Dra. Maria Esteve Comas Hospital Mútua de Terrassa Dr. Josep ...

UTILITAT DE L’AVALUACIÓ DE L’APOPTOSI DE CÈL·LULES
MONONUCLEARS DE LA MUCOSA INTESTINAL DE PACIENTS
AMB MALALTIA INFLAMATÒRIA INTESTINAL PER PREDIR
L’APARICIÓ DE REFRACTARIETAT A ESTEROIDES. RELACIÓ
AMB L’ACTIVACIÓ DEL FACTOR DE TRANSCRIPCIÓ NFΚB I LA
TRANSCRIPCIÓ DE CITOCINES
Investigadors principals:
Dra. Maria Esteve Comas
Hospital Mútua de Terrassa
Dr. Josep Mañé Almero
Hospital Universitari Germans Trias i Pujol
Durada: 3 anys
MEMÒRIA FINAL
1. Resum
Introducció
La malaltia inflamatòria intestinal (MII) és una patologia inflamatòria
crònica d’etiologia desconeguda que afecta el tub digestiu. Dins
d’aquesta entitat hi ha la malaltia de Crohn (MC) i la colitis ulcerosa
(CU). El tractament amb corticosteroides és l’estratègia terapèutica
de primera elecció en els brots d’activitat moderats i greus.
1

Hipòtesi i objectius
L’apoptosi és un dels mecanismes més importants de regulació de
l’homeòstasi immunològica. La seva alteració pot donar lloc a una
exagerada resposta immunològica amb tendència a la cronicitat. S’ha
suggerit que diversos fàrmacs immunosupressors actuen induint
l’apoptosi de cèl·lules inflamatòries. La refractarietat a esteroides o la
corticodependència (com a forma menor de corticorefractarietat) es
pot predir quantificant l’apoptosi de diferents tipus de cèl·lules
inflamatòries. Els pacients amb MII refractària a esteroides presenten
una disminució de l’apoptosi de les cèl·lules inflamatòries de la làmina
pròpia i un increment de l’activació d’NFκB mediada per TNFα i els
transductors de senyal del seu receptor. D’acord amb aquesta
hipòtesi, els objectius de l’estudi van ser:
Avaluar: 1) si l’apoptosi de cèl·lules mononuclears de la mucosa
intestinal es troba disminuïda a l’MC i a la CU refractària i dependent
d’esteroides; 2) si això s’acompanya d’un augment de l’expressió i
activació d’NFκB, de TNFα i de proteïnes del seu receptor, i 3) si els
resultats obtinguts permeten predir la resposta al tractament d’una
manera més sensible que altres paràmetres clínics i biològics.
Disseny
Pacients i mètodes: inclusió de 60 pacients amb MII activa (30 CU i
30 MC) corticosensibles, dependents i refractaris a esteroides (6
grups de pacients, 10 per grup) tractats amb 1mg/kg/dia de
prednisona. Es van obtenir biòpsies a la inclusió i al 7è-10è dies de
tractament. La resposta es va avaluar mitjançant índex d’activitat
clínics, endoscòpics i histopatològics prèviament validats.
Per avaluar l’equilibri apoptosi i inflamació s’han realitzat una sèrie de
tècniques que són complementàries. Immunohistoquímica:
determinació de l’apoptosi en les poblacions de limfòcits T, cèl·lules
plasmàtiques i monòcits/macròfags amb caspasa-3 i TNFr-FADD.
L’activació de la resposta inflamatòria s’avalua amb els marcadors
2

p65-NFκB, TNFα i TNFr-TRAF2. Citometria de flux: anàlisi del
percentatge d’apoptosi dels mateixos tipus cel·lulars mitjançant un
doble marcatge amb Annexina-V (apoptosi) i 7-AAD (viabilitat
cel·lular) . Real Time-PCR: avaluació de l’expressió de Bax, Bcl-2,
Fas-L, IFNγ, IL-1α, TNFα, IL12p40, IL-4, IL-10. Procarta
transcription factor assay kit (Luminex ® analyzer): anàlisi
fluorimètrica dels valors d’NFκB activat (p65).
Pla de treball
Centres 1 i 2 (HOSPITAL MÚTUA DE TERRASSA [HMT] Y HOSPITAL
GERMANS TRIAS I PUJOL [HGTiP]).
La inclusió de pacients, com també la recollida de dades
clíniques, endoscòpiques i obtenció de biòpsies s’ha realitzat
als 2 centres. Després d’un període mínim de 6 mesos de
seguiment, els pacients es van classificar en corticosensibles,
refractaris i dependents. En aquesta fase de la recerca, s’hi
han involucrat els metges gastroenteròlegs dels 2 hospitals
participants i un patòleg de l’Hospital Mútua de Terrassa
(A.S.).
L’estudi immunohistoquímic s’ha realitzat a l’HMT. L’estudi
mitjançant citometria de flux per avaluar el percentatge d’apoptosi de
les poblacions cel·lulars d’estudi a la mucosa intestinal, l’ha realitzat a
l’HMT una biòloga (Rebeca Santaolalla) contractada específicament
per a aquest projecte, tot constituint el tema de la seva tesi doctoral,
pendent de lectura al Departament de Biologia Cel·lular, Fisiologia i
Immunologia de la UAB durant l’últim trimestre de 2008 .
A l’HGTiP s’ha realitzat la posada a punt de la tècnica de Real Time-
PCR per a determinació de totes les citocines en les biòpsies, així com
la quantificació de l’activitat p65-NFκB mitjançant l’analitzador
Luminex ® , basat en la citometria de flux i la hibridació amb sondes
fluorescents.
3

