Ensayo de neutralización in vitro de aplicación en la ... - Instituto Finlay
Ensayo de neutralización in vitro de aplicación en la ... - Instituto Finlay
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<strong>Ensayo</strong> <strong>de</strong> <strong>neutralización</strong> <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> <strong>de</strong> <strong>aplicación</strong> <strong>en</strong> <strong>la</strong> evaluación <strong>de</strong><br />
<strong>in</strong>munóg<strong>en</strong>os contra <strong>la</strong> hepatitis A, obt<strong>en</strong>idos mediante <strong>la</strong> tecnología <strong>de</strong><br />
expresión <strong>en</strong> fagos fi<strong>la</strong>m<strong>en</strong>tosos<br />
Alicia Agui<strong>la</strong>r1 * , Raiza Martínez1 , Frank Camacho1 , Nevis Am<strong>in</strong>1 , José Luis Alfonso1 , David Stott2 , E<strong>la</strong> María Pérez1 1 <strong>Instituto</strong> F<strong>in</strong><strong>la</strong>y. C<strong>en</strong>tro <strong>de</strong> Investigación-Producción <strong>de</strong> Vacunas. Ave 27, No 19805, La Lisa, Ciudad <strong>de</strong> La Habana, Cuba.<br />
2 University of G<strong>la</strong>sgow, 120 University P<strong>la</strong>ce, G<strong>la</strong>sgow G12 8TA, Scot<strong>la</strong>nd, U.K.<br />
email: email: email: aagui<strong>la</strong>r@f<strong>in</strong><strong>la</strong>y.edu.cu<br />
Introducción<br />
La <strong>in</strong>munidad contra el virus <strong>de</strong> <strong>la</strong> hepatitis A (VHA) se <strong>de</strong>be <strong>en</strong> primera <strong>in</strong>stancia a <strong>la</strong> <strong>in</strong>ducción <strong>de</strong> anticuerpos<br />
neutralizantes. Disponer <strong>de</strong> <strong>en</strong>sayos <strong>de</strong> <strong>neutralización</strong> es <strong>in</strong>disp<strong>en</strong>sable para evaluar nuevos candidatos vacunales<br />
contra este patóg<strong>en</strong>o. En el pres<strong>en</strong>te trabajo se <strong>de</strong>sarrolló un <strong>en</strong>sayo <strong>de</strong> <strong>neutralización</strong> <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> que permitió<br />
evaluar <strong>la</strong> <strong>in</strong>munog<strong>en</strong>icidad <strong>de</strong> mimotopos <strong>de</strong>l VHA obt<strong>en</strong>idos mediante <strong>la</strong> tecnología <strong>de</strong> expresión <strong>en</strong> fagos al<br />
ser <strong>in</strong>munizados ratones Balb/c. Difer<strong>en</strong>tes diluciones <strong>de</strong> anticuerpos se <strong>in</strong>cubaron con 10 3 o 10 2 Dosis Infecciosas<br />
<strong>en</strong> Cultivo <strong>de</strong> Tejidos 50% (DICT 50 ) <strong>de</strong>l clon citopático HM175/18f <strong>de</strong> VHA, y se <strong>in</strong>ocu<strong>la</strong>ron <strong>en</strong> p<strong>la</strong>cas con célu<strong>la</strong>s<br />
FRhK4. Después <strong>de</strong> 7 días <strong>de</strong> <strong>in</strong>cubación el título neutralizante se <strong>de</strong>term<strong>in</strong>ó como el recíproco <strong>de</strong> <strong>la</strong> dilución <strong>de</strong>l<br />
suero capaz <strong>de</strong> reducir <strong>la</strong> multiplicación viral al 50%. Tanto 10 3 como 10 2 DICT 50 fueron neutralizadas por el<br />
anticuerpo monoclonal 7E7 y los sueros humanos (A12 y A31) positivos a anticuerpos anti-VHA. Los controles<br />
negativos <strong>de</strong>l <strong>en</strong>sayo no neutralizaron al virus. Los títulos neutralizantes <strong>de</strong> los sueros <strong>de</strong> ratones <strong>in</strong>munizados<br />
con fagos portadores <strong>de</strong> mimotopos <strong>de</strong> VHA osci<strong>la</strong>ron <strong>en</strong>tre 4 y 16, mi<strong>en</strong>tras que los sueros pre<strong>in</strong>munes y los <strong>de</strong><br />
ratones <strong>in</strong>munizados con fago salvaje M13 no neutralizaron <strong>la</strong> <strong>in</strong>fectividad viral. Este <strong>en</strong>sayo <strong>de</strong> <strong>neutralización</strong><br />
