Volumen 79 Número 1 - Sociedad Argentina de Oftalmología

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Luengo Gimeno, Federico ABSTRACT ALLOGRAFT EPITHELIAL CORNEAL CELL LAYERS TRANSPLANTATION IN RABBITS Objective: To evaluate the efficacy of heterologous limbal cell sheet transplantatation over time. Methods: Limbal stem cell deficiency (LSCD) was induced in 1 New Zealand White rabbits by alkaline injury (autologous group) and in 20 animals by anterior lamellar keratectomy including the limbal area (heterologous group). A small 2. mm2 limbal sample was obtained from healthy eyes of randomly selected rabbits. Limbal epithelial cells were cultured on a fibroblast feeder layer grown on autologous clotted platelet poor plasma (PPP), and 21 days later stratified epithelial sheets were ready to be grafted. The heterologous epithelial grafts were sutured over the exposed corneal stroma. Clinical follow up was performed for up to 360 days. Results: Clinically the corneas were clear from the 21 st postoperative day in all animals. No neovascularization was seen in the autologous group. A full thickness continuous layer of stratified epithelial cells resembling corneal epithelium was seen in grafted corneas of the heterologous group. Control group showed a thin regenerative epithelium and a pronounced fibroblastic proliferation. Neither clinical nor histological evidence of immune reaction was observed. Conclusions: Auto and allografts of bioengineered limbal epithelium promoted corneal reepithelialization. These results could be considered as a beneficial option for uni or bilateral ocular surface diseases treatment. Key Words: stem cells, timbal cell déficit, bioengineerigng, alkalis. [ 14 ] Introducción Actualmente, la bioingeniería de tejidos se ha establecido como una opción terapéutica en diversos campos de la medicina. Los avances biotecnológicos han permitido el cultivo y replicación de células pluripotenciales de algunos órganos, como mioblastos, condroblastos, células madre de médula ósea y queratinocitos de piel. Esto ha permitido desarrollar nuevas terapias de transplante de tejidos en pacientes que no tenían, tiempo atrás, posibilidades de recibir algún tipo de tratamiento. A estos avances se sumó el transplante de epitelio corneal a partir de las células madre del limbo esclerocorneal. 1-3 El transplante autólogo de células troncales limbares de epitelio corneal es una opción terapéutica. 4 Se ha establecido como opción te- rapéutica en patologías de la superficie corneal como quemaduras por álcalis, síndrome de Stevens-Johnson, 6 penfigoide ocular 7 y pterigion gigante, donde procesos secundarios a un Déficit de Stem Cells Limbares (DSCL) - como la presencia de vasos sanguíneos invadiendo la cornea 8-9 más una histoarquitectura corneal anormal-, conllevan a una pérdida total de la transparencia de ese órgano, causando una ceguera invalidante en el paciente. 10 Los objetivos de nuestro estudio fueron lograr el cultivo de una neomembrana de epitelio corneal a partir de una mínima muestra de células troncales limbares 11 y que ésta sea efectiva en el tratamiento de alteraciones de la superficie corneal de conejos, autólogos o heterólogos, con déficit de células troncales limbares.
Implante de epitelio corneal organotípico en el tratamiento del déficit de stem cells limbares Materiales y métodos Se utilizaron un total de 3 conejos de raza Neocelandesa. Con un peso aproximado de 3000 gr., estos animales fueron mantenidos en un hábitat con temperatura, humedad e iluminación constante (ciclo de luz de 14 horas/ día), alimentados con alimento balanceado y agua natural ad-libitum y supervisados por un médico veterinario, según las normas de nuestra institución. La investigación fue llevada a cabo en el Departamento de Investigación de la Facultad de Ciencias Biomédicas de la Universidad Austral en conjunto con el Departamento de Bioingeniería de Tejidos de Laboratorios Craveri y la Fundación Oftalmológica Argentina “Jorge Malbrán”, desde marzo del 2003 hasta diciembre del 200 . Se utilizaron dos modelos de DSCL: Uno antólogo, en 1 conejos machos a los cuales se les lesionó la córnea tras la aplicación de hidróxido de sodio; y otro heterólogo en 20 conejos hembras, en los que se produjo el DSCL mediante una queratectomía laminar profunda incluyendo limbo. Todo procedimiento invasivo fue realizado bajo anestesia general con midazolam 0.2ml/kg y ketamina 1.4ml/kg y tópica con colirios de proparacaína y lidocaína. Los animales fueron tratados según las normas de investigación en oftalmología y visión en animales de ARVO (ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research). 12 Modelo de DSCL con Quemaduras por Álcalis Para obtener un estado de DSCL similar a humanos se utilizaron 1 conejos en los que se aplicó sobre la superficie ocular una solución de 1M NaOH durante 60 segundos, que luego fue lavada con ClNa 0,9%. Posteriormente, se tomó una muestra de tejido limbar de 2, 4 mm 2 del ojo sano contralateral con un trépano de 1,8 mm. de diámetro. Las células troncales así obtenidas fueron aisladas, cultivadas y replicadas durante 21 días. Luego, estas células fueron colocadas en una matriz de plasma, formándose una membrana de 14 mm. de diámetro en condiciones de ser implantada. A los 60 días de producida la lesión por álcalis, se realizó el implante de la neomembrana epitelial. Se efectuó una periotomía de 360° seguida de una queratectomía laminar que se extendió hasta el limbo esclero-corneal con el objetivo de lograr un lecho corneal adecuado. La lámina con células troncales corneales fue colocada sobre el estroma receptor, y se la suturó a la esclera perilimbar con 8 puntos no continuos de sutura de nylon 10-0. El tratamiento postoperatorio fue con ciprofloxacina 0,3% cinco veces al día durante 10 días; dexametasona 0,1% cuatro veces al día más ciclosporina 1% dos veces al día durante todo el postoperatorio. La aplicación de láser argón sobre neovasos corneales fue implementada en casos de neovascularización del implante corneal. El análisis clínico se realizó durante los 12 meses postoperatorios y los animales fueron sacrificados al primer mes (n= ), tercero (n= ), sexto (n=3) y decimosegundo mes (n=2) postoperatorio para estudiar los resultados mediante microscopía óptica y electrónica. El análisis cuantitativo de las mitosis celulares fue realizado visualmente bajo microscopio, siguiendo un mismo método, que consistió en la cuenta de mitosis en cinco campos del 100X del espécimen histológico. Cinco animales con descementocele y/o endoftalmitis pre-transplante fueron excluidos del protocolo y reemplazados por nuevos animales lesionados. Modelo de DSCL con Queratectomía Laminar Profunda incluyendo Limbo Se utilizaron 1 conejos en los que se realizó sobre un ojo sano una queratectomía laminar profunda incluyendo limbo para reproducir un estado deficitario de células troncales limbares. Inmediatamente se colocó la neomembrana epitelial heteróloga que había sido cultivada y replicada bajo las mismas condiciones explicadas en el modelo anterior pero a partir de una biopsia de otro conejo (heterólogo). El grupo control fue de conejos en los que solo se realizó la queratectomía laminar profunda sin la implantación de una neomembrana epitelial. Los animales fueron tratados en el postoperatorio con ciprofloxacina 0,3% cinco veces al día, y dexametasona 0,1% durante 1 días. El análisis histológico se realizó a los 30, 60 y 90 días. El análisis cuantitativo de las mitosis celulares se realizó utilizando el mismo método que en el modelo anterior. [ 1 ]
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