2. Resultats
Descripció de la població de pacients reclutada.
S’han inclòs un total de 32 pacients amb CU (18 homes, 14 dones;
45,6 ± 2,9 anys), 22 pacients amb MC (8 homes, 14 dones; 37,4 ±
3,3 anys) i 22 controls (10 homes i 12 dones; edat 54,2 ± 3,6). La
resposta a esteroides després del seguiment a la CU va ser la
següent: 14 corticosensibles, 9 corticodependents i 9 refractaris, i a
l’MC: 6 corticosensibles, 8 corticodependents i 8 refractaris.
Fenotip i apoptosi de les cèl·lules inflamatòries de la làmina
pròpia
Els resultats obtinguts fins al moment de l’elaboració de la memòria
mostren que l’apoptosi dels limfòcits de la làmina pròpia a l’MC (amb
predomini de pacients amb mala evolució), igual que a la CU, no
difereix de la del budell sa. Tampoc no es van trobar diferències per a
cèl·lules plasmàtiques (CD38) ni limfòcits B (CD19). En canvi, es va
trobar una disminució significativa, tant de monòcits/macròfags com
de monòcits/macròfags apoptòtics.
% Malaltia de
Crohn
Colitis
Ulcerosa
Controls p
CD3 29,85 ± 5,05 27,71 ± 4,82 33,10 ± 5,70 0,775
CD3
apoptòtics
25,65 ± 6,05 23,39 ± 5,19 24,31 ± 9,16 0,969
CD14 1,66 ± 0,34 1,75 ± 0,26 4,53 ± 0,77 <
CD14
apoptòtics
0,0001
50,35 ± 7,28 41,80 ± 7,76 66,43 ± 5,03 0,05
ANOVA per a 1 factor (mostra basal).
4

A la CU activa s’observa un increment de cèl·lules plasmàtiques i de
cèl·lules plasmàtiques apoptòtiques, i no es van trobar diferències per
a la resta de poblacions cel·lulars. Als pacients corticosensibles, i
malgrat observar-se una clara millora clínica, endoscòpica i
histològica, per efecte del tractament amb corticosteroides, no es
detecta cap canvi en el fenotip cel·lular ni en l’apoptosi de cap tipus
cel·lular.
% Colitis Ulcerosa Control p
CD38+ 8.93 ± 1.62 4.50 ± 1.17 0,04
CD38+ apoptòtics 14.76 ± 2.17 8.89 ± 1.69 0,009
t d’Student per a dades no emparellades. Els resultats s’expressen en
% com a mitjana i ESM del % de població fenotipada / total cèl·lules
LP i % apoptosi població fenotipada / total cèl·lules del mateix tipus.
Apoptosi: Bax i Bcl2
L’estudi de l’expressió de Bax i Bcl-2 tampoc no ha mostrat
diferències significatives entre grups excepte per als pacients
corticodependents, en què s’observa un increment significatiu de
l’expressió de Bcl-2 posttractament amb esteroides.
Bax
pretract.
Bax
posttract.
CU sensible CU
1,5 (0,01 -
5,4)
1,5 (0,01 -
316,2)
dependent
CU
refractària
1,2 (0,1 - 2,3) 0,5 (0,01 -
7,4)
1,6 (0,6 - 3,3) 0,9 (0,1 -
5,6)
p** 0,937 0,263 0,859
p*
0,794
5

Bcl-2
pretract.
Bcl-2
posttract.
CU sensible CU
2,3 (0,04 -
10,1)
2,3 (0,2 -
294,05)
dependent
CU
refractària
1,5 (0,3 - 2,6) 0,9 (0,01 -
8,3)
2,7 (0,8 - 4,5) 1,8 (0,3 -
15,1)
p** 0,929 0,018 0,138
p*
0,853
Mediana (IC 95%). *ANOVA 1 factor (resposta a esteroides) **t
d’Student dades emparellades (pre/posttractament)
Expressió i activació de NFκB i citocines
Als pacients corticosensibles, els valors d’NFκB disminueixen
paral·lelament a la millora dels índexs clínics i endoscòpics. En canvi,
no s’observen diferències als pacients corticodependents, malgrat que
es detecta una millora significativa en la intensitat de l’activitat
inflamatòria. A la mostra basal no es detecten diferències
significatives entre pacients sensibles, dependents i refractaris.
6

