UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID - Biblioteca de la ...

1. POBLACIÓN ESTUDIADA.
1.1. SELECCIÓN DE INDIVIDUOS.
Con la colaboración de Polybios Iliakis, se
seleccionaron 135 donantes de sangre voluntarios sanos
no emparentados, cuyos antepasados han vivido en la
isla al menos tres generaciones. Las localidades
cretenses de donde procedían los donantes eran variadas
y comprendían una muestra representativa de toda la
isla: Iraklion, Rethimnon, Sitia, Ierapetra, Malia y
Timbaki entre otras (ver figura 22).
1.2. RECOGIDA DE MUESTRAS.
Se procedió a la extracción de sangre periférica con
un sistema de vacío (Venoject, Terumo, Japón) en tubos
de 10 ml que contenían EDTA-Na + como
anticoagulante. Posteriormente, para cada muestra de
sangre se mezclaron volúmenes iguales (7'5 ml) de
sangre anticoagulada y solución conservante (SC) en
tubos de polipropileno de 15 ml, que se identificaron de
forma apropiada. La solución conservante impide la
degradación del DNA genómico y lo mantiene en
condiciones óptimas hasta su extracción.
2. EXTRACCIÓN DE DNA GENÓMICO.
Se realizó de forma manual mediante extracción con
fenol/cloroformo/agua (FCA). Los pasos fueron los
siguientes:
-Incubación a 37ºC durante 14 horas y en agitación de
la siguiente mezcla:
-15 ml de sangre periférica + solución conservante.
-15 ml de reactivo de lisis (Applied Biosystems, CA,
EE.UU).
-1 ml de Proteinasa K (200 µg/ml)
-Una extracción con un volumen de FCA (Applied
Biosystems, CA, EE.UU).
-Incubación en agitación durante 10 minutos, y
posterior centrifugación a 2500 rpm a temperatura
ambiente.
-Se recoge la fase acuosa (superior).
-Adición de un volumen de FCA.
-Incubación en agitación durante 10 minutos, y
posterior centrifugación a 2500 rpm a temperatura
ambiente.
-Se recoge la fase acuosa (superior).
-Adición de un volumen de cloroformo (Applied
Biosystems, CA, EE.UU).
-Incubación en agitación durante 10 minutos, y
posterior centrifugación a 2500 rpm a temperatura
ambiente.
-Se recoge la fase acuosa (superior).
-Adición de dos volúmenes de isopropanol.
-Agitación suave y posterior precipitación del DNA en
forma de "medusa", o bien precipitación del DNA
Eduardo Gómez Casado
Material y Métodos 55
(aspecto de aceite) solvatado con el exceso de sal que
inicialmente tenía la solución conservante.
-Dos lavados con etanol al 70% (-20ºC). En el primer
lavado, el DNA con aspecto de aceite forma "medusa"
debido a la disolución del exceso de sal en el 30% de
agua que contiene el etanol frío.
A los DNAs extraídos se les añade agua bidestilada
para su resuspensión y se conservan a -20ºC hasta su
utilización. El cálculo de concentración del DNA se
realiza sobre una mezcla compuesta de 3 µl de DNA y
297 µl de agua bidestilada (dilución 1/100). Se mide la
absorbancia de esta muestra a 260 y 280 nm. Se aplica
la fórmula:
[DNA]= Factor de dilución x 50x A260
La relación A260/A280 nos indica la pureza del DNA
y debe comprender un valor entre 1'6-1'8.
3. REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR).
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR, del
inglés: Polymerase Chain Reaction), es un método de
obtención de un número elevado de copias a partir de un
fragmento de ácidos nucleicos de interés. Partiendo de
una muestra con un sustrato DNA de cualquier origen,
la PCR consiste en la repetición cíclica de tres etapas
por el siguiente orden (Figura 23):
1.- Desnaturalización: consiste en la separación de cada
una de las dos cadenas del DNA substrato, efecto que se
consigue al incubar la muestra a alta temperatura (93-
97ºC). Las dos cadenas permanecerán separadas libres
en la disolución hasta que la temperatura baje lo
suficiente (37-55ºC) para permitir la renaturalización.
2.- Anillamiento o hibridación: en presencia de altas
concentraciones de oligonucleótidos sintéticos
(denominados primers o cebadores), complementarios a
ciertas zonas del DNA substrato, el descenso de
temperatura previamente citado permite la hibridación
de dichos cebadores a sus secuencias homólogas en el
DNA substrato. Para la amplificación de una región de
DNA "diana", son necesarios por tanto dos primers, uno
de ellos complementario a una de las cadenas y el otro a
la antiparalela, en zonas que flanqueen el segmento de
DNA que queremos amplificar. Estos primers vienen
definidos, por tanto, por la secuencia del DNA
substrato, vienen a estar compuestos en la mayoría de
los casos por 18-28 nucleótidos y es necesario que sus
secuencias no sean complementarias entre sí.