Cuantificación mediante la técnica de PCR en tiempo real ... - FBMC

Cuantificación mediante
la técnica de PCR en tiempo real
Usos y aplicaciones
Paula Fernández
Laboratorio de Marcadores Moleculares y Genómica Vegetal
Instituto de Biotecnología. CICVyA. INTA-Castelar

PCR Standard vs. PCR Tiempo
Real
Análisis de punto final
Detección del producto por
Electroforesis en gel
Análisis de la cinética de
la reacción
Detección del producto en
cada ciclo de la reacción

VENTAJAS DE PCR SOBRE
ALTA SENSIBILIDAD
ALTA ESPECIFICIDAD
RAPIDEZ
DESVENTAJA:
OTRAS TÉCNICAS
PROBLEMAS DE CONTAMINACION (a partir de trazas de DNA
templado específico o productos amplificados previamente)

Geles de agarosa….
* Baja precisión
* Baja sensibilidad
* Baja resolución
* No automatizado
* Discriminación sólo por tamaño
* Resultados cualitativos

RT-PCR
OBJETIVO:
Detección de la expresión de
un gen – por presencia de
mRNA
Consiste en dos pasos:
• Transcripción reversa
• PCR
mRNA
cDNA (simple cadena)
cDNA (doble cadena)
PCR

PCR en tiempo real
• La PCR cuantitativa se realiza en un termociclador con
capacidad de hacer incidir sobre cada muestra un haz de
luz de una longitud de onda determinada y de detectar la
fluorescencia emitida por el fluorocromo excitado.

Real Time PCR

• Fluoróforo que se intercala en
el surco menor de la doble
cadena de ADN
Desventaja: se une a CUALQUIER
ADN de doble cadena (dímeros
de primers y productos
inespecíficos).

Observación del proceso de amplificación
Se adquieren los datos cuando la amplificación está
todavía en la fase exponencial. Esto está
determinado por la identificación del número de
ciclo al cual la intensidad de emisión del fluoróforo
aumenta con respecto al ruido de fondo (background)
Este número de ciclo se llama ciclo umbral
(C t: threshold cycle). El C t está determinado en la fase
exponencial de la reacción y es más confiable que las
mediciones a punto final convencionales. El C t es
inversamente proporcional al número de copias del
target templado: a mayor concentración de templado,
menor C t medido.
Concepto de eficiencia

X n = X 0(1 + E) n
Using the PCR Equation
Ecuación de la PCR
Xn = producto de PCR luego del ciclo n
X0 = número inicial de copias
E = eficiencia de amplificación
n = número de copias
X0 Número de
ciclos
X n

Eficiencia
La eficiencia de la reacción puede ser calculada por la siguiente
ecuación: E=10 (-1/slope) . La eficiencia de la PCR debería ser de aprox.
90-100% (pendiente ideal = 3.32)
Diversos factores afectan la eficiencia como puede ser: el largo del
amplicón, la estructura secundaria y el diseño de primers (entre
otros).

Efecto de la eficiencia de
amplificación
Xn = X0(1+E) n
Caso 1: E = 0.9 Caso 2: E = 0.8
Xn = 100 (1+0.9) 30 Xn = 100 (1+0.8) 30
X n = 2.3 x 10 10 X n = 4.6 x 10 9
Resultados
Una diferencia de 0.1 en la eficiencia de amplificación resultó en u
número final de copias significativamente menor.

log view
Las cinco diluciones alcanzan el plateau en el mismo punto aunque cada curva muestra
un recorrido diferente. Esto refuerza el hecho de que si las mediciones fueran tomadas a
lo largo del plateau los datos no representarían la cantidad inicial del target.

