PDF - Instituto de Biotecnología - Universidad Nacional Autónoma ...

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA
Métodos fisicoquímicos en Biotecnología
Trabajo de investigación
CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA
Presentan
M. en C. Edgar Ernesto Esquivel Soto
Q.F.B. Lidia Irene Leal Guadarrama

JUNIO 2004
CUERNAVACA, MORELOS
Cromatografía de fase reversa
2

CONTENIDO
INTRODUCCIÓN
TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA
La fase estacionaria
Retención de modo mixto
La fase móvil
Elución por gradiente
Parámetros cromatográficos
Factor de capacidad
Eficiencia
Selectividad
Resolución
Cromatografía por supresión iónica
Cromatografía secuencial
Arreglo positivo­negativo
Arreglo negativo­positivo
Arreglo negativo­negativo
Arreglo positivo­positivo
Cromatografía de fase reversa
APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA
Purificación de biomoléculas
Purificación de proteínas y péptidos naturales
Purificación de péptidos y proteínas recombinantes
Purificación de péptidos obtenidos por digestiones enzimáticas
Purificación de péptidos sintéticos
3

Purificación de oligonucleótidos sintetizados químicamente
Purificación a gran escala
Desalado
Análisis cuantitativo
Normalización de área
Calibración con estándar externo
Calibración con estándar interno
Adición de estándar
Cromatografía de fase reversa
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Cromatografía de fase reversa
ALGUNOS ASPECTOS PARA EL DESARROLLO DE UN ANÁLISIS DE
CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA
Naturaleza química de la fase estacionaria
Tamaño y forma de partícula
Tamaño de la columna
Velocidad de Flujo
Temperatura
Solventes
Desnaturalización
Gradiente de elución
Acondicionamiento de columna
Preparación de las muestras
Limpieza de la columna
Almacenamiento de columna
Resolución de problemas
EQUIPO DE HPLC
Sistemas para el tratamiento de los disolventes
Sistemas de bombeo
Sistemas de inyección de la muestra
Columnas
Tipos de relleno de la columna
Termostatos
Detectores
Detectores de absorbancia
Detectores de arreglos de diodos
Detectores de infrarrojo
Detectores de índice de refracción
Detector de dispersión de luz (ELSD)
Detectores de espectrometría de masas
PROVEEDORES
COMENTARIOS
5

BIBLIOGRAFÍA
INTRODUCCIÓN
Cromatografía de fase reversa
Los avances en el campo de la biotecnología han requerido el uso de técnicas más eficaces
para la separación y purificación de biomoléculas. La cromatografía de líquidos ha
resultado ser una herramienta muy poderosa y eficiente para la separación de mezclas
complejas tanto de compuestos de bajo peso molecular como de proteínas y ácidos
nucleicos.
En los inicios de la cromatografía de líquidos se utilizaban columnas de vidrio con
diámetros de 1 a 5 cm y longitudes de 50 a 500 cm. En este tipo de columnas realizó sus
trabajos el botánico ruso Mikhail Tswett. Él empleó esta técnica para separar varios
pigmentos vegetales, que aparecían como bandas coloreadas en la columna. El relleno de
las columnas consistía en partículas de 150 a 200 micras de diámetro. Más tarde se
encontró que se podía aumentar la eficiencia disminuyendo el tamaño de las partículas de
los rellenos. A finales de los años sesenta se logró desarrollar la tecnología adecuada para
producir y utilizar partículas del orden de las 3 a 10 micras. A esta nueva forma de
cromatografía se le llamó cromatografía de líquidos de alta resolución, HPLC por sus siglas
en inglés (High Performance Liquid Chromatography).
El sistema cromatográfico de fase reversa fue introducido por Howard y Marlin en 1950.
Hasta ese momento, la cromatografía de líquidos se utilizaba básicamente para separar
compuestos polares, siendo la fase estacionaria de un carácter altamente polar y la fase
móvil poco polar. Estos científicos revirtieron la polaridad de las fases con el objetivo de
separar ácidos grasos. Así fue como surgió la cromatografía de fase reversa; aquella en la
que la fase estacionaria es no polar y la fase móvil es polar. Entonces, a la primera
modalidad de cromatografía se le empezó a conocer como cromatografía de fase normal.
La técnica de fase reversa, RPC (del ingles Reverse Phase Chromatography), se ha
convertido en el tipo de cromatografía más ampliamente utilizada en HPLC e incluye cerca
de la mitad de los métodos de cromatografía de líquidos descritos en la literatura. Esta
técnica proporciona retención y selectividad óptimas cuando las muestras tienen un carácter
predominantemente alifático o aromático.
6

Cromatografía de fase reversa
En el presente trabajo se pretende dar al lector un panorama de la teoría y aplicaciones de la
cromatografía en fase reversa, así como algunas consideraciones importantes durante el
desarrollo de esta técnica cromatográfica. Y dado que la cromatografía de fase reversa se
aplica en equipos de alta resolución (HPLC), también se incluye una sección en la que se
describe brevemente su funcionamiento.
TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA
Todas las formas de cromatografía de líquidos son procesos de migración diferencial, donde
los componentes de la muestra son selectivamente retenidos por una fase estacionaria y
eluídos secuencialmente mediante el cambio de polaridad de la fase móvil. En la
cromatografía de fase reversa (RPC) se utiliza un empaque hidrofóbico, usualmente un
grupo funcional octadecilo u octilo y una fase móvil polar.
La fase estacionaria
La fase estacionaria para cromatografía de fase reversa consiste en una matriz porosa e
insoluble a la que se le han unido químicamente compuestos hidrofóbicos. Los soportes
para casi todos los rellenos se preparan con sílica rígida, formada por partículas
mecánicamente resistentes, porosas y uniformes, con diámetros de 3, 5 o 10 micras.
La superficie de la sílica está constituida por grupos silanol (SiOH) químicamente reactivos
2
que abarcan una superficie cercana a los 8 μmol/m
. (Figura 1)
Si
Si
Si
Si
O
OH
CH 3
O Si (CH 2 ) 17 CH 3
CH 3
CH 3
Si O Si
CH 3
CH 2
CH 3
7

Figura 1. Grupos silanol libres y grupos silanol derivatizados.
Cromatografía de fase reversa
La sílica presenta las ventajas de resistir la aplicación de altas presiones sin contraerse, y de
no expandirse al contacto con los solventes. Pero tiene la desventaja de ser químicamente
inestable; a un pH menor de 3 los ligandos unidos a la sílica pueden ser removidos y a un
pH mayor de 7.5, la sílica se solubiliza.
A diferencia de la sílica, las matrices de poliestireno son muy estables incluso en pH´s que
van desde 1 hasta 12, lo cual permite lavar y regenerar la columna con hidróxido de sodio
que es el agente más efectivo para la remoción de proteínas fuertemente unidas a la
superficie de la fase estacionaria. Además, el poliestireno tiene un carácter hidrofóbico per
se (Figura 2) por lo que ya no requiere ser derivatizado, evitándose así el inconveniente de
procesos ineficientes de unión de ligandos. Sin embargo, presenta la desventaja de
expandirse al contacto con los solventes orgánicos típicamente empleados en RPC.
­CH2­CH­CH2­CH­CH2­CH­CH2­CH­CH2­CH
­CH2­CH­CH2­CH­CH2­CH­CH2­CH­CH2­
CH
­CH2­CH­CH2­CH­CH2­CH­CH2­CH­CH2­CH
­CH2­CH­CH2­CH­CH2­CH­CH2­CH­CH2­CH
­CH2­CH­CH2­CH­CH2­CH­CH2­CH­CH2­CH
Figura 2. Estructura química de las matrices de poliestireno.
El acoplamiento de los ligandos a la sílica generalmente se efectúa usando reactivos de tipo
clorotrialquilsilanos. (Figura 3) En esta reacción, no todos los grupos silanol reaccionan ya
que las cadenas alquilo generan un impedimento estérico que previene la derivatización
completa de todos los grupos disponibles. El recubrimiento de la superficie por sililación se
8

Cromatografía de fase reversa
2
limita a 4 μmoles/m
. Los grupos silanol residuales imparten una polaridad indeseable a la
superficie, y son responsables del efecto de retención de modo mixto. Para reducir este
efecto, los grupos silanol residuales se hacen reaccionar con compuestos cloroalquilsilanos
más pequeños como el clorotrimetil y clorotrietilsilano. A este proceso se le conoce como
“end­capping” o bloqueo.
Figura 3. Alquilación de grupos silanol.
Por lo general, el grupo alquilo del siloxano en estos recubrimientos es una cadena C8 (noctilo)
o una cadena C18 (n­octadecilo). (Figura 4)
A)
B)
C)
O
O
O
CH3
Si
CH3
CH3
Si
CH3
CH3
Si
CH3
Si OH + Cl Si (CH 2 ) 17 CH 3
CH2 CH3
CH2 CH2
CH2 CH2
CH 3
CH 3
CH 3
Si O Si (CH 2 ) 17 CH 3 + HCl
CH 3
CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3
CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3
Figura 4. Ejemplos de grupos siloxanos. A) Grupo alquilo de 2 carbonos
B) Grupo alquilo de 8 carbonos C) Grupo alquilo de 18 carbonos.
9

