microstick

Apartado de Correos / P.O. Box 44
28210‐Valdemorillo (Madrid, Spain)
(34) 91 897 46 16 Fax: (34) 91 897 46 41
E‐mail: microkit@microkit.es
Web: www.microkit.es
http://www.laboratoriosmicrokit.blogspot.com
MICROSTICK‐SALMONELLA
Test rápido de Immunocromatografía para la detección
Uso exclusivo en laboratorio cualitativa de Salmonella spp. en muestras de alimentos.
Ref. KMTC85
LAS 10 VENTAJAS DE UN KIT SOBRESALIENTE:
1‐Rapidez de resultados: ¡5‐10 minutos tras el
enriquecimiento ISO 6578! (no horas como los
kits ELISA, ni 4‐6 días como en el método
tradicional de cultivo en placa). Ahorro en la
obtención de resultados, conseguidos en sólo
36 horas (incluidos los enriquecimientos).
Ahorro mínimo de 2 días de trabajo. No hace
falta ir a leer resultados en días festivos.
COLICULT-MCC
CRIOTECA®
PLAQUIS®
M-IDENT®
ER‐0632/1999
ISO 9001
COSMETIKIT®
CHROMOSALM
KITPRO-5S
SEILAGUA®
COMPACT-DRY-PLATES®
DESINFECTEST®
NUTRILINIA
MUGPLUS CROMOKIT®
2‐Robustez: se ahorran los puntos críticos de otros métodos como los látex o los ELISAs; el
inmunocromatograma es el método inmunológico más duro en toda circunstancia, que puede incluso
almacenarse fuera del refrigerador y transportarse a temperatura ambiente sin verse alterado.
3‐Sensibilidad extraordinaria: 99,9%, lo que limita la proporción de resultados falsamente negativos a
algo testimonial, convirtiendo el método en un correcto screening de barrido de muestras negativas
4‐Especificidad excelente: >90%, lo que limita adecuadamente la proporción de resultados falsamente
positivos y permite ahorrar las posteriores confirmaciones de los presuntos positivos a menos del 10%
de casos en los que no había Salmonella y el test dió presunto positivo
5‐Seguridad para el operario: las muestras pueden hervirse una vez concentradas y justo antes de
realizar el test, ya que éste detecta los antígenos de Salmonella, no las células, por lo que no es
necesario que éstas sigan vivas tras el enriquecimiento selectivo
6‐Comodidad de uso: es como un test de embarazo, no necesita aparato alguno para su interpretación,
que es simplemente visual. Reducir manipulaciones es reducir puntos críticos. El kit es compacto, al
incluir los dos caldos de enriquecimiento ISO 6579 optimizados y los Sticks confirmativos.
7‐Flexibilidad: test unitarios, no hay necesidad de agrupar muestras, se pueden analizar de 1 a 20 ó más
8‐Estabilidad: se mantiene, incluso sin necesidad de refrigeración (4‐30ºC), durante muchos meses
9‐Ahorro económico: Dada la rapidez de resultados, el alimento puede ser liberado al mercado varios
días antes que como lo haría con el método clásico, lo que supone inmensos ahorros económicos para la
empresa, que deben redundar en un aumento del presupuesto para el laboratorio artífice de esta
heroicidad. Por ello, aunque el kit parece más costoso que el método clásico, NO LO ES en absoluto.
10‐Validado: estudio realizado en todo tipo de muestras alimentarias por los mayores especialistas en
España en validación de métodos microbiológicos: carne de ternera, leche pasteurizada, pescado,
vegetales, ovoproductos, especias y aperitivos, harina de cereales, pollo, alimentos infantiles, alimentos
dietéticos, salsas, paella, postres, pastelería, helados, embutidos loncheados, queso, mariscos, comida
animal, espaguettis. Límite de detección demostrado desde 10‐16 ufc Salmonella /25 g de alimento con
un nivel de acompañantes e interferentes muy diversos 10 2 ‐10 3 veces superior que las dianas!
1

I. INTRODUCION Y USO
Los síntomas clínicos causados por infección de Salmonella typhimurium, en seres humanos, se dividen en la
fiebre tifoidea, causada por S. typhimurium serotipos typhi y paratyphi y una variedad de síntomas clínicos,
incluyendo las enfermedades diarreicas, causadas por las Salmonellas no tifoideas (NTS), de las cuales hay unos
2.500 serotipos, como la S. enteritidis. La fiebre tifoidea es restringida a humanos y está altamente adaptada
como enfermedad invasiva sistémica de adultos y niños, mostrando una leve asociación con la inmunosupresión.
En contraste, las cepas NTS tienen una amplia gama de huéspedes vertebrados y una epidemiología que a
menudo incluye alimentos animales, al menos en los países industrializados donde normalmente se manifiesta en
forma de gastroenteritis. Las cepas NTS pueden producir una grave enfermedad invasiva si va asociada a estados
inmunodeprimidos. También es común en niños africanos que presentan afecciones, desnutrición y anemia.
MICROSTICK‐SALMONELLA es un kit de tres componentes diseñado para proporcionar una rápida detección de
Salmonella spp. en muestras de alimentos. MICROSTICK‐SALMONELLA combina un doble enriquecimiento
optimizado de la muestra, con un inmunoensayo cromatográfico para la detección cualitativa de Salmonella spp.
en muestras de alimentos contaminados, para así evitar el consumo y por tanto, la salmonelosis.
II. FUNDAMENTO DEL TEST
Los caldos de pre‐enriquecimiento revitalizador y post‐enriquecimiento selectivo, basados en los de la Norma ISO
6579 pero optimizados para el Stick, mejoran extraordinariamente el rendimiento de dicha norma. El
MICROSTICK‐Salmonella es un inmunoensayo cualitativo para la detección de Salmonella en muestras de
alimentos. La membrana está pre‐revestida con anticuerpos, en la región de banda del test, para reconocer el
antígeno de Salmonella spp. Durante la prueba, la muestra puede reaccionar con las partículas rojas de látex que
están recubiertas con anticuerpos anti‐salmonella pre‐desecados. La mezcla resultante, empuja hacia arriba la
membrana por acción capilar. Como la muestra fluye a través de la membrana, el aglutinado de partículas rojas
migra. En el caso de un resultado positivo, los anticuerpos específicos presentes en la membrana capturarán el
aglutinado de partículas rojas, formando una banda roja. La mezcla sigue avanzando a través de la membrana con
el anticuerpo inmovilizado que está en la región de banda de
control. En la línea de control siempre aparece una banda de color
verde, lo cual verifica que se ha añadido el volumen suficiente y
que se obtuvo un flujo adecuado del caldo de post‐
enriquecimiento inoculado, además de servir como control interno
de los reactivos.
