Dra. Maria Esteve Comas Hospital Mútua de Terrassa Dr. Josep ...
Dra. Maria Esteve Comas Hospital Mútua de Terrassa Dr. Josep ... Dra. Maria Esteve Comas Hospital Mútua de Terrassa Dr. Josep ...
Hipòtesi i objectius L’apoptosi és un dels mecanismes més importants de regulació de l’homeòstasi immunològica. La seva alteració pot donar lloc a una exagerada resposta immunològica amb tendència a la cronicitat. S’ha suggerit que diversos fàrmacs immunosupressors actuen induint l’apoptosi de cèl·lules inflamatòries. La refractarietat a esteroides o la corticodependència (com a forma menor de corticorefractarietat) es pot predir quantificant l’apoptosi de diferents tipus de cèl·lules inflamatòries. Els pacients amb MII refractària a esteroides presenten una disminució de l’apoptosi de les cèl·lules inflamatòries de la làmina pròpia i un increment de l’activació d’NFκB mediada per TNFα i els transductors de senyal del seu receptor. D’acord amb aquesta hipòtesi, els objectius de l’estudi van ser: Avaluar: 1) si l’apoptosi de cèl·lules mononuclears de la mucosa intestinal es troba disminuïda a l’MC i a la CU refractària i dependent d’esteroides; 2) si això s’acompanya d’un augment de l’expressió i activació d’NFκB, de TNFα i de proteïnes del seu receptor, i 3) si els resultats obtinguts permeten predir la resposta al tractament d’una manera més sensible que altres paràmetres clínics i biològics. Disseny Pacients i mètodes: inclusió de 60 pacients amb MII activa (30 CU i 30 MC) corticosensibles, dependents i refractaris a esteroides (6 grups de pacients, 10 per grup) tractats amb 1mg/kg/dia de prednisona. Es van obtenir biòpsies a la inclusió i al 7è-10è dies de tractament. La resposta es va avaluar mitjançant índex d’activitat clínics, endoscòpics i histopatològics prèviament validats. Per avaluar l’equilibri apoptosi i inflamació s’han realitzat una sèrie de tècniques que són complementàries. Immunohistoquímica: determinació de l’apoptosi en les poblacions de limfòcits T, cèl·lules plasmàtiques i monòcits/macròfags amb caspasa-3 i TNFr-FADD. L’activació de la resposta inflamatòria s’avalua amb els marcadors 2
p65-NFκB, TNFα i TNFr-TRAF2. Citometria de flux: anàlisi del percentatge d’apoptosi dels mateixos tipus cel·lulars mitjançant un doble marcatge amb Annexina-V (apoptosi) i 7-AAD (viabilitat cel·lular) . Real Time-PCR: avaluació de l’expressió de Bax, Bcl-2, Fas-L, IFNγ, IL-1α, TNFα, IL12p40, IL-4, IL-10. Procarta transcription factor assay kit (Luminex ® analyzer): anàlisi fluorimètrica dels valors d’NFκB activat (p65). Pla de treball Centres 1 i 2 (HOSPITAL MÚTUA DE TERRASSA [HMT] Y HOSPITAL GERMANS TRIAS I PUJOL [HGTiP]). La inclusió de pacients, com també la recollida de dades clíniques, endoscòpiques i obtenció de biòpsies s’ha realitzat als 2 centres. Després d’un període mínim de 6 mesos de seguiment, els pacients es van classificar en corticosensibles, refractaris i dependents. En aquesta fase de la recerca, s’hi han involucrat els metges gastroenteròlegs dels 2 hospitals participants i un patòleg de l’Hospital Mútua de Terrassa (A.S.). L’estudi immunohistoquímic s’ha realitzat a l’HMT. L’estudi mitjançant citometria de flux per avaluar el percentatge d’apoptosi de les poblacions cel·lulars d’estudi a la mucosa intestinal, l’ha realitzat a l’HMT una biòloga (Rebeca