Cromatografía de fase reversa
Puede considerarse que la RPC es un proceso de partición en donde los solutos están
distribuidos entre una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar. Los solutos no
polares tienden a adsorberse en la fase estacionaria y se mueven a través del sistema más
lentamente que los solutos polares.
El mecanismo que se ha propuesto para explicar el mecanismo por el cual estas superficies
retienen a los solutos es el siguiente. Cuando un soluto se disuelve en agua, las fuerzas de
atracción entre las moléculas de agua se distorsionan o se rompen. Únicamente los solutos
altamente polares o iónicos pueden interaccionar con la estructura del agua. Los solutos no
polares casi no interactúan con estas estructuras y como consecuencia “abandonan” la fase
móvil para adsorberse al hidrocarburo de la fase estacionaria. La fuerza motriz de la
retención no es la interacción favorable del soluto con la fase estacionaria, sino el efecto de
repulsión del disolvente por el soluto.
La fase móvil
La retención hidrofóbica del soluto en la fase estacionaria puede disminuirse añadiendo un
disolvente orgánico a la fase móvil acuosa. Al decrementar la polaridad de la fase móvil, la
distribución de los solutos se cambia hacia la fase móvil.
La cantidad de muestra que se une a la fase estacionaria depende de la concentración del
ligando inmovilizado, de las propiedades químicas y físicas de la molécula que va a ser
adsorbida y de la polaridad de la fase móvil y estacionaria. Así, conforme menos polar sea
la fase móvil, menor será la adsorción de la muestra a la fase estacionaria.
Respecto a las características químicas del ligando, es difícil predecir qué tipo de cadena
hidrocarbonada será mejor para determinada aplicación.
En principio, entre menos polar sea la molécula que se va a purificar, se requerirá una fase
estacionaria más hidrofóbica. Sin embargo, si la muestra resulta ser muy afín a la matriz, la
elución se dificultaría. Así que debe hacerse un análisis cuidadoso de la molécula de interés
y determinar la naturaleza química de los contaminantes asociados.
10

Cromatografía de fase reversa
La porosidad de las partículas de la fase estacionaria también es un factor importante que
influye en la capacidad de unión. Los poros grandes facilitan la interacción del soluto con el
ligando. Cuando se requiera una capacidad de unión máxima, deberá escogerse una matriz
que contenga poros suficientemente grandes, capaces de alojar todas las moléculas de
interés.
Retención de modo mixto
El modo mixto de retención resulta de la interacción de los grupos silanol cargados
negativamente expuestos en la superficie de la matriz con los grupos cargados
positivamente de las moléculas de la muestra. Genera ensanchamiento de picos e
incremento de los tiempos de retención.
Los grupos silanol expuestos en la superficie de la matriz pueden provenir de un “endcapping”
ineficiente o del deterioro de las columnas. La superficie de la matriz se erosiona
por el uso de la columna, lo que resulta en la exposición de los grupos silanol. El uso
prolongado de soluciones acuosas también puede acelerar el envejecimiento de la columna.
El uso de fases móviles de bajo pH, suprime la ionización de los grupos silanol, sin
embargo, no hay que olvidar que un pH menor de 3 puede hidrolisar los ligandos de la
matriz.
El mecanismo de separación en cromatografía de fase reversa se basa en la distribución del
soluto entre la fase móvil y la estacionaria. La elución o el arrastre del soluto mediante la
fase móvil, se inicia con un eluyente de elevada polaridad como es el caso de una solución
acuosa; a esta fase móvil inicial se le denomina fase A. Hay que tomar en cuenta que la
polaridad de la fase móvil A debe ser suficientemente baja como para disolver al soluto de
carácter hidrofóbico y suficientemente alta como para permitir que el soluto se una a la
matriz hidrofóbica.
Para lograr la desorción secuencial de los solutos unidos a la matriz, se disminuye la
polaridad de la fase móvil. Esto se hace mediante la adición gradual de solventes orgánicos
a la fase móvil A como son el metanol o el acetonitrilo. La fase móvil final, denominada
fase B, es la que presenta menor polaridad y tiene el mayor poder de elución. La fuerza del
solvente está definida cuantitativamente por el parámetro εº.
(Tabla 1) Generalmente el
pH de la fase móvil inicial y final permanece constante.
El acetonitrilo y el metanol son los solventes más comunes puesto que ambos tienen baja
viscosidad y no absorben luz UV. El isopropanol es un disolvente con alto poder de
11

Cromatografía de fase reversa
elución, sin embargo, no es de los más empleados debido a su incrementada viscosidad que
resulta en baja transferencia de masa del soluto entre las fases y elevación de presión aún en
bajos flujos.
Para describir cuantitativamente la polaridad de los disolventes, Synder desarrolló el índice
de polaridad P’. (Tabla 1) En esta escala, los valores de polaridad varían de 10.2 para un
compuesto muy polar como el agua hasta –2 para los muy poco polares. Cualquier índice
de polaridad que se desee entre esos límites se puede conseguir mezclando dos disolventes
adecuados. De este modo, la polaridad P’AB de una mezcla de disolventes A y B está dada
por:
P’AB = ФAPA+ФBPB
Donde Ф son las fracciones en volumen de cada solvente y P son los parámetros de
polaridad de cada solvente.
Disolvente UV
nm
Índice de
refracción
a 25°C
Viscosidad
La fuerza del eluyente se estableció en base a una columna: *C18, ** silica.
ND = No determinado
cP
Tabla 1. Índice de polaridad de Snyder.
Índice de
polaridad P
´
Fuerza
eluyente ε 0
Ciclohexano 200 1.424 1.00 0.2 ND
Dietiléter 215 1.352 0.24 2.8 **0.43
Tetrahidrofurano 212 1.472 0.55 4.0 *3.7
Cloroformo 245 1.445 0.57 4.1 **0.26
Etanol 210 1.359 1.08 4.3 ND
Metanol 205 1.328 0.55 5.1 *1
Acetonitrilo 190 1.341 0.38 5.8 *3.1
Isopropanol 205 1.377 2.40 3.9 *8.3
Agua 190 1.333 1.00 10.2 *Alta
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Elución por gradiente
Cromatografía de fase reversa
Las separaciones isocráticas usan la misma composición de fase móvil a través de la
separación. Las eluciones isocráticas se usan cuando la mezcla a separar no es muy
compleja o cuando los componentes de la mezcla tienen tiempos de retención muy
diferentes.
Pero para separar mezclas de proteínas, generalmente se requiere de un gradiente de elución
en el que la composición de la fase móvil cambia através del análisis como se indicó
anteriormente.
El gradiente de elución se recomienda generalmente para:
• Muestras que tengan tiempos de retención semejantes.
• Muestras de peso molecular mayor a 1000.
• Muestras de origen biológico.
Aún cuando se piense utilizar una elución isocrática, es recomendable hacer un primer
análisis por gradiente para determinar el porcentaje del solvente más adecuado.
En cuanto a los tipos de gradiente, los hay lineales, curvos y escalonados o segmentados.
(Figura 5)
%B
Lineal
Tiempo
%B
Curvo
Tiempo
%B
Figura 5. Formas de los gradientes más comunes
Segmentado
Tiempo
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Parámetros cromatográficos
Cromatografía de fase reversa
El comportamiento de retención de un compuesto refleja la distribución del soluto entre la
fase móvil y la estacionaria. La concentración en cada fase está dada por el coeficiente
termodinámico de repartición. Cuando K = 1, el soluto se encuentra igualmente distribuido
entre las dos fases.
K=
C E
C M
Donde CE y CM son las concentraciones de soluto en la fase estacionaria y la fase móvil
respectivamente.
Factor de capacidad
La razón de reparto o razón de capacidad, k’, relaciona el equilibrio de distribución de la
muestra dentro de la columna, es decir, es la relación del tiempo transcurrido en la fase
estacionaria contra el tiempo transcurrido en la fase móvil. Matemáticamente se define
como el cociente de los moles de un soluto en la fase estacionaria entre los moles en la fase
móvil:
C V
E E
k '=
C V
M M
El factor de capacidad puede ser calculado para cada pico usando la siguiente ecuación:
t −t
R 0
k '=
t
0
Donde tR es el tiempo de retención de la muestra y t0 es el tiempo de retención de un soluto
que no interactúa con la fase estacionaria, también conocido como tiempo muerto. El
14