resultó a<strong>de</strong>cuado para <strong>la</strong> evaluación <strong>de</strong> los <strong>in</strong>munóg<strong>en</strong>os propuestos.<br />
Pa<strong>la</strong>bras a<strong>la</strong>bras c<strong>la</strong>ve: c<strong>la</strong>ve: VHA, <strong>neutralización</strong>, mimotopos, <strong>in</strong>munog<strong>en</strong>icidad, fagos.<br />
La hepatitis A es una <strong>en</strong>fermedad aguda que ti<strong>en</strong>e una<br />
consi<strong>de</strong>rable morbilidad e impacto económico,<br />
especialm<strong>en</strong>te <strong>en</strong> los países <strong>en</strong> <strong>de</strong>sarrollo. El ag<strong>en</strong>te<br />
etiológico es el virus <strong>de</strong> <strong>la</strong> hepatitis A (VHA), pert<strong>en</strong>eci<strong>en</strong>te<br />
al género Hepatovirus familia Picornaviridae (1).<br />
El <strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> vacunas <strong>in</strong>activadas y at<strong>en</strong>uadas constituye<br />
un paso importante para el control <strong>de</strong> <strong>la</strong> hepatitis A (2). El<br />
l<strong>en</strong>to ciclo <strong>de</strong> replicación y bajos títulos <strong>de</strong>l VHA <strong>en</strong> cultivo<br />
<strong>de</strong> célu<strong>la</strong>s conduce a que los costos <strong>de</strong> <strong>la</strong>s mismas sean<br />
elevados, lo que limita su <strong>aplicación</strong> <strong>en</strong> los países <strong>en</strong><br />
<strong>de</strong>sarrollo, razón por <strong>la</strong> cual se ha valorado <strong>la</strong> posibilidad <strong>de</strong><br />
<strong>de</strong>sarrol<strong>la</strong>r vacunas más económicas (3).<br />
Se ha <strong>de</strong>mostrado que los péptidos seleccionados a partir<br />
<strong>de</strong> bibliotecas expuestas <strong>en</strong> fagos, empleando anticuerpos<br />
producidos contra antíg<strong>en</strong>os <strong>de</strong> difer<strong>en</strong>tes patóg<strong>en</strong>os,<br />
pue<strong>de</strong>n ser <strong>de</strong> utilidad para el diagnóstico y <strong>la</strong> prev<strong>en</strong>ción<br />
<strong>de</strong> <strong>en</strong>fermeda<strong>de</strong>s (4). La i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> mimotopos <strong>de</strong>l VHA<br />
empleando esta metodología pudiera constituir una fu<strong>en</strong>te<br />
alternativa <strong>de</strong> antíg<strong>en</strong>os para <strong>de</strong>sarrol<strong>la</strong>r nuevos candidatos<br />
vacunales. La <strong>in</strong>munidad contra el VHA se <strong>de</strong>be, <strong>en</strong> primera<br />
<strong>in</strong>stancia, a <strong>la</strong> <strong>in</strong>ducción <strong>de</strong> anticuerpos neutralizantes, por<br />
lo que es <strong>in</strong>disp<strong>en</strong>sable disponer <strong>de</strong> <strong>en</strong>sayos <strong>de</strong> <strong>neutralización</strong><br />
para evaluar los nuevos candidatos <strong>en</strong> estudio (5).<br />
Las cepas <strong>de</strong>l VHA usualm<strong>en</strong>te provocan poco o n<strong>in</strong>gún<br />
efecto citopático (ECP) <strong>en</strong> cultivos celu<strong>la</strong>res. Para evi<strong>de</strong>nciar<br />
su multiplicación se requiere <strong>de</strong> <strong>en</strong>sayos <strong>in</strong>munológicos para<br />
<strong>la</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> antíg<strong>en</strong>o viral u otras técnicas para localizar<br />
secu<strong>en</strong>cias <strong>de</strong> ácidos nucleicos virus específicas (6). Varios<br />
<strong>en</strong>sayos <strong>de</strong> <strong>neutralización</strong> se han <strong>de</strong>sarrol<strong>la</strong>do t<strong>en</strong>i<strong>en</strong>do <strong>en</strong><br />
cu<strong>en</strong>ta <strong>la</strong> naturaleza no citopática <strong>de</strong> <strong>la</strong> mayoría <strong>de</strong> <strong>la</strong>s cepas<br />