Resposta a
esteoides
Corticosensibles
n=9
Corticodependents
n=8
Corticorefractaris
n=9
NFκB Index
a) 86,4 ±
6,4
b) 61,1 ±
p=0,005
7,9
a) 106,6 ±
18,5
b) 139,4 ±
p=0,255
27,3
a) 81,9 ±
9,9
b) 77,1 ±
p=0,750
10,5
a) mostra pretractament; b) posttractament. Resultats
expressats com a intensitat de fluorescència (mitjana ±
ESM). Grup control: NFκB = 72,7 ± 8,4
clín
Les citocines amb funció predominantment immunoreguladora IFNγ,
IL-4 , IL12p40 i IL-10 mostren un comportament similar als pacients
corticosensibles, amb valors significativament més alts (o quasi, per
a IL-10), que als dependents i refractaris. Als pacients
corticosensibles es detecta una tendència al descens d’IFNγ, IL-4,
IL10 i IL12p40 per efecte del tractament. Els pacients
corticodependents tenen un comportament intermedi i no mostren un
descens d’IFNγ i IL-10 per efecte del tractament i només tenen
ic
a) 9,3 ±
0,7
b) 6,4 ±
0,2
p=0,001
a) 12,1 ±
0,6
b) 8,5 ±
0,3
p

tendència al descens per a IL-12p40 i IL-4. Per a les citocines IL1α i
TNFα (amb una forta funció proinflamatòria) no s’observen
diferències entre grups a la mostra basal. S’observa un descens
significatiu de TNFα als pacients sensibles i tendència similar per a IL-
1α. També s’observa una tendència al descens en pacients
corticodependents i cap canvi als pacients refractaris.
IFNγ
pretract.
IFNγ
posttract.
CU sensible CU dependent CU refractària p*
4,3 (0,02 -
38,4)
0,2 (0,01 -
38,1)
0,2 (0,02 -
15,3)
0,14 (0,01 -
646,2)
0,1 (0,01 -
68,2)
0,9 (0,07 -
85,9)
p** 0,158 0,484 0,038
TNFα
pretract.
TNFα
posttract.
5,6 (0,03 -
2229,5)
0,2 (0,01 -
38,1)
15,2 (0,2 -
31706,7)
0,50 (0,01 -
913,8)
80,9 (0,04 -
284,5)
22,3 (0,03 -
434,3)
p** 0,021 0,345 0,674
IL-4
pretract.
IL-4
posttract.
2,3 (0,02 -
38,4)
0,16 (0,01 -
38,1)
0,2 (0,02 -
15,3)
0,11 (0,01 -
0,5)
0,08 (0,01 -
12,1)
0,2 (0,02 -
0,3)
p** 0,116 0,262 0,767
IL-1α
pretract.
IL-1α
posttract.
205,8 (0,1 -
29379)
25,3 (0,04 -
905,4)
148,2 (0,4 -
950,5)
59,5 (0,07 -
449,6)
170,4 (12,1 -
357,6)
99,2 (0,16 -
795,5)
p** 0,140 0,484 0,678
0,039
0,822
0,038
0,995
8

IL-10
pretract.
IL-10
posttract.
40,0 (0,1 -
25049,6)
11,8 (0,1 -
190,3)
11,36 (0,2 -
6049,1)
35,5 (0,2 -
567,7)
2,4 (0,06 -
60,6)
7,6 (0,16 -
113,4)
p** 0,064 0,484 0,484
IL-12
pretract.
IL-12
posttract.
3,12 (0,02 -
1701,3)
0,16 (0,01 -
38,1)
0,2 (0,02 -
15,3)
0,08 (0,01 -
12,1)
0,1 (0,01 - 0,5) 0,2 (0,07 -
0,3)
p** 0,101 0,262 0,767
Mediana (IC 95%). *ANOVA 1 factor (resposta a esteroides). **t
d’Student dades emparellades (pre/posttractament)
0,089
0,032
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques dels resultats
finals obtinguts
Aquest estudi avalua per primera vegada, d’una manera simultània i
amb un gran nombre de paràmetres biològics, el balanç entre
apoptosi i inflamació a l’MII (tant CU com MC) i la relació entre
aquest equilibri i la resposta terapèutica als esteroides. La inducció
d’apoptosi de limfòcits i de monòcits/macròfags de certs fàrmacs
actius a l’MII s’ha considerat un mecanisme d’acció essencial per
aconseguir una bona resposta terapèutica. De fet, els corticoides
indueixen apoptosi en diferents tipus cel·lulars per mecanismes
encara poc establerts i que inclouen l’activació de gens que indueixen
lisi o la repressió de l’expressió de gens de proliferació i creixement
(Schmidt S et al. Cell Death Differ 2004;11 Suppl 1:S45-55). Amb
tot, les dades disponibles d’aquest projecte suggereixen que els
9