Cromatografía de fase reversa
tiempo de retención transcurre desde la inyección de la muestra hasta que el compuesto
alcanza el detector. El primer componente eluído deberá tener un tiempo de retención del
doble del tiempo muerto.
Dicho de otra manera, la razón de reparto es el tiempo adicional que un soluto requiere para
eluir, en comparación con un soluto no retenido, para el cual k’=0.
La fase móvil seleccionada debe dar valores de k’ que estén en el rango de 1 a 20. Valores
mayores de k’ generan tiempos de retención largos que resultan en tiempo analítico
desperdiciado; y los valores menores que la unidad no proporcionan una resolución
adecuada entre los solutos.
Los solventes fuertes proveen pequeños valores de k’, mientras que los solventes débiles
dan valores de k’ más altos. Se ha visto que por cada 2 unidades de diferencia en el valor de
polaridad de un mezcla de disolventes, el factor de capacidad k’ cambia un orden de
magnitud aproximadamente, lo que significa que la retención del compuesto en una
columna particular puede variarse simplemente mediante la modificación de los solventes
de la fase móvil
Eficiencia
Una característica importante de un sistema cromatográfico es su eficiencia, expresada
como una cantidad adimensional llamada número de platos teóricos. El término “plato
teórico” proviene de un estudio teórico en el que se trató a una columna como si estuviera
constituida de numerosas, discretas y contiguas capas denominadas platos teóricos. Refleja
el número de veces que el soluto se reparte entre las dos fases durante su paso a través de la
columna. Entre más grande sea el número de platos teóricos de una columna, mayor será su
eficiencia y por tanto se podrá lograr una mayor resolución.
La eficiencia de una columna puede determinarse a partir de un pico del cromatograma
mediante la siguiente ecuación:
15

N =5.54
2
t
R
W
1/2
Cromatografía de fase reversa
Donde tR es el tiempo de retención del pico y W1/2 es ancho del pico medido a la mitad de la
altura del mismo. (Figura 6)
Absorbancia
Figura 6. Determinación de la eficiencia de una columna en base a un pico de un cromatograma.
El número de platos teóricos algunas veces es reportado como platos por metro de columna.
En esta expresión, la altura equivalente a un plato teórico H está dada por la ecuación:
H= L
N
Donde L es longitud de columna y N es el número de platos teóricos.
t R
W 1/2 1/2
Tiempo
Alto de
pico
La eficiencia depende principalmente de las propiedades físicas de la matriz y de la
columna. La eficiencia mejora mucho al disminuir el diámetro de la columna, al aumentar
su longitud y al reducir el tamaño de partícula del empaque o al bajar la viscosidad del
disolvente.
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Selectividad
Cromatografía de fase reversa
La selectividad se refiere a la capacidad del método para distinguir las propiedades de los
componentes a nivel molecular y que permite diferenciarlos. Es importante determinar las
características de la molécula que nos permitirán separarla, ya sea peso molecular, carácter
ácido­base, polaridad, tamaño, actividad bioquímica, óptica, etc.
La selectividad puede ser física o química, dependiendo de la naturaleza de las
interacciones entre el grupo funcional y el medio de separación. Las interacciones que
involucran fuerzas de dispersión, dipolos y fuerzas de hidrógeno se consideran físicas. Por
otro lado, un equilibrio ácido­base o la formación de complejos se clasifican como
selectividades químicas.
La selectividad física es la que predomina en RPC porque en este método los componentes
son separados de acuerdo a sus polaridades. Esto significa que la RPC puede usarse para
separar grupos de compuestos de acuerdo a su estructura química. Las pequeñas diferencias
en las estructuras moleculares de dos compuestos resultan en grandes diferencias de
adsorción y por lo tanto permite su separación por RPC.
La selectividad (α) es equivalente a la retención relativa de los picos de la muestra y está
dada por la siguiente expresión:
'
k
2
α=
k
1
' =
V
2
V
1
Donde V1 y V2 son los volúmenes de retención, k1´ y k2´ son los factores de capacidad
para los picos 1 y 2 respectivamente.
Resolución
La resolución de una columna constituye una medida cuantitativa de su capacidad para
separar dos solutos.
Los parámetros que contribuyen en la resolución (Rs) de los picos son la selectividad (α),
la eficiencia o número de platos teóricos (N) y el factor de retención k’. (Figura 7 y 8)
17

Estos parámetros se relacionan en una ecuación de la siguiente manera:
Rs= α−1
4 α N k '
1k '
V 1
V 2
W 1
Cromatografía de fase reversa
Figura 7. Determinación de la resolución en un par de picos de un cromatograma.
W 2
R s =
V 2 – V 2
W 2
2 + + W W 1/ 1/ 2
2
18

Cromatografía de fase reversa
Figura 8. Resolución de picos en diferentes cromatogramas. En el segundo
cromatograma hay mayor resolución porque los picos están más separados uno de otro.
Para mejorar la resolución de una columna se pueden variar cada uno de los siguientes
parámetros:
•Factor de capacidad: es el elemento más manipulable debido a que depende de la
polaridad de la fase móvil. Para una resolución óptima, k’ debe estar en el intervalo
entre 2 y 5.
A B
A
B
95 % A 95 % B
99 % A 99 % B
R s = 1 R s = 1. 5
•Número de platos teóricos: los números de platos teóricos se incrementan aumentando
la longitud de la columna. Sin embargo, una consecuencia adversa es un incremento del
tiempo necesario para la separación. La relación entre N y Rs está definida por el
cuadrado de N. Por ejemplo, un incremento en el número de platos teóricos N de 100 a
625 aumentará la resolución por un factor de 2.5 y no por uno de 6.25. Otra forma de
mejorar la resolución consiste en reducir la altura de los platos lo cual puede
conseguirse disminuyendo el tamaño de partícula del relleno o bajando la viscosidad del
disolvente.
•Selectividad: implica modificar las características químicas del relleno de la columna.
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Cromatografía por supresión iónica
Cromatografía de fase reversa
La cromatografía de pares iónicos o cromatografía por supresión iónica es un tipo de
cromatografía de fase reversa que se utiliza para la separación de especies ionizables. Se
recomienda el uso de este tipo de cromatografía especialmente para moléculas cargadas de
gran peso molecular como las proteínas o los ácidos nucleicos.
En este modo de cromatografía, se añade a la fase móvil un compuesto iónico que aporta un
contra­ión orgánico grande; la concentración de estos agentes está en un rango de 0.01 % a
0.03 %.
El mecanismo exacto de la cromatografía de pares iónicos no se ha establecido claramente,
sin embargo, existen dos modelos fundamentales.
El primero postula que la molécula del soluto forma un par iónico con el contra­ión en la
fase móvil y de esta manera aumenta la hidrofobicidad de la muestra. (Figura 9) El grado
en el que la muestra ionizada y el contra­ión forman el complejo de par iónico, así como la
fuerza de unión del complejo con la fase estacionaria, afecta al tiempo de retención de la
muestra. Al aumentar la concentración del contra­ión, aumenta la retención hasta un límite
que generalmente está dado por la solubilidad del contra­ión en la fase móvil.
El otro mecanismo postula que el contra­ión se retiene en la fase estacionaria que es
normalmente neutra y le proporciona una carga. Esta fase estacionaria cargada puede
entonces formar complejos con los iones orgánicos de carga opuesta. Es muy probable que
el mecanismo real involucre a ambos postulados.
Luego, la elución de los pares iónicos se consigue mediante una fase móvil que contenga
metanol u otro disolvente orgánico miscible en agua.
20

­
­
+ + + +
+
­
+
Péptidos cargados positivamente
­
+
­
+
­
+
+
­
­
+
Cromatografía de fase reversa
Figura 9. Supresión de cargas de proteínas y de ácidos nucleicos.
El agente más usado para la supresión de cargas en proteínas es el ácido trifluoroacético y
para los ácidos nucleicos es la trietilamina.
El control del pH es el parámetro más importante en este tipo de cromatografía. La
retención aumenta conforme el pH maximiza la concentración de la forma iónica de los
solutos. Un pH bajo asegura que las bases fuertes estén en su forma iónica protonada y que
los ácidos débiles presentes estén en su forma no iónica. La fase móvil es preparada
generalmente con ácido trifluoroacético (TFA) o el ácido ortofosfórico que mantienen el
pH cercano a 3.
El mayor beneficio de los pH´s bajos usados en la cromatografía de supresión iónica es la
eliminación del efecto de modo mixto que genera un incremento en el tiempo de retención
y un ensanchamiento de picos. Pero al mismo tiempo, el método de supresión iónica está
limitado a un intervalo de pH de 3.0 a 7.5, debido a la inestabilidad de las fases
estacionarias fuera de este intervalo de pH.
­
­
­
+
Agentes supresores de iones cargados negativamente
Oligonucleótidos cargados negativamente
+
Agentes supresores de iones cargados positivamente
+
­
+
21

