican
secuencias de los intrones 1 y 2. Las Tablas 6 y 7
muestran los oligonucleótidos empleados y la
especificidad de cada uno para los alelos HLA-A y -B.