Unitat de Toxicologia Experimental i Ecotoxicologia (UTOX-PCB)

Unitat de Toxicologia Experimental
i Ecotoxicologia (UTOX-PCB)

Índex
1. Presentació 3
2. «Screening» toxicològic de molècules bioactives 5
3. Toxicologia general 9
4. Toxicologia Ambiental i Ecotoxicologia 12
5. Control sanitari d’animals d’experimentació 20
Unitat de Toxicologia Experimental
i Ecotoxicologia (UTOX-PCB)
2

1. Presentació
Plantejament i objectius
La Unitat de Toxicologia Experimental
i Ecotoxicologia (UTOX-PCB) es
constitueix com una unitat pròpia
del Parc Científic de Barcelona, amb
l’objectiu, d’una banda, d’actuar com a
suport per a grups o departaments de la
UB i de les empreses radicades al Parc,
així com d’altres centres d’investigació
públics o privats; i, d’altra, de portar a
terme projectes de recerca propis o en
col·laboració.
El camp d’interès de la Toxicologia abasta
diversos aspectes, entre els que destaca el
triatge (screening) i el desenvolupament
de fàrmacs, així com l’avaluació del risc
presentat per substàncies d’ús industrial,
cosmètic, de neteja, etc..
Igualment es posa de manifest la necessitat
de l’enfocament toxicològic en els
projectes relacionats amb l’estudi de la
contaminació, ja sigui del medi aquàtic, del
sòl o atmosfèrica.
Aquest camp, el de la Toxicologia
Ambiental i l’Ecotoxicologia, es troba en
una fase de forta expansió, impulsada des
de sectors molt diversos. D’una banda,
la documentació ecotoxicològica s’ha
convertit en part obligatòria dels dossiers
de registre de medicaments veterinaris, així
com també pels productes biocides; d’altra,
objectius com ara l’estudi de l’impacte de
focus de contaminació concrets, tant sobre
els propis ecosistemes com sobre espècies
d’interès especial o sobre les poblacions
humanes, l’avaluació ecotoxicològica
de productes amb potencials efectes
mediambientals, la caracterització
d’espècies sentinella i de biomarcadors
novedosos, la modelització en l’avaluació
del risc, etc., són d’un gran interès científic
i social.
D’altra banda, la recerca toxicològica
representa (i ha de representar encara més
en el pròxim futur) una aportació cabdal
al desenvolupament d’eines terapèutiques
més segures; al mateix temps que ha de
permetre el disseny de metodologies
éticament més vàlides i socialment més
acceptables.
La Unitat es planteja aquests objectius
d’una forma realista i, per tant, modular,
implementant en una primera fase aquells
assaigs que estan al nostre abast immediat
en funció de la tecnologia i el know how
disponible, i ampliant progressivament
aquesta oferta segons les necessitats que es
detectin.
Unitat de Toxicologia Experimental
i Ecotoxicologia (UTOX-PCB)
3

De manera immediata, per tant, les activats
a desenvolupar s’estructuren seguint quatre
línies principals:
n Screening toxicològic de molècules
bioactives
n Toxicologia general
n Toxicologia Ambiental i Ecotoxicologia
n Control sanitari d’animals
d’experimentació
Infraestructura
i instrumentació científica
La Unitat compta amb unes instal·lacions
de 75 m 2 , totalment equipades per a la
realització de les tècniques que s’ofereixen.
L’equipament inclou, entre d’altre material:
n Processador automàtic de teixits Leica
TP 1020
n Unitat formadora de blocs Leica
EG1140H
n Tenyidor automàtic Varistain 24-4K,
Thermo Shandon
n Micròtom Leica RM 2145
n Bany per a histologia Leica HI 1210
n Microscopi Nikon E400
n Microscopi Nikon E200
n Microscopi estereoscòpic Nikon SMZ
645
n Espectrefotòmetre UV 1240, Shimadzu
n Termociclador en gradient PTC 200, MJ-
Research
n Incubador Prebatem 80l, Selecta
n Centrífuga Allegra 21, Beckman Coulter
Dotació de personal
UTOX-PCB compta amb tres persones com
a personal propi (a més de la col·laboració,
en diversos projectes, amb el personal de
la Unitat de Toxicologia de Farmàcia, amb
el Grup de Recerca Consolidat en Biologia
dels Vertebrats i amb l’equip del Dr. Serra-
Cobo, entre d’altres).
Personal propi:
n Miquel Borràs, Doctor en Ciències
Biològiques, Cap de la Unitat
n Joaquín de Lapuente, Llicenciat en
Ciències Biològiques, Investigador
n Roser Cruz, Diplomada Universitària en
Infermeria, Supervisora de la Unitat.
Unitat de Toxicologia Experimental
i Ecotoxicologia (UTOX-PCB)
4