Cromatografía secuencial
Cromatografía de fase reversa
En este tipo de cromatografía las columnas se acoplan de manera secuencial, es decir, se
conecta una columna después de otra. De esta manera los compuestos a analizar interactúan
de manera independiente con cada soporte y los mecanismos de retención son diferentes en
cada columna.
La consideración más importante en el diseño de acoplamiento de columnas involucra la
compatibilidad de la fase móvil con cada columna. El eluyente debe facilitar la unión
selectiva de los compuestos de interés en una o ambas columnas.
Las columnas pueden acoplarse de manera que los contaminantes queden retenidos en la
primera o en la segunda columna. Esta modalidad es empleada más frecuentemente para la
purificación de proteínas. A continuación se revisan los tipos de acoplamiento.
Arreglo positivo­negativo
En un acoplamiento de columnas positivo­negativo, la proteína de interés se une a la
primera columna y los contaminantes fluyen sin interactuar. En la segunda columna los
contaminantes quedan retenidos, pero la proteína de interés no. En los siguientes pasos se
cambia la polaridad de la fase móvil generando la elución de la proteína de una manera
concentrada.
Generalmente las proteínas están presentes en muy bajas concentraciones en las muestras
biológicas, así que la estrategia más eficiente es utilizar una columna que retenga a la
proteína y la concentre.
Arreglo negativo­positivo
La columna inicial retiene a los contaminantes, mientras que la segunda columna une a la
proteína de interés. En este arreglo, la primera columna (llamada “negativa” porque no
22

Cromatografía de fase reversa
retiene a la proteína o componente de interés) generalmente se remueve, luego se procede la
elución de la proteína de la segunda columna (positiva) sin que los contaminantes
interfieran puesto que fueron eliminados al retirar la primera columna.
Una de las desventajas de este arreglo es que la primera columna debe unir a la mayoría de
los compuestos contaminantes.
Arreglo negativo­negativo
La proteína de interés no tiene ningún tipo de interacción con ninguna columna. La
desventaja de este arreglo es que la proteína se va diluyendo conforme atraviesa el sistema
cromatográfico.
Arreglo positivo­positivo
Es el arreglo que genera la mayor selectividad pues la proteína es retenida tanto en la
primera columna como en la segunda, así que de alguna manera la proteína se somete a dos
pasos de purificación. La proteína se une a la columna inicial y los contaminantes pasan de
largo. Cuando la proteína eluye de la primera columna pasa a la segunda donde es retenida.
En este caso se requiere de un segundo proceso de elución para liberar a la proteína.
23

Cromatografía de fase reversa
APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA DE FASE
REVERSA
La cromatografía de fase reversa fue desarrollada en 1950 y fue ideada para la separación
de pequeñas moléculas orgánicas. Más tarde, con la aparición de nuevos soportes para la
fase estacionaria y nuevos detectores, se convirtió en una herramienta indispensable para la
separación de biomoléculas como proteínas, péptidos y oligonucleótidos.
Purificación de biomoléculas
En la actualidad, la RPC se usa de manera generalizada para separar los siguientes grupos
de biomoléculas:
• Proteínas y péptidos de origen natural
• Proteínas y péptidos recombinantes
• Péptidos obtenidos por digestión enzimática
• Péptidos sintetizados químicamente
• Oligonucleótidos sintéticos
A continuación se señalan algunas consideraciones generales para lograr estrategias de
purificación correctas.
Purificación de proteínas y péptidos de origen natural
La purificación de péptidos y proteínas a partir de sus fuentes naturales requiere de
diferentes técnicas cromatográficas debido a la complejidad de la mezcla original. Para el
último paso de purificación se usa la RPC y la filtración por gel de alto rendimiento. Sin
embargo, la RPC no es un método tan apropiado para separar péptidos y proteínas de
fuentes biológicas debido a la presencia de lípidos y otros solutos altamente hidrofóbicos
que se unen fuertemente a la fase estacionaria, dificultando su separación de la columna.
Hay varios puntos a considerar cuando se utiliza la RPC para purificar moléculas
provenientes de mezclas biológicas complejas. En primer lugar, si una proteína o péptido se
va a utilizar en estudios funcionales, debemos asegurarnos que la actividad biológica se
24

Cromatografía de fase reversa
mantiene después de cada paso de purificación. Este no es un problema crítico cuando se
trata de péptidos o proteínas pequeñas, pero las proteínas grandes tienden a desnaturalizarse
bajo las condiciones de la RPC.
La elección adecuada del medio de fase reversa y las condiciones de elución, incluyendo el
tiempo de exposición a condiciones potencialmente desnaturalizantes, deberá optimizarse a
fin de mantener la integridad funcional de la molécula. Además, la presencia de proteasas
en las muestras puede dificultar la purificación de polipéptidos, por lo que es aconsejable
trabajar con agilidad durante las primeras etapas de purificación a fin de minimizar el
tiempo de contacto entre las proteasas y la muestra. Una manera de evitar la degradación de
proteínas es adicionando a la solución amortiguadora inhibidores específicos de proteasas.
Otro problema común de purificación a partir de mezclas naturales es el fenómeno de
agregación. Los agregados solubles como dímeros o trímeros pueden ser separados de los
monómeros por filtración en gel.
Purificación de péptidos y proteínas recombinantes
La dificultad para aislar péptidos o proteínas de sus fuentes naturales, se puede superar a
través de la producción de éstas con técnicas recombinantes. Los polipéptidos
intracelulares son más difíciles de purificar, ya que es necesario lisar las células para su
obtención. En cambio, las proteínas o péptidos secretados al medio son relativamente
fáciles de purificar y en general, no son susceptibles a las proteasas intracelulares.
La purificación de péptidos recombinantes del medio extracelular puede dificultarse por los
volúmenes tan grandes que se obtienen por lo que se requiere de un paso inicial para
concentrar la muestra. Este inconveniente se puede resolver si se une al péptido una
secuencia terminal específica como proteína A, glutatión trasferasa, o poli­amino ácidos, lo
que permitirá una purificación cromatográfica por afinidad. Una vez concentrado y
purificado el péptido será necesario remover el asa a través de métodos enzimáticos o
químicos. La purificación de péptidos recombinantes puede monitorearse mediante RPC,
análisis de amino ácidos, mapeo de epítopes, bioensayos o electroforesis en gel de
poliacrilamida.
Purificación de péptidos obtenidos por digestiones enzimáticas
25

Cromatografía de fase reversa
La digestión de una proteína con proteasas, usualmente tripsina, genera una mezcla de
péptidos que pueden ser separados por RPC para obtener un mapa peptídico de la proteína.
Incluso puede asignarse la posición de los puentes de disulfuro al comparar los
cromatogramas de una digestión en donde los puentes de disulfuro permanezcan intactos y
los cromatogramas de otra digestión en donde los puentes de disulfuro hayan sido
reducidos con β­mercaptoetanol.
Purificación de péptidos sintéticos
En la actualidad, la síntesis química de péptidos menores de 20 amino ácidos es un
procedimiento de rutina en muchos laboratorios. Las cantidades sintetizadas van de
miligramos hasta gramos. La generación de péptidos sintéticos genera contaminantes
adyacentes como péptidos truncados o con modificaciones en la secuencia de aminoácidos.
También se encuentran presentes pequeñas moléculas orgánicas como fenol y tioles,
producidos al separar el péptido sintético de la fase estacionaria o soporte.
Los péptidos con menos de 20 aminoácidos, en general, se pueden obtener con un alto
grado de pureza usando solamente RPC. Para purificar microgramos de muestra podría
utilizarse un empaque con partículas de 5 μm,
pero si se requieren cantidades mayores
será necesario utilizar una matriz de 15 a 30 μm.
Purificación de oligonucleótidos sintetizados químicamente
La síntesis de fase sólida automatizada es un procedimiento comúnmente utilizado para
generar oligonucleótidos de 20 a 30 pares de bases de largo.
El carácter hidrofóbico de las bases nitrogenadas disminuye en el orden
adenina>timina>guanina>citosina. Entonces, los oligonucleótidos ricos en adenina tenderán
a eluir más lento que aquellos ricos en citosina.
Los principales contaminantes son secuencias truncadas junto con pequeñas cantidades de
oligonucleótidos que difieren en la secuencia. La separación entre las secuencias completas
de las incompletas se puede simplificar si la purificación se lleva a cabo usando grupos
protectores 5´ tritilo que poseen tres anillos de benceno; de esta manera sólo los
oligonucleótidos completos tendrán la hidrofobicidad suficiente para permanecer anclados
a la fase estacionaria.
26