<strong>de</strong>l VHA (5, 7-10).<br />
El <strong>en</strong>sayo <strong>de</strong> <strong>in</strong>hibición <strong>de</strong> radio<strong>in</strong>munofocos RIFIT (5) se<br />
recomi<strong>en</strong>da para <strong>de</strong>tectar anticuerpos neutralizantes contra<br />
el virus, pero es muy <strong>la</strong>borioso, consume mucho tiempo y<br />
requiere <strong>de</strong>l uso <strong>de</strong> radioisótopos (11). Con el ais<strong>la</strong>mi<strong>en</strong>to<br />
<strong>de</strong> cepas citopáticas (12) pudieron <strong>de</strong>sarrol<strong>la</strong>rse <strong>en</strong>sayos<br />
basados <strong>en</strong> <strong>la</strong> aparición <strong>de</strong> ECP para <strong>la</strong> titu<strong>la</strong>ción viral y<br />
evaluación <strong>de</strong> pres<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> anticuerpos neutralizantes (11).<br />
Estos son simples, emplean <strong>la</strong>s técnicas tradicionales <strong>de</strong><br />
cultivo <strong>de</strong> tejidos, no necesitan un sistema <strong>de</strong> <strong>de</strong>tección<br />
complejo y pue<strong>de</strong>n ser útiles para el control <strong>de</strong> vacunas y<br />
validación <strong>de</strong> protocolos <strong>de</strong> <strong>in</strong>activación (11).<br />
T<strong>en</strong>i<strong>en</strong>do <strong>en</strong> cu<strong>en</strong>ta que <strong>en</strong> nuestro <strong>la</strong>boratorio contamos<br />
con el clon HM175/18f <strong>de</strong>l VHA que produce ECP <strong>en</strong> corto<br />
tiempo <strong>en</strong> cultivo <strong>de</strong> célu<strong>la</strong>s (12), nos propusimos <strong>de</strong>sarrol<strong>la</strong>r<br />
un <strong>en</strong>sayo <strong>de</strong> <strong>neutralización</strong> <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> basado <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>in</strong>hibición<br />
<strong>de</strong> <strong>la</strong> aparición <strong>de</strong> ECP, aplicable a <strong>la</strong> evaluación <strong>de</strong><br />
* Lic. Microbiología, MC. <strong>en</strong> Microbiología, Investigador agregado. J´Grupo <strong>de</strong> Virología Molecu<strong>la</strong>r <strong>de</strong> <strong>la</strong> Vicepresi<strong>de</strong>ncia <strong>de</strong> Investigaciones <strong>de</strong>l <strong>Instituto</strong> F<strong>in</strong><strong>la</strong>y.<br />
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<strong>in</strong>munóg<strong>en</strong>os y candidatos vacunales contra el VHA<br />
<strong>de</strong>sarrol<strong>la</strong>dos <strong>en</strong> nuestro <strong>la</strong>boratorio mediante <strong>la</strong> tecnología<br />
<strong>de</strong> exposición <strong>de</strong> péptidos <strong>en</strong> fagos fi<strong>la</strong>m<strong>en</strong>tosos.<br />
Materiales y métodos<br />
Cultivos celu<strong>la</strong>res<br />
Célu<strong>la</strong>s <strong>de</strong> <strong>la</strong> línea FRhK-4 (ATCC CRL 1688, Estados Unidos)<br />
se propagaron <strong>en</strong> medio Dulbecco MEM (DMEM) (Gibco,<br />
Estados Unidos) con 10% <strong>de</strong> suero bov<strong>in</strong>o fetal (SBF) v/v<br />
(Gibco, Estados Unidos) a 37 ºC y atmósfera <strong>de</strong> 5% <strong>de</strong> CO 2 .<br />
Preparación <strong>de</strong> un lote viral<br />
El clon citopático HM175/18f <strong>de</strong>l VHA (ATCC VR-1402,<br />
Estados Unidos) fue multiplicado <strong>en</strong> tres frascos <strong>de</strong> 75 cm 2<br />
<strong>de</strong> célu<strong>la</strong>s FRhK-4 a una multiplicidad <strong>de</strong> <strong>in</strong>fección (m.o.i) <strong>de</strong><br />
0,1. Los frascos se <strong>in</strong>cubaron a 37 °C y se observaron<br />
diariam<strong>en</strong>te al microscopio óptico para <strong>de</strong>tectar el efecto<br />
citopático.<br />
Al séptimo día se procedió a realizar <strong>la</strong> cosecha viral.<br />