R n
Como interpretar Rn?
C T
Sample
Threshold R n
0 10 20 30 40
Cycle number
No Template
Control
R n
R n

Rn
* Rn + es el valor Rn de una reacción que contiene todos los
componentes (muestra de interés, GOI, blanco); Rn - es el valor
Rn detectado in NTC
(valor de base)
* Delta Rn es la diferencia entre Rn + and Rn - . Es además un
indicador de la magnitud de señal generada por la PCR
* El gráfico de Delta Rn versus el número de ciclos y muestra las
curvas de amplificación para estimar los valores de Ct
NTC: no template control
GOI: gene of interest

PROBLEMAS
PRODUCTOS NO ESPECÍFICOS (artefactos): que pueden
incrementar el valor de fluorescencia obtenida durante la
reacción. Esto es mas frecuente cuando se utiliza SYBR-green.
ARTEFACTOS - PRODUCTOS NO ESPECIFICOS:
• Unión inespecífica de primers (mispriming): por unión de los
primers a secuencias parcialmente complementarias presentes en
el DNA o cDNAs de la muestra
• Dímeros: los primers pueden hibridarse entre ellos creando
productos pequeños

CURVA DE DENATURALIZACIÓN
Muestra el perfil de denaturalización de los productos
amplificados.
Si un producto presenta un perfil de denaturalización
diferente (valores de Tm diferentes), significa que es otro
producto (no específico) de amplificación, pueden ser
dímeros.

CURVA DE DENATURALIZACIÓN DE DILUCIONES
(se observan dímeros, de menor temperatura de fusión)
dímeros

DISEÑO EN PLACA

Ventajas del PCR en tiempo real
• Simple y rápida (semi-automatizada).
• No hay manipulación post-PCR.
• Eliminación de contaminación por amplicones.
• Cuantificación del DNA o RNA molde inicial.
• Muy sensible.
• Detección de productos inespecíficos con la opción
“curva de desnaturalización” (Melt-Curve).
• Detección de más de un producto específico en una
misma reacción.
• Extraordinariamente específico.

Desventajas del PCR en tiempo real
• Laborioso y dificultoso de poner a punto
• Determinación de genes presuntos constitutivos
• Alta sensibilidad

Determinación del ciclo umbral (Cq) y eficiencias de la
reacción de PCR cuantitativa (LinReg PCR)

Normalización con genes de referencia
• Usualmente son genes abundantes y expresados a un nivel
celular/tisular constante
• Los más usados son en general los menos confiables
•Usar una combinación de varios genes

Valor M: índice de estabilidad de control interno
(nivel de expresión de dos genes constitutivos debe ser idéntica)
Media aritmética de los desvíos de los dos genes constitutivos (j y k)
Limitantes:
Dependencia de genes analizados
Evalúa media aritmética de los desvíos estándard de a pares de genes
Supuesto de estabilidad de todos los genes
33

CL1: Control leaf 1
CL2: Control leaf 2
FE1: Flower excision 1
FE2: Flower excision2
D: Dehydrated1
Búsqueda de genes de referencia
Modelo estadístico

Búsqueda de genes de referencia
Uso de geNorm

• Degradación de la clorofila
• Degradación de proteínas
• Degradación de lípidos
• Reciclaje de nutrientes

(Gan and Amasino 1997)

El objetivo general de este trabajo es contribuir al conocimiento de los factores
moleculares involucrados en el desencadenamiento del proceso de senescencia
temprana en girasol, a través del estudio de los perfiles de expresión de genes
candidatos en plantas de girasol sometidas a tratamientos que aceleran o retardan
este proceso y sus respectivos controles.
Objetivos específicos
•Seleccionar genes candidatos asociados a distintas etapas del proceso de
senescencia foliar (SAG) a partir de información disponible en distintas especies de
plantas.
•Identificar secuencias ortólogas de estos genes en girasol y diseñar
oligonucleótidos iniciadores específicos para su evaluación por PCR.
•Evaluar el comportamiento de los genes SAGs seleccionados en plantas de girasol
expuestas a condiciones que aceleran o retardan el proceso de senescencia
mediante la técnica de RT‐PCR.
•Verificar y cuantificar la expresión de estos genes en plantas de girasol sometidas a
tratamientos que aceleran o retardan el proceso de senescencia mediante PCR
cuantitativa, utilizando distintos genes de referencia (RG).

