Escalas de tiempo en RMN
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Metodologías para la <strong>de</strong>terminación estructural<br />
<strong>de</strong> fármacos y el estudio <strong>de</strong> f<strong>en</strong>óm<strong>en</strong>os <strong>de</strong><br />
reconocimi<strong>en</strong>to molecular<br />
Programa <strong>de</strong> doctorado <strong>en</strong> Química Médica<br />
<strong>Escalas</strong> <strong>de</strong> <strong>tiempo</strong> <strong>en</strong> <strong>RMN</strong><br />
Gema Domínguez Martín<br />
USP-CEU<br />
1
<strong>Escalas</strong> <strong>de</strong> <strong>tiempo</strong> <strong>en</strong> <strong>RMN</strong><br />
Procesos <strong>de</strong> relajación. Relajación espín-red. Relajación espínespín.<br />
Determinación <strong>de</strong> T1. Determinación <strong>de</strong> T2, secu<strong>en</strong>cia<br />
<strong>de</strong> eco <strong>de</strong> espín. Técnicas <strong>de</strong> doble resonancia.<br />
Deacoplami<strong>en</strong>to homonuclear. Desacoplami<strong>en</strong>to heteronuclear.<br />
Espectros editados utilizando secu<strong>en</strong>cias <strong>de</strong> eco <strong>de</strong> espín:<br />
modulación por la constante <strong>de</strong> acoplami<strong>en</strong>to (SEFT y APT).<br />
Transfer<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> polarización por irradiación selectiva (SPT).<br />
Transfer<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> polarización por inversión <strong>de</strong> población (SPI).<br />
Experim<strong>en</strong>to INEPT. Experim<strong>en</strong>to DEPT.<br />
USP-CEU<br />
2
Procesos <strong>de</strong> relajación<br />
• En un campo magnético estático B0 , la magnetización longitudinal Mz (<strong>en</strong> el<br />
eje z) crece progresivam<strong>en</strong>te <strong>de</strong>s<strong>de</strong> cero hasta un valor máximo M0 . En ese<br />
mom<strong>en</strong>to el sistema habrá alcanzado el equilibrio térmodinámico y la<br />
ocupación <strong>de</strong> los niveles v<strong>en</strong>drá gobernada por la estadística <strong>de</strong> Boltzman: el<br />
estado <strong>de</strong> espín ½ (es <strong>de</strong>cir, aquel ori<strong>en</strong>tado como el campo B0 ) estará más<br />
poblado que el estado <strong>de</strong> espín -½, por lo que aparecerá una magnetización<br />
M0 .<br />
USP-CEU<br />
3
Procesos <strong>de</strong> relajación<br />
• Si <strong>en</strong> esta situación aplicamos un pulso <strong>de</strong> radiofrecu<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> duración t a la<br />
frecu<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> resonancia, la muestra se verá afectada por la acción <strong>de</strong> un<br />
nuevo campo magnético <strong>de</strong>p<strong>en</strong>di<strong>en</strong>te <strong>de</strong>l <strong>tiempo</strong> B1 (t).<br />
• El sistema absorbe <strong>en</strong>ergía provocando un aum<strong>en</strong>to <strong>de</strong>l número <strong>de</strong> estados<br />
con espín -½ y una disminución <strong>de</strong>l número <strong>de</strong> estados con espín ½.<br />
Se produce una pérdida <strong>de</strong><br />
magnetización longitudinal<br />
y un increm<strong>en</strong>to <strong>de</strong><br />
magnetización transversal<br />
USP-CEU<br />
4
Procesos <strong>de</strong> relajación<br />
• Tras aplicar un pulso <strong>de</strong> 90º, el extremo <strong>de</strong>l vector µ (vector <strong>de</strong> magnetización)<br />
<strong>de</strong>sci<strong>en</strong><strong>de</strong> hacia el plano transversal xy <strong>de</strong>scribi<strong>en</strong>do una espiral y los<br />
protones adquier<strong>en</strong> la misma fase apareci<strong>en</strong>do la magnetización transversal<br />
(Mt)<br />
USP-CEU<br />
5
Procesos <strong>de</strong> relajación<br />
USP-CEU<br />
6
Procesos <strong>de</strong> relajación<br />
• Si se aplica un pulso <strong>de</strong> 180º, los protones no se <strong>de</strong>ti<strong>en</strong><strong>en</strong> <strong>en</strong> el plano<br />
transversal, continúan su movimi<strong>en</strong>to <strong>en</strong> espiral volviéndose a <strong>de</strong>sfasar y<br />
aparece un compon<strong>en</strong>te negativo <strong>de</strong> la imantación longitudinal (-Ml).<br />
USP-CEU<br />
7
Procesos <strong>de</strong> relajación<br />
• Cuando finaliza el pulso <strong>de</strong> radiofrecu<strong>en</strong>cia (RF) se necesita un <strong>tiempo</strong> para<br />
que la magnetización vuelva a alcanzar el equilibrio. Debido a que <strong>en</strong> <strong>RMN</strong> la<br />
emisión espontánea es muy poco efectiva, el retorno al equilibrio se logra a<br />
través <strong>de</strong> los procesos <strong>de</strong> relajación .<br />
• Procesos <strong>de</strong> relajación (PR): Difer<strong>en</strong>tes tipos <strong>de</strong> transiciones sin radiación<br />
mediante los cuales un núcleo <strong>en</strong> un estado <strong>de</strong> espín excitado vuelve al<br />
estado inferior o fundam<strong>en</strong>tal.<br />
• Los procesos <strong>de</strong> relajación se divi<strong>de</strong>n <strong>en</strong> dos categorías:<br />
- Relajación espín-red (o longitudinal), <strong>en</strong> la misma dirección que<br />
el campo aplicado.<br />
- Relajación espín-espín (o transversal), perp<strong>en</strong>dicular a la dirección<br />
<strong>de</strong>l campo.<br />
USP-CEU<br />
8
Procesos <strong>de</strong> relajación<br />
• Durante la relajación, el vector µ <strong>de</strong> cada protón regresa <strong>de</strong>s<strong>de</strong> el plano<br />
transversal a su posición original recorri<strong>en</strong>do a la inversa la misma espiral<br />
pero a una velocidad <strong>de</strong> precesión difer<strong>en</strong>te <strong>en</strong> función <strong>de</strong>l tipo <strong>de</strong> protón.<br />
• En primer lugar, los espines se <strong>de</strong>sfasan<br />
mi<strong>en</strong>tras precesionan hasta que la<br />
distribución es uniforme. Por consigui<strong>en</strong>te,<br />
la magnetización transversal <strong>de</strong>crece<br />
progresivam<strong>en</strong>te hasta cero.<br />
• En segundo lugar, la <strong>de</strong>sexcitación <strong>de</strong> un<br />
gran número <strong>de</strong> espines reestablece la<br />
magnetización longitudinal Mz hasta su<br />
valor <strong>en</strong> el equilibrio térmico M0 .<br />
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9
Procesos <strong>de</strong> relajación<br />
• Cada proceso <strong>de</strong> relajación ocurre <strong>en</strong> un periodo <strong>de</strong> <strong>tiempo</strong> <strong>de</strong>terminado,<br />
<strong>de</strong>nominados <strong>tiempo</strong> <strong>de</strong> relajación longitudinal y <strong>tiempo</strong> <strong>de</strong> relajación<br />
transversal, T1 y T2, respectivam<strong>en</strong>te (o sus recíprocos, las velocida<strong>de</strong>s<br />
