UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID - Biblioteca de la ...

incubación de esta disolución amoniacal a 54ºC durante
un tiempo de 5 a 12 horas permite la desprotección de
todas las bases de la secuencia y la obtención del
fragmento de DNA en solución acuosa.
3.1.2. Purificación de oligonucleótidos.
Existen varios métodos de purificación de
oligonucleótidos. El más cómodo y rápido consiste en la
utilización del llamado cartucho de purificación de
oligonucleótidos (OPC; del inglés: Oligonucleotide
Purification Cartridge). Se llevan a cabo los siguientes
pasos:
-Inyección a través del cartucho (flujo de 1 a 2 gotas
por segundo) de 5 ml de acetonitrilo grado HPLC.
-Inyección a través del cartucho (flujo de 1 a 2 gotas
por segundo) de 5 ml de acetato de trietilamina
(TEAA) 2 M, a pH 7.0.
-Inyección a través del cartucho de 1 ml de
amoníaco, seguido del volumen de la solución de
oligonucleótido obtenida (habitualmente 0.5 ml) y
de 0.5 ml de agua bidestilada.
-Recoger el eluyente y hacerlo pasar de nuevo por el
mismo cartucho.
-Lavar el cartucho con 5 ml de amoníaco diluido, 3
veces.
-Lavar el cartucho con 5 ml de agua bidestilada, 2
veces.
-Lavar el cartucho con 5 ml de TEAA al 2%, 2
veces.
-Lavar el cartucho con 5 ml de agua bidestilada, 2
veces.
-Inyectar al cartucho 1 ml de acetonitrilo al 20%: el
eluyente que se recoge contiene el oligonucleótido
purificado.
-Desecar la solución en una centrífuga conectada a
vacío.
3.1.3. Precipitación de oligonucleótidos.
El procedimiento para eliminar las sales del
oligonucleótido seco es el siguiente:
- Añadir 100 µl de acetato sódico 2M pH 4.5 y
resuspender por pipeteo.
-Añadir 900 µl de etanol absoluto. Homogeneizar la
mezcla. Enfriar 60 min a -70ºC
- Centrifugar a 4ºC a 14000 rpm. Desechar el
sobrenadante a vacío o por pipeteo.
- Secar en centrífuga a vacío, teniendo cuidado de
no sobresecar.
- Resuspender en 100 µl de agua bidestilada.
3.1.4. Medición espectrofotométrica de
oligonucleótidos.
Una dilución que consta de 3 µl de oligonucleótido
resuspendido en 297 µl de agua bidestilada, se mide al
Eduardo Gómez Casado
Material y Métodos 58
espectrofotómetro a una longitud de onda de 260 nm.
La concentración del oligonucleótido en la solución
original se obtiene aplicando la siguiente fórmula:
Factor de dilución x A 260 * x 100
Concentración (µM) = -----------------------------------------------
---
1,54A + 0.75C + 1.17G + 0.92T
* Valor de la medición a longitud de onda de 260 nm.
3.1.5. Oligonucleótidos empleados.
Los oligonucleótidos utilizados en la amplificación y
oligotipaje de los loci HLA-A y -B se muestran en la
tablas 4, 6 y 7. Los oligonucleótidos utilizados en la
secuenciación de alelos de clase I y clase II se muestran
en las tablas 4, 8 y 9.
4. AMPLIFICACIÓN Y OLIGOTIPAJE DE LOS
LOCI HLA DE CLASE I
4.1. AMPLIFICACIÓN DE LOS LOCI HLA DE CLASE I
4.1.1. Locus HLA-A.
A partir de las secuencias exónicas (Arnett y
Parham 1995) e intrónicas (Summers y col. 1993) de los
alelos HLA-A, se diseñaron primers específicos para
este locus (Tabla 4). La amplificación conjunta de los
dos alelos HLA-A para cada individuo estudiado, rinde
fragmentos de aproximadamente 1000 pb y comprende
las regiones nucleotídicas completas del exón 1, intrón
1, exón 2, intrón 2, exón 3 y el intrón 3 de forma
parcial. Un esquema de la amplificación se muestra en
la figura 24.
4.1.2. Locus HLA-B.
La obtención de secuencias no codificantes de
intrones 1, 2 y 3, permitió a Cereb y col. (1996)
establecer un dimorfismo en el intrón 1 para alelos de
HLA-B. En base a este dimorfismo, los alelos HLA-B
pueden clasificarse en dos grupos diferenciados (ver
Tabla 5). El diseño de dos primers para el extremo 5'
específicos de cada grupo, y de un primer 3' genérico de
todos los alelos HLA-B (ver Tabla 4), permite aplicar a
un mismo DNA las dos amplificaciones de grupo. Si el
DNA amplifica sólo para uno de los dos grupos, bien
grupo CG bien grupo TA, indicará que los dos alelos
pertenecen a este grupo. De lo contrario, el individuo
será heterocigoto de grupo para HLA-B. Esta
separación específica en la PCR nos va a facilitar la
resolución de los alelos HLA-B en el oligotipaje.
Las amplificaciones rinden fragmentos de
aproximadamente 900 pb, y comprende las regiones
nucleotídicas del intrón 1 (parcial), exón 2, intrón 2,
exón 3 y el intrón 3 (parcial). Un esquema de la