Posteriorm<strong>en</strong>te fue <strong>de</strong>term<strong>in</strong>ado el título viral <strong>en</strong> p<strong>la</strong>cas <strong>de</strong><br />
96 pozos (Nunc, Fisher Sci<strong>en</strong>tific, Re<strong>in</strong>o Unido) con<br />
monocapas conflu<strong>en</strong>tes <strong>de</strong> célu<strong>la</strong>s FRhK-4. Se <strong>in</strong>ocu<strong>la</strong>ron 8<br />
pozos con 50 µL <strong>de</strong> diluciones <strong>en</strong> base 10 <strong>de</strong>l VHA <strong>en</strong> medio<br />
DMEM (GIBCO, Estados Unidos). Después <strong>de</strong> 1 h <strong>de</strong><br />
adsorción viral a 37 ºC se adicionaron 150 µL <strong>de</strong> DMEM/2%<br />
SBF v/v y <strong>la</strong>s p<strong>la</strong>cas fueron <strong>in</strong>cubadas durante 7 días a 37 ºC<br />
<strong>en</strong> atmósfera <strong>de</strong> 5% CO 2 . El título viral se calculó por el<br />
método <strong>de</strong> Reed y Mu<strong>en</strong>ch (13).<br />
Inmunización <strong>de</strong> ratones<br />
Los fagos (BA1-54, BA1-56, BA1-53, BA1-46 y el fago salvaje<br />
M13) fueron preparados para <strong>la</strong> <strong>in</strong>munización, según<br />
<strong>de</strong>scribieron <strong>de</strong> <strong>la</strong> Cruz y co<strong>la</strong>boradores (14). Los clones <strong>de</strong><br />
fagos fueron resusp<strong>en</strong>didos <strong>en</strong> Amortiguador Fosfato Sal<strong>in</strong>o<br />
(AFS), 0,15 M, pH 7,2, a conc<strong>en</strong>traciones <strong>de</strong> 10 12 UFC/mL e<br />
<strong>in</strong>yectados <strong>in</strong>traperitonealm<strong>en</strong>te <strong>en</strong> ratones BALB/c (c<strong>in</strong>co<br />
por grupo), a razón <strong>de</strong> 0,1 mL/ratón con una emulsión 1:1<br />
con adyuvante completo <strong>de</strong> Freund para <strong>la</strong> primera<br />
<strong>in</strong>munización y con adyuvante <strong>in</strong>completo para <strong>la</strong>s<br />
re<strong>in</strong>munizaciones a los 14 y 28 días. Los animales se<br />
<strong>de</strong>sangraron a los 42 días y el suero fue colectado y guardado<br />
a -20 ºC hasta su evaluación.<br />
<strong>Ensayo</strong> <strong>de</strong> <strong>neutralización</strong><br />
Se <strong>de</strong>sarrolló un <strong>en</strong>sayo <strong>de</strong> <strong>neutralización</strong> <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> simi<strong>la</strong>r al<br />
reportado por Beales y co<strong>la</strong>boradores (11). Para ello, 50 µL<br />
<strong>de</strong> diluciones seriadas <strong>de</strong> los sueros a evaluar se mezc<strong>la</strong>ron<br />
con igual volum<strong>en</strong> <strong>de</strong> diluciones fijas <strong>de</strong>l VHA; 10 3 y 10 2 Dosis<br />
Infecciosas <strong>en</strong> Cultivo <strong>de</strong> Tejidos 50% (DICT 50 ), y se <strong>in</strong>cubaron<br />
durante 2 h a 37 ºC. Posteriorm<strong>en</strong>te cada mezc<strong>la</strong> se <strong>in</strong>oculó<br />
<strong>en</strong> c<strong>in</strong>co pozos <strong>de</strong> p<strong>la</strong>cas <strong>de</strong> 96, sembradas con célu<strong>la</strong>s<br />
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FRhK-4, y se <strong>in</strong>cubó durante 1 h a 37 ºC. Pasado este tiempo<br />
<strong>la</strong>s monocapas celu<strong>la</strong>res se <strong>la</strong>varon tres veces con AFS y se<br />
adicionó DMEM que cont<strong>en</strong>ía el 2% SBF v/v como medio <strong>de</strong><br />
mant<strong>en</strong>imi<strong>en</strong>to. Las p<strong>la</strong>cas fueron <strong>in</strong>cubadas por 7 días a<br />
37 ºC <strong>en</strong> atmósfera <strong>de</strong> 5% CO 2 y observadas diariam<strong>en</strong>te al<br />
microscopio óptico para <strong>de</strong>term<strong>in</strong>ar aparición <strong>de</strong> ECP.<br />
En cada p<strong>la</strong>ca <strong>de</strong> 96 pocillos (Nunc, Re<strong>in</strong>o Unido) se<br />
