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REsuLTADOs y DIsCusIONEs Empleo de transformates para incrementar el yx/p de polihidroxialcanoatos: La biosíntesis de estos materiales tiene una relación extrecha con la de aquellos de naturaleza extracelular, desde el punto de vista genético, los genes codificantes de biosíntesis de PHA y otras proteínas relacionadas con el metabolismo son frecuentemente encontrados en un mismo operón en el cromosoma bacteriano el cual es inducible bajo factores de presión ambientales como la composición del medio empleada en este estudio. En Ralstonia eutropha H16 y en algunas otras bacterias Gram negativas, los genes estructurales están organizados en el siguiente orden: phaCAB, PHA sintasa (phaC), 3 cetotiolasa (phaA) y acetoacetil-CoA reductasa NADPH dependiente (phaB). (Figura ) Estos mismos tres genes se han encontrado en Pseudomonas sp 61-3 organizados en un mismo operón pero en diferente orden – phaBCA. (York et al 001). Si logramos obtener transformantes capaces de desviar las moléculas de acetilCoA destinadas para la fabricación de exopolímero mediante un control negativo del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, entonces estos nuevos transformantes obtenidos podrán aprovechar los desechos industriales que estamos tratando para la fabricación de bioplástico (material orgánico presente en las aguas más electrones para la cadena transportadora proveniente de fuentes inorgánicas), generando así una tecnología que además de contribuir con un proceso de reducción biológica conlleve a la biofabricación costo efectiva de material de ácido polihidroxialcanoico., la otra gran ventaja consiste en que el sistema será una tecnología dual que permita ser acoplada para el tratamiento de aguas permitiendo el uso de reactores que puedan ser libres de “Down Time” (Rajkumar y Palanivelu, 2004). generación de mutantes mediante transformación bacteriana : Para tener éxito en transformaciones bacterianas existen diversos métodos reportados por la literatura. El empleo de técnicas comerciales como BacterioMatch para la generación de estos mutantes es una alternativa que puede llegar a ser incluida a futuro en este estudio. El presente sistema permite la bśsqueda de aquellos hķbridos bacterianos que sean identificados por las nuevas proteķnas biosintetizadas y que a su vez sean caracterizadas de acuerdo a una interacción transcripcional de tipo proteico. El presente plįsmido (figura 1), es un ejemplo del vector genético a insertar y del cual se espera que los nuevos transformantes sean capaces de biosintetizar ésteres de įcido hidroxialcanoico con tasas tambie´n productoras de exopolisacįrido sufiente para permitir una adhesión celular. Una vez que el vecotr con su gen blanco ha sido objeto de inserción mediante una técnica de transformación bacteriana, el sistema serį capaz de asegurar que el nuevo transformante transcriba y traduzca la caracterķstica fenotķpica deseada, en este caso producir ésteres de įcido polihidroxialcanoico (Dove et al. 1997., Joung et al. 2000., Sambrook et
Figura 1. Plásmido pBTHA diseñado mediante el programa Plasmid Processor Ver. 1.02 . La estructura plasmídica presenta un sitio de multiclonaje de genes MCS S:2770 E:2790 (restricción con Not I, EcoR I, Sma I, BamH I)., Plac-UV5 S:1556 E:1686 región promotora., marcador de selección de antibiótico con ORF S:3200 E:2770 ., y región promotora P15A ori S:591 E:1300. El cassette integrado al sistema (no mostrado, será el operón phaCAB (figura 2) el cual posee los genes biosintéticos para la producción de ésteres de ácido hidroxialcanoico de cadena media. Fuente: generación de Biofilm bacteriano: Los aislamientos presentan la particularidad de la formación de material extracelular de tipo adhesivo a las paredes del reactor tipo Batch (biofilm bacteriano). A pesar que el