III. REACTIVOS Y MATERIALES
Cada kit contiene:
1. 20 tubotes (ref: DPA001) con polvo estéril del caldo de revitalización APT‐MICROKIT para 25 g de alimento
(pre‐enriquecimiento)
2. 20 tubos (ref: TPL401) con 10 ml del caldo de enriquecimiento selectivo SS‐MICROKIT, de color rojo
(post‐enriquecimiento)
3. 20 tarjetas inmunocromatográficas para Salmonella Ag (Sticks)
4. Instrucciones de uso
Materiales necesarios (no suministrados):
Contenedor de recogida de muestras, guantes desechables, contenedor de desechos, pipetas de plástico,
temporizador, Stomacher y bolsas Stomacher, incubadoras + 37 º y + 41.5ºC (se puede mantener con sólo la
estufa de 35‐37° C y agua purificada estéril.
IV. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
Los tubotes de polvo deben mantenerse lejos de la humedad atmosférica, entre 15 y 25ºC, y emplear antes de la
fecha de caducidad impresa en sus etiquetas.
Los tubos de líquido deben mantenerse entre 8 y 25° C al abrigo de la luz y se deben usar antes de la fecha de
caducidad impresa en sus etiquetas.
Las tarjetas inmunocromatográficas se deben almacenar tal y como están empaquetados en sus bolsas selladas, a
una temperatura comprendida entre 4 y 30 ºC (36‐86ºF), al abrigo de la luz y de la humedad. No congelar! Las
tarjetas inmunocromatográficas son estables hasta la fecha de caducidad impresa en su bolsa sellada y deben
permanecer en ésta hasta su uso.
2

V. TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS DE ALIMENTOS
Las muestras de alimentos deben ser recogidas en recipientes limpios y el ensayo debe realizarse
inmediatamente después de la recogida, aunque las muestras pueden almacenarse en el frigorífico (2‐4 º C)
durante 1‐2 días previos a la prueba. Para un almacenamiento mas prolongado, la muestra debe mantenerse en
el congelador a ‐20ºC. En ese caso, la muestra será totalmente descongelada y puesta a temperatura ambiente
antes del ensayo. Descongelar sólo la cantidad necesaria ya que los ciclos de congelación‐descongelación no son
recomendables. Homogeneizar la muestra lo mejor posible antes de la preparación.
Para conseguir el nivel necesario de 1 célula de Salmonella en 25g de alimento, es fundamental realizar un
enriquecimiento adecuado en dos fases:
a) Pre‐enriquecimiento, enriquecimiento primario o fase revitalizante de las células de Salmonella
dañadas sub‐letalmente durante la fabricación el alimento y neutralización de los conservantes del
alimento, sean naturales, sean añadidos
b) Post‐enriquecimiento, enriquecimiento secundario o fase de enriquecimiento selectivo que
multiplicará más que las acompañantes, las células de Salmonella hasta 10 6 ‐10 9 , un nivel más que
adecuado para ser detectadas por las tarjetas inmunocromatográficas del MICROSTICK‐
SALMONELLA, que detectan desde 10 4 uf/ml
Aún así, diversos kits en el mercado aseguran que la fase de post‐enriquecimiento no es necesaria, sobre todo si
el nivel de flora interferente (aerobios totales) es baja, menor a 10 4 ufc/ml final; esa es una afirmación muy
aventurada, ya que si se comete el frecuente error de validar el kit con una muestra que tenga ya de entrada 10 3 ‐
10 4 células viables de Salmonella/25 g y escasa flora interferente, lógicamente la fase de enriquecimiento
multiplicador es redundante; pero nadie puede asegurar la detección de Salmonella por debajo del límite de
detección de la técnica, que en inmunocromatografía ronda las 10 6 células de Salmonella por test (y las 10 4
células de Salmonella por test en el mejor de los casos, como es el MICROSTICK‐Salmonella para S.enteritidis y
S.typhimurium). Por ello el laboratorio debe elegir un kit de su total confianza, validado por entidades que
muestren claramente todos los datos de la validación y no un simple certificado por mucho renombre
internacional que tenga la entidad certificadora.
VI. ENRIQUECIMIENTO DEL ALIMENTO ANTE LA POSIBLE PRESENCIA DE SALMONELLA
1‐Mezclar 25 g de muestra sólida o 25 ml de muestra líquida con 225 ml de agua estéril a la que añadiremos el
polvo contenido en un tubote de caldo de revitalización APT‐MICROKIT (una mejora del agua de peptona
tamponada BPW, especialmente obligada para este kit). Si es preciso, golpear el tubote con polvo de pre‐
enriquecimiento, en posición horizontal, antes de abrirlo, para descompactar el polvo del fondo; después
cerciórese de que se ha vaciado completamente sobre el agua y la muestra. Homogeneizar durante
aproximadamente 2 minutos, a ser posible en el Stomacher. Incubar durante 18‐24 h a 35‐37 ° C.
2‐ Añadir 1 ml de cultivo de pre‐enriquecimiento a un tubo de 10 ml de caldo de enriquecimiento selectivo SS‐
MICROKIT, e incubar este tubo durante otras 18‐24 h a 35‐37 ° C (no resulta necesario hacerlo a 41,5 ° C). Si el
tubo ha virado a negro es altamente presuntivo de presencia de Salmonella, pero no hay que descartar los tubos
que hayan quedado rosas‐rojos y a ellos también hay que hacerles el Stick.
