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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID - Biblioteca de la ...

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a)<br />

b)<br />

5'AE1c<br />

Eduardo Gómez Casado<br />

Material y Métodos 59<br />

Figura 24. Esquema <strong>de</strong> <strong>la</strong>s regiones amplificadas <strong>de</strong> los loci HLA <strong>de</strong> c<strong>la</strong>se I: a) HLA-A y b) HLA-B.<br />

amplificación se muestra en <strong>la</strong> figura 24.<br />

- Todo ello en un volumen final <strong>de</strong> 100 µl.<br />

4.1.3. Reacciones <strong>de</strong> amplificación <strong>de</strong>l DNA.<br />

La mezc<strong>la</strong> <strong>de</strong> reacción <strong>de</strong> PCR para amplificar<br />

HLA-A y -B a partir DNA genómico constaba <strong>de</strong>:<br />

- DNA genómico: 1 µg<br />

- KCl 50 mM<br />

- Tris, pH 8.3, 10 mM<br />

- MgCl2 1.5 mM<br />

- Ge<strong>la</strong>tina 0.01%<br />

- dATP 200 µM<br />

- dCTP 200 µM<br />

- dGTP 200 µM<br />

- dTTP 200 µM<br />

- Primer 5': 1 µM<br />

- Primer 3': 1 µM<br />

- Taq polimerasa, 2.5 Unida<strong>de</strong>s enzimáticas (Perkin<br />

Elmer Cetus, EE.UU).<br />

Es importante seña<strong>la</strong>r que <strong>la</strong> mezc<strong>la</strong> se prepara en su<br />

totalidad excluyendo el DNA y se expone durante 15<br />

minutos con luz ultravioleta a dos longitu<strong>de</strong>s <strong>de</strong> onda:<br />

254 y 302 nm. La irradiación fragmentaría el posible<br />

DNA contaminante, impidiendo que actúe <strong>de</strong> mol<strong>de</strong> en<br />

el proceso <strong>de</strong> amplificación. Las condiciones para <strong>la</strong><br />

amplificación <strong>de</strong> HLA-A y -B que se aplicaron en el<br />

termocic<strong>la</strong>dor PCR-9600 (Perkin Elmer Cetus) fueron:<br />

- Desnaturalización previa a 96ºC durante 1 minuto.<br />

- 4 ciclos <strong>de</strong> <strong>la</strong>s siguientes etapas:<br />

Desnaturalización a 96ºC, 15 segundos.<br />

Hibridación a 72ºC, 45 segundos.<br />

Extensión a 72ºC, 40 segundos.<br />

- 21 ciclos <strong>de</strong> <strong>la</strong>s siguientes etapas:<br />

Desnaturalización a 96ºC, 15 segundos.<br />

Hibridación a 65ºC, 10 segundos.<br />

Extensión a 72ºC, 1 minuto y 10 segundos.<br />

- Extensión final a 72ºC durante 10 minutos.<br />

Tab<strong>la</strong> 4. Oligonucleótidos empleados para <strong>la</strong> amplificación y secuenciación <strong>de</strong> los loci HLA-A y HLA-B<br />

HLA-A<br />

Primer<br />

5'AE1c<br />

3'Ai3c<br />

HLA-B<br />

Primer<br />

5BN1-CG<br />

5BN1-TA<br />

3Bint3-37<br />

EXON 1 INTRON 1<br />

74bp<br />

EXON 1<br />

74bp<br />

5'BN1-TA<br />

5'BN1-CG<br />

129 bp<br />

INTRON 1<br />

129 bp<br />

EXON 2<br />

270 bp<br />

EXON 2<br />

270 bp<br />

Secuencia 5'!3'<br />

CAGACGCCGAGGATGGC<br />

GATCAGGGAGGCGCCCCG<br />

Secuencia 5'!3'<br />

CGGGGGCGCAGGACCCGG<br />

GGCGGGGGCGCAGGACCTGA<br />

AGGCCATCCCCG(G/C)CGACCTAT<br />

INTRON 2<br />

245 bp<br />

EXON 3<br />

276 bp<br />

Localización (pb)<br />

5'UT-Exón 1 (-12 a 5)<br />

Intrón 3 (14 a 31)<br />

Localización (pb)<br />

Intrón 1 (59 a 76)<br />

Intrón 1 (57 a 76)<br />

Intrón 3 (3 a 37)<br />

INTRON 3<br />

3'Ai3c<br />

INTRON 2 EXON 3 INTRON 3<br />

276 bp<br />

245 bp<br />

3'Bint3-37

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