biofilm generado no excede de mm aproximadamente en grosor, se espera mediante posteriores prácticas experimentales que éste sea mayor para generar un incremento en el flujo de las fuentes carbonadas al interior del sistema bacteriano, para ello es preciso entender que a partir de un proceso REDOX se incorpor- an desde el MM suplementado con aguas contamiandas las moléculas de acetilCoA necesarias en la posterior biosíntesis tanto de polímero extracelular así como de polímeros intracelulares (Rincón et al. 004., Steinbü- Figura 2. Operón phbCAB (inserto región MCS en pBTPHA para la síntesis de P(3HB) Fuente: Madison y Huisman, 1999. Se puede mejorar la tasa de acumulo de biopolímero gracias a la movilización del exopolímero al interior celular en forma de moléculas de acetilCoA. Uno de los mecanismos que favorecen la tasa de acumulo de polímero intracelular en bacterias es la deficiencia en nutrientes esenciales para su multiplicación (N, P, Mg, etc). Igualmente existen otras formas de incrementar dicho rendimiento, por ejemplo se pueden emplear protocolos para la generación de transformantes (figura I) que sean capaces de alcanzar altos rendimientos de producción 38
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Figura 1.<br />
Plásmido pBTHA diseñado mediante el programa<br />
P<strong>la</strong>smid Processor Ver. 1.02 . La estructura p<strong>la</strong>smídica<br />
presenta un sitio de multiclonaje de genes MCS<br />
S:2770 E:2790 (restricción con Not I, EcoR I, Sma I,<br />
BamH I)., P<strong>la</strong>c-UV5 S:1556 E:1686 región promotora.,<br />
marcador de selección de antibiótico con ORF S:3200<br />
E:2770 ., y región promotora P15A ori S:591 E:1300.<br />
El cassette integrado al sistema (no mostrado, será<br />
el operón phaCAB (figura 2) el cual posee los genes<br />
biosintéticos para <strong>la</strong> producción de ésteres de<br />
ácido hidroxialcanoico de cadena media. Fuente:<br />
generación de Biofilm bacteriano: Los<br />
ais<strong>la</strong>mientos presentan <strong>la</strong> particu<strong>la</strong>ridad de<br />
<strong>la</strong> formación de material extracelu<strong>la</strong>r de tipo<br />
adhesivo a <strong>la</strong>s paredes del reactor tipo Batch<br />
(biofilm bacteriano). A pesar que el biofilm<br />
generado no excede de mm aproximadamente<br />
en grosor, se espera mediante posteriores<br />
prácticas experimentales que éste sea mayor<br />
para generar un incremento en el flujo de <strong>la</strong>s<br />
fuentes carbonadas al interior del sistema<br />
bacteriano, para ello es preciso entender que<br />
a partir de un proceso REDOX se incorpor-<br />
an desde el MM suplementado con aguas<br />
contamiandas <strong>la</strong>s molécu<strong>la</strong>s de acetilCoA<br />
necesarias en <strong>la</strong> posterior biosíntesis tanto de<br />
polímero extracelu<strong>la</strong>r así como de polímeros<br />
intracelu<strong>la</strong>res (Rincón et al. 004., Steinbü-<br />
Figura 2.<br />
Operón phbCAB (inserto región MCS<br />
en pBTPHA para <strong>la</strong> síntesis de P(3HB)<br />
Fuente: Madison y Huisman, 1999.<br />
Se puede mejorar <strong>la</strong> tasa de acumulo de<br />
biopolímero gracias a <strong>la</strong> movilización del<br />
exopolímero al interior celu<strong>la</strong>r en forma de<br />
molécu<strong>la</strong>s de acetilCoA.<br />
Uno de los mecanismos que favorecen <strong>la</strong><br />
tasa de acumulo de polímero intracelu<strong>la</strong>r<br />
en bacterias es <strong>la</strong> deficiencia en nutrientes<br />
esenciales para su multiplicación (N, P, Mg,<br />
etc).<br />
Igualmente existen otras formas de incrementar<br />
dicho rendimiento, por ejemplo se pueden<br />
emplear protocolos para <strong>la</strong> generación de<br />
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