Ya en el segundo día se obtendrán los resultados de Salmonella, ya que de aquí el paso siguiente y definitivo se
tardan escasamente 5‐15 minutos.
VII. PROCEDIMIENTO PARA EL TEST INMUNOCROMATOGRÁFICO EN MUESTRAS DE ALIMENTOS
Mantener previo al ensayo, todo el material: test, muestras y envases, a temperatura ambiente (15‐30ºC/59‐86ºF ).
No abrir las bolsas hasta el momento de realizar el ensayo.
0. Si se desea por cuestiones de seguridad para el analista, colocar el tubo en un baño de agua hirviendo
durante 15 minutos. Retirar y dejar atemperar.
1. Abra la bolsa del Stick por la muesca, retire la tarjeta, descarte la bolsita desecante y use la tarjeta lo antes
posible.
2. Con una pipeta diferente para cada muestra, dispensar 3‐5 gotas ó 100 µL de la muestra de post‐
enriquecimiento en el pocillo (S), hasta que éste se llene completamente, evitando añadir partículas sólidas de la
muestra (no pipetear del fondo del tubo). Llenar el pocillo generosamente de caldo de post‐enriquecimiento,
con un volumen suficiente como para crear un menisco que casi desborde el pocillo. Iniciar el temporizador.
3. Leer el resultado en 5‐15 minutos (aparecen las bandas de colores, normalmente la de control mucho antes
que la del test). Generalmente no hace falta esperar 15 minutos a la lectura del Stick y en los primeros 2‐5
minutos ya se ven los positivos, pero en caso negativo hay que esperar 15 minutos por si acaso se trata de un
positivo lento.
3

VIII. INTERPRETACION DE RESULTADOS
NEGATIVO: Sólo aparece una banda verde en la ventana central del punto
marcado con la letra C (línea de control).
POSITIVO: Además de la banda verde de control a través de la ventana
central del sitio marcado con la letra C (línea de control), aparece una banda
roja (línea de test) en el sitio marcado con la letra T (zona de resultados).
Toda banda roja, por tenue que sea o truncada que esté, debe considerarse
muestra positiva.
NO VALIDO: Una ausencia total de bandas coloreadas. Insuficiente volumen
de muestras, procedimientos incorrectos de utilización o reactivos
deteriorados son probablemente las razones del fracaso del test. Revisar el
procedimiento y repetir el test usando un nuevo Stick con otra muestra
similar del caldo SS, sin partículas de alimento.
IX. CONTROL DE CALIDAD INTERNO
Los controles internos están incluidos en el test. La línea de color verde que aparece en la región de control (C) es un
control interno. Confirma suficiente volumen de muestra y correcta técnica de uso del test. Si desea un control
positivo de Salmonella emplee preferentemente cepas de referencia como S. enteritidis (por ejemplo NCTC 6676) o
S. typhimurium (por ejemplo NCTC 74).
X. PRECAUCIONES ESPECIALES Y LIMITACIONES DEL KIT
POSITIVO:
BANDA
ROJA DEL
TEST Y
VERDE
DEL
CONTROL
NEGATIVO:
SÓLO
BANDA
VERDE DEL
CONTROL
‐Solo para profesionales de laboratorio.
‐No utilizar ningún reactivo después de su fecha de caducidad.
‐Seguir las buenas prácticas de laboratorio: ropa protectora, guantes desechables y no comer, beber o fumar en
la zona...
‐Todas las muestras deben considerarse potencialmente infecciosas y ser manejadas igual que un agente
infeccioso.
‐Los tubotes y tubos de caldos deben permanecer cerrados hasta el momento de su uso, guardados en lugar
fresco, seco y oscuro.
‐Siga al pie de la letra las instrucciones de enriquecimiento, ya que otras combinaciones y otros medios han
demostrado no ser válidos, al disminuir drásticamente la efectividad del kit. Por ejemplo el caldo Rappaport no es
bien absorbido por la membrana del kit, mientras el SS sí lo es y a pesar de estar algunos de sus tubos negros, no
suelen dejar residuo suficiente como para ocultar el resultado. De modo que el SS detecta un 80% más que el
Rappaport con este kit.
‐La turbidez o el viraje de color en los tubos no es indicadora de presunta presencia de Salmonella y debe
realizarse el Stick.
‐El medio de post‐enriquecimiento contiene Sales biliares, por lo que debe trabajarse con precaución (guantes,
máscaras) y evitar tocar el líquido.
‐No se puede prescindir del post‐enriquecimiento; aunque en algunas muestras una incubación del pre‐
enriquecimiento prolongada otras 18 h permite obtener positivos reales con el Stick, la mayoría de muestras
tomadas directamente de la solución madre son demasiado espesas o grasas y no migran adecuadamente en la
membrana del inmunocromatograma.
‐La adición de 0,1 ml de pre‐enriquecimiento (en lugar de 1 ml) a 10 ml del tubo de post‐enriquecimiento que
defienden algunos autores, no da tan buenos resultados cuando hay presentes pocas ufc de Salmonella y muchas
ufc de interferentes y acompañantes, por lo que resulta mejor añadir 1 ml; sin embargo, se pueden añadir 0,1 ml si
la muestra enriquecida es demasiado espesa o coloreada y esto impide su correcta difusión en el stick, ya que el
límite de detección sigue siendo el adecuado.
‐No es necesario hervir la muestra enriquecida inmediatamente antes de realizar el test, sólo si los protocolos
internos de seguridad del laboratorio así se lo exigen; ya que la banda test se ve mejor sin hervir.
‐El test debe realizarse dentro de las 2 horas siguientes a la apertura de la bolsa de la tarjeta
inmunocromatográfica.
‐Las tarjetas inmunocromatográficas deben permanecer en sus bolsas selladas hasta el momento de su uso.
‐No utilizar las tarjetas inmunocromatográficas cuyas bolsas estén dañadas.
‐Una vez utilizado el kit, aunque se deje secar, no funcionará correctamente con una segunda muestra aunque
incluyamos altas concentraciones de Salmonella: Los Sticks NO son reutilizables en ningún caso.