específicas <strong>de</strong> relajación longitudinal y transversal R1 y R2).<br />
• Los procesos <strong>de</strong> relajación <strong>de</strong>terminan la anchura <strong>de</strong> la señal. El principio <strong>de</strong><br />
incertidumbre <strong>de</strong> Heiss<strong>en</strong>berg <strong>de</strong>muestra que la anchura natural <strong>de</strong> una<br />
banda es inversam<strong>en</strong>te proporcional al <strong>tiempo</strong> medio que el sistema<br />
permanece <strong>en</strong> el estado excitado.<br />
• Des<strong>de</strong> un punto <strong>de</strong> vista operativo, la velocidad <strong>de</strong> relajación <strong>de</strong>termina el<br />
<strong>tiempo</strong> que t<strong>en</strong>emos que esperar para que dos medidas consecutivas<br />
realizadas sobre el mismo sistema sean realm<strong>en</strong>te idénticas o la int<strong>en</strong>sidad y<br />
la velocidad <strong>de</strong> repetición máximas <strong>de</strong> los pulsos que no cause saturación.<br />
USP-CEU<br />
10
Relajación espín-red, espín-retículo o longitudinal<br />
• La relajación espín-red es conjunto <strong>de</strong> procesos mediante los que se<br />
recupera la magnetización longitudinal perdida tras el pulso <strong>de</strong><br />
radiofrecu<strong>en</strong>cia y se alcanza la magnetización <strong>de</strong>l equilibrio termodinámico<br />
(M0 ).<br />
• La interacción <strong>en</strong>tre los espines nucleares <strong>en</strong> estado excitado y los campos<br />
magnéticos fluctuantes g<strong>en</strong>erados por el <strong>en</strong>torno molecular o retículo<br />
<strong>de</strong>vuelve el espín excitado al estado fundam<strong>en</strong>tal <strong>de</strong>spr<strong>en</strong>di<strong>en</strong>do calor.<br />
• La constante <strong>de</strong> <strong>tiempo</strong> que regula este proceso se <strong>de</strong>nomina <strong>tiempo</strong> <strong>de</strong><br />
relajación longitudinal T1.<br />
• La relajación espín-red, que <strong>de</strong>p<strong>en</strong><strong>de</strong> <strong>de</strong> la movilidad <strong>de</strong>l retículo, es<br />
relativam<strong>en</strong>te efici<strong>en</strong>te <strong>en</strong> los líquidos (T1 <strong>de</strong>l or<strong>de</strong>n <strong>de</strong> 1s), pero no lo es <strong>en</strong><br />
los líquidos viscosos y <strong>en</strong> los sólidos cristalinos don<strong>de</strong> las movilida<strong>de</strong>s son<br />
bajas, <strong>en</strong> esos casos T1 suele ser gran<strong>de</strong> (T1 <strong>de</strong>l or<strong>de</strong>n <strong>de</strong> 102s). • T1 disminuye a temperaturas elevadas porque aum<strong>en</strong>ta la movilidad <strong>de</strong>l<br />
sistema.<br />
USP-CEU<br />
11
Relajación espín-espín o transversal<br />
• La relajación transversal es conjunto <strong>de</strong> procesos mediante los que la<br />
magnetización transversal <strong>de</strong>cae hasta prácticam<strong>en</strong>te cero tras un pulso <strong>de</strong><br />
radiofrecu<strong>en</strong>cia<br />
• En la relajación transversal o espín-espín los espines nucleares <strong>de</strong>jan <strong>de</strong><br />
precesionar perdi<strong>en</strong>do la magnetización transversal (<strong>en</strong> el plano xy).<br />
• Este <strong>de</strong>sfase está producido por tres f<strong>en</strong>óm<strong>en</strong>os:<br />
La interacción dipolar <strong>en</strong>tre un espín <strong>en</strong> su estado excitado y otro<br />
espín <strong>de</strong>l mismo tipo <strong>en</strong> su estado fundam<strong>en</strong>tal, el espín excitado<br />
retorna al estado fundam<strong>en</strong>tal transfiri<strong>en</strong>do <strong>en</strong>ergía al otro espín que<br />
sufre la transición al estado excitado.<br />
Desplazami<strong>en</strong>to químico: los núcleos con difer<strong>en</strong>te <strong>de</strong>splazami<strong>en</strong>to<br />
precesan a difer<strong>en</strong>tes frecu<strong>en</strong>cias.<br />
Inhomog<strong>en</strong>eida<strong>de</strong>s <strong>en</strong> el campo magnético externo: núcleos bajo<br />
difer<strong>en</strong>tes valores <strong>de</strong>l campo magnético externo precesan a difer<strong>en</strong>tes<br />
frecu<strong>en</strong>cias.<br />
USP-CEU<br />
12
Relajación espín-espín o transversal<br />
• La compon<strong>en</strong>te estática (paralela a B0 ) no intervi<strong>en</strong>e <strong>en</strong> la relajación. Varía<br />
<strong>de</strong> un núcleo a otro bajo el efecto <strong>de</strong> los campos producidos por los otros<br />
núcleos.<br />
• Compon<strong>en</strong>te giratoria: si hay 2 núcleos vecinos <strong>de</strong> igual naturaleza,<br />
experim<strong>en</strong>tarán mutuam<strong>en</strong>te la acción <strong>de</strong> estas compon<strong>en</strong>tes giratorias y se<br />
pue<strong>de</strong>n inducir transiciones <strong>en</strong>tre las difer<strong>en</strong>tes ori<strong>en</strong>taciones <strong>de</strong> los espines<br />
nucleares. Ambos núcleos podrán interactuar intercambiando <strong>en</strong>ergía <strong>en</strong>tre<br />
ellos. Este proceso se <strong>de</strong>nomina inversión mutua <strong>de</strong> espines o flip-flop.<br />
USP-CEU<br />
13
Relajación espín-espín o transversal<br />
• La interacción <strong>en</strong>tre espines no cambia la población neta <strong>de</strong>l estado excitado<br />
porque las poblaciones N1 y N2 no se v<strong>en</strong> modificadas, pero que la duración<br />
<strong>de</strong> vida <strong>de</strong>l núcleo <strong>en</strong> el estado excitado disminuye y <strong>en</strong> consecu<strong>en</strong>cia la<br />
señal se <strong>en</strong>sancha.<br />
• Este f<strong>en</strong>óm<strong>en</strong>o, que es irreversible, se caracteriza por un <strong>tiempo</strong> <strong>de</strong><br />
relajación transversal T2.<br />
• En moléculas pequeñas normalm<strong>en</strong>te T2 ≈ T1 (<strong>tiempo</strong> largo <strong>de</strong><br />
reestablecimi<strong>en</strong>to <strong>de</strong>l equilibrio). En moléculas gran<strong>de</strong>s T1 >>> T2.<br />
∆ν ½ = 1 / πT*2<br />
T2 pequeño<br />
relajación rápida<br />
T2 gran<strong>de</strong><br />
relajación l<strong>en</strong>ta<br />
USP-CEU<br />
14
I h<br />
Random…<br />
Randomization in XY plane:<br />
Magnetization Decays<br />
A 90º pulse flips the<br />
z-magnetization to xy-plane<br />
Magnetic<br />
field<br />
CLICK !<br />
t<br />
Relaxation Longitudinal and transverse<br />
Alignm<strong>en</strong>t…..<br />
Transverse T 2<br />
Relaxation<br />
NET<br />
Magnetization<br />
Longitudinal<br />
T 1 Relaxation<br />
USP-CEU<br />
15
Anchura <strong>de</strong> las bandas<br />
• Normalm<strong>en</strong>te, T2 condiciona la anchura <strong>de</strong> la señal.<br />
• Sin embargo, <strong>en</strong> ciertos casos las señales se <strong>en</strong>sanchan <strong>de</strong> forma marcada<br />