2. «Screening» toxicològic de molècules bioactives
Toxicologia de «screening»
El concepte actual de drug discovery ha
introduït nous aspectes en la problemàtica
relacionada amb la gestació i el
desenvolupament de fàrmacs. Les noves
tecnologies han multiplicat la capacitat
per a generar un nombre inicialment força
elevat de molècules, que constitueixen el
fons a partir del qual cal triar, en darrera
instància, les candidates per a la fase de
desenvolupament.
Com a conseqüència, la fase de screening
ha adquirit una especial rellevància, tant
des d’un punt de vista quantitatiu com
també qualitatiu. En efecte, disposar de
mètodes de selecció ràpids, econòmics i
fiables pot marcar una diferència decisiva.
Mentre que en la fase de desenvolupament
els assaigs a realitzar estan perfectament
definits en les normatives internacionals
(en les quals, a més, es detallen
estrictament els protocols que cal emprar),
l’etapa de triatge es caracteritza per una
major flexibilitat, que obre les portes a la
introducció de metodologies innovadores.
Aquestes, si aconsegueixen disminuir el
temps i els costos tot conservant el nivell
de confiança, poden constituir una eina
extremament valuosa.
Les particulars característiques d’aquesta
etapa aconsellen, a més, evitar la
utilització d’assaigs in vivo efectuats en
les espècies de laboratori convencionals,
degut, en primer lloc, a l’exigua quantitat
de cada producte de la que es disposa;
d’altra banda, encara que els limitéssim
a fases més avançades i amb un nombre
menor de molècules, aquests exigirien el
sacrifici d’un nombre elevat d’animals,
poc recomanable des del punt de vista
del temps i dels costos, i èticament
inadmissible.
Per tant, la implementació de procediments
basats en les relacions (quantitatives)
estructura-activitat ((Q)SARs), en
metodologies in vitro o ex vivo, o en
Unitat de Toxicologia Experimental
i Ecotoxicologia (UTOX-PCB)
5

l’ús d’espècies alternatives, resulta
especialment apropiat, tant des del punt
de vista de la filosofia de les 3R’s com del
més estrictament pràctic.
Això es fa especialment possible en la
fase de screening degut al seu caràcter
intern i no normatiu. La incorporació
d’innovacions a les normes internacionals
és, per contra, un procés complex i lent; per
posar només un exemple, les objeccions al
test de la DL 50 expressades per Zbinden i
Flury-Roversy en els primers anys 70 del
segle passat, i recolzades posteriorment
per la majoria dels professionals implicats,
només s’han reflectit a la legislació, i
encara de manera parcial, l’any 2001.
En un cert sentit, i permetent-nos la
llibertar d’utilitzar un símil esportiu,
podríem dir que la fase de screening és
al desenvolupament preclínic el que la
fórmula 1 és a l’automobilisme comercial:
un escenari obert, en el que es poden
desenvolupar propostes de futur i en el
que, si no es descuida en cap moment
la seguretat, la innovació no només és
permissible sinó que, fins i tot, pot ajudar
decisivament a guanyar la cursa.
La UTOX-PCB considera la col·laboració
amb les empreses en aquesta etapa com
un dels seus objectius prioritaris i té el
propòsit d’avançar, a mig termini, en el
disseny d’una estratègia integral, amb
una fase prèvia basada en l’aplicació
personalitzada de la toxicologia in silico,
seguida d’una primera basada en tests en
microplaca i una prova de clastogenicitat
in vitro, una segona que combini l’ús
de micro-arrays microbiològics amb un
nombre reduït d’assaigs que cobreixin
punts clau de l’avaluació toxicològica,
com la genotoxicitat o la toxicologia de
la reproducció, i potser una tercera, ja
restringida a un petit grup de candidats,
que introdueixi versions simplificades
dels tests in vivo propis de la fase de
desenvolupament.
En aquest terreny treballarem en estreta
col·laboració amb la Unitat de Toxicologia
de la Facultat de Farmàcia, que disposa
de la capacitat i l’experiència necessàries
per a desenvolupar els aspectes relacionats
amb la toxicologia in silico i amb diverses
tècniques in vitro.
Algunes d’aquestes proves les estem posant
actualment a punt, validant o estudiantne
diverses adaptacions. D’altres són ja
operatives.
Un primer esquema d’aquesta estratègia es
resumeix a la figura:
Comentarem amb més detall cada un
d’aquests passos.
Unitat de Toxicologia Experimental
i Ecotoxicologia (UTOX-PCB)
6