mantuvieron c<strong>in</strong>co como controles <strong>de</strong> célu<strong>la</strong>s, a los cuales<br />
sólo se les adicionó medio <strong>de</strong> mant<strong>en</strong>imi<strong>en</strong>to. Se <strong>in</strong>ocu<strong>la</strong>ron,<br />
a<strong>de</strong>más, c<strong>in</strong>co pocillos con cada una <strong>de</strong> <strong>la</strong>s diluciones <strong>de</strong><br />
suero para evaluar su posible efecto tóxico para <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s<br />
y con mezc<strong>la</strong>s v/v <strong>de</strong> medio DMEM con 10 3 , 10 2 , 10, 1 y 0<br />
DICT 50 <strong>de</strong>l VHA, como controles <strong>de</strong> titu<strong>la</strong>ción retroversa <strong>de</strong>l<br />
virus.<br />
En un primer experim<strong>en</strong>to se evaluaron <strong>la</strong>s muestras<br />
sigui<strong>en</strong>tes:<br />
- Anticuerpo monoclonal neutralizante anti-VHA 7E7<br />
Mediagnost (45,3 UI/mL) a <strong>la</strong>s diluciones 1/20 (2,260<br />
UI/mL) y 1/40 (1,130 UI/mL).<br />
- Sueros humanos A12 (314 UI/mL) y A31 (214 UI/mL)<br />
positivos a anticuerpos anti-VHA y el suero humano<br />
negativo 1936 (
Resultados y Discusión<br />
Para <strong>la</strong> realización <strong>de</strong>l <strong>en</strong>sayo partimos <strong>de</strong> un lote viral cuyo<br />
título fue 1,12 x 10 6 DICT 50 /mL, el tiempo necesario para <strong>la</strong><br />
aparición <strong>de</strong> ECP fue 7 días, lo cual está <strong>en</strong> el rango reportado<br />
para esta cepa (11).<br />
Las dosis estándares 10 3 y 10 2 DICT 50 <strong>de</strong>l VHA fueron<br />
sufici<strong>en</strong>tes para provocar ECP <strong>en</strong> los c<strong>in</strong>co pozos <strong>in</strong>ocu<strong>la</strong>dos<br />
con controles virales. La pres<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> anticuerpos<br />
específicos <strong>en</strong> <strong>la</strong>s preparaciones <strong>de</strong> anticuerpos empleadas<br />
fue capaz <strong>de</strong> neutralizar <strong>la</strong> <strong>in</strong>fectividad viral, lo que resultó<br />
<strong>en</strong> más <strong>de</strong>l 50% <strong>de</strong> <strong>in</strong>hibición <strong>de</strong> <strong>la</strong> formación <strong>de</strong> ECP para<br />
<strong>la</strong>s dos dosis <strong>de</strong> virus empleadas. El ajuste <strong>de</strong> <strong>la</strong> dosis<br />
estándar <strong>de</strong> virus es importante <strong>en</strong> <strong>la</strong> prueba <strong>de</strong><br />
<strong>neutralización</strong>. En el pres<strong>en</strong>te <strong>en</strong>sayo tanto 10 3 como 10 2<br />
DICT 50 <strong>de</strong>l VHA resultaron útiles, pues <strong>en</strong> ambos casos los<br />
anticuerpos pres<strong>en</strong>tes <strong>en</strong> <strong>la</strong>s muestras positivas fueron<br />
capaces <strong>de</strong> neutralizar al virus. Resultados simi<strong>la</strong>res se<br />
obtuvieron por Krah y co<strong>la</strong>boradores, al <strong>de</strong>sarrol<strong>la</strong>r un <strong>en</strong>sayo<br />
<strong>de</strong> <strong>neutralización</strong> cuya s<strong>en</strong>sibilidad no se vio afectada a una<br />
conc<strong>en</strong>tración <strong>de</strong> virus <strong>en</strong>tre 10 3 y 10 4,7 DICT 50 /mL (7). Zahn<br />
y co<strong>la</strong>boradores reportaron que no hubo variación <strong>en</strong> los<br />
títulos <strong>de</strong> anticuerpos neutralizantes ante dosis <strong>de</strong> virus <strong>de</strong><br />
10 3,4 y 10 5,4 DICT 50 (8). Dosis estándares <strong>de</strong> virus <strong>de</strong> 5000<br />
DICT 50 (9) y <strong>de</strong> 500 DICT 50 (10) también se han empleado con<br />
resultados satisfactorios.<br />
Las diluciones evaluadas <strong>de</strong>l anticuerpo monoclonal 7E7 y<br />
<strong>de</strong>l suero A12 redujeron <strong>la</strong> multiplicación viral <strong>en</strong> más <strong>de</strong>l<br />