al producirse un <strong>de</strong>sc<strong>en</strong>so muy ac<strong>en</strong>tuado <strong>de</strong> T1:<br />
- La pres<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> electrones <strong>de</strong>sapareados (radicales). Los radicales<br />
orgánicos, el oxíg<strong>en</strong>o molecular (dirradical) o las sales <strong>de</strong> metales <strong>de</strong><br />
transición (iones paramagnéticos) produc<strong>en</strong> <strong>en</strong>sanchami<strong>en</strong>to <strong>de</strong> las señales.<br />
- La pres<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> núcleos cuadrupolares (I > ½), como el 14N, pue<strong>de</strong><br />
producir también <strong>en</strong>sanchami<strong>en</strong>tos <strong>en</strong> las señales <strong>de</strong> núcleos vecinos no<br />
cuadrupolares. Así los protones unidos a un 14N (Q = 1) o <strong>en</strong> posiciones<br />
próximas, dan lugar a señales notablem<strong>en</strong>te más anchas que el resto <strong>de</strong> los<br />
protones <strong>de</strong> la molécula.<br />
USP-CEU<br />
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Estado<br />
físico<br />
Líquido<br />
Sólido<br />
Relajación<br />
espín-red<br />
Efici<strong>en</strong>te<br />
T1↓<br />
Poco efici<strong>en</strong>te<br />
T1↑<br />
Relajación<br />
espín-espín<br />
Poco efici<strong>en</strong>te<br />
T2↑<br />
Efici<strong>en</strong>te<br />
T2↓<br />
Características<br />
Señales finas <strong>en</strong> el espectro.<br />
Rápida restauración <strong>de</strong>l<br />
equilibrio térmico<br />
Señales anchas <strong>en</strong> el espectro.<br />
Muy l<strong>en</strong>ta recuperación <strong>de</strong>l<br />
equilibrio térmico (saturación)<br />
• Una relajación espín-red eficaz es una condición necesaria para que exista<br />
una distribución <strong>en</strong> los niveles <strong>de</strong> espín que no alcance la saturación y así<br />
po<strong>de</strong>r observar la señal <strong>de</strong> absorción <strong>de</strong> radiofrecu<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> una manera<br />
continua.<br />
• En la práctica esa condición no siempre se cumple y <strong>en</strong>tonces la señal<br />
disminuye con el <strong>tiempo</strong> llegando incluso a <strong>de</strong>saparecer.<br />
USP-CEU<br />
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Procesos <strong>de</strong> relajación: Determinación <strong>de</strong> T1 y T2<br />
• Los <strong>tiempo</strong>s <strong>de</strong> relajación T1 y T2 nos van a proporcionar una valiosa<br />
información sobre la muestra, <strong>de</strong>bido a que están asociados a procesos<br />
relacionados tanto con la interacción <strong>en</strong>tre los espines nucleares y sus<br />
<strong>en</strong>tornos moleculares (T1) como con las interacciones <strong>en</strong>tre los propios<br />
espines nucleares (T2).<br />
• Nos van a permitir la utilización óptima <strong>de</strong>l <strong>tiempo</strong> disponible para acumular<br />
los espectros y optimizar experim<strong>en</strong>tos como el NOE o el STD que están<br />
basados <strong>en</strong> la relajación.<br />
• T1 se <strong>de</strong>termina usando secu<strong>en</strong>cias multipulso, es <strong>de</strong>cir, se g<strong>en</strong>eran varios<br />
pulsos <strong>de</strong> radiofrecu<strong>en</strong>cias separados por intervalos <strong>de</strong> <strong>tiempo</strong> <strong>de</strong>terminados.<br />
Para T1 se utilizan dos secu<strong>en</strong>cias difer<strong>en</strong>tes:<br />
• Técnica <strong>de</strong> recuperación <strong>de</strong> saturación.<br />
• Técnica <strong>de</strong> recuperación <strong>de</strong> la inversión<br />
• T2 se <strong>de</strong>termina mediante los multipulsos <strong>de</strong> eco <strong>de</strong> espín.<br />
USP-CEU<br />
18
Procesos <strong>de</strong> relajación: Determinación <strong>de</strong> T1 y T2<br />
• Un pulso <strong>de</strong> radiofrecu<strong>en</strong>cias equivale a la irradiación simultánea <strong>de</strong> un<br />
<strong>de</strong>terminado rango <strong>de</strong> frecu<strong>en</strong>cias y también a aplicar un campo magnético a la<br />
muestra, dada la relación <strong>en</strong>tre frecu<strong>en</strong>cia y campo:<br />
γ<br />
ν =<br />
2π<br />
B0(1 - σ)<br />
• Las secu<strong>en</strong>cias <strong>de</strong> pulsos son una serie <strong>de</strong> ev<strong>en</strong>tos (básicam<strong>en</strong>te pulsos <strong>de</strong><br />
radiofrecu<strong>en</strong>cia separados por periodos <strong>de</strong> <strong>tiempo</strong>s o <strong>de</strong>lays) aplicados <strong>en</strong> el<br />
<strong>tiempo</strong> <strong>de</strong> modo secu<strong>en</strong>cial, or<strong>de</strong>nado y pre<strong>de</strong>finido, que provocan una<br />
modificación específica sobre el estado <strong>de</strong> los espines que luego se pue<strong>de</strong>n<br />
relacionar con algún parámetro molecular a partir <strong>de</strong>l análisis <strong>de</strong>l espectro <strong>de</strong><br />
<strong>RMN</strong> resultante.<br />
Pulso <strong>de</strong> 90º iguala las poblaciones<br />
Pulso <strong>de</strong> 180º invierte las poblaciones<br />
USP-CEU<br />
19
Determinación experim<strong>en</strong>tal <strong>de</strong> T1.<br />
Experim<strong>en</strong>to <strong>de</strong> recuperación <strong>de</strong> la inversión<br />
• Se aplica un pulso inicial <strong>de</strong> 180º que invierte la magnetización y los niveles<br />
poblacionales <strong>de</strong> la transición sobre la que actúa. Durante el intervalo <strong>de</strong><br />
<strong>tiempo</strong> τ sigui<strong>en</strong>te se produce relajación longitudinal cuya magnitud <strong>de</strong>p<strong>en</strong><strong>de</strong><br />
<strong>de</strong> la duración <strong>de</strong> dicho intervalo. Como la magnetizatión <strong>en</strong> el eje z no es<br />
<strong>de</strong>tectable, se aplica un pulso final <strong>de</strong> 90º para dirigir el vector <strong>de</strong><br />
magnetización hacia el plano xy y así pueda ser <strong>de</strong>tectado.<br />
τ<br />
• Según el intervalo τ que usemos veremos señales cuya int<strong>en</strong>sidad varía <strong>en</strong><br />
función <strong>de</strong>l <strong>tiempo</strong> <strong>de</strong> relajación T1.<br />
• Repiti<strong>en</strong>do el experim<strong>en</strong>to a difer<strong>en</strong>tes valores <strong>de</strong> τ pue<strong>de</strong> <strong>de</strong>terminarse el<br />
valor <strong>de</strong> T1 para las distintas señales <strong>en</strong> el espectro.<br />
USP-CEU<br />
20
τ = 0<br />
y<br />
τ > 0<br />
y<br />
τ >> 0<br />
y<br />
180º<br />
z<br />
z<br />
z<br />
x<br />
x<br />
x<br />
Determinación experim<strong>en</strong>tal <strong>de</strong> T1.<br />