Toxicologia «in silico»
La utilització de sistemes experts
suportats en tecnologia informàtica permet
efectuar prediccions del potencial tòxic
a partir d’una base de dades que recull
descriptors moleculars (principalment,
topològics) i resultats toxicològics d’una
amplia i diversa mostra de substàncies i
d’uns algorismes optimitzats per tal de
relacionar-los.
Existeixen diversos programes disponibles
en el mercat (TOPKAT, MULTICASE,
DEREK, ...), la majoria del quals permeten
un cert grau de personalització, tan pel
que fa a l’ampliació de la base de dades
com a l’adaptació dels algorismes. Aquests
programes es poden aplicar per fer un
primer screening toxicològic sobre una
biblioteca virtual, abans de procedir a
la síntesi combinatòria. Això permetrà
descartar d’entrada determinats tipus
d’estructures. Evidentment, també es
podrien aplicar a posteriori per la selecció
d’estructures d’una biblioteca real.
La capacitat predictiva del mètodes in
silico es major quan més solapament
de característiques estructurals hi hagi
entre les substàncies que constitueixen
el training set i les substàncies que són
objecte de la predicció. Això pot fer
interessant desenvolupar una segona fase
de screening in silico personalitzat: a partir
de les dades de toxicitat experimental (amb
mètodes in vitro, comentats posteriorment)
obtingudes en una mostra de substàncies
acuradament seleccionada de la biblioteca
real, es poden desenvolupar (Q)SAR
específiques per aquesta biblioteca.
L’èxit dels algorismes de predicció
de la toxicitat in silico ha propiciat el
desenvolupament de programes per a la
predicció de la farmacocinètica (ADME)
que permetin anar més enllà de les regles
de Lipinski. Aquest tipus de software
també es podria aplicar en la fase de
screening virtual per a eliminar les
estructures amb pitjors característiques
cinètiques.
Toxicologia «in vitro» (Fase 1)
El primer triatge pensem que caldria
efectuar-lo emprant tests escollits segons
quatre criteris:
n rapidesa
n economia
n despesa mínima del producte
n cobrir diferents aspectes de la toxicitat.
Resulten especialment indicats els tests
efectuats en microplaques, entre els quals
un assaig de citotoxicitat ens pot donar una
idea global dels efectes tòxics (equivalent,
d’alguna manera, a la toxicitat aguda); un
test d’expressió gènica en bacteris permet
comprovar l’activació d’un ventall ampli
de mecanismes directament implicats
Unitat de Toxicologia Experimental
i Ecotoxicologia (UTOX-PCB)
7

en la toxicitat (des de les proteïnes HSP
–o proteïnes de stress– fins a enzims de
destoxicació); també resulta d’interès una
prova realitzada igualment en microplaques
que mesura l’activació de la resposta SOS,
és a dir, realitza una estimació indirecta
de l’efecte genotòxic, amb l’avantatge
addicional de que la diana testada no és
un sol locus, com és el cas en els assaigs
basats en el test d’Ames, sinó la totalitat
del genoma.
Creiem interessant incloure també un
test directe de genotoxicitat, forçosament
molt senzill. Una bona opció és l’el·lució
alcalina del DNA, que detecta l’efecte
clastogènic. Actualment intentem posar a
punt una alternativa basada en el mateix
rationale, però utilitzant com a tècnica de
separació l’electroforesi en gel d’agarosa.
Toxicologia «in vitro» (Fase 2)
Per a la fase 2, ja amb un nombre de
molècules molt més reduït, proposem
proves en cultius cel·lulars i en embrions
d’anur. Aquestes darreres, des d’un punt
de vista legal, es consideren també in vitro
(embrions de vertebrats no mamífers).
Com a avaluació de la toxicitat sistèmica
proposem el test de proliferació en cèl·lules
d’ovari d’hàmster xinès (CHO). Aquest
test utilitza com a endpoint una corba
dosi/resposta obtinguda confrontant les
taxes de creixement relatiu i les diverses
concentracions testades del producte,
durant una setmana.
L’avaluació de l’hepatotoxicitat s’abordarà
mitjançant un test de formació de colònies
en cultius de cèl·lules d’hepatoma
(humanes o de rosegador).
La nefrotoxicitat resulta més difícil
d’estimar en cultius cel·lulars. Proposem
un test d’incorporació de metil-glucosa
en cèl·lules aïllades dels túbuls proximals.
Aquesta tècnica, tot i estar encara en
fase de validació i ser de realització més
delicada, resulta molt prometedora.
L’altra proposta consisteix en combinar
una prova de teratogènia amb una de
genotoxicitat, reduint així el temps i la
despesa de producte, i amb el valor afegit,
pel que fa a la interpretació de conjunt,
d’haver realitzat ambdós tests en els
mateixos individus.
Ens referim al test de teratogènia en
embrions de Xenopus laevis (FETAX),
realitzat en una versió lleugerament
abreujada, i a l’electroforesi de cèl·lules
individuals en gels d’agarosa (SCGE o
Comet Test) realitzat en homogenats dels
mateixos embrions al finalitzar l’assaig.
El Comet Test és una tècnica de gran
eficiència i sensibilitat per a la detecció de
clastògens; combinada amb l’ús de diversos
enzims, pot servir per a identificar altres
tipus d’efectes genotòxics.
Toxicologia «in vivo» (Fase 3)
Com a darrer pas abans de la fase de
desenvolupament, es poden realitzar, si
es creu convenient en cada cas concret,
assaigs abreujats de toxicitat aguda,
toxicitat subaguda i Test dels Micronuclis
en ratolins.
Per descomptat, i si fos necessari en algun
cas concret, per aquesta fase podríem
dissenyar qualsevol tipus d’estudi in vivo
personalitzat.
Unitat de Toxicologia Experimental
i Ecotoxicologia (UTOX-PCB)
8