4

‐Un exceso de muestra de alimento en el pocillo del Stick podría provocar resultados erróneos (aparecen bandas
marrones). Las bandas negras que se dan circunstancialmente (menos del 2% de tubos SS negros) en el test no se
consideran positivas, pero tampoco negativas, ya que son acúmulo del precipitado negro del medio SS que no deja
ver si hay o no banda roja. En tal caso, dejar reposar el tubo y extraer muestra limpia de la zona superior y media
del tubo, para repetir el test en otro Stick.
‐Algunas muestras de ciertos alimentos pueden disminuir la intensidad de la línea de control verde. Otras
muestras (alimentos muy grasos…) pueden migrar con más dificultad por la membrana e incluso no llegar a formar
la línea verde (test invalidado).
‐Puede solicitar para estos ultimos casos, una caja de 5 sticks sin tubotes ni tubos, pida la ref: KMTC85‐TT
‐Ciclos de congelación y descongelación en la muestra no son recomendables ya que pueden causar resultados
erróneos.
‐Las tarjetas inmunocromatográficas y los tubos empleados deben eliminarse en un recipiente adecuado
biohazard después de los ensayos.
‐Esta prueba proporciona un diagnóstico presuntivo de ausencia/presencia de Salmonella spp. en muestras de
alimentos, pero un resultado negativo podría eventualmente indicar que la concentración de Salmonella spp. en la
muestra es demasiado pequeña o que las células están demasiado sub‐letales y no han conseguido replicarse lo
suficiente como para ser detectadas. La determinación de Salmonella spp. debe llevarse a cabo sobre la muestra
adecuadamente enriquecida con el protocolo que se explica en este folleto.
‐Todo positivo debe confirmarse con Agar Cromosalm (Ref: DMT500) y si en él crecen colonias verdes,
identificarlas bioquímica (ref: KBH260), inmunológica (refs: AC01, ZC02, PL6100) y/o molecularmente (ref: SFI004+),
a fin de evitar reportar falsos positivos.
XI. RENDIMIENTO
A. Límite de detección
El límite de detección del Stick inmunocromatograma para los diferentes serotipos es:
S. enteritidis 1x10 4 bacteria/mL,
S. typhimurium 1x10 4 bacteria/mL y
S. typhi: 1x10 7 bacteria/ml.
de caldo post‐enriquecido, que equivale, según la validación con el protocolo aquí explicado, a menos de 10 ufc de
Salmonella/25 g de alimento (por cuestiones de incertidumbre microbiológica, nadie puede apostar en un método
que el límite de detección sea 1 ufc).
B. Sensibilidad y Especificidad
Se realizó una evaluación con diversas cepas mediante MICROSTICK‐SALMONELLA aplicando el método de
referencia ISO 6578:2002 de Salmonella. MICROSTICK‐SALMONELLA mostró > 99% de sensibilidad y > 97% de
especificidad. Los anticuerpos utilizados para elaborar este test reconocen epitopos de Salmonella encontrados en
cultivos de bacterias in vitro. Estos valores preliminares deben tomarse con precaución hasta que más datos de
evaluación estén disponibles en matrices alimentarias (ver más abajo) y con cepas salvajes.
C. Reactividad cruzada e Interferencias
Se realizó una evaluación para determinar la reactividad cruzada de MICROSTICK‐SALMONELLA. No hay reactividad
cruzada con patógenos intestinales comunes, otros organismos ni otras sustancias presentes ocasionalmente en los
alimentos como Listeria monocytogenes, Campylobacter, H. pylori, Escherichia coli O157: H7.
D.Validación con muestras naturales de alimentos
Se analizaron 20 muestras positivas y 20 muestras negativas para Salmonella spp. de diferentes alimentos, con
toda clase de microorganismos acompañantes
Gram + (Enterococcus faecalis, Micrococcus
luteus, Staphylococcus epidermidis, Listeria
monocytogenes, Listeria grayii, Listeria ivanovii,
Listeria welshimeri, Listeria inocua) e
interferentes Gram ‐ (Proteus mirabilis,
Citrobacter freundii, E.coli) en mezclas muy
diversas y a muy superior concentración (>10 2 ‐10 3
ufc/25 g) que los microorganismos diana
(Salmonella nottingham), que estaban a un nivel
ínfimo de presencia (10‐16 ufc/25 g). Los
alimentos implicados en la validación fueron
hamburguesa cruda de ternera, leche
pasteurizada, pescado crudo, ensaladas vegetales,
huevo crudo, patatas con ajo, cebolla y pimienta,
harina de trigo, pollo crudo, papilla infantil de
frutas, barritas dietéticas con chocolate, salsa rosa, paella‐arroz a banda, pasteles variados, crema catalana, helado
de vainilla, chorizo loncheado, queso curado, mariscos, galletas de perro, espaguettis. Los resultados fueron, para
5

tan ajustado inóculo de Salmonella y tan elevada carga interferente, de una sensibilidad del 100% (ningún falso
negativo) y de una especificidad del 90% (los únicos falsos positivos detectados fueron en pollo crudo y en pescado
crudo).
De este modo queda validado MICROSTICK‐SALMONELLA en alimentos por su inmejorable sensibilidad (100%,
no hay falsos negativos para Salmonella), por su correcta especificidad (90%, solo un 10% de falsos positivos) y
por su inmejorable límite de detección (demostrado para 10 ufc/25 g, lo cual no significa que no pueda llegar a
1 ufc/25g, el problema es que es estadísticamente imposible de evaluar a causa de la incertidumbre
microbiológica).
XIII. REFERENCIAS‐
‐GORDON, M, et al, “Invasive salmonellosis in Malawi”. J Infect Developing Countries
2008; 2(6):438‐442.
‐ SANCHEZ‐JIMENEZ, M. et al. “Validation of a PCR for diagnosis of typhoid fever and salmonellosis by
amplification of the hilA gene in clinical simples from Colombian patients”, Journal of Medical Microbiology
(2004), 53, 875–878.
‐ ISO 6579:2003 ALIMENTOS, método horizontal para aislamiento de Salmonella.