Experim<strong>en</strong>to <strong>de</strong> recuperación <strong>de</strong> la inversión<br />
90º<br />
90º<br />
90º<br />
y<br />
y<br />
y<br />
z<br />
z<br />
z<br />
x<br />
x<br />
x<br />
TF<br />
TF<br />
TF<br />
• Según el intervalo τ que<br />
usemos veremos señales cuya<br />
int<strong>en</strong>sidad varía <strong>en</strong> función <strong>de</strong>l<br />
<strong>tiempo</strong> <strong>de</strong> relajación T1.<br />
• Repiti<strong>en</strong>do el experim<strong>en</strong>to a<br />
difer<strong>en</strong>tes valores <strong>de</strong> τ se<br />
pue<strong>de</strong> <strong>de</strong>terminar el valor <strong>de</strong> T1<br />
para las distintas señales <strong>en</strong> el<br />
espectro.<br />
USP-CEU<br />
21
Procesos <strong>de</strong> relajación: Determinación <strong>de</strong> T1<br />
Recuperación <strong>de</strong> la inversión<br />
Secu<strong>en</strong>cia: 180º - τ - 90º - Adquisición<br />
USP-CEU<br />
22
Procesos <strong>de</strong> relajación: Determinación <strong>de</strong> T1<br />
Recuperación <strong>de</strong> la saturación<br />
Secu<strong>en</strong>cia: 90º - τ - 90º - Adquisición<br />
Se usan secu<strong>en</strong>cias <strong>de</strong> dos pulsos <strong>de</strong> 90º<br />
separados por un <strong>tiempo</strong> τ <strong>de</strong>terminado.<br />
El primer pulso tumba la magnetización al<br />
plano xy, es <strong>de</strong>cir anula Mz, luego se <strong>de</strong>ja<br />
que la magnetización se recupere durante<br />
un <strong>tiempo</strong> y finalm<strong>en</strong>te se vuelve a tumbar<br />
al plano xy para po<strong>de</strong>r medirla (el<br />
espectrómetro mi<strong>de</strong> la compon<strong>en</strong>te x).<br />
Variando el <strong>tiempo</strong> τ se obti<strong>en</strong><strong>en</strong> puntos<br />
que se ajustan a una expon<strong>en</strong>cial<br />
<strong>de</strong>creci<strong>en</strong>te, obt<strong>en</strong>i<strong>en</strong>do T1 como<br />
parámetro <strong>de</strong>l ajuste.<br />
USP-CEU<br />
23
Experim<strong>en</strong>to <strong>de</strong> recuperación <strong>de</strong> la inversión para evaluar los <strong>tiempo</strong>s <strong>de</strong><br />
relajación longitudinales <strong>de</strong> 13 C <strong>en</strong> H 2 O<br />
Espectros con τ = 1-12s y 50s. El C 4 ti<strong>en</strong>e una relajación<br />
longitudinal más efectiva que los otros carbonos.<br />
USP-CEU<br />
24
• Si el <strong>tiempo</strong> <strong>de</strong> espera <strong>en</strong>tre pulsos (irradiación) es <strong>de</strong>masiado rápido la<br />
magnetización no se recuperará <strong>en</strong>tre una irradiación y la sigui<strong>en</strong>te, la señal<br />
se at<strong>en</strong>uará y <strong>en</strong> casos extremos pue<strong>de</strong> <strong>de</strong>saparecer.<br />
• En una medida don<strong>de</strong> no se permite relajación total <strong>en</strong>tre pulso y pulso las<br />
señales <strong>de</strong> núcleos <strong>de</strong> mayor T1 (por ejemplo,<br />
USP-CEU 25<br />
13C cuaternarios o carbonilos)<br />
t<strong>en</strong>drán m<strong>en</strong>or int<strong>en</strong>sidad que los <strong>de</strong> m<strong>en</strong>or T1 (CH y CH2 ).
Determinación experim<strong>en</strong>tal <strong>de</strong> T2.<br />
Eco <strong>de</strong> espines<br />
• El campo magnético creado por el imán no es totalm<strong>en</strong>te homogéneo. Las<br />
<strong>de</strong>sviaciones <strong>de</strong> la homog<strong>en</strong>eidad hac<strong>en</strong> que los núcleos "si<strong>en</strong>tan" un campo<br />
ligeram<strong>en</strong>te distinto <strong>en</strong> función <strong>de</strong> su situación <strong>en</strong> el tubo <strong>de</strong> muestra. Así,<br />
los vectores magnéticos <strong>de</strong> los núcleos individuales, que compon<strong>en</strong> la<br />
magnetización transversal <strong>de</strong>l plano xy, se abrirán <strong>en</strong> abanico, disminuy<strong>en</strong>do<br />
la int<strong>en</strong>sidad <strong>de</strong> este tipo <strong>de</strong> magnetización.<br />
• En principio la evaluación <strong>de</strong> T2 podría realizarse mediante la medición <strong>de</strong> la<br />
anchura <strong>de</strong> las señales a altura media, pero <strong>en</strong> la práctica este parámetro<br />
está dominado por las inhomog<strong>en</strong>eida<strong>de</strong>s <strong>de</strong>l campo magnético, que es <strong>de</strong><br />
carácter instrum<strong>en</strong>tal.<br />
• El ancho <strong>de</strong> la señal se asocia <strong>en</strong>tonces con el valor <strong>de</strong> T2 efectivo, T2*,<br />
(T2* ≤ T2).<br />
• Para evaluar al <strong>tiempo</strong> <strong>de</strong> relajación transversal T2, eliminando el efecto <strong>de</strong><br />
las inhomog<strong>en</strong>eida<strong>de</strong>s <strong>de</strong>l campo B0 , se hace uso <strong>de</strong> la técnica <strong>de</strong>l eco <strong>de</strong><br />
espines <strong>de</strong>sarrollada por Hahn <strong>en</strong> 1950.<br />
USP-CEU<br />
26
Determinación experim<strong>en</strong>tal <strong>de</strong> T2.<br />
Eco <strong>de</strong> espines<br />
• La secu<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> pulsos <strong>de</strong>l eco <strong>de</strong> espines o <strong>de</strong> Hahn se muestra <strong>en</strong> la<br />
sigui<strong>en</strong>te figura:<br />
• Se aplica un primer pulso <strong>de</strong> 90º <strong>en</strong> x (para hacer bascular el vector <strong>de</strong><br />
magnetización longitudinal al plano transversal) seguido <strong>de</strong> un <strong>tiempo</strong> τ,<br />
posteriorm<strong>en</strong>te se aplican conjuntos formados por pulsos <strong>de</strong> 180º <strong>en</strong> y o <strong>en</strong> x<br />
(el pulso <strong>de</strong> 180º re<strong>en</strong>foca los espines <strong>de</strong>sfasados) seguidos <strong>de</strong> intervalos<br />
<strong>de</strong> <strong>tiempo</strong> 2τ.<br />
USP-CEU<br />
27
• Veamos lo que ocurre<br />
<strong>de</strong>spués <strong>de</strong>l pulso <strong>de</strong> 90º:<br />
• Volvemos a las coor<strong>de</strong>nadas xyz:<br />
Determinación experim<strong>en</strong>tal <strong>de</strong> T2.<br />
Eco <strong>de</strong> espines<br />
y<br />
z<br />
y<br />
y<br />
x<br />
≡<br />
x<br />
x<br />
τ<br />
≡<br />
y<br />
y<br />
y<br />
x<br />
τ<br />
re<strong>en</strong>foque<br />
z<br />
x<br />
y<br />
<strong>de</strong>sfase<br />
180º<br />
AQ<br />
USP-CEU<br />
x<br />
28
Determinación experim<strong>en</strong>tal <strong>de</strong> T2.<br />
Eco <strong>de</strong> espines<br />
• Si adquirimos la FID justo <strong>de</strong>spués <strong>de</strong>l eco, la int<strong>en</strong>sidad <strong>de</strong> la señal sólo<br />
estar afectada por T2 y no por las inhomog<strong>en</strong>eida<strong>de</strong>s <strong>de</strong>l campo B0 .<br />