3. Toxicologia general
En diversos contextos pot resultar
necessària la realització d’estudis
toxicològics especials, o especialment
adaptats a les circumstàncies concretes.
Això resulta aplicable a situacions
típicament no normatives, en les que
es pretén temptejar la viabilitat d’un
candidat, en el camp de la terapèutica, de
la cosmètica o d’altres, abans d’iniciar un
desenvolupament regular, o bé en estudis
d’altres característiques (toxicitat en sòls,
etc.).
A banda d’aquestes consideracions,
però, els assaigs es poden realitzar,
a conveniència, d’acord amb els
corresponents protocols normalitzats, i a
l’empara del Sistema de Qualitat del PCB.
En aquesta línia s’inclouen:
n Tests reduïts de toxicitat aguda, subaguda
o subcrònica, adaptats a les necessitats
de l’usuari, incloent hematologia,
bioquímica sèrica i histopatologia
n Tolerància local dèrmica, ocular,
en mucosa oral, vaginal o rectal,
intramuscular i intravenosa, en diverses
espècies
n Estudi histopatològic (confecció de
les preparacions i diagnòstic), en un
context de toxicologia experimental, de
toxicologia ambiental o bé de control
sanitari
n Tests de genotoxicitat in vivo (Tests
dels Micronuclis, en sang circulant o
en medul·la òssia, i Electroforesi en
Gel de Cèl·lules individuals (SCGE o
Comet Test), en limfòcits, en teixits o en
celomòcits de lumbrícids
n Proves de letalitat i de reproducció en
lumbrícids (Eisenia foetida i espècies
autòctones)
La genotoxicitat ha estat objecte d’una
atenció extraordinària, especialment durant
la dècada dels vuitanta, degut a l’interès
prioritari de la indústria farmacèutica
per trobar un substitut a les proves de
carcinogènesi a terme de vida, molt
oneroses. Aquest interès és la causa de
que es desenvolupessin en aquells anys
més d’un centenar de tècniques per a
l’avaluació de l’efecte mutagènic.
Unitat de Toxicologia Experimental
i Ecotoxicologia (UTOX-PCB)
9

Si alguna cosa va quedar clarament
establerta durant aquell període inicial
va ser la impossibilitat d’abastar tots
els eventuals mecanismes d’acció amb
una sola tècnica d’anàlisi i, per tant,
l’obligatorietat de l’ús de bateries de tests.
D’entre les tècniques que han passat el
sedàs de la pràctica destaca el test dels
micronuclis (MNT) (Schmid, 1973; von
Ledebur i Schmid, 1973; Borràs, 1986;
Ashby et al., 1990; Tucker i Preston, 1996).
Aquesta tècnica és capaç de detectar,
amb un nivell de sensibilitat, de fiabilitat
i d’esforç raonables, els compostos
clastògens, és a dir, que produeixen
fragmentació de l’ADN, així com també
els denominats tòxics del fus acromàtic
(spindle poisons), que impedeixen la
correcta separació de les cromàtides.
L’assaig in vivo es realitza generalment
en eritròcits. Aquestes cèl·lules, en la
majoria dels mamífers (amb l’excepció dels
camèlids), sofreixen en las fases finals del
seu procés de maduració una extrusió del
nucli. Ara bé, els fragments procedents de
l’activitat clastogènica o d’una separació
parcialment incorrecta de les cromàtides
s’agrupen en cossos esfèrics de mida petita
que no són expulsats. Aquests cossos,
que es produeixen espontàniament en
una proporció inferior al tres per mil, són
denominats, en condicions fisiològiques,
corpuscles de Howell-Jolly. Quan, per
l’acció d’un mutàgen, aquests cossos
excedeixen significativament de les xifres
considerades normals, constitueixen els
micronuclis, el percentatge dels quals a
la preparació es considera proporcional al
potencial mutagènic del compost.
També és possible realitzar el Test dels
Micronuclis in vitro. En aquest cas, la
incubació del cultiu amb citocalasina B,
que impedeix la separació de les cèl·lules
filles a la telofase, permet l’observació de
micronuclis sense que es requereixi un
procés d’extrusió nuclear.
Més recentment, ha començat a perfilar-se
com una alternativa plena de possibilitats
l’electroforesi de cèl·lules individuals en
gels d’agarosa (SCGE) (McKelvey-Martin
et al, 1993; Fairbain et al., 1995; Ross et
al., 1995; Hooghe et al., 1995, Collins
et al., 1997; Delgado et al., 2000), més
conegut com Comet test degut a l’especial
morfologia de les figures observades, que
recorda la forma d’un cometa.
Unitat de Toxicologia Experimental
i Ecotoxicologia (UTOX-PCB)
10

