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Apuntes de clases. 2012
Técnicas para fibras colágenas y elásticas del Tejido
Conjuntivo.
Prof. TM Patricia Toledo Rodríguez
En el tejido conjuntivo se identifican varios elementos: músculo liso,
estriado, eritrocitos, fibras y otros tipos celulares .Las fibras colágenas
están constituidas por grupos fuertemente catiónicos dependiente de
los aminoácidos que forman su cadena polipeptídica (glicoproteínas
básicas) con alta proporción de glicina, hodroxiprolina y prolina,
además de pequeñas cantidades de hidroxilisina de manera que se
aprovecha esa característica para ser identificados con colorantes
aniónicos. Se identifican cerca de 20 tipos diferentes de colágenas,
reconocidas por su secuencia de aminoácidos, y sus propiedades
físicas e inmunológicas. En mamíferos destacan cuatro:
Tipo I : colágeno de tendones
Tipo II: componente de cartílago hialino
Tipo III: Piel y músculos, membranas basales
Tipo IV.: principal colágeno de membranas basales (en asociación
con otras proteínas) es no birrefringente.
Dentro las metodologías de identificación de las fibras colágenas,
destacan las técnicas Tricromicas (tres colores). Las técnicas
tricrómicas tienen siempre un colorante nuclear y al menos dos
colorantes aniónicos que se utilizan asociados a una molécula de
heteropoliácido (HPA). Se discuten tres teorías del mecanismo de
tinción.
1.- Los HPA: los más usados son el ácido fosfomolibdico PMA y el
ácido Fosfotungstico PTA; éstas moléculas se usan en pasos
sucesivos o en asociación a los colorantes aniónicos. Los HPA tienen
la propiedad de unirse a proteínas y aminoácidos, pero no a hidratos
de carbono, el efecto es la coloración selectiva de las fibras de
colágeno por uno de los colorantes aniónicos, cartílago y algunas

mucosustancias muestran la misma afinidad tintorial pero más leve. El
ácido fosfomolíbdico no solamente produce una tinción intensa de las
fibras de tejido conectivo por colorantes de grupos aniónicos, sino que
también reduce la tinción del citoplasma. Los HPA forman enlaces
coordinados con molibdatos o tungstato o iones de ácido fosfóricos.
Son colorantes aniónicos: azul de anilina, fucsina ácida, fast green y
verde luz. El uso de los HPA además favorece colorear en un medio
fuertemente ácido, el pH óptimo es cerca de 1,5 (a pH 2,5 hay pérdida
de un 50% de la afinidad).
2. Los HPA generarían una fuerte negatividad en la carga de las fibras
de colágeno, similar a la función de un MORDIENTE. Esta teoría tiene
detractores, pues deja absolutamente de lado la conocida composición
de la fibras de colágeno, además de generarse un conflicto con la
hemoglobina de los eritrocitos, pues tiene una alta proporción de
aminoácidos básicos y no se tiñe igual que las fibras de colágeno. Se
sugiere que los colorantes se unirían por fuerzas iónicas a los HPA
que ya estarían unidas a las fibra de colágeno.
3. Los HPA tendrían dos maneras de unirse a los tejidos, primero por
uniones ionicas de los HPA con proteínas del citoplasma que inhibirían
las uniones de los colorantes en el citoplasma, la unión de los HPA a
las fibras de colágeno serían por uniones no iónicas. Esta teoría tiene
detractores.
En general, para éstas técnicas no se recomiendan fijadores
alcoholicos; los mejores resultados se obtienen con mezclas fijadoras
en base de mercurio (recordar desenkerizar los cortes), Bouin y
Formalina logran buenos resultados. Se pueden realizar
mordentaciones de las muestras fijadas con formalina con solución
fijadora de Bouin.
Se prefiere realizar tinción nuclear con Hematoxilina de Weiger, debido
a que la laca formada es más fuerte que las aluminicas, además de no
requerir proceso de diferenciación.
Se postula que el mecanismo de coloración no es solo atribuible al
efecto de los HPA, sino que además intervendrían factores como la
malla molecular formada por el entrecruzamiento de las proteínas
durante la fijación lo que genera grados de permeabilidad al paso de