eco<br />
evolución <strong>de</strong>tección<br />
Mxy(t) = Mxy(0) e -τ/T2<br />
USP-CEU<br />
29
Determinación experim<strong>en</strong>tal <strong>de</strong> T2.<br />
Eco <strong>de</strong> espines<br />
N N<br />
a 90oC M xy(t) = M xy(0) e -τ/T2<br />
USP-CEU<br />
30
Eco <strong>de</strong> espín y acoplami<strong>en</strong>tos heteronucleares<br />
• El eco <strong>de</strong> espines re<strong>en</strong>foca la evolución <strong>de</strong>l <strong>de</strong>splazami<strong>en</strong>to químico, si el pulso<br />
inicial <strong>de</strong> 90º para un núcleo <strong>de</strong>terminado está ligeram<strong>en</strong>te fuera <strong>de</strong> resonancia, el<br />
pulso <strong>de</strong> 180º lo re<strong>en</strong>foca:<br />
• También re<strong>en</strong>foca los efectos <strong>de</strong>l acoplami<strong>en</strong>to heteronuclear, el pulso <strong>de</strong> 180º<br />
sólo afecta al 13C: re<strong>en</strong>foque <strong>de</strong>l<br />
USP-CEU acoplami<strong>en</strong>to<br />
31
Eco <strong>de</strong> espín y acoplami<strong>en</strong>tos homonucleares<br />
• El eco <strong>de</strong> espines no re<strong>en</strong>foca los efectos <strong>de</strong>l acoplami<strong>en</strong>to homonuclear. El<br />
pulso <strong>de</strong> 180º no selectivo, afecta tanto a los dos núcleos involucrados <strong>en</strong> el<br />
acoplami<strong>en</strong>to como a los espines <strong>de</strong> su pareja <strong>de</strong> acoplami<strong>en</strong>to:<br />
evolución <strong>de</strong>l<br />
acoplami<strong>en</strong>to<br />
• La secu<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> eco <strong>de</strong> espines se utiliza <strong>en</strong> difer<strong>en</strong>tes experim<strong>en</strong>tos<br />
multipulsos y multidim<strong>en</strong>sionales. La secu<strong>en</strong>cia elimina la evolución <strong>de</strong> los<br />
<strong>de</strong>splazami<strong>en</strong>tos químicos y/o los acoplami<strong>en</strong>tos heteronucleares.<br />
USP-CEU<br />
32
Técnicas <strong>de</strong> doble resonancia<br />
• Las técnicas <strong>de</strong> doble resonancia consist<strong>en</strong>, <strong>en</strong> términos g<strong>en</strong>erales, <strong>en</strong> la<br />
irradiación <strong>de</strong> la muestra con una frecu<strong>en</strong>cia <strong>de</strong>terminada (por ejemplo la <strong>de</strong> un<br />
protón o la <strong>de</strong> todos los protones) y al mismo <strong>tiempo</strong> registrar el espectro <strong>de</strong> la<br />
muestra <strong>de</strong> forma conv<strong>en</strong>cional, con lo que el espectro aparecerá como si dicho<br />
protón no existiera y por tanto <strong>de</strong>saparecerán los acoplami<strong>en</strong>to con él.<br />
• Las técnicas <strong>de</strong> doble resonancia son una herrami<strong>en</strong>ta importante para:<br />
- Simplificar el espectro<br />
- Determinar la posición relativa <strong>de</strong> los protones <strong>de</strong> una molécula<br />
- Localizar absorciones ocultas por otras<br />
• Desacoplami<strong>en</strong>to homonuclear: se usa fundam<strong>en</strong>talm<strong>en</strong>te <strong>en</strong> 1H-<strong>RMN</strong> para<br />
<strong>de</strong>sacoplar unos protones <strong>de</strong> otros.<br />
• Desacoplami<strong>en</strong>to heteronuclear: se utiliza fundam<strong>en</strong>talm<strong>en</strong>te <strong>en</strong> 13C-<strong>RMN</strong> don<strong>de</strong> los espectros se realizan con “<strong>de</strong>sacoplami<strong>en</strong>to protónico”, lo cual<br />
simplifica <strong>en</strong>ormem<strong>en</strong>te los espectros al no observarse acoplami<strong>en</strong>tos<br />
USP-CEU<br />
13C-1H. 33
Desacoplami<strong>en</strong>to Homonuclear. Desacoplami<strong>en</strong>to espín-espín<br />
• Se irradia a la frecu<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> un protón <strong>de</strong>terminado (<strong>en</strong> el c<strong>en</strong>tro <strong>de</strong> la señal si se<br />
trata <strong>de</strong> un multiplete) y se registra el espectro <strong>de</strong> protones.<br />
• Los acoplami<strong>en</strong>tos <strong>de</strong>l protón irradiado con el resto <strong>de</strong> los protones <strong>de</strong> la<br />
molécula <strong>de</strong>saparec<strong>en</strong>, el espectro se suele simplificar bastante y las<br />
asignaciones se pue<strong>de</strong>n realizar <strong>de</strong> una manera más eficaz.<br />
• Ejemplo: <strong>de</strong>sacoplami<strong>en</strong>to homonuclear <strong>en</strong> la 3-aminoacroleína<br />
La irradiación <strong>en</strong> el c<strong>en</strong>tro <strong>de</strong>l<br />
doblete a 8.5 ppm (CO─H) hace<br />
que se simplifique la señal a<br />
5,25 ppm (que queda como un<br />
doblete) y por tanto ésta <strong>de</strong>be<br />
correspon<strong>de</strong>r a la señal <strong>de</strong>l<br />
protón vecino al grupo al<strong>de</strong>hído,<br />
<strong>de</strong> igual modo, la irradiación <strong>de</strong>l<br />
protón olefínico a 7,3 ppm hace<br />
que también se simplifique la<br />
señal a 5.25 ppm.<br />
USP-CEU<br />
34
Desacoplami<strong>en</strong>to Heteronuclear. Desacoplami<strong>en</strong>to <strong>de</strong> banda ancha<br />
• El <strong>de</strong>sacoplami<strong>en</strong>to <strong>de</strong> hidróg<strong>en</strong>o <strong>de</strong> banda ancha (BB <strong>de</strong>coupling) es otra<br />
técnica <strong>de</strong> Doble Resonancia.<br />
• Se irradia con una pot<strong>en</strong>cia elevada una banda <strong>de</strong> frecu<strong>en</strong>cias que abarque el<br />
intervalo completo <strong>de</strong> <strong>de</strong>splazami<strong>en</strong>to <strong>de</strong> todos los protones. Para lograrlo, se<br />
modula la frecu<strong>en</strong>cia <strong>de</strong>l <strong>de</strong>sacoplador mediante ruido <strong>de</strong> baja frecu<strong>en</strong>cia.<br />
• Así, los núcleos <strong>de</strong> 1H acoplados cambian <strong>de</strong> forma tan rápida la ori<strong>en</strong>tación <strong>de</strong><br />
sus espines que los 13C acoplados con ellos, sólo “v<strong>en</strong>” un valor promedio que<br />
es nulo.<br />
• Como resultado <strong>de</strong>saparec<strong>en</strong> los acoplami<strong>en</strong>tos 13C-1H y las señales <strong>de</strong> 13C aparec<strong>en</strong> como singletes con una int<strong>en</strong>sidad mayor.<br />
• El inconv<strong>en</strong>i<strong>en</strong>te es que se pier<strong>de</strong> información sobre las constantes <strong>de</strong><br />
acoplami<strong>en</strong>to 13C-1H. USP-CEU<br />
35
Ejemplo: espectro <strong>de</strong> 13 C <strong>RMN</strong> <strong>de</strong>sacoplado <strong>de</strong>l adamantano.<br />
Mi<strong>en</strong>tras que el triplete a<br />
~ 30 ppm es fácilm<strong>en</strong>te<br />
i<strong>de</strong>ntificable como un CH 2 ,<br />