• Material biológico: híbrido de girasol VDH 481 (Advanta Semillas)
• Experimento realizado a campo EEA INTA Balcarce
• Tratamientos y diseño experimental :

• Los niveles de expresión relativos de los genes
R2, D3 y D4 se compararon con los genes de
referencia (RG): Tubulina‐1 (TUB1) y Factor de
Elongación (EF1α)
• A partir de los datos de eficiencias y Cq se
calcularon los perfiles de expresión de los tres
genes por medio del programa fgStatistic
(UNCor).

Moschen, S. 2009

Normalización de PCR cuantitativa y
búsqueda de genes de referencia
•Imposibilidad de usar un solo gen constitutivo para todas las
especies (Coker y Davies 2003)
•Tubulina es el más estable en hoja, raíz y flor (más conveniente para
análisis dentro de clonotecas en tomate) y en Populus pero el menos
estable en Arabidopsis.
•DNA-J-like protein más estable en su expresión media (∆Ct) entre
todas las clonotecas (tomate).
•Alta abundancia de 18S o 28S RNA frente a mRNA (Kim y col. 2003)
(refutado por Solanas y col. 2001).

C1
C2
F1
F2
F3
S1
S2
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F401
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H110
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T289
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EF432
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H124
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F549
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H387
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H302
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F231
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T234
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F209
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H136
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H209
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T253
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EF624
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F210
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F171
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T107
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T111
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F192
C1
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T322
C1
C2
F1
F2
F3
S1
S2
S3
T187
Estudios de expresión de genes candidatos
frente a estreses abióticos
Perfil de expresión
para cada uno de los
80 genes candidatos
Fernández y col. 2008

?
∆Rn
7
6
5
4
3
2
1
0
-1
Estudios de expresión de genes candidatos
frente a estreses abióticos
Validación de genes por PCR cuantitativa (PCR en tiempo real)
• De los 15 genes que fueron seleccionados para su validación se evaluaron 12,
confirmándose la expresión diferencial de 10 de ellos (Método 2 -∆∆Ct Livak y
Schmittgen, 2001).
(BU671806)
EST T124
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
Ciclo
FH
SH
CH
7
6
5
4
∆Rn
3
2
1
0
-1
(BU671910)
EST EF502
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
Ciclo
FH
SH
CH

Desarrollos y aplicaciones
• qRT- PCR: muy útil ya que los métodos tradicionales no permiten
cuantificar o son muy dificultosos o poco sensibles
• monitorear eficacia de las estrategias de resistencia a enfermedades
(variedades mejoradas, transgénicas, rotación de cultivos, etc)
• monitorear la progresión de la infección en plantas modelo o de
interés agronómico
• diagnóstico niveles de infección
• correlacionar manifestaciones de la enfermedad con la carga del
patógeno en un rango más amplio
• correlación entre genotipo de la planta y respuesta a la infección
• cuantificar diferentes genotipos que coexisten en una infección
• cuantificación de RNA: niveles de expresión de genes de patógenos
y de hospedadores en respuesta a la infección
• confirmación de resultados de micromatrices de ADNc u
oligonucleótidos

Métodos de detección por hidrólisis de ADN
(Sondas TaqMan)
• Permiten medir la producción de productos de PCR mediante un sistema de sondas
marcadas mediante dos fluorocromos.
• Su utilidad radica en que poseen un fluoróforo en su extremo 3' y una molécula en el 5'
que bloquea su emisión de fluorescencia (denominada en inglés «quencher»); esta
sonda marcada hibrida específicamente en la parte central del producto de PCR a
obtener.
• Cuando la polimerasa se topa con la sonda la hidroliza mediante su actividad
exonucleasa 5'-3', lo cual provoca la separación del quencher del fluorocromo y, por
tanto, se emite fluorescencia.

Métodos de detección por hidrólisis de ADN
(Sondas Molecular Beacons)
• Son también oligonucleótidos de cadena simple que, por su estructura, poseen una zona
de apareamiento de bases interna y, que, por tanto, forman una horquilla. En presencia del
amplicón la sonda se abre y se une preferentemente a aquél, lo que produce la emisión de
fluorescencia.
• Cuando la sonda está cerrada en horquilla, el fluoróforo del 3' impide la emisión de
fluorescencia por parte del propio del 5', cosa que no sucede al unirse al amplicón.