Aquesta prova consisteix en sotmetre una
suspensió cel·lular de puresa i concentració
adequades, procedent d’animals exposats
al tòxic i englobada en un gel d’agarosa
aplicat sobre un portaobjectes, a una lisi
alcalina, a un tractament per a desenrotllar
l’ADN i a una migració electroforètica
de curta durada. L’ADN tenyit amb un
fluorocrom apropiat és observat mitjançant
un microscopi de fluorescència. El
material genètic no danyat, agrupat en
l’anomenat nucleoid, de forma esfèrica, no
migra; en canvi, en cas d’haver-se produït
fragmentació del mateix, els fragments més
petits migraran una determinada distància,
inversament proporcional a la seva mida,
produint una imatge similar a la cua
d’un cometa. La classificació d’aquestes
figures segons una escala semi-quantitativa
prèviament establerta és una forma senzilla
de quantificació (s’en utilitzen d’altres
més sofisticades, que requereixen l’anàlisi,
mitjançant un programa informàtic
adequat, de les imatges digitalitzades)
que es correlaciona amb el grau de
genotoxicitat del compost estudiat.
Els avantatges d’aquesta tècnica són
evidents: per una banda, al no ser necessari
comptar amb un procés d’extrusió nuclear,
és possible utilitzar in vivo qualsevol tipus
cel·lular, permetent d’aquesta manera
expandir el camp de l’experimentació i,
si s’escau, afinar en gran manera en la
identificació de les cèl·lules diana del
tòxic estudiat; d’altra banda, se obvien en
gran mesura alguns dels inconvenients del
MNT, al mateix temps que es guanya en
sensibilitat.
Referències
ASHBY, J, TINWELL, H, GULATI, D, HEDDLE,
JA, 1990
Overview on the study in relation to protocol design
for the rodent bone-marrow micronucleus test.
Mutation Research, 234(3-4):233-248
BORRÀS, M, 1986
Formol-saline as a cell conserving medium in the
micronucleus test. Stain Technology, 57(4):59-60
COLLINS, AR, DOBSON, VL, DUSINSKÁ, M,
KENNEDY, G, STETINA, R, 1997
The comet assay: what can it really tell us?.
Mutation Research, 375:183-193
DELGADO E, BORRÀS M, NADAL J, 2000
Genotoxic assessment of urban dumping sites:
Comet Test in wood mouse circulating lymphocytes.
Toxicology Letters, 116suppl.1:91
FAIRBAIRN, DW, OLIVE, PL, O’NEILL, KL, 1995
The comet assay: a comprehensive review.
Mutation Research, 339:35-79
MCKELVEY-MARTIN, VJ, GREEN, MHL,
SCHMEZER, P, POOL-ZOBEL, BL, DE MEO, MP,
COLLINS, A, 1993
The single cell gel electrophoresis assay (comet
assay): a European review. Mutation Research,
288:47-63
ROSS, GM, MCMILLAN, TJ, WILCOX, P,
COLLINS, AR, 1995
The single cell microgel electrophoresis assay
(comet assay): technical aspects and applications.
Report on the 5th LH Gray Trust Workshop,
Institute of Cancer Research, 1994.
Mutation Research, 337:57-60
SCHMID, W, 1973
Chemical mutagen testing on in vivo somatic
mammalian cells. Agents and Actions, 3(2):77-85
TUCKER, JD, PRESTON, RJ, 1996
Chromosome aberrations, micronuclei, aneuploidy,
sister chromatid exchanges and cancer risk
assessment. Mutation Research, 365:147-159
VON LEDEBUR, M, SCHMID, W, 1973
The micronucleus test: methodological aspects.
Mutation Research, 19:109-117
Unitat de Toxicologia Experimental
i Ecotoxicologia (UTOX-PCB)
11