Purificación a gran escala
Cromatografía de fase reversa
La purificación a gran escala de péptidos y oligonucleótidos sintéticos o proteínas
recombinantes por cromatografía de fase reversa requiere de una alta resolución para la
separación de estos compuestos. En estos casos, la purificación a escala analítica se
optimiza usando una matriz de fase reversa de partículas pequeñas y se escala utilizando
una matriz con una selectividad similar pero hecho con partículas más grandes.
Hay esencialmente tres etapas en la purificación de una biomolécula a partir de extractos o
muestras naturales: la captura, purificación intermedia y el pulido.
El propósito de la captura es aislar, concentrar y estabilizar la molécula blanco de la
muestra cruda en forma rápida y con un buen porcentaje de recuperación. La captura no se
espera que sea un paso altamente resolutivo, pero es necesaria para aislar la molécula de
interés de distintas sustancias contaminantes; es decir, es un proceso de separación de
grupo.
La fase intermedia de purificación se enfoca en separar a la molécula blanco de la mayoría
de las impurezas como proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, endotoxinas y virus. La
capacidad de resolver componentes similares es de suma importancia en esta etapa de
purificación dado que los contaminantes presentes comparten características funcionales y
estructurales con la molécula blanco.
El pulido es el último paso para la obtención de un producto puro, este procedimiento se
utiliza para remover el resto de los contaminantes e impurezas, de tal manera que el
producto final pueda ser obtenido puro para su posterior uso. Los contaminantes en esta
etapa son a menudo muy similares a la molécula blanco. Los más comunes incluyen a
variantes estructurales y conformacionales de la propia molécula.
Desalado
La desalación es un procedimiento de rutina en el laboratorio y consiste en la separación de
contaminantes de bajo peso molecular de las biomoléculas de mayor peso molecular. A este
procedimiento en ocasiones también se le denomina “cambio de buffer”. Las técnicas no
cromatográficas para desalar incluyen a la ultra filtración y a la diálisis.
27

Cromatografía de fase reversa
Las proteínas, péptidos y ácidos nucleicos pueden desalarse adecuadamente usando la
cromatografía de fase reversa puesto que las muestras pueden recuperarse y reconstituirse
en volúmenes pequeños y de esta manera evitar el fenómeno de dilución que resulta de la
filtración por gel.
Una vez que se ha procesado toda la muestra, el soluto se eluye usando volúmenes
pequeños de fase móvil de baja polaridad, típicamente acetonitrilo. Si el solvente utilizado
es volátil, éste puede ser removido por evaporación y la muestra residual podrá ser
resuspendida en el volumen deseado de otro solvente o solución.
Análisis cuantitativo
La cromatografía de fase reversa también puede proporcionar información cuantitativa
acerca de las especies separadas, lo cual le da un impacto de aplicación aún mayor a esta
técnica. La cuantificación en RPC se basa en la comparación del área del pico del
compuesto problema con las de uno o más estándares.
Los instrumentos cromatográficos están equipados con integradores electrónicos digitales,
los cuales permiten una precisa estimación de las áreas de pico.
Hay cuatro técnicas principales para la cuantificación: normalización de área, calibración
con estándar externo, estándar interno y la adición de estándar.
Normalización de área
El área de los picos se reporta como un porcentaje de área total. (Figura 10) Ésta técnica es
muy empleada para estimar las cantidades relativas de impurezas en una muestra; la
desventaja es que asume que todos los componentes tienen el mismo nivel absorción a la
longitud de onda que se monitorea.
28

Calibración con estándar externo
93%
2.8%
2.2%
Tiempo
Figura 10. Ejemplo de normalización de área.
Cromatografía de fase reversa
0.8% 1.2%
Implica preparar soluciones del estándar con una concentración conocida. Se inyecta el
mismo volumen de cada solución y se construye una curva de calibración en función de la
concentración y las áreas de pico. La concentración de los estándares debe ser parecida a la
concentración que se espera para las muestras. Las muestras de concentración desconocida
se preparan, inyectan y analizan de la misma manera. La concentración de las muestras se
obtiene a partir de la curva de calibración.
A este método se le llama estándar externo porque los estándares se analizan en
cromatogramas separados de las muestras.
Calibración con estándar interno
Consiste en la adición de un compuesto diferente al analito a cada una de la soluciones que
se van a analizar. Se analizan soluciones de muestra de diferentes concentraciones a las que
se ha añadido la misma cantidad de estándar interno.
29

Cromatografía de fase reversa
Requerimientos para un estándar interno:
• Tener buena resolución (Rs>1.25)
• Factor de capacidad similar al compuesto problema
• El compuesto que se utilice como estándar interno no debe estar presente en la
muestra original
• Que tenga alto grado de pureza
Adición de estándar
Este método se usa para análisis de trazas. Diferentes cantidades del analito que se desea
medir se adicionan a la solución problema, la cual contiene una concentración desconocida
de analito. A la cuantificación total se le resta el valor de la cantidad adicionada; de esta
manera se puede calcular la concentración desconocida.
30

Cromatografía de fase reversa
ALGUNOS ASPECTOS PARA EL DESARROLLO DE UN
ANÁLISIS DE CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA
En la siguiente sección se tratarán algunas consideraciones que hay que tomar en cuenta en
la aplicación de la cromatografía de fase reversa para la separación de biomoléculas como
es la selección de columna, la fase móvil, las condiciones de elución, preparación de las
muestras, manejo de las columnas, así como la resolución de problemas más comunes.
Naturaleza química de la fase estacionaria
Para la separación de proteínas grandes hay una preferencia a usar sílicas con ligandos nbutilo
y n­octilo sobre los alquilos n­octadecilo ya que las biomoléculas no son capaces de
intercalarse en las capas n­alquilo largas como lo hacen las moléculas pequeñas; además,
no se genera una adsorción tan fuerte de las proteínas en las cadenas alquilo pequeñas y por
consiguiente se requiere menor cantidad de solventes orgánicos para la elución, lo cual
disminuye el riesgo de desnaturalización de la proteína.
Tamaño y forma de partícula
La accesibilidad de la muestra a la matriz depende en gran medida del tamaño de poro. Los
empaques con tamaños de poro menores de 300 armstrongs se usan para la separación de
péptidos y oligonucleótidos. Generalmente se recomiendan tamaños de poro de 300
armstrongs o mayores para la separación de proteínas porque como se mencionó
anteriormente, los poros grandes generan mejor resolución para biomoléculas más largas.
El tamaño de la partícula también difiere entre una separación analítica y una preparativa.
Las separaciones analíticas se desarrollan en columnas con partículas de 3 a 5 micras, las
preparativas con partículas de 10 a 30 micras y las separaciones a gran escala utilizan
partículas de 40 a 50 micras. El inconveniente es que a mayor tamaño de partícula, la
columna se vuelve más frágil y por tanto se reduce su tiempo de vida.
31

Cromatografía de fase reversa
Respecto a la forma de las partículas, las columnas con empaque de partículas irregulares
son menos caras que las partículas esféricas y son más comúnmente empleadas en
aplicaciones de gran escala.
Tamaño de la columna
La resolución de biomoléculas de alto peso molecular en las separaciones de fase reversa,
es menos sensible al largo de la columna que la resolución de moléculas orgánicas
pequeñas, de tal manera que los ácidos nucleicos, proteínas y péptidos largos pueden ser
purificados eficientemente en columnas cortas. El incrementar el largo de las columnas en
general no incrementa la resolución significativamente y sí podría dañar a las proteínas
porque la pérdida de actividad biológica es proporcional al tiempo de residencia de la
proteína en la columna.
Por otra parte, las separaciones analíticas generalmente usan columnas de 100 a 250 mm de
largo x 4 mm de diámetro; y las separaciones preparativas requieren columnas con
diámetros más anchos, por ejempo, de 9 mm aproximadamente.
Velocidad de Flujo
La velocidad de flujo es un factor importante para la resolución de moléculas pequeñas, ya
que la tendencia de las moléculas a difundirse disminuye al incrementar el flujo,
produciendo picos más angostos y por lo tanto, mejora la resolución. Las proteínas tienen
menor difusibilidad que las moléculas pequeñas, por lo que se obtiene una buena eficiencia
aún con flujos bajos.
Generalmente las separaciones en columnas de 100 a 250 mm de largo x 4.6 mm de
diámetro se eluyen con un flujo de 1 ml/min y las separaciones preparativas que se
desarrollan en columnas de 250 mm x 9.4 mm de diámetro utilizan flujos de 4 ml/min.
Las variaciones en la velocidad de flujo son especialmente significativas en las
separaciones a gran escala, pero no es crítica en los experimentos analíticos.
Temperatura
La temperatura puede afectar profundamente a la cromatografía de fase reversa,
especialmente la utilizada para solutos de bajo peso molecular, péptidos pequeños y
32