El usuario final es el único responsable de la eliminación de los microorganismos crecidos, de acuerdo con la legislación
medioambiental vigente. Autoclavar antes de desechar en la basura.
Protocolo y componentes del kit MICROSTICK‐Salmonella diseñados y fabricados por/para MICROKIT desde el 22 de Diciembre de 2011.
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Apartado de Correos / P.O. Box 44
28210‐Valdemorillo (Madrid, Spain)
(34) 91 897 46 16 Fax: (34) 91 897 46 41
E‐mail: microkit@microkit.es
Web: www.microkit.es
http://www.laboratoriosmicrokit.blogspot.com
Uso exclusivo en laboratorio
LAS 10 VENTAJAS DE UN KIT SOBRESALIENTE:
1‐Rapidez de resultados: ¡5‐10 minutos
tras el enriquecimiento! (no horas como
los kits ELISA, ni 3‐4 días como en el
método tradicional de cultivo en placa).
Ahorro en la obtención de resultados,
conseguidos en sólo 36 horas (incluidos
los enriquecimientos). Ahorro mínimo de
2 días de trabajo. Elimina la necesidad de
ir a leer resultados en días festivos.
COLICULT-MCC
CRIOTECA®
PLAQUIS®
M-IDENT®
ER‐0632/1999
ISO 9001
COSMETIKIT®
CHROMOSALM
KITPRO-5S
SEILAGUA®
COMPACT-DRY-PLATES®
DESINFECTEST®
NUTRILINIA
MUGPLUS CROMOKIT®
MICROSTICK-LISTERIA
Test rápido de Immunocromatografía para la detección
Ref.KMTC86 cualitativa de Listeria spp. en muestras de alimentos.
2‐Robustez: se ahorran los puntos críticos de otros métodos, como los látex o ELISAs; el
inmunocromatograma es el método inmunológico más duro en toda circunstancia, que puede almacenarse
durante meses fuera del refrigerador y transportarse a temperatura ambiente sin verse alterado.
3‐Sensibilidad extraordinaria: 99,9% para L.monocytogenes, lo que limita la proporción de resultados
falsamente negativos a algo testimonial, convirtiendo el método en un correcto screening de barrido de
muestras negativas de Listeria monocytogenes, ya que si no hay Listeria, no hay Listeria monocytogenes.
4‐Especificidad excelente: 95%, lo que limita adecuadamente la proporción de resultados falsamente
positivos y permite ahorrar las posteriores confirmaciones de los presuntos positivos a menos del 5% de
casos en los que no había Listeria monocytogenes y el test dió presunto positivo
5‐ Kit compacto: incluye los dos caldos de enriquecimiento ISO 11290 optimizados y los Sticks confirmativos
6‐Comodidad de uso: es como un test de embarazo, no necesita aparato alguno para su interpretación,
simple y visual por aparición de dos bandas de colores. Reducir manipulaciones es reducir puntos críticos.
7‐Flexibilidad: test unitarios, no hay necesidad de agrupar muestras, se pueden analizar de 1 a 20 ó más
8‐Estabilidad: se mantiene, incluso sin necesidad de refrigeración (4‐30ºC), durante muchos meses
9‐Ahorro económico: Dada la rapidez de resultados, el alimento puede ser liberado al mercado varios días
antes que como lo haría con el método clásico, lo que supone inmensos ahorros económicos para la
empresa, que deben redundar en un aumento del presupuesto para el laboratorio artífice de esta heroicidad.
Por ello, aunque el kit parece más costoso que el método clásico, en realidad NO LO ES en absoluto.
10‐Validado: Eficiencia del 95‐97,5% en todo tipo de muestras alimentarias según los mayores especialistas
en España en validación de métodos microbiológicos: carne de ternera, leche pasteurizada, pescado,
vegetales, ovoproductos, especias y aperitivos, harina de cereales, pollo, alimentos infantiles, alimentos
dietéticos, salsas, paella, postres, pastelería, helados, embutidos loncheados, queso, mariscos, comida
animal, espaguettis. Límite de detección demostrado desde 6‐10 ufc Listeria /25 g de alimento con un nivel
de acompañantes e interferentes muy diversos 10 2 ‐10 3 veces superior que las dianas!
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I. INTRODUCION Y USO
Listeria monocytogenes es un pequeño bacilo, Gram positivo que puede crecer en condiciones anaerobias o aeróbicas. Se encuentra
ampliamente en el medio ambiente, en el suelo, agua y vegetación en descomposición y pueden formar parte de la flora fecal de
muchos mamíferos, incluyendo adultos humanos sanos. Los síntomas iniciales de infección incluyen síntomas inespecíficos de gripe,
náuseas, vómitos, fiebre, diarrea, calambres, septicemia, meningitis.... Hay muy pocas características clínicas que son exclusivas de la
listeriosis. Los síntomas se pueden desarrollar en cualquier momento desde 2 a 70 días después de comer alimentos contaminados. A
excepción de la transmisión vertical madre–feto, la mayoría de los casos de listeriosis comienza con la ingestión de una fuente de
alimentación contaminada. La mayoría de los adultos y los niños que consumen alimentos contaminados, experimentan sólo síntomas
leves o moderados. Las personas inmunocomprometidas (bebés, ancianos, embarazadas, convalecientes…) corren un riesgo mucho
mayor de sufrir manifestaciones graves e incluso mortales de listeriosis.
El MICROSTICK‐LISTERIA es un kit de 3 componentes diseñado para proporcionar una rápida detección de Listeria spp. (incluida
L.monocytogenes) en muestras de alimentos. El MICROSTICK‐LISTERIA combina un doble enriquecimiento optimizado de la muestra,
con un inmunoensayo cromatográfico para la detección cualitativa de Listeria spp. (incluida L.monocytogenes) en muestras de
alimentos contaminados.