los colorantes, motivo por el que muestras fijadas con dialdehídos
(Glutaraldehído, glioxal, etc) no son recomendables en éstas técnicas.
Esto explicaría que colorantes de peso molecular menor (ácido pícrico,
orange G, biebrich, azofloxina, etc) son capaces de penetrar algunas
estructuras como citoplasma (poro fino) produciéndose una coloración
diferencial con aquellas estructuras con una red más laxa. Según J.A.
Kiernan la selectividad de éstas técnicas es aun poco entendida.
En resumen: los cortes primero se tiñen con un colorante nuclear
(hematoxilinas férricas frecuentemente), luego al menos dos
colorantes ácidos junto a HPA, que sumado a diferencias de
permeabilidad se genera la tinción selectiva de citoplasma y fibras de
colágeno.
1. Método de Masson
Se utiliza en general para diferenciar las fibras colágenas del
músculo liso.
Mecanismo: los colorantes utilizados en éste método son
Solución acuosa de Biebrich Scarlet (CI 26905) + Fucsina ácida
(42685) ambos en solución con ácido acético. Solución acuosa
de ácido fosfomolíbdico-fosfotúngstico (denominados colorantes
sin colorear), tiñendo citoplasma, queratina y fibras musculares
de color rosado a rojo. Azul de anilina (CI 42755) en medio
ácido que tiñen las fibras colágenas. El azul de anilina puede
ser reemplazado por verde luz al 2% (CI 42095) o fast green
FCF (CI 42053) en medio ácido. Tinción nuclear con
Hematoxilina de Weigert, núcleos negros

2. Método Picro-fuscina de Van Gieson
Mecanismo: Se inicia con la tinción nuclear con Hematoxilina de
Weigert. Luego es una solución en medio ácido se entrega a los
aminoácidos carga positiva (prolina, glicina e hidroxilisina),
permitiendo la coloración con la fucsina ácida (CI 42685) o el
ponceau que van junto a una solución acuosa saturada de ácido
pícrico, Fibras colágenas rojas. Por otra parte al ser el ácido
pícrico una molécula de pequeño tamaño logra teñir el
citoplasma célular de color amarillo ( un buen control son los
glóbulos rojos que estén presentes en el corte histológico).
3. Método de Mallory (1905)
Metodo: los colorantes utilizados son Fucsina ácida 0,1- 0,5 %
en solución acuosa (CI 42685), dando la tinción nuclear. Una
solución de azul de anilina (CI 42755, tener la precaución de no
usar el colorante soluble en alcohol) o azul de metileno (CI
42780) para fibras colágenas; con Orange G (CI 16230) el que
es una partícula muy difusible (citoplasmas) y ácido
Fosfotungstico 2% o Fosfomolibdico (heteropoliácido que forma
una laca entre el colágeno y el colorante).
4. Coloración diferencial de colágenas tipo I, II y III Rojo Sirius.
Método: Utiliza una solución de picro sirius (rojo sirius F3BA CI
35780 0.1% - 1% en una solución acuosa saturada de ácido
pícrico), los resultados son fibras de color rojo y citoplasma
amarillo; las láminas al ser observadas en microscopio de
polarización, la tinción lograda no es selectiva, pero ofrece una
oportunidad de identificar especialmente las fibras de colágenas
neo formadas, las colágenas tipo I amarillo brillante, naranja o
rojo, las II (de acuerdo a orientación) azules o amarillas claras, III
verde. Las fibras colágenas y reticulares son anisotrópicas en
cortes longitudinales (birrefringencia amarilla) e isotrópicas en
cortes transversales.

5. Método de Gomori:
Método: es un método en un paso. Utiliza una solución de
Hemalumbre de Gomori (hematoxilina + alcohol absoluto +
alumbre de potasio + dióxido de mercurio + agua destilada) y
Colorante de Gomori (agua destilada + Chromotro 2R CI 16570+
Fast green FCF CI 42053 + ácido fosfotúngstico y ácido acético);
el pH de la solución es de 2,5 a 2,7 levemente superior al óptimo
para fibras colágenas, por lo que puede presentar una coloración
incompleta y difusa del componente fibrilar más fino; resultando
los núcleos y fibras musculares de color violeta, fibras
colágenas verde y los citoplasmas rosados.
Otros métodos para fibras colágenas son: tricromicro Azan de
Heidenhein, Método rápido de Mallory- Heidenhein, Tricromico de
Cason, Gallegos, Gabe, Método de Ramon y Cajal para fibras
reticulares, colágenas y elásticas., Método de Arteta, Método de
“Allchrome” de Lillie
Colorantes utilizados:
Fucsina ácida: es generada a partir de la F. básica mediante la adición
de grupos sulfónicos (que le dan el carácter ácido)
Rojo Sirius: colorante poliazo, es una molécula de un PM más alto que
la Fucsina, pero planar. Puede ser reemplazada por el colorante benzo
azul BB (CI 22610), la birrefringencia ahora obtenida es azul-violeta a
amarillo.