Cromatografía de fase reversa
oligonucleótidos. Dado que el transporte de masas en solución entre la fase móvil y la fase
estacionaria es un proceso controlado por difusión, incrementar la temperatura disminuye la
viscosidad del solvente y esto generalmente favorece la transferencia de masas y por lo
tanto, mejora la resolución. En cambio, cuando las proteínas se desnaturalizan por un
incremento de la temperatura, la estructura de éstas se desdobla y tiene más sitios de
interacción con la fase estacionaria, por lo tanto se incrementa el tiempo de retención.
Solventes
Todos los solventes, soluciones amortiguadoras, sales, así como el agua usada para preparar
la fase móvil, deben ser de alta pureza química, libre de iones metálicos así como de
partículas suspendidas. La pureza química es importante en RPC preparativa puesto que
cualquier contaminante en la fase móvil puede producir picos indeseables, y contaminar la
biomolécula purificada.
Los solventes usados para preparar la fase móvil o la fase móvil ya preparada deben
desgasificarse en un baño de ultrasonido por 10 a 15 minutos para prevenir la formación de
gas que afectaría la estabilidad de la columna. También pueden desgasificarse utilizando
vacío y burbujeando helio.
Desnaturalización
Las interacciones de las proteínas con los solventes orgánicos, en general, conduce a cierta
pérdida de la estructura terciaria que puede generar varios estados conformacionales y cada
estado a su vez puede interactuar de manera diferente con la fase estacionaria. El
desdoblamiento puede exponer los residuos hidrofóbicos de la proteína con el consecuente
incremento de la retención, lo que puede generar insuficiente recuperación de la proteína.
Los complejos enzimáticos y proteínas de componentes múltiples son más lábiles a perder
actividad que los péptidos pequeños. Ahora bien, el proceso de desnaturalización presenta
una cinética lenta y puede reducirse este proceso disminuyendo el tiempo que la proteína
permanece en la columna. En caso de que ocurriera cierta desnaturalización, la
conformación podría regenerarse al reincorporar la proteína a sus condiciones nativas. En
caso de que una proteína o péptido fuera purificada con el fin de determinar su estructura
primaria, la desnaturalización no sería un problema.
33

Gradiente de elución
Cromatografía de fase reversa
La retención de las proteínas disminuye exponencialmente al adicionar a la fase móvil un
modificador orgánico. Este comportamiento de las proteínas obliga al uso de eluciones con
gradiente para la separación de mezclas proteicas.
Cuando se pretende separar por primera vez los componentes de una mezcla compleja, se
usa un gradiente “grueso” para una separación inicial, que servirá para ajustar la forma del
gradiente hasta llegar al punto óptimo. Esto usualmente implica la disminución de la
pendiente del gradiente en el lugar donde eluyen los componentes deseados y del aumento
de la pendiente antes y después de ese punto.
La elección de la pendiente del gradiente dependerá de que tan próximos eluyan los
componentes contaminantes de la molécula blanco. Por lo general, cuando disminuimos la
pendiente del gradiente incrementamos la resolución, pero también aumentamos los
tiempos de retención.
Los gradientes en RPC siempre provienen de una condición de alta polaridad (fase móvil A
altamente acuosa) a una de baja polaridad (fase móvil B con alto contenido de solvente
orgánico). Los gradientes o pendientes de gradiente se reportan usualmente como el
incremento en el porcentaje de la fase móvil B por unidad de tiempo (%B/min) o por
unidad de volumen (%B/ml).
Un gradiente típico va de 0 % B a 100 % B en 10 a 30 volúmenes de columna. Con un flujo
de 1 ml/min para una columna de 1 ml, corresponde un gradiente de 3 a 10 % B/min.
Acondicionamiento de columna
El acondicionamiento de columna debe realizarse siempre que se use una columna por
primera vez, después de un almacenamiento prolongado, y cada vez que se desee cambiar la
fase móvil para un análisis.
El acondicionamiento se lleva a cabo usando la misma fase móvil que la del análisis
cromatográfico. El procedimiento general para el acondicionamiento de las columnas es el
siguiente:
1. Lavar con 3 volúmenes de columna de fase móvil B para eliminar posibles
contaminantes del análisis anterior.
34

Cromatografía de fase reversa
2. Correr 2 a 3 volúmenes de columna de un gradiente lineal de 100 % fase B a 100 %
fase A. No debe cambiarse de manera abrupta la fase móvil porque existe el riesgo
de que la columna se dañe.
3. Equilibrar con fase A hasta que todas las señales de monitoreo sean estables.
Cada vez que se cambie la fase móvil, es importante correr un blanco para corroborar la
ausencia de impurezas y analizar la estabilidad del sistema.
Después de haber equilibrado la columna con la fase móvil A, el segundo paso es aplicar la
muestra a la columna. Enseguida se procede a eluir con la misma fase móvil A. La
molécula de interés deberá unirse a la matriz y los solutos indeseados serán arrastrados por
la fase móvil.
Preparación de las muestras
La muestra debe disolverse en la fase móvil que se empleará para hacer el análisis
cromatográfico. Si la muestra no es completamente soluble en la fase móvil, puede
adicionarse ácido fórmico, acético o alguna sal; este procedimiento mejora la solubilidad y
no afecta la separación, siempre y cuando estos agentes se encuentren en bajo porcentaje.
Todas las muestras deben centrifugarse a 10,000 rpm por 10 minutos antes de la inyección
o filtrarse a través de una membrana de 0.22 micras para eliminar partículas.
No se recomienda almacenar las fases móviles acuosas de pH neutro por más de 3 días
porque existe el riesgo de crecimiento microbiano y además la muestra podría oxidarse.
Limpieza de la columna
Se recomienda limpiar la columna periódicamente, especialmente cuando se detecte una
elevación en la presión o pérdida de resolución. Hay que considerar que la pérdida de
resolución debido al ensanchamiento de los picos puede deberse a la presencia de grupos
silanol en la superficie de la sílica o incluso a la disolución de la matriz debido al uso
frecuente de fases móviles con pH por arriba de 7.
Un procedimiento común de limpieza es:
35

Cromatografía de fase reversa
1. Lavar a bajo flujo con varios volúmenes de columna utilizando 0.1 % de TFA
(ácido trifluoroacético) en agua.
2. Correr un gradiente, aproximadamente 20 a 30 volúmenes de columna, desde 0.1 %
de TFA en agua hasta 0.1 % de TFA en isopropanol. El isopropanol es muy usado
para la limpieza de columnas debido a su alto poder de elución.
3. Equilibrar con 100 % de isopropanol conteniendo 0.1 % de TFA y luego llevar la
columna nuevamente a agua con 0.1 % de TFA empleando un gradiente.
4. Utilizar un gradiente para introducir la fase móvil A.
5. Equilibrar con varios volúmenes de columna de fase móvil A antes de iniciar el
análisis.
Para columnas de poliestireno, un procedimiento efectivo de limpieza es equilibrar con
varios volúmenes de columna empleando hidróxido de sodio 0.5 M. El hidróxido de sodio
es un agente de limpieza muy efectivo.
Almacenamiento de la columna
Las columnas de fase reversa hechas a base de sílica no deben almacenarse en soluciones
acuosas debido a la inestabilidad de la sílica en condiciones acuosas. Las columnas deben
almacenarse en solventes orgánicos como metanol libre de TFA.
Resolución de problemas
A continuación se presentan algunas soluciones para los problemas más comunes durante
el desarrollo de un análisis por cromatografía de fase reversa.
Síntoma Causa Solución
36

El flujo de la columna
se ha reducido.
No hay flujo por la
columna.
La presión se
incrementa durante una
o varias corridas.
•Presencia de material
particulado en la fase móvil.
•Precipitación de proteínas en la
columna.
•La bomba no funciona.
•Alguna pieza, adaptador o tubo
del sistema esta obstruído.
•Precipitación de la muestra en la
columna.
Cromatografía de fase reversa
•Filtre las muestras y la fase
móvil antes de usarlas.
•Reemplace el filtro de la fase
móvil, la precolumna, y/o la
columna.
•En ambos casos limpie y
regenere la columna.
•Revise que la bomba esté
funcionando adecuadamente.
•Verifique si la bomba o el
sistema presentan fugas o si hay
obstrucciones.
•Limpie y regenere la columna.
•Reemplace el filtro de la fase
móvil, la precolumna, y/o la
columna.
•Cambie el aditivo usado para
solubilizar la muestra.
•Filtre las muestras y la fase
móvil antes de usarlas.
Síntoma Causa Solución
La muestra no eluye en
el gradiente usado.
•La concentración del solvente B
en el gradiente es muy baja.
•El poder de elución del solvente
orgánico es muy bajo.
•Incremente la concentración del
solvente.
•Sustituya la columna por una
con ligandos menos hidrofóbicos.
•Cambie el solvente por otro de
mayores propiedades de elución.
37