II. FUNDAMENTO DEL TEST
Los caldos de pre‐enriquecimiento revitalizador y post‐enriquecimiento selectivo, basados en los de la Norma ISO
11290 pero optimizados para el Stick, mejoran extraordinariamente el rendimiento de ésta. La membrana del Stick
está revestida con anticuerpos monoclonales de ratón, en la región de banda del test, para reconocer este
antígeno. Durante la prueba, la muestra puede reaccionar con las partículas rojas de látex que están recubiertas
con anticuerpos anti‐Listeria pre‐desecados. La mezcla resultante, migra hacia arriba en la membrana por acción
capilar. Como la muestra fluye a través de la membrana, el aglutinado de partículas rojas migra. En el caso de un
resultado positivo, los anticuerpos específicos presentes en la membrana capturarán el aglutinado de partículas
rojas, formando una banda roja. La mezcla sigue avanzando a través de la membrana con el anticuerpo
inmovilizado que está en la región de la banda de control. En la línea de control aparece una banda de color verde,
lo cual verifica que se ha añadido el volumen suficiente y que se obtuvo un flujo adecuado del caldo de post‐
enriquecimiento inoculado, además de servir como control interno de los reactivos.
III. REACTIVOS Y MATERIALES
Cada Kit contiene:
1. 20 tubotes (ref: DPA015) con polvo estéril del caldo de revitalización MICROKIT‐Listeria para 25 g de alimento
(pre‐enriquecimiento)
2. 20 tubos (ref: TPL033) con 10 ml del caldo de enriquecimiento selectivo MICROKIT‐Listeria, de color amarillo
(post‐enriquecimiento)
3. 20 tarjetas inmunocromatográficas para Listeria Ag (Sticks)
4. Instruciones de uso
Materiales necesarios (no suministrados):
Contenedor de recogida de muestras, guantes desechables, contenedor de desechos, pipetas de plástico, temporizador, Stomacher y
bolsas Stomacher, incubadoras + 30 ºC y + 37 ºC (se puede mantener con sólo la estufa de 35‐37ºC), y agua purificada estéril.
IV. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
Los tubotes de polvo deben mantenerse lejos de la humedad atmosférica, entre 15 y 25° C, y emplear antes de la fecha de caducidad
impresa en sus etiquetas.
Los tubos de líquido deben mantenerse entre 8 y 25° C al abrigo de la luz y usar antes de la fecha de caducidad impresa en sus
etiquetas.
Las tarjetas inmunocromatográficas deben almacenarse tal como están empaquetadas en sus bolsas selladas, así como los tubos
herméticos, a una temperatura comprendida entre 4 y 30 ºC (36‐86ºF), al abrigo de la luz y de la humedad. No congelar! Las tarjetas
son estables hasta la fecha de caducidad impresa en su bolsa sellada y deben permanecer en éstas hasta su uso.
V. TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS DE ALIMENTOS
Las muestras de alimentos deben ser recogidas en recipientes limpios y el ensayo debería realizarse inmediatamente después de la
recogida. Aún así, las muestras pueden almacenarse en el frigorífico (2‐4 º C) durante 1‐2 días previos a la prueba. Para un
almacenamiento más prolongado, la muestra debe mantenerse en el congelador a ‐20ºC. En ese caso, la muestra será totalmente
descongelada y puesta a temperatura ambiente antes del ensayo. Descongelar sólo la cantidad necesaria ya que los ciclos de
congelación‐descongelación no son recomendables. Homogeneizar la muestra lo mejor posible antes de la preparación.
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Para conseguir el nivel necesario de 1 célula de Listeria monocytogenes en 25g de alimento, es fundamental realizar un
enriquecimiento adecuado en dos fases:
a) Pre‐enriquecimiento, enriquecimiento primario o fase revitalizante de las células de Listeria monocytogenes dañadas
sub‐letalmente durante la fabricación el alimento y neutralización de los conservantes del alimento, sean naturales,
sean añadidos
b) Post‐enriquecimiento, enriquecimiento secundario o fase de enriquecimiento selectivo que multiplicará más que las
acompañantes, las células de Listeria monocytogenes hasta 10 5 ‐10 8 ufc/ml, un nivel más que adecuado para ser
detectadas por las tarjetas inmunocromatográficas del MICROSTICK‐LISTERIA, que detectan desde 10 4 ufc/ml
Aún así, diversos kits en el mercado aseguran que la fase de post‐enriquecimiento no es necesaria, sobre todo si el nivel de flora
interferente (aerobios totales) es baja, menor a 10 4 ufc/ml final; esa es una afirmación muy aventurada, ya que si se comete el
frecuente error de validar el kit con una muestra que tenga ya de entrada 10 3 ‐10 4 células viables de Listeria/25 g y escasa flora
interferente, lógicamente la fase de enriquecimiento multiplicador es redundante; pero nadie puede asegurar la detección de
Listeria por debajo del límite de detección de la técnica, que en inmunocromatografía ronda las 10 6 células de Listeria por test (y las
10 4 células de Listeria por test en el mejor de los casos, como es el MICROSTICK‐LISTERIA para L.monocytogenes). Por ello el
laboratorio debe elegir un kit de su total confianza, validado por entidades que muestren claramente todos los datos de la validación
y no un simple certificado, por mucho renombre internacional que tenga la entidad certificadora.
VI. ENRIQUECIMIENTO NECESARIO DEL ALIMENTO ANTE LA POSIBLE PRESENCIA DE Listeria monocytogenes
1‐Mezclar 25 g de muestra sólida o 25 ml de muestra líquida con 225 ml de agua estéril a la que añadiremos el polvo contenido en
un tubote de caldo revitalizador Listeria‐MICROKIT (una mejora del caldo semiFraser, especialmente obligada para este kit). Si es
preciso, golpear el tubote con polvo de pre‐enriquecimiento, en posición horizontal, antes de abrirlo, para descompactar el polvo del
fondo; después cerciórese de que se ha vaciado completamente sobre el agua y la muestra. Homogeneizar durante
aproximadamente 2 minutos, a ser posible en el Stomacher. Incubar durante 18‐24 h a 28‐30ºC, o bien a 35‐37ºC.
2‐Añadir 1 ml de caldo de enriquecimiento a un tubo de 10 ml de caldo de enriquecimiento selectivo Listeria‐MICROKIT. Incubar
durante otras 18‐24 h a 35‐37°C. Si no hay turbidez en el tubo después de 24 horas de incubación, reincubar otras 24 ± 2 h.