corticosteroides a l’MII, malgrat la seva eficàcia en un percentatge
elevat de pacients, no actuen induint apoptosi dels tipus cel·lulars
avaluats, als pacients amb bona resposta a aquesta terapèutica
(pacients corticosensibles). L’avaluació de l’apoptosi mitjançant
l’expressió dels gens anti- i proapoptòtics (Bcl-2 i Bax) tampoc no
apunta cap a indicar que el mecanisme d’acció terapèutica dels
corticoides sigui un efecte proapoptòtic a l’MII. De fet, s’observa
només un increment de l’expressió de Bcl-2 per efecte del tractament
a la CU corticodependent i una tendència en el mateix sentit a la
malaltia refractària.
D’altra banda, l’MC, contràriament al que s’ha afirmat prèviament, no
és intrínsecament una malaltia amb resistència a l’apoptosi de
limfòcits (“limfòcits que viuen massa”) (Itoh J et al. Gut 2001;49:35-
41). La reducció observada de cèl·lules CD14+ i CD14+ apoptòtiques
a l’MII caldrà confirmar-la en una sèrie més àmplia purificant
específicament aquesta població cel·lular i pot tenir importància
fisiopatològica, ja que els monòcits/macròfags participen en el
reconeixement d’antígens microbians.
La detecció d’un increment de cèl·lules plasmàtiques a la mucosa
inflamada del còlon (↑CD38+ i ↑CD38+ apoptòtiques) es correspon
amb els resultats d’estudis immunohistoquímics clàssics en què es
demostrava un augment de cèl·lules plasmàtiques productores d’IgA,
IgM i sobretot IgG (Scott MG et al. Clin Exp Immunol 1986; 66:209-
15 i McDermott RP et al. Gastroenterology 1986; 91:379-85). La
discordança existent entre la millora clínica i endoscòpica i la
resistència al canvi de l’índex histològic i de les poblacions cel·lulars
inflamatòries, suggereix que les alteracions en els mecanismes
d’immunoregulació detectats, no són fenòmens desencadenants
primaris sinó epifenòmens de la inflamació.
Diversos estudis han demostrat que en la mucosa intestinal inflamada
de pacients amb MII hi ha una activació d’NFκB (Schreiber S et al.
Gut. 1998; 42:477-84) i que es produeix una reducció de la seva
10

expressió per efecte dels esteroides (Ardite E et al. Br J Pharmacol.
1998;124:431-3). En canvi, no hi ha pràcticament informació sobre
el seu comportament en pacients refractaris i només s’ha publicat un
estudi en pacients amb elevat risc de recidiva, i per tant
probablement corticodependents, en els quals s’ha detectat una
expressió incrementada d’NFκB activat a la mucosa intestinal en
comparació amb els pacients amb bona resposta prolongada (Wild
GE. Aliment Pharmacol Ther 2003;18:309-17). En aquest sentit, tot i
que s’ha suggerit que la corticodependència és una forma menor de
corticorefractarietat, no hi ha a l’MII estudis de biologia cel·lular o
molecular que proporcionin evidències per refermar aquesta
afirmació. El present estudi avalua simultàniament un bon nombre de
pacients amb MII sensibles, dependents i refractaris a esteroides. Els
resultats confirmen l’increment d’NFB a la mucosa colònica inflamada
i demostren que en fase activa i abans de l’inici del tractament, ni els
valors d’NFκB, ni tampoc de TNFα i IL1α, serveixen per predir la seva
resposta. En canvi, es demostra de forma clara que als pacients
corticodependents, la persistència de valors elevats d’NFκB a la
mostra posttractament, malgrat l’aparent bona resposta immediata,
fa preveure l’aparició d’una recaiguda precoç. L’activació sostinguda
d’NFκB als pacients corticodependents i refractaris pot tenir com a
causa una incapacitat dels corticoides d’inhibir aquest factor de
transcripció. L’elevació significativa d’IFN-γ, IL-4, IL12p40 i IL-10 a la
mostra basal de pacients corticosensibles és una troballa inesperada i
suggereix que la funció immunoreguladora (antiinflamatòria en el cas
de l’IL-10) d’aquestes citocines té un paper important en la bona
resposta als corticoides.
El comportament biològic tant d’NFκB, com del perfil de citocines
immunoreguladores i proinflamatòries als pacients corticodependents,
proporcionen una base fisiopatològica que demostra per primera
vegada que la corticodependència constitueix una forma menor de
corticorefractarietat.
11