50%, por lo cual todas se consi<strong>de</strong>raron positivas a <strong>la</strong><br />
pres<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> anticuerpos neutralizantes. La última dilución<br />
<strong>en</strong> <strong>la</strong> que el suero A12 mostró este efecto fue 1/256 y se<br />
correspondió con 1,226 UI/mL. El suero A31 mostró un título<br />
promedio <strong>de</strong> 2,67±0,18. El suero 1936, el <strong>de</strong> ratón y el Líquido<br />
Ascítico Negativos no neutralizaron <strong>la</strong> <strong>in</strong>fectividad viral (0%<br />
<strong>de</strong> reducción <strong>de</strong> <strong>la</strong> multiplicación viral). No hubo variación<br />
persona/persona <strong>en</strong> <strong>la</strong> lectura <strong>de</strong> <strong>la</strong>s p<strong>la</strong>cas por lo que los<br />
porc<strong>en</strong>tajes <strong>de</strong> reducción <strong>de</strong> <strong>la</strong> multiplicación viral calcu<strong>la</strong>dos<br />
por los dos <strong>in</strong>vestigadores fueron los mismos.<br />
El comportami<strong>en</strong>to <strong>de</strong>l anticuerpo monoclonal 7E7, <strong>de</strong> los<br />
sueros 1936 y <strong>de</strong> ratón y <strong>de</strong>l Líquido Ascítico Negativo fue el<br />
esperado, dado el carácter neutralizante <strong>de</strong>l primero y <strong>la</strong><br />
aus<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> anticuerpos anti-VHA <strong>en</strong> los últimos. Cualquiera<br />
<strong>de</strong> <strong>la</strong>s diluciones evaluadas <strong>de</strong> <strong>la</strong>s muestras anteriores y <strong>de</strong>l<br />
suero A12 pudieran ser empleados como controles <strong>en</strong> futuros<br />
<strong>en</strong>sayos. Sería <strong>de</strong> utilidad <strong>de</strong>term<strong>in</strong>ar los títulos neutralizantes<br />
<strong>de</strong>l anticuerpo monoclonal y el suero A12 <strong>en</strong> futuros<br />
experim<strong>en</strong>tos, lo que permitirá emplearlos más diluidos y<br />
consumir m<strong>en</strong>os cantidad <strong>de</strong> ellos.<br />
El suero A31, aunque pres<strong>en</strong>tó un alto título <strong>de</strong> anticuerpos<br />
anti-VHA, tuvo un título neutralizante bajo, por lo cual no<br />
recom<strong>en</strong>damos su uso. Las diluciones más bajas <strong>de</strong> suero<br />
no causaron efecto tóxico <strong>en</strong> <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s, lo cual pudiera ser<br />
erróneam<strong>en</strong>te <strong>in</strong>terpretado como ECP.<br />
18<br />
Los sueros que se obtuvieron 42 días <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
<strong>in</strong>munización <strong>de</strong> los ratones con los cuatro clones <strong>de</strong> fagos<br />
portadores <strong>de</strong> mimotopos <strong>de</strong>l VHA neutralizaron <strong>la</strong><br />
<strong>in</strong>fectividad viral (Tab<strong>la</strong> 1). Los títulos neutralizantes <strong>de</strong> los<br />
mismos osci<strong>la</strong>ron <strong>en</strong>tre 4 y 16 días. El anticuerpo monoclonal<br />
7E7 (control positivo) produjo el mismo efecto a <strong>la</strong> dilución<br />
1/40, que neutralizó al 66,6% <strong>la</strong> multiplicación viral. En<br />
contraste, el suero pre<strong>in</strong>mune y el obt<strong>en</strong>ido a partir <strong>de</strong> los<br />
animales <strong>in</strong>munizados con el fago salvaje (M13) no<br />
neutralizaron al virus <strong>en</strong> n<strong>in</strong>guna <strong>de</strong> <strong>la</strong>s diluciones evaluadas,<br />
así como <strong>la</strong> dilución 1/100 <strong>de</strong>l suero <strong>de</strong> ratón (control<br />
negativo).<br />
Tab<strong>la</strong> ab<strong>la</strong> 1. 1. 1. Títulos Títulos <strong>de</strong> <strong>de</strong> anticuerpos anticuerpos neutralizantes neutralizantes antianti- anti-VHA anti- VHA <strong>en</strong><br />
<strong>en</strong><br />