Los componentes de la
muestra eluyen en la
fase de equilibrio.
La resolución es menor
a lo esperado.
Síntoma
La resolución es menor
a lo esperado.
•La muestra no es lo
suficientemente hidrofóbica para
adsorberse en la columna.
•La concentración inicial de
solvente es muy alta.
•La pendiente del gradiente es
muy alta.
•Baja selectividad
•El volumen de la celda de
detección es muy grande.
•La columna esta mal empacada.
•Proteínas o lípidos precipitados
en la columna.
•La concentración de la muestra
es demasiado alta.
Causa
•Hay grupos silanol libres en la
superficie de la fase estacionaria.
•La velocidad del flujo es muy
alta.
Cromatografía de fase reversa
•Incremente la concentración del
agente supresor de iones.
•Cambie la columna por una con
ligandos más hidrofóbicos.
•Sustituya el solvente orgánico
por otro con menores propiedades
de elución.
•Disminuya la concentración del
solvente.
•Use un gradiente más bajo.
•Adicione o ajuste la
concentración del agente supresor
de iones.
•Cambie la celda de flujo.
•Determine los platos teóricos de
la columna y de ser necesario,
cámbiela
•Limpie y regenere la columna.
Incremente la concentración de
solvente en la fase móvil inicial.
•Limpie y regenere la columna.
Disminuya el volumen de carga
de la muestra.
Solución
•Disminuya el pH para suprimir
la ionización de los grupos silanol
o cambie de columna.
•Disminuya el flujo de elución.
38

Ensanchamiento de
banda o asimetría.
No se puede reproducir
un perfil de elución
previo.
Buena recuperación de
la muestra pero poca
actividad biológica.
•La columna está mal empacada.
•La columna está sobre cargada.
•Hay difusión de la muestra.
•La columna no está equilibrada,
falta acondicionamiento.
•La fase móvil no se preparó
correctamente o el solvente se
evaporó.
•Alteración de la muestra durante
el almacenaje.
•Los componentes de la muestra
están desnaturali­zados o
inactivados en la fase móvil.
Cromatografía de fase reversa
•Determinar el número de platos
teóricos. De ser necesario
reemplace la columna.
•Limpie y regenere la columna.
Disminuya el volumen de carga
de la muestra. No debe haber más
de 1 mg de muestra por gramo de
fase estacionaria.
•Incremente la velocidad de flujo.
•Continúe el acondicionamiento
de columna hasta que la línea
basal sea estable,
aproximadamente 5 a 10
volúmenes de columna.
•Prepare nuevamente la fase
móvil.
•Prepare nuevamente la muestra.
•Disminuya el tiempo de corrida
a fin de limitar la exposición de la
muestra a los reactivos de la fase
móvil.
•Use una matriz con ligandos
menos hidrofóbicos para
disminuir la concentración de
solvente B en la fase móvil o
cambie el solvente de la fase
móvil.
Síntoma Causa Solución
39

La cantidad de muestra
en las fracciones
eluídas es mucho
menor a lo esperado.
•Precipitación de la muestra.
•La muestra se ha adsorbido
fuertemente a la columna por
retención iónica.
•La muestra se ha degradado por
proteasas o nucleasas.
Picos muy pequeños •La muestra absorbe poco a esa
longitud de onda.
Picos extraños en el
cromatograma.
Ruido en el
cromatograma
El tiempo de retención
para un mismo
componente de la
muestra aumenta con el
tiempo.
•Impurezas en la fase móvil.
• Elución incompleta de la
corrida anterior.
•Burbujas de aire atrapadas en la
columna o en la celda del
detector.
•Hay un comportamiento de
modo mixto debido a grupos
silanol en la superficie de la
sílica.
Cromatografía de fase reversa
•Cambie la composición de la
fase móvil a fin de mantener la
estabilidad.
•Disminuya el pH de la fase
móvil o adicione un agente
supresor de iones.
•Agregue inhibidores de
proteasas o nucleasas o minimice
el tiempo de separación.
•Monitoree la muestra a diferente
longitud de onda.
•Use reactivos de mejor calidad.
•Lave la columna.
•Elimine el gas de la fase móvil.
•Disminuya el pH para suprimir
la ionización de los grupos
silanol. O bien, cambie la
columna.
40

EQUIPO DE HPLC
Cromatografía de fase reversa
La técnica de fase reversa es el tipo de cromatografía más ampliamente utilizada en HPLC
que son las siglas del inglés High Performance Liquid Chromatography. La cromatografía
de líquidos de alta resolución utiliza presiones elevadas para hacer pasar un flujo de fase
móvil a través de una columna empacada con partículas micrométricas. Sin la aplicación de
presión sería prácticamente imposible que el eluyente pasara a través de la columna.
Dadas las características de una columna de cromatografía de fase reversa, se requerirá de
un equipo de HPLC para realizar la separación. Así que es relevante comentar de forma
general cómo está conformado este equipo.
Un equipo de HPLC básicamente debe contar con un sistema de bombeo que impulse el
flujo de la fase móvil a través de la columna, una columna que separe los componentes de
la muestra, un detector que mida alguna característica de dichos componentes conforme van
saliendo de la columna y un procesador que convierta la señal electrónica del detector en un
cromatograma.
La figura 11 muestra un esquema de un cromatógrafo de líquidos de alta resolución típico;
enseguida se explicará brevemente cada uno de los componentes.
Fuent e de helio
regulada
Al det ect or
Co lum na
Válvula d e s alid a
Bomba
Válvula d e e nt r ad a
Válvula d e iny e c c ió n
Am o r t ig uad o r d e puls ac io ne s
Transduct or de
presión
Válvula d e d r e naj e
Ent rada de j eringa
para cebar
Re g ulad o r d e
c o nt r a pr e s ió n
Filt r o
41