4. Toxicologia ambiental i Ecotoxicologia
Estudis de camp
L’home posseeix la capacitat d’incidir en
la natura d’una manera significativament
superior, qualitativament i quantitativa,
a la de qualsevulla altra espècie.
L’impacte de l’activitat antropogènica
sobre les comunitats naturals ha crescut
exponencialment en correlació estreta amb
l’increment de la capacitat tecnològica.
En les darreres dècades, una part de la
humanitat ha pres consciència dels perills
i de les responsabilitats derivades d’aquest
potencial transformador.
Actualment, en els països desenvolupats,
es consideraria impensable la realització
d’una gran infrastructura, o d’una actuació
urbanitzadora, sense portar prèviament
a terme un estudi de l’impacte ecològic
previsible.
Però no es pot deixar de banda un altre
aspecte, extremament significatiu, de la
incidència humana sobre el medi ambient:
la introducció en aquest de compostos
aliens, a través de molt diverses vies, des de
la producció de fums per les instal·lacions
industrials o pels mitjans de transport fins a
la generació de deixalles d’origen industrial
o domèstic, passant per l’aplicació de
biocides en les labors agrícoles, entre
d’altres. En concret, l’extraordinari impuls
experimentat per la indústria química en
la segona meitat del segle XX ha suposat
l’aparició en el medi natural de diversos
milers de productes nous cada any, un
elevat percentatge dels quals presenta
efectes biològics significatius.
La presència de xenobiòtics biològicament
actius i difícilment degradables a l’ambient
representa un grau de stress freqüentment
inacceptable per als organismes vius, que té
la seva traducció a nivell de les poblacions
i dels ecosistemes. L’activitat tòxica,
bé sigui directament o indirectament, a
través de la interferència amb l’equilibri
de les comunitats naturals, pot arribar
a representar fins i tot, en determinades
circumstàncies, un risc rellevant per a les
poblacions humanes.
Ara bé, l’avaluació dels risc,
ecològic o sanitari, requereix anàlisis
multidisciplinars, com les que du a terme
la UTOX-PCB, que determinin l’impacte
ambiental i vagin més enllà d’una simple
detecció i quantificació (d’altra banda
molt necessàries) dels tòxics ambientals
mitjançant l’anàlisi química.
La pregunta que la societat formula a les
autoritats reguladores i gestores, i, en
darrera instància, a la comunitat científica,
no es pot respondre únicament amb unes
xifres de nivells de contaminació. El que la
societat desitja i necessita saber, admès el
fet de que la contaminació zero pot resultar,
Unitat de Toxicologia Experimental
i Ecotoxicologia (UTOX-PCB)
12

sovint, inabastable, és en quin punt es situa
el grau màxim permissible d’exposició
sense risc, o, fent encara un pas més enllà,
quin és, en una situació determinada, el
balanç risc/benefici de l’exposició realment
existent.
Per aquesta raó s’ha fet evident, en
els darrers anys, l’absoluta necessitat
d’acudir als paràmetres biològics per tal
de monitoritzar la pol·lució, de determinar
el seu potencial tòxic i, en definitiva,
avaluar-ne el risc. Aquest és el camp de la
Toxicologia Ambiental (efectes sobre els
individus) i de l’Ecotoxicologia (efectes a
nivell de poblacions i ecosistemes).
Només així s’aconsegueix prendre en
consideració, degudament, els mecanismes
homeostàtics ambientals, que són
capaços de modular la biodisponibilitat
i la toxicitat dels xenobiòtics, i els
dels propis organismes (capacitat
d’emmagatzemament, de metabolització
destoxicadora o, eventualment, activadora,
i d’excreció).
En aquest sentit, els organismes vius, i en
especial els animals per la seva capacitat
de desplaçar-se en el biòtop, actuen com
a prospectors i integradors d’informació,
tant en l’eix espacial com en el temporal,
constituint-se en indispensables sentinelles
dels efectes causats per la pol·lució.
És necessari també, no obstant, prendre
en consideració les condicions del
suport abiòtic (edafologia, climatologia,
característiques físiques i químiques de
les aigües, etc.), que constitueixen factors
moduladors, sovint de gran rellevància, de
la resposta tòxica.
L’avaluació de risc (risk assessment)
efectuada partint d’aquestes premises, en
ser més realista, ens permetrà d’establir una
base més sòlida per a la gestió del mateix
(risk management), és a dir, per a proposar
les mesures més adequades per tal de
prevenir-lo o limitar-lo.
Un altre aspecte a tenir en compte és que
l’activitat antròpica, bé sigui directament
per l’acció tòxica dels xenobiòtics, o bé
indirectament, a través de la influència
sobre els factors climàtics, pot incidir
en l’evolució i emergència de malalties
originades per agents infecciosos. Així per
exemple, les alteracions ambientals solen
tenir un fort impacte (immunodepressió)
sobre els organismes que actuen de vectors
o són reservoris d’aquests agents, i poden
contribuir a l’aparició de noves malalties en
una regió determinada o bé a l’emergència
de zoonosis que es consideraven
eradicades.
Unitat de Toxicologia Experimental
i Ecotoxicologia (UTOX-PCB)
13