Ya en el segundo día se obtendrán los resultados para Listeria monocytogenes, ya que de aquí al paso siguiente se tardan
escasamente 5‐15 minutos.
VII. PROCEDIMIENTO PARA EL TEST INMUNOCROMATOGRÁFICO EN MUESTRAS DE ALIMENTOS
Mantener previo al ensayo, todo el material: test, muestras y envases, a temperatura ambiente (15‐30ºC/59‐86ºF ). No abrir las bolsas
hasta el momento de realizar el ensayo.
1. Abra la bolsa del Stick por la muesca, retire la tarjeta, descarte la bolsita desecante y use la tarjeta lo antes posible.
2. Con una pipeta diferente para cada muestra, dispensar 3‐5 gotas ó 100 µL de la muestra de post‐enriquecimiento en el pocillo (S),
hasta que éste se llene completamente, evitando añadir partículas sólidas de la muestra (no pipetear del fondo del tubo). Llenar el
pocillo generosamente de caldo de post‐enriquecimiento, con un volumen suficiente como para crear un menisco que casi
desborde el pocillo. Iniciar el temporizador.
3. Leer el resultado en 5‐15 minutos (aparecen las bandas de colores, normalmente la de control mucho antes que la del test).
Generalmente no hace falta esperar 15 minutos a la lectura del Stick y en los primeros 2‐5 minutos ya se ven los positivos, pero en
caso negativo hay que esperar 15 minutos por si acaso se trata de un positivo lento.
VIII. INTERPRETACION DE RESULTADOS
NEGATIVO: Solo aparece una banda verde en la ventana central del sitio marcado con la
letra C (línea de control).
POSITIVO: Además de la banda verde de control a través de la ventana central del
sitio marcado con la letra C (línea de control), aparece una banda roja (línea de test)
en el sitio marcado con la letra T (región de resultados). Toda banda roja, por tenue
que sea o truncada que esté, debe considerarse muestra positiva.
NO VALIDO: Ausencia total de banda coloreada en C. Revisar el procedimiento y repetir
usando un nuevo Stick con otra muestra similar del caldo LEB, sin partículas de alimento.
POSITIVO:
BANDA
ROJA DEL
TEST Y
VERDE
DEL
CONTROL
NEGATIVO:
SÓLO
BANDA
VERDE DEL
CONTROL
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IX. CONTROL DE CALIDAD INTERNO
Los controles internos están incluidos en el test. La línea de color verde que aparece en la región de control (C) es un control interno.
Confirma un suficiente volumen de muestra y una correcta técnica de uso del test. Si desea un control positivo de Listeria
monocytogenes emplee preferentemente cepas de referencia como L.monocytogenes (por ejemplo la NCTC 11994)
X. PRECAUCIONES ESPECIALES Y LIMITACIONES DEL KIT
‐Solo para profesionales de laboratorio.
‐No utilizar ningún reactivo después de su fecha de caducidad.
‐Seguir las buenas prácticas de laboratorio: ropa protectora, guantes desechables y no comer, beber o fumar en la zona...
‐Todas las muestras deben considerarse potencialmente infecciosas y ser manejadas igual que un agente infeccioso.
‐Los tubotes y tubos de caldos deben permanecer cerrados hasta el momento de su uso, guardados en lugar fresco, seco y oscuro.
‐Siga al pie de la letra las instrucciones de enriquecimiento, ya que otras combinaciones y otros medios como el agua peptonada
tamponada en pre‐enriquecimiento, han demostrado no ser válidos, al disminuir drásticamente la efectividad del kit.
‐La turbidez o el viraje de color en los tubos no es indicadora de presunta presencia de Listeria y debe realizarse el Stick.
‐Los medios de enriquecimiento contienen Ac.Nalidíxico, Acriflavina y Cicloheximida, por lo que deben trabajarse con precaución
(guantes, máscaras) y evitar tocar y respirar el polvo y el líquido.
‐No se puede prescindir del post‐enriquecimiento; aunque en algunas muestras una incubación del pre‐enriquecimiento
prolongada otras 18 h permite obtener positivos reales con el Stick, la mayoría de muestras tomadas directamente de la solución
madre son demasiado espesas o grasas y no migran adecuadamente en la membrana del inmunocromatograma.
‐La adición de 0,1 ml de pre‐enriquecimiento (en lugar de 1 ml) a 10 ml del tubo de post‐enriquecimiento que defienden algunos
autores, no da tan buenos resultados cuando hay presentes pocas ufc de Listeria y muchas ufc de interferentes y acompañantes, por
lo que en todos los casos resulta mejor añadir 1 ml; sin embargo, se pueden añadir 0,1 ml si la muestra enriquecida es demasiado
espesa o coloreada y esto impide su correcta difusión en el stick, ya que el límite de detección sigue siendo el adecuado.
‐Las tarjetas inmunocromatográficas deben permanecer en sus bolsas selladas hasta el momento de su uso.
‐No utilizar las tarjetas inmunocromatográficas cuyas bolsas están dañadas.
‐El test debe realizarse dentro de las 2 horas siguientes a la apertura de la bolsa de la tarjeta inmunocromatográfica.
‐Una vez utilizado el kit, aunque se deje secar, no funcionará correctamente con una segunda muestra aunque incluyamos altas
concentraciones de Listeria: Los Sticks NO son reutilizables en ningún caso.
‐Un exceso de muestra de alimento en el pocillo del Stick podría provocar resultados erróneos (aparecen bandas marrones). En
tal caso, dejar reposar el tubo y extraer muestra limpia de la zona superior y media del tubo, para repetir el test en otro Stick.
‐Algunas muestras de ciertos alimentos pueden disminuir la intensidad de la línea de control verde. Otras muestras (alimentos
muy grasos…) pueden migrar con más dificultad por la membrana e incluso no llegar a formar la línea verde (test invalidado).
‐Puede solicitar para estos ultimos casos, una caja de 5 sticks sin tubotes ni tubos, pida la ref: KMTC86‐TT
‐Ciclos de congelación y descongelación en la muestra no son recomendables ya que pueden causar resultados erróneos.