<strong>en</strong> el resto <strong>de</strong> las las<br />
señales los multipletes<br />
están solapados.<br />
El espectro <strong>de</strong> 13 C <strong>RMN</strong><br />
<strong>de</strong>sacoplado muestra<br />
claram<strong>en</strong>te la exist<strong>en</strong>cia<br />
<strong>de</strong> tres tipos <strong>de</strong> carbonos<br />
USP-CEU<br />
36
Desacoplami<strong>en</strong>to Heteronuclear. Desacoplami<strong>en</strong>to off resonance<br />
• Si se irradia <strong>en</strong> una zona muy cercana a la frecu<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> resonancia <strong>de</strong> los<br />
protones sin coincidir exactam<strong>en</strong>te con ésta, lo que se obti<strong>en</strong>e es un espectro<br />
que <strong>de</strong>nominamos <strong>de</strong> “off resonance”.<br />
• Las señales aparec<strong>en</strong> como multipletes pero con una disminución significativa <strong>de</strong><br />
las JCH , no hay tanto solapami<strong>en</strong>to <strong>de</strong> señales como <strong>en</strong> el espectro acoplado.<br />
• V<strong>en</strong>tajas: sabemos el tipo <strong>de</strong> carbono que es cada una <strong>de</strong> las señales (metilo,<br />
metil<strong>en</strong>o, metino o carbono cuaternario) <strong>de</strong>p<strong>en</strong>di<strong>en</strong>do <strong>de</strong> la multiplicidad que<br />
pres<strong>en</strong>t<strong>en</strong> las mismas, información que se pier<strong>de</strong> <strong>en</strong> el espectro <strong>de</strong>sacoplado o<br />
BB.<br />
• Inconv<strong>en</strong>i<strong>en</strong>tes: los <strong>de</strong>sdoblami<strong>en</strong>tos no son siempre sufici<strong>en</strong>tem<strong>en</strong>te claros, y si<br />
<strong>en</strong> un intervalo estrecho <strong>de</strong> <strong>de</strong>splazami<strong>en</strong>to químico aparec<strong>en</strong> muchas señales<br />
<strong>de</strong> carbonos se produc<strong>en</strong> solapami<strong>en</strong>tos que dificultan la i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> los<br />
multipletes.<br />
USP-CEU<br />
37
Ejemplo: espectro <strong>de</strong> 13 C <strong>RMN</strong> off resonance <strong>de</strong>l propanol.<br />
En rojo se repres<strong>en</strong>tan las 1 J<br />
<strong>de</strong>l espectro <strong>de</strong> 13 C acoplado<br />
USP-CEU<br />
38
Espectros editados utilizando secu<strong>en</strong>cias <strong>de</strong> eco <strong>de</strong> espín: modulación<br />
por la constante <strong>de</strong> acoplami<strong>en</strong>to (SEFT y APT).<br />
• Exist<strong>en</strong> difer<strong>en</strong>tes métodos, basados <strong>en</strong> la técnica <strong>de</strong>l eco <strong>de</strong> espines o <strong>en</strong> la<br />
transfer<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> polarización, que permit<strong>en</strong> editar un espectro 1D <strong>de</strong>l espín<br />
heteronuclear X ( 13C o 15N), y que suministran información sobre el número<br />
<strong>de</strong> hidróg<strong>en</strong>os unidos al heteroátomo (SEFT, APT, INEPT, DEPT).<br />
• La información no se extrae <strong>de</strong> acoplami<strong>en</strong>tos residuales, sino <strong>de</strong> la<br />
int<strong>en</strong>sidad <strong>de</strong> las señales que podrán ser positivas, negativas o nulas. Este<br />
efecto se consigue mediante experim<strong>en</strong>tos modulados a través <strong>de</strong> J.<br />
• La técnica SEFT (Spin-Echo Fourier Transform) es una <strong>de</strong> las<br />
aproximaciones más simples para <strong>de</strong>terminar el número <strong>de</strong> hidróg<strong>en</strong>os<br />
unidos directam<strong>en</strong>te a cada carbono.<br />
USP-CEU<br />
39
Secu<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> pulsos SEFT<br />
τ =1/ 1 J CH<br />
USP-CEU<br />
40
Técnica <strong>de</strong>l Spin-Echo Fourier Transform (SEFT)<br />
• Durante el periodo <strong>de</strong> evolución los difer<strong>en</strong>tes compon<strong>en</strong>tes <strong>de</strong> los<br />
multipletes <strong>de</strong> carbono precesan a sus frecu<strong>en</strong>cias individuales.<br />
• La int<strong>en</strong>sidad <strong>de</strong> las señales está modulada por la evolución <strong>de</strong>l<br />
acoplami<strong>en</strong>to heteronuclear (JCH ) durante el primer intervalo τ. Durante el<br />
segundo intervalo el acoplami<strong>en</strong>to heteronuclear no evoluciona pues<br />
estamos <strong>de</strong>sacoplando a los protones. Por eso, las señales <strong>de</strong>l espectro <strong>de</strong><br />
13 C aparec<strong>en</strong> como singletes.<br />
• El pulso <strong>de</strong> 180º re<strong>en</strong>foca los <strong>de</strong>splazami<strong>en</strong>tos químicos.<br />
• El éxito <strong>de</strong>l experim<strong>en</strong>to <strong>de</strong>p<strong>en</strong><strong>de</strong> <strong>de</strong> lo estrecho que sea el intervalo <strong>de</strong><br />
valores <strong>de</strong> 1JCH , lo que constituye una limitación importante <strong>de</strong> esta técnica.<br />
USP-CEU<br />
41
Secu<strong>en</strong>cia SEFT<br />
• Evolución <strong>de</strong> los vectores <strong>de</strong> magnetización <strong>de</strong>l carbono bajo la influ<strong>en</strong>cia<br />
<strong>de</strong>l acoplami<strong>en</strong>to protón-carbono:<br />
USP-CEU<br />
42
• Espectro <strong>de</strong> 13 C-<strong>RMN</strong> <strong>de</strong>l alcanfor:<br />
Secu<strong>en</strong>cia SEFT<br />
a) espectro conv<strong>en</strong>cional (no se muestra la señal <strong>de</strong>l carbonilo)<br />
b) τ = 1/J (θ = 180º)<br />
c) τ = 1/2J (θ = 90º)<br />
O<br />
3CH 3 , 3CH 2 , 1CH, 2C<br />
C<br />
CH 2<br />
sólo aparec<strong>en</strong> señales <strong>de</strong> C y CH 2<br />
CH CH 3<br />
USP-CEU<br />
43
Técnica <strong>de</strong>l Attached Proton Test (APT)<br />
• La técnica APT también permite <strong>de</strong>terminar el número <strong>de</strong> hidróg<strong>en</strong>os unidos<br />
directam<strong>en</strong>te a cada carbono lo que facilita la asignación <strong>de</strong> espectros <strong>de</strong><br />
13 C <strong>RMN</strong>.<br />
• El periodo <strong>de</strong> evolución suele ser 1/ 1JCH , <strong>de</strong> este modo las señales <strong>de</strong> los<br />
CH y CH3 aparec<strong>en</strong> como picos positivos mi<strong>en</strong>tras que los CH2 y carbonos<br />
cuaternarios son negativos.<br />
• Secu<strong>en</strong>cia APT:<br />
USP-CEU<br />
44
Espectro APT <strong>de</strong>l acetato <strong>de</strong> colesterilo <strong>en</strong> CDCl 3<br />
USP-CEU<br />
45
Transfer<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> polarización (TP)<br />
• 13 C y 15 N: poca abundancia natural y s<strong>en</strong>sibilidad reducida <strong>en</strong> <strong>RMN</strong>.<br />