Avaluació del risc
En Toxicologia es denomina risc a la
probabilitat de que un determinat potencial
tòxic (hazard) es concreti en un efecte
deleteri real.
El risc es calcula a partir d’una relació
matemàtica entre potencial tòxic i
exposició. La forma de càlcul més habitual
consisteix en un quocient entre l’exposició
prevista (predicted exposure concentration,
PEC), obtinguda a partir de l’anàlisi
directa de xenobiòtics en el medi, i la
dosi més alta que es preveu sense efectes
tòxics (predicted no-effect concentration,
PNEC), que és el valor més baix obtingut
en diverses proves de laboratori realitzades
amb cada xenobiòtic separadament, i en
espècies substitutes (Daphnia magna,
Scenedesmus subspicatus, Eisenia foetida,
peix zebra, etc.).
L’enfocament que nosaltres proposem
és molt diferent: pretenem considerar
la pol·lució com una barreja complexa,
sotmesa a interaccions entre els seus
elements (reaccions creuades) i a
la influència de factors climàtics i
edafològics, que, per obrar els seus
efectes, ha de penetrar en els organismes
i experimentar-hi determinades
transformacions metabòliques. Aquests
efectes els pretenem avaluar sobre les
poblacions naturals, en condicions de
camp. Aquest plantejament, per tant, es
basa en l’ús d’espècies sentinelles i dels
biomarcadors adients.
Anomenem «sentinella» a una espècie
ubiqua, abundant, relativament sedentària
i amb certa capacitat d’adaptació
(resistència) als xenobiòtics, que és capaç
de proporcionar-nos informació sobre
l’exposició o els efectes de la pol·lució,
actuant com a senyal d’alerta de la salut de
l’ecosistema.
OBJECTIUS
n Considerar la pol·lució com una barreja
complexa
n Prendre en consideració l’homeostasi
– del medi
– dels organismes
n Realisme (dades obtingudes in situ, càlculs
basats en efectes reals)
COMPARTIMENTS
n Medi aèri
– contaminació atmosfèrica
n Medi terrestre
– contaminació edàfica
n Medi aquàtic
– contaminació de rius i llacs
– contaminació marina
Unitat de Toxicologia Experimental
i Ecotoxicologia (UTOX-PCB)
14

n Medi terrestre
– aus
– rosegadors
– lumbrícids
– artròpodes
ORGANISMES SENTINELLES
n Medi aquàtic
– amfibis
– peixos
– mol·luscs
Caldrà escollir les espècies sentinella entre
els grups zoològics rellevants, en cada
cas, en funció del terreny i del tipus de
contaminació, i del o dels compartiments
mediambientals que vulguem estudiar.
S’anomenen biomarcadors els diversos
indicadors (en uns casos destructius,
en d’altres, evidentment els més útils,
no invasius) de que disposem per tal de
mesurar els nivells reals de tòxics a que es
veuen exposats els organismes, per mesurar
els efectes que aquesta exposició produeix,
i també les possibles diferències, inter o
intra-específiques, en la resposta.
Avaluació del potencial tòxic
(«hazard assessment»)
A diferència del que passa en el camp
de la Farmacotoxicologia, en el que les
normatives ja establertes des de fa temps
per les institucions representatives de
les diferents regions geopolítiques (la
Food and Drug Administration (FDA) als
Estats Units d’Amèrica, l’Organització
per al Comerç i el Desenvolupament a
Europa (OCDE) i l’Agència Europea
del Medicament, a la Unió Europea, i
el Ministeri d’Indústria al Japó) s’han
unificat recentment en les normatives de la
International Conference for armonization
(ICH), pel que fa a l’Ecotoxicologia la
situació és molt més laxa.
Si bé algunes tècniques de laboratori
estan degudament protocolitzades, no
existeix una estratègia oficial i generalment
acceptada per a l’estudi de l’efecte tòxic
dels xenobiòtics ambientals. Cada grup
de recerca o cada centre ha d’establir
l’estratègia general i el ventall de tècniques
que consideri més adient per a l’estudi de
la realitat concreta que pretén analitzar.
En qualsevol cas ens sembla important
arribar a la caracterització de l’efecte tòxic
global mitjançant una aproximació de
tipus polinomial, que contempli la suma
ponderada dels efectes sobre els diversos
sistemes o funcions.
Per la nostra banda, i com a conclusió
dels treballs que hem vingut realitzant
durant els darrers quinze anys, proposem
una determinada bateria d’espècies i de
biomarcadors que es resumeixen en la taula
següent:
A partir del sumatori ponderat dels diversos
paràmetres indicats obtindrem un valor
representatiu de la severitat i de l’extensió
de l’efecte tòxic produït, que anomenem
Efecte Tòxic Integrat (ETI).
Unitat de Toxicologia Experimental
i Ecotoxicologia (UTOX-PCB)
15

