TEMA:HIBRIDACIÓN in situ - Instituto de Biotecnología

ii) Para sondas marcadas con haptenos detectados con anticuerpos
conjugados a enzimas, la señal puede ser generada por enzimas endógenas.
Esto puede evaluarse por controles en los cuales la sonda y el anticuerpo no
estén presentes.
Aquí son listados algunos artefactos más comúnes y sus posibles soluciones.
a) Ruido de fondo sobre la laminilla (sondas radiactivas). Éste es el más
frecuente debido a la emulsión. Evaluar la emulsión sumergiendo una
laminilla blanca. Un ruido de fondo muy alto, puede aparecer en las orillas de
la laminilla debido al secado muy rápido de la sonda durante la hibridación,
evitando tener secciones de tejido cerca de las orillas de la lámina.
b) Ruido de fondo en los límittes del tejido (sondas radioactivas). Granos de
plata pueden ser detectados alrededor del tejido por estrés meánico durante
el secado. El secado de la emulsión debe ser muy lento reemplazandoló por
un plato fresco.
c) Ruido de fondo uniforme sobre el tejido. Éste es el mayormente causado
por enlaces no específicos de la sonda, el cual puede ser debido a:
i) Para sondas de RNA, la secuencia del plásmido ha sido transcrita.
ii) La sonda es muy larga o muy pequeña.
iii) La concentración de la sonda es muy alta (o tan pequeña que el ruido de
fondo llega a ser un factor imitante después de una larga exposición
(reacción colorimétrica).
iv) La baja selectividad de los lavados en la hibridación
v) Si la digestión post-hibridación con ribonucleasas está actuando sobre la
sonda de RNA.
vi) La sonda es enlazada a un componente celular. Esto amerita evaluar una
región distnta en el mismo gene. Se evita usar sondas que sean ricas en GC.
d) Ruido de fondo sobre tejidos específicos. Ciertos tejidos parecen
favorecere más el pegado de la sonda que otros. Tratando diferente a la
sonda o ajustando la concentración, la hibridación y/o las condiciones de
lavado puede ayudar.
e) Ruido de fondo con sondas marcadas con haptenos. Puede ser debido
a:
i) Alta concentración del anticuerpo anti-haptenos.
ii) Bloqueo insuficiente de sitios de pegado inespecífico antes de la
hibridación. Condiciones muy astringentes en los lavados al igual que en las
de bloqueo.
iii) Presencia de enzimas endógenas que pueden catalizar la señal de
detcción. El uso de inhibidores a una alta temperatura o con ácidos pueden
ser usados para inactivar ciertas enzimas endógenas.
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