UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID - Biblioteca de la ...

3.- Elongación o polimerización: este paso consiste en
la extensión, en sentido 5'3' del complejo primer-
DNA substrato. Como enzima DNA polimerasa que
incorpora los deoxinucleótidos monofosfato (dNMPs), a
partir de los trifosfato (dNTPs) presentes en la
disolución, se utiliza de preferencia la denominada Taqpolimerasa
(extraída de la bacteria Thermus aquaticus,
Saiki y col. 1985).
3.1. OLIGONUCLEÓTIDOS SINTÉTICOS.
3.1.1. Síntesis de oligonucleótidos.
La síntesis de los oligonucleótidos empleados como
cebadores en las reacciones de amplificación se llevó a
cabo en el sintetizador automático "Oligo-1000M DNA
Synthesizer" (Beckman, Palo Alto, CA, EE.UU). La
técnica de síntesis está basada en la denominada
"química de cianoetil-fosforamidito", que consiste en la
incorporación sucesiva de los diferentes nucleótidos a
un soporte sólido funcionalizado, a través de tres etapas:
1) Protección de nucleósidos y funcionalización del
soporte: los nucleósidos se protegen por acilación de sus
grupos amino (con cloruro de benzoilo para la citidina y
adenosina, y cloruro de isobutirilo para la guanosina, la
timidina no necesita protección); y el bloqueo de la
posición 5'-OH con p-dimetoxotritilo. Con el primer
nucleósido de la secuencia (teniendo en cuenta que la
síntesis ocurre en sentido 3'5'), se funcionaliza el
soporte sólido. Esto consiste en la reacción del primer
nucleósido con grupos carboxilos terminales presentes
en el soporte, que suele ser gel de sílice o vidrio de poro
controlado.
2) Síntesis cíclica: comienza haciendo pasar a través del
soporte funcionalizado una disolución de ácido
tricloroacético (TCA), el cual libera el 5'-OH del
nucleósido unido al soporte del grupo p-dimetoxitritilo.
Seguidamente se añade el fosforamidito (reacción del
nucleósido protegido con N,N-diisopropil-clorometoxifosfina)
del segundo nucleótido de la secuencia.
Los posibles 5'-OH que no hayan reaccionado se
bloquean haciendo pasar por la columna una solución
de anhídrido acético. Con una disolución de iodo se
oxidan los grupos fosfitos a fosfatos obteniendo así un
dímero unido al soporte por el 3'-OH. Se vuelve a pasar
TCA a través de la columna, se libera la posición 5'-OH
y el dímero es susceptible de admitir un tercer
nucleótido. Este ciclo se repite hasta llegar a la longitud
de secuencia deseada.
3) Liberación del soporte y desprotección final: al
acabar el ciclo de síntesis se ha obtenido una cadena de
oligonucleótido unida al soporte. Añadiendo tiofenol se
liberan todos los metoxilos unidos a los átomos de
fósforo y eluyendo con amoníaco concentrado queda
separado el oligonucleótido del soporte sólido. La
Eduardo Gómez Casado
DNA
Taq Pol
Buffer
MgCl2
Material y Métodos 57
dATP
dCTP
dTTP
dGTP
PCR
Figura 23. Primeros ciclos de una PCR.