Tema 4 - BioScripts
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Genética Microbiana<br />
<strong>Tema</strong> 4<br />
Mutagénesis
Mutagénesis = inducción de mutaciones<br />
Mutágeno = agente físico o químico<br />
que induce mutaciones<br />
Mutágeno = agente físico o químico<br />
que aumenta la frecuencia de<br />
mutaciones espontáneas<br />
Mutación espontánea = producida en ausencia<br />
de mutágenos<br />
Mutación espontánea = debida a errores de la<br />
maquinaria celular y a daños asociados al metabolismo
DNA<br />
Transcripción<br />
RNA<br />
Proteínas<br />
Metabolismo<br />
Replicación<br />
Errores<br />
DNA
Transcripción<br />
Daños<br />
DNA DNA<br />
RNA<br />
Proteínas<br />
Metabolismo<br />
Replicación<br />
Errores
Replicación del DNA<br />
3’ G – A – C – T – A – G – G – A – C – T –<br />
5’ C<br />
DNA polimerasa III<br />
DNA polimerasa I Heteromultímeros<br />
Contienen una subunidad<br />
autocorrectora<br />
– T – G – A – T – T<br />
Exonucleasa<br />
3’ 5’
3’ G – A – C – T – A – G – G – A – C – T –<br />
5’ C<br />
– T – G – A – T – C – C – T – G – A...<br />
Autocorrección<br />
de la DNA Pol III<br />
(“proofreading”)<br />
Tasa de error (en E. coli)<br />
10 -10 por par de nucleótidos<br />
Reparación de<br />
emparejamientos erróneos<br />
(“mismatch repair”)
3’ G – A – C – T – A – G – G – A – C – T –<br />
5’ C<br />
– T – G – A – T – C – T – T – G – A...<br />
Replicación<br />
3’ G – A – C – T – A – G – A – A – C – T –<br />
5’ C<br />
– T – G – A – T – C – T – T – G – A...
3’ G – A – C – T – A – G – G – A – C – T –<br />
5’ C<br />
– T – G – A – T – C – T – T – G – A...<br />
Corrección de emparejamientos erróneos producidos<br />
durante la replicación<br />
Problema: ¿corregir a G-C o a A-T?<br />
Solución: distinguir cuál es<br />
la cadena molde
N<br />
NH<br />
NH 2<br />
adenina<br />
CH 3<br />
6-metil-adenina
Formación de 6meA: postreplicativa<br />
DNA adenina metiltransferasa (Metilasa Dam)<br />
Diana de Dam: 5’-GATC-3’<br />
Frecuencia esperada/observada en los genomas<br />
de E. coli and Salmonella: 3-5 sitios GATC / kb<br />
Número total de sitios GATC en el genoma:<br />
> 20,000
5’ GATC 3’<br />
3’ CTAG 5’<br />
Replicación<br />
5’ GATC 3’<br />
3’ CTAG 5’<br />
Metilación<br />
5’ GATC 3’<br />
3’ CTAG 5’<br />
DNA transitoriamente<br />
hemimetilado
5’<br />
A<br />
C<br />
A<br />
C<br />
MutS<br />
A<br />
C<br />
MutS MutL<br />
A<br />
C<br />
MutS MutL<br />
MutH<br />
GATC<br />
CTAG<br />
GATC<br />
CTAG<br />
GATC<br />
CTAG<br />
GATC<br />
CTAG<br />
5’
5’<br />
5’<br />
5’<br />
A<br />
C<br />
A<br />
A<br />
Pol III<br />
GATC<br />
CTAG<br />
5’<br />
RecJ<br />
GATC<br />
3’<br />
GATC<br />
3’
Mutantes sin autocorreción<br />
Mutantes sin reparación de emparejamientos<br />
erróneos (Dam -, MutH - , MutL - o MutS - )<br />
Frecuencias más altas de<br />
mutación espontánea<br />
(Mutantes “mutadores”)
GTCTGGCTGGCTGGCTGGC<br />
FS5, FS25, FS45, FS65<br />
5’-GTCTGGCTGGCTGGC-3’<br />
FS2, FS84<br />
GTCTGGCTGGC
Mutágeno = agente físico o químico<br />
que aumenta la frecuencia de<br />
mutaciones espontáneas<br />
F<br />
Q<br />
Radiaciones ionizantes<br />
Radiaciones no ionizantes (UV)<br />
Análogos de bases<br />
Sustancias intercalantes<br />
Oxidantes<br />
Alquilantes
Radiaciones ionizantes<br />
Electromagnéticas: rayos X, rayos γ<br />
Partículas subatómicas: rayos α, β, cósmicos,<br />
protones y neutrones producidos en las reacciones<br />
nucleares, etc.<br />
Roturas en el DNA<br />
Alteración de bases<br />
Radicales libres
H 20 H 20 + + e -<br />
H 20 + H + + OH .<br />
e - + H 20 OH - + H .<br />
H 20 H 20* OH . + H .