muestras muestras <strong>de</strong> <strong>de</strong> sueros sueros tomadas tomadas antes antes <strong>de</strong> <strong>de</strong> <strong>in</strong>munizar <strong>in</strong>munizar y y a a los<br />
los<br />
42 42 días días pos<strong>in</strong>munización.<br />
pos<strong>in</strong>munización.<br />
Ley<strong>en</strong>da: Los resultados se expresan como el recíproco <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
dilución <strong>de</strong> suero que reduce <strong>la</strong> multiplicación <strong>de</strong> <strong>la</strong> cepa HM175/f8<br />
al 50%, se muestran los títulos para 10 3 DICT 50.<br />
*Promedio y <strong>la</strong> <strong>de</strong>sviación estándar <strong>de</strong> los títulos <strong>de</strong> los sueros<br />
pos<strong>in</strong>munización.<br />
(-) aus<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> anticuerpos neutralizantes.<br />
La pres<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> anticuerpos neutralizantes <strong>en</strong> <strong>in</strong>munóg<strong>en</strong>os<br />
contra el VHA, que se <strong>de</strong>sarrol<strong>la</strong>ron <strong>en</strong> nuestro <strong>la</strong>boratorio<br />
mediante <strong>la</strong> tecnología <strong>de</strong> exposición <strong>de</strong> péptidos <strong>en</strong> fagos<br />
fi<strong>la</strong>m<strong>en</strong>tosos, fue posible evaluar<strong>la</strong> mediante <strong>la</strong> <strong>aplicación</strong><br />
<strong>de</strong> este <strong>en</strong>sayo.<br />
El hecho <strong>de</strong> que <strong>en</strong> <strong>la</strong> superficie <strong>de</strong> los fagos pueda ser<br />
expuesto un amplio repertorio <strong>de</strong> secu<strong>en</strong>cias peptídicas al<br />
azar, ofrece <strong>la</strong> v<strong>en</strong>taja <strong>de</strong> po<strong>de</strong>r seleccionar un gran número<br />
<strong>de</strong> secu<strong>en</strong>cias <strong>en</strong> un tiempo re<strong>la</strong>tivam<strong>en</strong>te corto. Para<br />
confirmar <strong>la</strong> utilidad <strong>de</strong> <strong>la</strong>s secu<strong>en</strong>cias seleccionadas como<br />
posibles candidatos vacunales es necesario evaluar <strong>la</strong><br />
<strong>in</strong>munog<strong>en</strong>icidad <strong>de</strong> <strong>la</strong>s mismas fuera <strong>de</strong>l ambi<strong>en</strong>te <strong>de</strong>l fago<br />
<strong>en</strong> forma <strong>de</strong> péptidos s<strong>in</strong>téticos. Los péptidos libres pue<strong>de</strong>n<br />
adoptar múltiples conformaciones llevando a una baja<br />
conc<strong>en</strong>tración <strong>de</strong> <strong>la</strong>s conformaciones necesarias para <strong>in</strong>ducir<br />
<strong>la</strong> respuesta <strong>in</strong>mune específica contra el antíg<strong>en</strong>o (16). De<br />
ahí que el empleo <strong>de</strong> <strong>la</strong> tecnología <strong>de</strong> expresión <strong>de</strong> péptidos<br />
<strong>en</strong> fagos fi<strong>la</strong>m<strong>en</strong>tosos para seleccionar péptidos capaces<br />
<strong>de</strong> <strong>in</strong>ducir una respuesta específica contra el VHA, impone<br />
evaluar <strong>la</strong> respuesta <strong>in</strong>mune <strong>in</strong>ducida por múltiples<br />
candidatos. Un <strong>en</strong>sayo <strong>de</strong> <strong>neutralización</strong> simple y rápido,<br />
como el <strong>de</strong>sarrol<strong>la</strong>do por nosotros, resulta v<strong>en</strong>tajoso para<br />
este propósito.<br />
De los difer<strong>en</strong>tes métodos empleados para evaluar <strong>la</strong><br />
respuesta <strong>in</strong>mune humoral contra el VHA, sólo los <strong>en</strong>sayos<br />
VacciMonitor acciMonitor 2010; 2010; V VVol.<br />
VV<br />
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<strong>de</strong> <strong>neutralización</strong> i<strong>de</strong>ntifican anticuerpos biológicam<strong>en</strong>te<br />