Santaolalla) contractada específicament per a aquest projecte, tot constituint el tema de la seva tesi doctoral, pendent de lectura al Departament de Biologia Cel·lular, Fisiologia i Immunologia de la UAB durant l’últim trimestre de 2008 . A l’HGTiP s’ha realitzat la posada a punt de la tècnica de Real Time- PCR per a determinació de totes les citocines en les biòpsies, així com la quantificació de l’activitat p65-NFκB mitjançant l’analitzador Luminex ® , basat en la citometria de flux i la hibridació amb sondes fluorescents. 3
- Page 1: UTILITAT DE L’AVALUACIÓ DE L’A
- Page 5 and 6: A la CU activa s’observa un incre
- Page 7 and 8: Resposta a esteoides Corticosensibl
- Page 9 and 10: IL-10 pretract. IL-10 posttract. 40
- Page 11: expressió per efecte dels esteroid
p65-NFκB, TNFα i TNFr-TRAF2. Citometria <strong>de</strong> flux: anàlisi <strong>de</strong>l<br />
percentatge d’apoptosi <strong>de</strong>ls mateixos tipus cel·lulars mitjançant un<br />
doble marcatge amb Annexina-V (apoptosi) i 7-AAD (viabilitat<br />
cel·lular) . Real Time-PCR: avaluació <strong>de</strong> l’expressió <strong>de</strong> Bax, Bcl-2,<br />
Fas-L, IFNγ, IL-1α, TNFα, IL12p40, IL-4, IL-10. Procarta<br />
transcription factor assay kit (Luminex ® analyzer): anàlisi<br />
fluorimètrica <strong>de</strong>ls valors d’NFκB activat (p65).<br />
Pla <strong>de</strong> treball<br />
Centres 1 i 2 (HOSPITAL MÚTUA DE TERRASSA [HMT] Y HOSPITAL<br />
GERMANS TRIAS I PUJOL [HGTiP]).<br />
La inclusió <strong>de</strong> pacients, com també la recollida <strong>de</strong> da<strong>de</strong>s<br />
clíniques, endoscòpiques i obtenció <strong>de</strong> biòpsies s’ha realitzat<br />
als 2 centres. Després d’un perío<strong>de</strong> mínim <strong>de</strong> 6 mesos <strong>de</strong><br />
seguiment, els pacients es van classificar en corticosensibles,<br />
refractaris i <strong>de</strong>pen<strong>de</strong>nts. En aquesta fase <strong>de</strong> la recerca, s’hi<br />
han involucrat els metges gastroenteròlegs <strong>de</strong>ls 2 hospitals<br />
participants i un patòleg <strong>de</strong> l’<strong>Hospital</strong> <strong>Mútua</strong> <strong>de</strong> <strong>Terrassa</strong><br />
(A.S.).<br />
L’estudi immunohistoquímic s’ha realitzat a l’HMT. L’estudi<br />
mitjançant citometria <strong>de</strong> flux per avaluar el percentatge d’apoptosi <strong>de</strong><br />
les poblacions cel·lulars d’estudi a la mucosa intestinal, l’ha realitzat a<br />
l’HMT una biòloga (Rebeca Santaolalla) contractada específicament<br />
per a aquest projecte, tot constituint el tema <strong>de</strong> la seva tesi doctoral,<br />
pen<strong>de</strong>nt <strong>de</strong> lectura al Departament <strong>de</strong> Biologia Cel·lular, Fisiologia i<br />
Immunologia <strong>de</strong> la UAB durant l’últim trimestre <strong>de</strong> 2008 .<br />
A l’HGTiP s’ha realitzat la posada a punt <strong>de</strong> la tècnica <strong>de</strong> Real Time-<br />
PCR per a <strong>de</strong>terminació <strong>de</strong> totes les citocines en les biòpsies, així com<br />
la quantificació <strong>de</strong> l’activitat p65-NFκB mitjançant l’analitzador<br />
Luminex ® , basat en la citometria <strong>de</strong> flux i la hibridació amb son<strong>de</strong>s<br />
fluorescents.<br />
3
Change language