Frecuencia de mutaciones letales (%)<br />
16<br />
8<br />
2<br />
Inducción de mutaciones por rayos X<br />
2000<br />
4000<br />
6000<br />
Dosis (Roentgen)<br />
1 Roentgen = cantidad de radiación que produce 2 x 10 9 pares de iones en 1 cm 3 de agua
Radiación ultravioleta<br />
Absorción selectiva<br />
a 260 nm<br />
Dímeros de pirimidina
adenina<br />
Mutágenos químicos<br />
1. Análogos de bases<br />
2-aminopurina<br />
O<br />
guanina
2AP: Puede emparejarse con T y con C<br />
CG C 2AP T 2AP T A<br />
Transición CG TA
5BU: Puede emparejarse con A y con G<br />
T A 5BU A 5BU G C G<br />
Transición TA CG
Mutágenos químicos<br />
2. Agentes intercalantes
3’AGGAAATTTTTTA<br />
5’TCCTTTAAAAAAT<br />
T<br />
+1<br />
Consecuencias<br />
1<br />
2<br />
3’AGGAAATTTTTTA<br />
5’TCCTTTAAAA–AT<br />
-1<br />
En secuencias codificadoras de<br />
proteína, DESFASE<br />
En sitios de unión de proteínas<br />
reguladoras, posibilidad de unión<br />
alterada
OH .<br />
.<br />
O2 H 2O 2<br />
Defensa celular<br />
???<br />
Mutágenos químicos<br />
3. Agentes oxidantes<br />
Superóxido dismutasa<br />
Catalasa<br />
Timina Timin-glicol<br />
Adenina Diamino-formamido-pirimidina<br />
Guanina Diamino-hidroxiformamido-pirimidina
Mutágenos químicos<br />
4. Agentes alquilantes<br />
Metanosulfonato de etilo (MMS)<br />
Etanosulfonato de etilo (EMS)<br />
Nitrosoguanidina<br />
Dietilsulfato<br />
Metilación y/o alquilación<br />
de bases<br />
(-CH 3,<br />
-CH 2-CH 3)<br />
N 1 -Alquil-Adenina<br />
N 3 -Alquil-Adenina<br />
N 7 -Alquil-Adenina<br />
N 3 -Alquil-Guanina<br />
N 7 -Alquil-Guanina<br />
O 6 -Alquil-Guanina<br />
N 3 -Alquil-Citosina<br />
O 2 -Alquil-Citosina<br />
N 3 -Alquil-Timina<br />
O 2 -Alquil-Timina<br />
O 6 -Alquil-Timina
Mitomicina<br />
Cis-platino<br />
Otros tipos de daño en el DNA<br />
Hidroxilamina<br />
(etc.)<br />
Entrecruzamiento de<br />
cadenas<br />
Desaminación de la<br />
citosina (C U)
Reparación del DNA<br />
1. Reversión del daño (fotorreactivación)<br />
2. Escisión y resíntesis<br />
3. Recombinación
DNA<br />
glicosilasa<br />
Endonucleasa<br />
de incisión
DNA<br />
glicosilasa<br />
Endonucleasa<br />
de sitio<br />
apurínico/<br />
apirimidínico
Exonucleasa<br />
DNA polimerasa Ligasa
Coordinación de sistemas de reparación:<br />
la respuesta S.O.S.<br />
RecA<br />
RecA RecA<br />
RecA RecA
RecA RecA<br />
Desrepresión del<br />
regulón S.O.S.<br />
Autodigestión<br />
LexA
p<br />
p<br />
Regulón SOS: conjunto de operones<br />
regulados por LexA<br />
LexA<br />
caja<br />
S.O.S.<br />
caja<br />
S.O.S.<br />
AUG UAA<br />
AUG UAA
Daño en el DNA<br />
-<br />
+<br />
Regulón SOS: jerarquía de genes<br />
RecA activada -Genes de reparación<br />
+<br />
LexA autodigerido -<br />
+<br />
por escisión<br />
Gen sulA<br />
(inhibición de la<br />
división celular)<br />
Genes dinB y<br />
umuDC<br />
(DNA polimerasas<br />
propensas a error)
RecBCD<br />
RecJ<br />
RecA<br />
RuvA<br />
RecG<br />
Helicasas<br />
Ligasa
Ejemplo de la importancia de la recombinación<br />
como mecanismo de reparación:<br />
Los mutantes de Salmonella deficientes en<br />
recombinación no producen infección
Patogénesis de Salmonella<br />
Gastroenteritis<br />
Invasión del<br />