relevantes y son los recom<strong>en</strong>dados para medir anticuerpos<br />
contra el virus, particu<strong>la</strong>rm<strong>en</strong>te aquellos g<strong>en</strong>erados <strong>de</strong>spués<br />
<strong>de</strong> <strong>la</strong> vacunación (7). El hecho <strong>de</strong> contar con un clon<br />
citopático <strong>de</strong>l VHA <strong>de</strong> rápida multiplicación <strong>en</strong> cultivo celu<strong>la</strong>r<br />
nos permitió realizar el <strong>en</strong>sayo <strong>de</strong> <strong>neutralización</strong> basado <strong>en</strong><br />
<strong>la</strong> <strong>in</strong>hibición <strong>de</strong> <strong>la</strong> aparición <strong>de</strong> ECP, como medida <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
multiplicación viral, que resultó ser simple y no necesitó un<br />
sistema <strong>de</strong> <strong>de</strong>tección complejo, sólo <strong>la</strong>s técnicas<br />
tradicionales <strong>de</strong> cultivo <strong>de</strong> tejidos, lo cual resulta v<strong>en</strong>tajoso<br />
para <strong>la</strong> evaluación <strong>de</strong> los múltiples <strong>in</strong>munóg<strong>en</strong>os y candidatos<br />
vacunales que permite obt<strong>en</strong>er <strong>la</strong> tecnología <strong>de</strong> expresión<br />
<strong>en</strong> fagos. Con su <strong>aplicación</strong> evitamos <strong>de</strong>sv<strong>en</strong>tajas propias<br />
<strong>de</strong> otros <strong>en</strong>sayos <strong>de</strong> <strong>neutralización</strong>.<br />
Refer<strong>en</strong>cias<br />
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2001;14:38-58.<br />
2. Wasley A, Fiore A, Bell BP. Hepatitis A <strong>in</strong> the Era of Vacc<strong>in</strong>ation.<br />
Epi<strong>de</strong>miologic reviews 2006; 28:101-11.<br />
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In <strong>vitro</strong> neutralization assay to evaluate new hepatitis A vacc<strong>in</strong>e candidates<br />
Abstract<br />
Abstract<br />
Immunity to hepatitis A virus (HAV) is <strong>in</strong> first <strong>in</strong>stance due to neutraliz<strong>in</strong>g antibodies. Neutralization assays are<br />
ess<strong>en</strong>tial to evaluate new candidate vacc<strong>in</strong>es aga<strong>in</strong>st this pathog<strong>en</strong>. In this paper, an <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> neutralization assay<br />
to evaluate HAV vacc<strong>in</strong>e candidates us<strong>in</strong>g phage–disp<strong>la</strong>y technology is <strong>de</strong>scribed. 10 3 and 10 2 DICT 50 of HAV<br />
were <strong>in</strong>cubated with differ<strong>en</strong>t antibodies preparations and were <strong>in</strong>ocu<strong>la</strong>ted onto p<strong>la</strong>tes with FRhK4 cells. After<br />
sev<strong>en</strong> days of <strong>in</strong>cubation, the neutraliz<strong>in</strong>g titer was <strong>de</strong>term<strong>in</strong>ed as reciprocal of the serum dilution reduc<strong>in</strong>g HAV<br />
growth (<strong>in</strong>hibition of CPE) by 50%. 10 3 and 10 2 DICT50 were neutralized by 7E7 anti-HAV monoclonal antibody<br />
and anti-VHA positive human sera (A12 and A31). Negative controls of the assay did not neutralize viral <strong>in</strong>fectivity.<br />
Sera from mice immunized with phages disp<strong>la</strong>y<strong>in</strong>g VHA mimotopes had neutraliz<strong>in</strong>g titers from 4 – 16. Neither<br />
negative control nor pre-immune and sera from mice immunized with M13 wild type phage neutralized HAV. A<br />
simple and faster <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> neutralization assay was <strong>de</strong>veloped to evaluate new HAV vacc<strong>in</strong>e candidates.<br />
Keywords eywords eywords: eywords HAV, neutralization, mimotope, immunog<strong>en</strong>icity, phages.<br />
Recibido: Octubre <strong>de</strong> 2009 Aceptado: Diciembre <strong>de</strong> 2009<br />
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