‐Las tarjetas inmunocromatográficas y los tubos empleados deben eliminarse en un recipiente adecuado biohazard después de
los ensayos.
‐Esta prueba proporciona un diagnóstico presuntivo de listeriosis o ausencia/ presencia de Listeria monocytogenes en muestras
de alimentos, pero un resultado negativo podría eventualmente indicar que la concentración de Listeria monocytogenes en la
muestra es demasiado pequeña o que las células están demasiado sub‐letales y no han conseguido replicarse lo suficiente como
para ser detectadas. La determinación de Listeria monocytogenes debe llevarse a cabo sobre la muestra adecuadamente
enriquecida con el protocolo que se explica en este folleto.
‐Todo positivo debe confirmarse con Agar Cromocytogenes (ref: PPL970) y si aparecen colonias verdes con halo, con
Xylosa/Rhamnosa (ref: KMT012), para evitar reportar falsos positivos; aunque el medio de aislamiento de la ISO 12290 obtiene hasta
un 45% de falsos positivos si están presentes ciertos acompañantes Gram positivos (frente a sólo el 5% de falsos positivos del
MICROSTICK‐LISTERIA), las colonias verdes y con halo en dicho medio que además resulten Xilosa – y Rhamnosa + se consideran
L.monocytogenes. Sin embargo, este Agar Cromocytogenes no obtiene ni un solo falso negativo (sensibilidad >99,9%) incluso estando
presente la Listeria monocytogenes en cantidades ínfimas (confirmado desde 6‐10 ufc/25 g) y la mencionada flora acompañante e
interferente en cantidades muy superiores (confirmado desde 10 2 ‐10 3 ufc/25 g).
XI. RENDIMIENTO
A.Límite de detección
El límite de detección del MICROSTICK‐LISTERIA es 6.25x10 4 L. monocytogenes /mL de caldo post‐enriquecido, que equivale, según la
validación con el protocolo aquí explicado, a menos de 6 ufc de L. monocytogenes/25 g de alimento (por cuestiones de incertidumbre
microbiológica, nadie puede apostar en un método que el límite de detección sea 1 ufc).
B. Sensibilidad y Especificidad
Se estudiaron diversas cepas de colección con MICROSTICK‐LISTERIA con el método tradicional (ISO 11290). Los resultados fueron > el
99% de sensibilidad y > 96% de especificidad. La utilización de un anticuerpo monoclonal de ratón en el kit asegura un alto grado de
especificidad para la detección de estas bacterias. Los anticuerpos utilizados para preparar este test reconocen epítopos de Listeria que
se encuentra en los cultivos de bacterias. Estos valores preliminares deben tomarse con precaución hasta que haya más de datos de
evaluación disponibles en matrices alimentarias (ver más abajo) y con cepas salvajes.
C. Reactividad cruzada
Se realizó una evaluación para determinar la reactividad cruzada de Listeria monocytogenes con MICROSTICK‐LISTERIA. No se ha
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encontrado reactividad cruzada con patógenos comunes de alimentos, otros organismos ni otras sustancias presentes
ocasionalmente en los alimentos, como Escherichia coli O157, Campylobacter y Salmonella.
D. Validación con muestras naturales de alimentos
Se analizaron 20 muestras positivas y 20 muestras negativas para
Listeria de diferentes alimentos, con toda clase de
microorganismos acompañantes Gram ‐ (Salmonella nottingham,
Proteus mirabilis, Citrobacter freundii, E.coli) e interferentes
Gram + (Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus,
Staphylococcus epidermidis,) en mezclas muy diversas y a muy
superior concentración (>10 2 ‐10 3 ufc/25 g) que los
microorganismos diana (Listeria monocytogenes, Listeria grayii,
Listeria ivanovii, Listeria welshimeri, Listeria inocua), que estaban
(sólo una de ellas en cada una de las diferentes matrices) a un
nivel ínfimo de presencia (6‐10 ufc/25 g). Los alimentos
implicados en la validación fueron hamburguesa cruda de
ternera, leche pasteurizada, pescado crudo, ensaladas vegetales,
huevo crudo, patatas con ajo, cebolla y pimienta, harina de trigo,
pollo crudo, papilla infantil de frutas, barritas dietéticas con
chocolate, salsa rosa, paella‐arroz a banda, pasteles variados,
crema catalana, helado de vainilla, chorizo
loncheado, queso curado, mariscos, galletas de
perro, espaguettis. Los resultados fueron, para
tan ajustado inóculo de Listeria y tan elevada
carga interferente, de una sensibilidad del 95%‐
100% (el único falso negativo de 20 fué en leche
pasteurizada con L.ivanovii, por lo que no afecta
a la búsqueda de Listeria monocytogenes) y de
una especificidad del 95% (falso positivo débil,
en harina de trigo).
De este modo queda validado MICROSTICK‐
LISTERIA en alimentos por su inmejorable
sensibilidad (100%, no hay falsos negativos
para L.monocytogenes), por su excelente
especificidad (95%, solo un 5% de falsos
positivos) y por su inmejorable límite de
detección (demostrado para 6 ufc/25 g, lo cual
no significa que no pueda llegar a 1 ufc/25g, el
problema es que es estadísticamente
imposible de evaluar a causa de la
incertidumbre microbiológica).
XIII. REFERENCIAS
1. BOTTELDOORN N, et al. “Microbiological and molecular investigation of an increase of human listeriosis in Belgium, 2006‐
2007”. Euro Surveill. 2010;15(6):pii=19482.
2. BORTOLUSSI, R. “Listeriosis: a primer”. CMAJ, October , 2008 Vol 179(8), p 795‐797
3. ISO 11290:2000‐2004 ALIMENTOS, método horizontal para aislamiento de Listeria monocytogenes.
El usuario final es el único responsable de la eliminación de los microorganismos crecidos, de acuerdo con la legislación medioambiental vigente.
Autoclavar antes de desechar en la basura.
Protocolo y componentes del MICROSTICK‐LISTERIA diseñados y fabricados por/para MICROKIT desde el 19 de Diciembre de 2011.
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