• Los núcleos poco s<strong>en</strong>sibles muestran bajas int<strong>en</strong>sida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> señal <strong>de</strong>bido a la<br />
escasa difer<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> ocupación <strong>de</strong> los dos estados nucleares <strong>en</strong> la inversión <strong>de</strong><br />
espín.<br />
• Transfer<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> polarización: transfer<strong>en</strong>cia <strong>de</strong>l exceso <strong>de</strong> población <strong>de</strong> un<br />
núcleo s<strong>en</strong>sible ( 1H) a núcleos m<strong>en</strong>os s<strong>en</strong>sibles ( 13C, 15N) antes <strong>de</strong> perturbarlos.<br />
• Se logra que las transiciones (absorciones y emisiones) <strong>de</strong>l núcleo poco s<strong>en</strong>sible<br />
se int<strong>en</strong>sifiqu<strong>en</strong>.<br />
USP-CEU<br />
46
Transfer<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> Polarización por irradiación Selectiva (SPT).<br />
Caso homonuclear<br />
• Para este diagrama usamos dos 1H que están ligeram<strong>en</strong>te acoplados y<br />
ti<strong>en</strong><strong>en</strong> una difer<strong>en</strong>cia gran<strong>de</strong> <strong>de</strong> δ. Se <strong>de</strong>nominan I y S, con un • se indica el<br />
el exceso <strong>de</strong> población <strong>de</strong> un estado a otro:<br />
• Ahora irradiamos y saturamos selectivam<strong>en</strong>te una sola <strong>de</strong> las transiciones<br />
con un pulso <strong>de</strong> 90º (la 1,3 <strong>de</strong> I). Después <strong>de</strong> un <strong>tiempo</strong>, las poblaciones <strong>de</strong><br />
esa transición se igualan y se modifica la int<strong>en</strong>sidad <strong>de</strong> las transiciones que<br />
<strong>de</strong>p<strong>en</strong><strong>de</strong>n <strong>de</strong> estas difer<strong>en</strong>cias <strong>de</strong> población :<br />
SPT<br />
USP-CEU<br />
47
Transfer<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> Polarización por irradiación Selectiva (SPT).<br />
Caso heteronuclear<br />
• A pesar <strong>de</strong> que po<strong>de</strong>mos usar las secu<strong>en</strong>cias SPT y SPI para i<strong>de</strong>ntificar<br />
espines <strong>en</strong> regiones muy complicadas <strong>de</strong> un espectro 1H, la TP<br />
homonuclear no es tan útil como la TP heteronuclear.<br />
• El efecto que ti<strong>en</strong>e la saturación o inversión <strong>de</strong> una <strong>de</strong> las transiciones <strong>de</strong> un<br />
núcleo sobre la distribución <strong>de</strong> las int<strong>en</strong>sida<strong>de</strong>s <strong>en</strong> la señal <strong>de</strong> otro núcleo<br />
acoplado con aquél es mucho más significativo <strong>en</strong> el caso heteronuclear.<br />
• En el caso <strong>de</strong> un grupo 13C-1H (cloroformo), las difer<strong>en</strong>cias <strong>de</strong> población <strong>de</strong><br />
los niveles son más complejas que <strong>en</strong> el caso homonuclear.<br />
• Si t<strong>en</strong>emos <strong>en</strong> cu<strong>en</strong>ta los valores <strong>de</strong> razones giromagnéticas (γ1H/γ13C ≈ 4),<br />
las difer<strong>en</strong>cias <strong>de</strong> población correspon<strong>de</strong>n a la relación 10:8:2:0<br />
USP-CEU<br />
48
Transfer<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> Polarización por irradiación Selectiva (SPT).<br />
Caso heteronuclear<br />
SPT (pulso <strong>de</strong> 90º sobre la transición 1,2 <strong>de</strong> 1 H)<br />
USP-CEU<br />
49
Transfer<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> Polarización por Inversión <strong>de</strong> población (SPI).<br />
Caso homonuclear<br />
• Efectos más drásticos pue<strong>de</strong>n obt<strong>en</strong>erse aplicando pulsos selectivos <strong>de</strong> 180º,<br />
los que produc<strong>en</strong> inversión <strong>de</strong> población <strong>en</strong>tre los estados involucrados <strong>en</strong> la<br />
transición, tal como se muestra <strong>en</strong> la figura:<br />
SPI: (pulso <strong>de</strong> 180º<br />
sobre transición 1,3)<br />
USP-CEU<br />
50
Ha<br />
Hb<br />
O<br />
OEt<br />
a<br />
Ejemplo <strong>de</strong> secu<strong>en</strong>cia SPI<br />
En este caso se invierte<br />
cada línea <strong>de</strong> los protones<br />
olefínicos a y b. Vemos<br />
como las int<strong>en</strong>sida<strong>de</strong>s <strong>de</strong><br />
las otras líneas varían.<br />
USP-CEU<br />
51
Transfer<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> Polarización por Inversión <strong>de</strong> población (SPI).<br />
Caso heteronuclear.<br />
• En la figura se muestra el diagrama <strong>de</strong> niveles correspondi<strong>en</strong>tes al sistema<br />
CH. El doblete <strong>de</strong>l hidróg<strong>en</strong>o ti<strong>en</strong>e líneas 4 veces más int<strong>en</strong>sas que el<br />
doblete <strong>de</strong>l carbono.<br />
USP-CEU<br />
52
Transfer<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> Polarización por Inversión <strong>de</strong> Población (SPI).<br />
Caso heteronuclear<br />
SPI (pulso <strong>de</strong> 180º<br />
sobre la transición 1,2)<br />
+ 2 + 2<br />
Al manipular las poblaciones <strong>de</strong> los protones,<br />
la señal <strong>de</strong> 13 C se int<strong>en</strong>sifica cuatro veces<br />
(consi<strong>de</strong>rando señales positivas y negativas).<br />
+ 10 + 8<br />
-6 -8<br />
USP-CEU<br />
53
Experim<strong>en</strong>to INEPT (Ins<strong>en</strong>sitive Nuclei Enhanced<br />
by Polarization Transfer)<br />
• La técnica INEPT (Morris, Freeman, 1979) está diseñada para transferir<br />
polarización a través <strong>de</strong>l acoplami<strong>en</strong>to 1H-13C a un <strong>en</strong>lace.<br />
USP-CEU<br />
54
Si J = 125 Hz, τ es 2 ms<br />
Secu<strong>en</strong>cia INEPT<br />
De 2 a 7 se repres<strong>en</strong>tan las magnetizaciones protónicas.<br />
En 8 la magnetización <strong>de</strong> USP-CEU<br />
13C <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> la transfer<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> polarización.<br />
55
Secu<strong>en</strong>cia INEPT<br />
• Tras el último pulso <strong>de</strong> 90º y <strong>en</strong> 1H la magnetización M Cβ<br />
H se <strong>en</strong>cu<strong>en</strong>tra invertida<br />
con respecto a M Cα<br />
H . La magnetización <strong>de</strong>bida a 13C se habrá increm<strong>en</strong>tado <strong>en</strong><br />
una proporción <strong>de</strong> -6 <strong>en</strong> s<strong>en</strong>tido negativo y <strong>de</strong> 10 <strong>en</strong> s<strong>en</strong>tido positivo.<br />
• El último pulso <strong>de</strong> 90º x <strong>en</strong><br />
USP-CEU 56<br />
13C hace que la señal se vuelva observable al rotarla<br />
hacia el eje y. La información obt<strong>en</strong>ida es la misma que la <strong>de</strong>l experim<strong>en</strong>to SPI,<br />