Verde Luz:
Azul de anilina: hasta el día de hoy se dan dos fórmulas diferentes de
éste colorante, por lo que es posible que en las presentaciones
comerciales se encuentran ambas.
Acido Pícrico:

IDENTIFICACION DE LAS FIBRAS ELASTICAS.
Las fibras elásticas están constituidas en un 92% por elastina y un 8%
por microfibrillas. La elastina es una proteína hidrofóbica que contiene
muy pocos aminoácidos con cadenas laterales ionizables, es rica en
aminoácidos no polares. Las microfibrillas son ricas en aminoácidos
polares, posee gran cantidad de cisternas (por lo tanto abundan los
grupos SH) y un 5% de ellas corresponde a hexosas-hexosaminas
(glicoproteínas). Los colorantes no serán atraídos a la elastina con
fuerzas iónicas electroéstaticas, si no que se postula sea por fuerzas
de Van der Waals y puentes de Hidrógeno cuando la solución
colorante es alcohólica. Si se realiza un bloqueo de los grupos
reactivos, se genera poco efecto en la coloración y la prevención de
puentes de hidrógeno disminuye levemente la coloración, el tipo de
uniones que estaría jugando un papel muy importante son las fuerzas
de Van der Waals.
Mecanismo de acción Hematoxilina de Verhoeff.
HEMATOXILINA: colorante aniónico
ALCOHOL ABS.: solvente de la hematoxilina
CLORURO FERRICO: acción de mordiente y oxidante
SOLUCION DE YODO: estabilizador de la hematoxilina
Las teorías que explican el mecanismo de tinción de la HV son
empíricas.
La capacidad de tinción de la solución de yodo disminuye en el tiempo
(horas) y el efecto del yodo es aumentar la vida útil de la H Férrica. El
hecho que la capacidad de tinción disminuya en el tiempo se debe a
que los iones fierro están en exceso (cloruro férrico al 10%) forman un
complejo metal-colorante, epro estas solucione no son indifenidamente
estables. Por otro lado, el yodo puede cambiar la oxidación de los
grupos SH y las microfibrillas que componen la fibras elásticas; esto
resulta importante pues la unión del colorante al tejido es por puentes
de hidrógeno y fuerzas de Van der Waals.

El método se realiza en dos pasos:
1. Se realiza una sobresaturación de las fibras elásticas con la
Hematoxilina ferrica.
2. Se realiza una diferenciación con cloruro ferrico al 2%, el cual
extrae el colorante unido inespecíficamente. Es opcional una
tinción de contraste
Método de ORCEINA
La Orceína es un colorante natural que se utiliza en solución
alcohólica puesto que no es muy soluble en agua. Mecanismo:
complejo colorante, oxaxina y azino oxaxinas básicas, se cree que une
por puentes de hidrógeno, fuerzas de van der Waals o uniones no
específicas con grupos aromáticos. El colorante es insoluble en agua
por lo que se disuelve en alcohol; es muy importante el pH ácido se
utiliza para aumentar las posibilidades de uniones por fuerzas de
Vander Waals y puentes de H. Pues si se trabaja a pH neutro es un
colorante ácido y colorea más fuertemente las fibras de colágeno,
obteniéndose coloraciones poco selectivas.
La tinción se realiza por sobresaturación y luego se diferencia con
alcohol clorhídrico al 1%.
BIBLIOGRAFIA:
Guía de Técnicas de Histología y Citología, segunda edición U de
Chile.
Manual de laboratorio clínico diagnóstico. Raimundo García del
Moral, 2001
Técnicas en histología y biología celular. Luis Montuenga . 2009
Histological and histochemical Methods J.A. Kiernan 4° edición
Apuntes UC