Cromatografía de fase reversa
Figura 11. Diagrama que muestra las partes más importantes que integran un cromatógrafo de líquidos de
alta resolución.
Sistemas para el tratamiento de los disolventes
Los recipientes que contienen los solventes a menudo se equipan con un sistema para
eliminar los gases disueltos, como oxígeno y nitrógeno, que interfieren formando burbujas
en los sistemas de detección.
Un desgasificador puede consistir en un sistema de bombeo por vacío, dispositivos para
calentar y agitar los disolventes o sistemas de difusión que permiten arrastrar los gases
disueltos fuera de la solución mediante finas burbujas de un gas inerte de baja solubilidad.
Para poder hacer eluciones por gradiente, los equipos de HPLC modernos cuentan con
recipientes conectados a una mezcladora, lo que permite variar la relación de los
disolventes en forma programada y modificar los valores de manera lineal o exponencial.
Sistemas de bombeo
Las bombas utilizadas en el HPLC son muy potentes y precisas. El flujo debe ser libre de
pulsaciones y con un caudal que pueda variar entre 0.1 y 10 ml/min, la presión puede ser
hasta de 6000psi (lbs/in 2 ) y todos los componentes deben ser resistentes a la corrosión.
Existen tres tipos de bombas: bombas recíprocas, bombas de jeringa y bombas de presión
constante o neumática.
La bombas recíprocas son las más usadas, el 90 % de los equipos de HPLC modernos
cuentan con este sistema de bombeo. El disolvente es expulsado de una cámara por el
movimiento de vaivén de un pistón accionado por un motor. Las bombas recíprocas tienen
la desventaja de que producen un flujo con pulsaciones que se manifiesta como ruido en la
línea base del cromatograma. Entre las ventajas de estas bombas se pueden citar su pequeño
volumen interno (35 a 400 μ l), sus altas presiones de salida (por encima de las 10,000 psi),
su fácil adaptación a la elución con gradiente y sus caudales constantes que son
prácticamente independientes de la contrapresión de la columna y de la viscosidad del
disolvente. Como una parte más del sistema de bombeo esta el restrictor colocado a la
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Cromatografía de fase reversa
salida de la bomba. Cualquier diferencia entre la señal y un valor preestablecido, se utiliza
para aumentar o disminuir la velocidad del motor de la bomba.
Sistemas de inyección de la muestra
A menudo, el factor limitante en la precisión de las medidas en cromatografía de líquidos
por HPLC, es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la columna. El
problema se agrava por el ensanchamiento de banda que acompaña a la sobre carga de las
columnas. Por ello, los volúmenes que se emplean han de ser muy pequeños, de 20 μl
hasta 500 μl.
Además, se ha de poder introducir la muestra sin despresurizar el sistema.
El método más ampliamente utilizado para la introducción de la muestra utiliza dispositivos
en forma de bucle, que pueden introducir la muestra a presiones de hasta 7000psi con una
precisión aceptable.
Columnas
Como se explicó en la primera parte de este trabajo, la separación de los componentes de la
muestra se produce en la columna.
La mayoría de las columnas para HPLC se construyen con tubos de acero inoxidable de
diámetro interno uniforme. Esta clase de tubos miden entre 10 y 30 cm. El diámetro interno
de las columnas es a menudo de 4 a 10 mm y los tamaños de las partículas de los rellenos
más comunes son 3, 5 y 10 μm.
Para aumentar la vida de la columna analítica se coloca delante una pre­columna que
elimina la materia en suspensión y los contaminantes de los disolventes. La composición
del relleno de la pre­columna debe ser semejante al de la columna analítica; sin embargo,
el tamaño de la partícula es por lo común mayor para minimizar la caída de presión.
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Tipos de relleno de la columna
Cromatografía de fase reversa
El relleno puede ser de dos tipos de partículas porosas o pediculares. El último consiste en
bolas de vidrio o de polímero, no porosas y esféricas con unos diámetros característicos de
30 a 40 μ m. En la superficie de estas bolas se deposita una capa delgada de sílice.
El
relleno pedicular se utiliza ampliamente en pre­columnas y no para columnas analíticas.
Los rellenos de partículas porosas para HPLC están formados por micro partículas porosas
con diámetros entre 3 y 10 μm
y con la menor dispersión posible para un tamaño
determinado. La sílice es el material más comúnmente empleado para este tipo de
columnas, debido a que se pueden producir partículas con diámetros muy uniformes.
Termostatos
En muchas aplicaciones no se necesita un control estricto de la temperatura y las columnas
trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, si se controla la temperatura de las
columnas se obtienen mejores cromatogramas. La mayoría de los aparatos lleva hornos que
controlan la temperatura en las columnas. Otra forma de controlar con precisión la
temperatura es colocando las columnas en camisas con agua que provenga de un baño de
temperatura constante.
Detectores
Los detectores en cromatografía de líquidos como HPLC son de dos tipos básicos. Los
detectores basados en una propiedad de la fase móvil que responden a cambios en el índice
de refracción, la constante dieléctrica o la densidad, las cuales se modifican por la presencia
de los analitos. Por contraste, los detectores basados en una propiedad del soluto responden
a alguna de las propiedades de la muestra como es la absorción en UV, fluorescencia,
actividad óptica, etc. Algunos de estos detectores se describen a continuación.
Detectores de absorbancia
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Cromatografía de fase reversa
Son los detectores más empleados ya que tanto las proteínas como los ácidos nucleicos
absorben luz de esta región. Las longitudes de onda típicamente monitoreadas son:
• 210­220 nm: corresponde a la absorción de la unión peptídica. Se usa
principalmente para monitorear péptidos que carecen de aminoácidos aromáticos.
• 228 nm para His
• 240 nm para Cys
• 254 nm para Phe
• 250–260 nm para medir oligonucleótidos
• 280 nm para Trp y Tyr
Los detectores de absorbancia ultravioleta más simples son los fotómetros de filtros con
una lámpara de mercurio como fuente. La desventaja que presentan estos aparatos es que el
efluente no se puede monitorear a varias longitudes de onda al mismo tiempo.
A fin de reducir el ensanchamiento de banda, el volumen de una cubeta de flujo (en forma
de Z) para medir absorbancia ha de ser lo menor posible. Las longitudes de la cubeta van
de 2 a 10 mm (Figura 12) de modo que los volúmenes se limitan por lo común de 1 a 10
μ l. Además la presión no debe ser mayor de unos 600 psi. pues existe el riesgo de romper la
cubeta del detector.
Fuent e UV
Detectores de arreglos de diodos
De la columna
Vent anas de
cuarzo
Al desecho
Det ect or
Figura 12. Esquema de la cubeta de un detector de absorbancia.
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Cromatografía de fase reversa
Este tipo de instrumentos permiten hacer barridos a distintas longitudes de onda de cada
uno de los componentes separados. De esta manera, se generan una colección de
cromatogramas a diferentes longitudes de onda de cada pico.
Mediante los arreglos de diodos se puede determinar la mejor longitud de onda a la que
debe monitorearse el compuesto de interés.
Detectores de fluorescencia
Los detectores de fluorescencia para HPLC son semejantes en diseño a los fluorímetros y
espectrofluorímetros. La fluorescencia se detecta por medio de un detector fotoeléctrico
colocado perpendicularmente respecto al haz de excitación. Una ventaja de los detectores
de florescencia es su alta sensibilidad, unas tres órdenes de magnitud mayor a la obtenida
por métodos de absorbancia.
Detectores de infrarrojo
Una de las mayores limitaciones del uso de detectores de infrarrojo se debe a la
interferencia generada por los disolventes que se utilizan. Por ejemplo, las bandas anchas de
absorción infrarroja del agua y de los alcoholes impiden prácticamente el uso de este
detector para muchas aplicaciones.
Detectores de índice de refracción
Son considerados detectores universales, pues el índice de refracción es una propiedad
física de todos los compuestos. Miden las variaciones en el índice de refracción de la fase
móvil cuando hay diferentes solutos presentes.
Estos detectores tienen la desventaja de no ser tan sensibles como la mayoría de los otros
detectores, por ejemplo, son dos a tres veces menos sensible que un detector de
absorbancia. Además son muy inestables a los cambios de temperatura por lo que se
requiere un estricto control de ésta.
Detector de dispersión de luz (ELSD)
El efluente de la columna se pasa a un nebulizador donde se convierte en una nube
mediante un flujo de nitrógeno o aire. Las gotitas viajan a través de un tubo de conducción
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Cromatografía de fase reversa
a temperatura controlada donde tiene lugar la evaporación de la fase móvil, lo que origina
unas finas partículas del compuesto problema. La nube de partículas de analito pasa a través
de un haz de láser y mediante un fotodiodo de silicio se detecta la radiación dispersada
perpendicularmente al flujo.
Una de las mayores ventajas de este tipo de detector es que puede emplearse para casi
todos los solutos no volátiles y es más sensible que el detector de índice de refracción.
Detectores de espectrometría de masas
La espectrometría de masas es el método de detección más reciente y cada vez se generaliza
más su uso.
La muestra al salir de la columna es ionizada. Luego los iones se separan de acuerdo a su
relación carga/masa.
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PROVEEDORES
Cromatografía de fase reversa
A continuación se presentan los nombres y direcciones electrónicas de los proveedores más
importantes de columnas y equipos cromatográficos.
Compañía Página de internet
ABI http://www.appliedbiosystems.com/
Alltech http://www.alltechweb.com/
Beckman http://www.beckman.com/
Bio­Rad http://www.biorad.com/
Merck http://chrombook.merck.de/chrombook/index.jsp?j=1
J & W Scientific http://www.chem.agilent.com/cag/cabu/jandw.htm
J.T. Baker http://www.jtbaker.com/chromatography/
Perkin­Elmer http://las.perkinelmer.com/
VWR http://www.chromatography.co.uk/products/Default.htm
Waters http://www.waters.com/
Whatman http://www.whatman.com/
Otras páginas de internet de interés
http://www.rpi.edu/dept/chem­eng/Biotech­Environ/IONEX/be_index.htm
http://www.separationsnow.com/basehtml/SepH/1,1353,3­0­0­0­0­home­0­0,00.html
http://ntri.tamuk.edu/fplc/rev.html
http://www.ionsource.com/tutorial/chromatography/rphplc.htm
http://www.nestgrp.com/protocols/vydac/rpcbuffernote.shtml
http://www.biocompare.com/jump/2105/Reverse­Phase­Chromatography.html
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COMENTARIOS
Cromatografía de fase reversa
Sin duda, la cromatografía de fase reversa se ha convertido en una herramienta
indispensable en la investigación biotecnológica. Esta técnica de separación debe su
crecimiento a su rapidez, simplicidad, relativo bajo costo y versatilidad. Justamente la
adaptabilidad de la cromatografía de fase reversa permitió el surgimiento de la
cromatografía por supresión iónica y la secuencial que se revisaron en el presente trabajo.
También se procuró dar una visión de las aplicaciones de la cromatografía en fase reversa
en el área de la biotecnología y algunos aspectos a considerar al momento de desarrollar
una separación de fase reversa.
Con seguridad se seguirán implementando modificaciones de la técnica que permitan
expandir aún más su uso. Ahora la tendencia es el empleo de columnas capilares que
mejoren la resolución de los análisis así como el acoplamiento a detectores más sensibles
que generen mayor información del compuesto en estudio como los arreglos de diodos y
los espectrómetros de masas.
BIBLIOGRAFÍA
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Wiley and Sons, Canada, 1973.
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Chromatographic Science Series, Marcel Dekker Inc., USA, 1990.
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USA, 1991.
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phase partition chromatography, Biochem J, 1950, 46:532­538.
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UK, 1992.
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Biotech, Sweden, 1997.
7. Skoog D. A. and Leary J. J., Análisis instrumental, 4a ed., McGraw­Hill, México,
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8. Snyder L. R., Kirkland J. J. and Glajch J. L., Practical HPLC method development, 2 nd
ed., John Wiley and Sons, USA, 1997.
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