pero se evita utilizar pulsos selectivos.<br />
M H Cα<br />
M H Cβ
Ejemplo:<br />
Experim<strong>en</strong>to INEPT<br />
USP-CEU<br />
57
Experim<strong>en</strong>to INEPT Re<strong>en</strong>focado<br />
• Para eliminar los acoplami<strong>en</strong>tos carbono-protón <strong>en</strong> el espectro sin cancelar las<br />
señales, es necesario añadir a la secu<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> pulsos INEPT normal dos<br />
pulsos <strong>de</strong> 180º (para re<strong>en</strong>focar) y dos <strong>tiempo</strong>s <strong>de</strong> espera (∆ = 1/8J) <strong>en</strong> ambos<br />
núcleos <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> los dos últimos pulsos <strong>de</strong> 90º y posteriorm<strong>en</strong>te adquirir y<br />
<strong>de</strong>sacoplar.<br />
• Con este experim<strong>en</strong>to se obti<strong>en</strong>e una señal completam<strong>en</strong>te <strong>de</strong>sacoplada, <strong>en</strong><br />
fase y amplificada por la transfer<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> polarización.<br />
Secu<strong>en</strong>cia <strong>de</strong><br />
pulsos INEPT<br />
re<strong>en</strong>focado<br />
USP-CEU<br />
58
Experim<strong>en</strong>to INEPT Re<strong>en</strong>focado<br />
• Dep<strong>en</strong>di<strong>en</strong>do <strong>de</strong>l tipo <strong>de</strong> carbono se utilizan difer<strong>en</strong>tes ∆:<br />
CH → ∆ = 1/4J (~ 1.79 ms); CH 2 → ∆ = 1/8J (~ 0.89 ms); CH 3 → ∆ = 1/8J<br />
• Se necesita una situación <strong>de</strong> compromiso, <strong>en</strong> la práctica suele usarse:<br />
∆ = 3/8J (~ 2.68 ms)<br />
• La limitación principal <strong>de</strong> la técnica INEPT radica <strong>en</strong> su s<strong>en</strong>sibilidad al ajuste<br />
<strong>de</strong>l intervalo ∆. En sistemas con una variación apreciable <strong>de</strong> 1JCH , por ejemplo,<br />
<strong>en</strong> pres<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> carbonos con difer<strong>en</strong>te hibridación, pue<strong>de</strong>n pres<strong>en</strong>tarse<br />
problemas con la int<strong>en</strong>sidad y con el signo <strong>de</strong> las señales.<br />
USP-CEU<br />
59
Secu<strong>en</strong>cia INEPT<br />
USP-CEU<br />
60
Experim<strong>en</strong>to INEPT<br />
Re<strong>en</strong>focado<br />
• Ejemplo:<br />
USP-CEU<br />
61
Experim<strong>en</strong>to DEPT (Distortionless Enhancem<strong>en</strong>t<br />
by Polarization Transfer)<br />
• El experim<strong>en</strong>to DEPT (B<strong>en</strong>dall, Doddrell, Pegg 1981) es la técnica <strong>de</strong> edición<br />
espectral actualm<strong>en</strong>te más utilizada.<br />
• También está basado <strong>en</strong> la Transfer<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> Polarización.<br />
• Pres<strong>en</strong>ta una m<strong>en</strong>or s<strong>en</strong>sibilidad a las variaciones <strong>de</strong> 1JCH que la técnica<br />
INEPT, utiliza una secu<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> pulsos más corta y m<strong>en</strong>os s<strong>en</strong>sible a los<br />
errores que se produc<strong>en</strong> al introducir <strong>en</strong> el programa parámetros como la achura<br />
<strong>de</strong> pulso o los <strong>de</strong>lays (<strong>de</strong>p<strong>en</strong>di<strong>en</strong>tes <strong>de</strong> las constantes <strong>de</strong> acoplami<strong>en</strong>to).<br />
• Secu<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> pulsos DEPT:<br />
USP-CEU<br />
62
Experim<strong>en</strong>to DEPT (Distortionless Enhancem<strong>en</strong>t<br />
by Polarization Transfer)<br />
• Se pue<strong>de</strong>n obt<strong>en</strong>er espectros DEPT <strong>en</strong> los que solam<strong>en</strong>te aparec<strong>en</strong> las señales<br />
<strong>de</strong> CH, CH2 o CH3 .<br />
• Hay que realizar tres espectros DEPT difer<strong>en</strong>tes.<br />
• Un espectro DEPT con θ = 135º muestra a los grupos CH3 y CH como señales<br />
positivas y a los CH2 como señales negativas.<br />
• Cuando sea necesario difer<strong>en</strong>ciar grupos CH3 <strong>de</strong> grupos CH se pue<strong>de</strong> repetir el<br />
experim<strong>en</strong>to con θ = 90º que sólo muestra los grupos CH.<br />
• El experim<strong>en</strong>to con θ = 45º muestra a todos los carbonos hidrog<strong>en</strong>ados como<br />
señales positivas.<br />
• Los carbonos cuaternarios se obti<strong>en</strong><strong>en</strong> por difer<strong>en</strong>cia <strong>de</strong>l espectro normal <strong>de</strong> 13C <strong>de</strong>sacoplado.<br />
USP-CEU<br />
63
pulegona<br />
H<br />
Me<br />
O<br />
13 C <strong>de</strong>sacoplado<br />
DEPT 90 sólo CH<br />
DEPT 135: CH, CH 3<br />
CH 2<br />
60 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 USP-CEU<br />
40 30 20<br />
f1 ppm<br />
64
INEPT/DEPT<br />
• Para la <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> la multiplicidad <strong>de</strong> los carbonos y para editar<br />
espectros normalm<strong>en</strong>te se utiliza el experim<strong>en</strong>to DEPT (Distortionless<br />
Enhancem<strong>en</strong>t by Polarisation Transfer).<br />
– La secu<strong>en</strong>cia DEPT es m<strong>en</strong>os s<strong>en</strong>sible que la INEPT a las variaciones<br />
<strong>de</strong>l valor <strong>de</strong> las JCH porque φ es in<strong>de</strong>p<strong>en</strong>di<strong>en</strong>te <strong>de</strong> J. En el el espectro<br />
INEPT ocurr<strong>en</strong> distorsiones cuando <strong>en</strong> la molécula hay difer<strong>en</strong>tes tipos<br />
<strong>de</strong> JCH . Por ejemplo: JCH alifática= 110-130Hz, JCH aromática= 160-<br />
180Hz. La solución <strong>de</strong> compromiso JCH ~ 145 Hz pres<strong>en</strong>ta un error <strong>de</strong>l<br />
20%.<br />
– La secu<strong>en</strong>cia DEPT g<strong>en</strong>era los multipletes <strong>en</strong> fase (adquisición sin<br />
<strong>de</strong>sacoplami<strong>en</strong>to) con un patrón regular <strong>de</strong> int<strong>en</strong>sida<strong>de</strong>s, mi<strong>en</strong>tras que<br />
la secu<strong>en</strong>cia INEPT básica g<strong>en</strong>era los multipletes <strong>en</strong> antifase.<br />
USP-CEU<br />
65
INEPT/DEPT<br />
• El experim<strong>en</strong>to INEPT es superior al DEPT <strong>en</strong> la transfer<strong>en</strong>cia <strong>de</strong><br />
polarización <strong>en</strong>tre núcleos y se usa habitualm<strong>en</strong>te como secu<strong>en</strong>cia básica<br />
<strong>en</strong> los experim<strong>en</strong>tos 2D heteronucleares (HSQC).<br />
• La secu<strong>en</strong>cia INEPT es más conv<strong>en</strong>i<strong>en</strong>te <strong>en</strong> experim<strong>en</strong>tos a baja<br />
temperatura o para muestras con pesos moleculares altos (T2 pequeño)<br />
USP-CEU<br />
66