epitelio intestinal<br />
6 días<br />
bazo<br />
hígado<br />
Supervivencia en<br />
macrófagos<br />
Fiebre tifoidea
Tipos de mutaciones producidas por diferentes mutágenos<br />
Espontáneas<br />
Análogos<br />
de bases<br />
Agentes<br />
alquilantes<br />
Agentes<br />
intercalantes<br />
Inducción<br />
de SOS<br />
Sustituciones Desfases Inserciones Deleciones<br />
+ + + +<br />
+ + -<br />
-/+<br />
-<br />
-<br />
-<br />
-<br />
- + - -<br />
+ + + +
Cultivo en<br />
fase exponencial<br />
Irradiación<br />
Recrecimiento en la oscuridad<br />
Escrutinio o selección
Cultivo en<br />
fase exponencial<br />
étodos de Gen<br />
Mezclar una alícuota<br />
con el mutágeno<br />
ética Bacteriana<br />
Lavar para eliminar<br />
ética el Bacteriana mutágeno<br />
(si es necesario)<br />
Recrecimiento<br />
Escrutinio o selección
Cultivo<br />
recrecido<br />
Ejemplo de escrutinio: búsqueda de auxótrofos<br />
étodos de Gen<br />
Medio completo<br />
é<br />
étodos de Gen<br />
Medio mínimo<br />
é
Crecen<br />
todos<br />
Cultivo<br />
en medio rico<br />
Enriquecimiento con penicilina<br />
Cultivo<br />
en medio mínimo<br />
Añadir<br />
penicilina<br />
Sólo crecen<br />
los protótrofos
6<br />
7<br />
8<br />
9<br />
10<br />
1<br />
Ade<br />
His<br />
Phe<br />
Glu<br />
Thy<br />
2<br />
Gua<br />
Leu<br />
Tyr<br />
Asn<br />
Ser<br />
3<br />
Cys<br />
Ile<br />
Trp<br />
Ura<br />
Glt<br />
4 5<br />
Met<br />
Lys<br />
Thr<br />
Asp<br />
DAP<br />
Thi<br />
Val<br />
Pro<br />
Arg<br />
Gly
6<br />
7<br />
8<br />
9<br />
10<br />
1<br />
Ade<br />
His<br />
Phe<br />
Glu<br />
Thy<br />
2<br />
Gua<br />
Leu<br />
Tyr<br />
Asn<br />
Ser<br />
3<br />
Cys<br />
Ile<br />
Trp<br />
Ura<br />
Glt<br />
4 5<br />
Met<br />
Lys<br />
Thr<br />
Asp<br />
DAP<br />
Thi<br />
Val<br />
Pro<br />
Arg<br />
Gly
6<br />
7<br />
8<br />
9<br />
10<br />
1<br />
Ade<br />
His<br />
Phe<br />
Glu<br />
Thy<br />
2<br />
Gua<br />
Leu<br />
Tyr<br />
Asn<br />
Ser<br />
3<br />
Cys<br />
Ile<br />
Trp<br />
Ura<br />
Glt<br />
4 5<br />
Met<br />
Lys<br />
Thr<br />
Asp<br />
DAP<br />
Thi<br />
Val<br />
Pro<br />
Arg<br />
Gly
Ejemplos:<br />
Fenotipos seleccionables:<br />
facilitan la detección de mutantes<br />
Nar - Resistencia a clorato<br />
Gpt - Resistencia a azaguanina<br />
Gyr - Resistencia a ácido nalidíxico<br />
His - Osmorresistencia (en fondo His c )<br />
Fuc - Crecimiento con propanodiol<br />
Ura3 - Crecimiento en Acido fluoroorótico
Silvestre<br />
Fenotipos seleccionables:<br />
facilitan la detección de mutantes<br />
Ura3<br />
FOA Compuesto tóxico<br />
Mutante ura3<br />
FOA
Escrutinios bacterianos para la<br />
detección de carcinógenos<br />
Bruce Ames, ~1970:<br />
Agentes carcinogénicos para humanos son<br />
mutagénicos para las bacterias<br />
Reversión<br />
His - His +<br />
étodos de Gen<br />
Medio mínimo<br />
é<br />
étodos de Gen<br />
Medio mínimo<br />
+ carcinógeno<br />
é
Ensayo de Ames<br />
étodos de Gen<br />
Medio mínimo<br />
é<br />
étodos de Gen<br />
Medio mínimo<br />
+ sustancia X<br />
én<br />
Medio mínimo<br />
+ sustancia X<br />
é<br />
é<br />
X no es<br />
un mutágeno<br />
X es<br />
un mutágeno
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