S’ha de ressaltar que l’estratègia proposada
avalua la toxicitat a partir del dany real
causat en situacions concretes, per comptes
d’extrapolar a partir de les dades de
laboratori.
Exposició
Les mesures d’exposició, en funció dels
criteris ja exposats, s’hauran de basar en
marcadors de dosi interna, és a dir, que
tinguin en compte la biodisponibilitat,
combinats, si s’escau, amb l’anàlisi de
contaminats en el medi abiòtic.
En determinats casos, el grau d’exposició
serà, senzillament, inversament
proporcional a la distància al focus de
contaminació, seguint els criteris marcats
per els mecanismes de disseminació que
actuïn en la localització estudiada.
La proposta per als diferents compartiments
es detalla en el quadre següent:
EXPOSICIÓ
n Pol·lució atmosfèrica: gasos d’immissió {}
metalls en vísceres o faneres
n Pol·lució edàfica: segons els casos, metalls
en vísceres o faneres, PCB’s en greix, distància
al focus (segons mecanismes de disseminació
locals)
n Pol·lució aquàtica: anàlisi de l’aigua {} metalls
en múscul, molècules orgàniques en greix
hepàtic o muscular (segons espècies)
Càlcul del risc
Finalment, l’avaluació quantitativa del risc
es farà mitjançant l’establiment d’una recta
o corba de regressió entre l’ETI i els valors
d’exposició en diversos punts (equivalent
a la corba dosi/efecte; per a models
saturables, per exemple, la regressió
hiperbòlica-rectangular pot resultar més
apropiada).
Es requerirà l’estudi de l’ETI en tres o
quatre localitzacions amb diferents valors
d’exposició.
Els valors prospectius per a noves
localitzacions s’obtindran per interpolació.
Si es considera convenient, els parells
exposició/ETI obtinguts es podran
assimilar a una escala convencional de risc,
per exemple de 0 a 10.
n Efecte tòxic: ETI
AVALUACIÓ DEL RISC
n Exposició: biomarcardor de dosi interna
n Risc: regressió ETI vs exposició, interpolació,
assimilació a escala de risc
Aspectes ecològics.
Diagrames de flux
Complementàriament a l’estudi dels
efectes toxicològics sensu stricto, és
necessari realitzar-ne d’altres d’àmbit més
Unitat de Toxicologia Experimental
i Ecotoxicologia (UTOX-PCB)
16

integral i multidisciplinars, que tinguin en
compte tant les característiques del propi
agent contaminant com les dels sistemes
naturals contaminats, tant pel que fa als
seus components biòtics com als abiòtics.
En aquest sentit, la UTOX-PCB realitza
estudis integrals que analitzen els diversos
aspectes de la disseminació i/o deposició
dels tòxiccs, les seves interaccions, el seu
comportament i destí al llarg de les cadenes
tròfiques, els efectes sobre la conducta i
la dinàmica de les espècies d’éssers vius
afectades, etc. En definitiva, els estudis
realitzats per la nostra Unitat incorporen
anàlisis ecològiques.
En aquest aspecte, resulta de gran utilitat
la confecció de diagrames de flux, en
les que es representa tot aquest entrellat
d’interrelacions. A l’esquema de la pàgina
següent es mostra com a exemple el
diagrama obtingut a partir dels resultats del
nostre estudi de la central tèrmica de Cercs,
al Berguedà.
Organització de la Unitat
La UTOX-PCB està dirigida pel
Dr. Miquel Borràs. El seu grup ha realitzat
diversos estudis de les característiques
esmentades, al voltant de la central tèrmica
de Cercs, dels abocadors de Garraf,
Bellestar (Seu d’Urgell) i Els Hostalets de
Pieroles, etc.. També ha efectuat estudis
fora de Catalunya, com per exemple a
l’àrea de Mèxico DF.
Els estudis ecològics, de zoonosis i de
sanitat animal són duts a terme pel grup de
recerca dirigit pel Dr. Jordi Serra-Cobo.
A continuació presentem com a referència
algunes de les publicacions que se n’han
derivat.
Unitat de Toxicologia Experimental
i Ecotoxicologia (UTOX-PCB)
17

Referències
AMENGUAL, B. WHITBY, J.E., KING, A.,
SERRA-COBO, J. i BOURHY, H. 1997. Evolution
of European bat lyssaviruses. Journal of General
Virology, 78: 2319-2328.
BORRÀS, M., LLACUNA, S., GÓRRIZ, A.,
NADAL, J. Animals as prospectors and integrators
of information in environmental quality assessment.
a: Animal Research and Welfare: A Partnership,
Proceedings of the International Joint Meeting XII
ICLAS General Assembly & Conference and 7th
FELASA Symposium, 1999 pp. 225-229, 2001.
BORRÀS, M., LLACUNA, S., GÓRRIZ, A.,
NADAL, J. Hematological and biochemical
parameters in pollution-exposed mice. Archives of
Toxicology, suppl. 20, pp.189-195, 1998.
BORRÀS, M., LLACUNA, S., GÓRRIZ, A.,
NADAL, J. Histopathological study of respiratory
tract, liver and kidney in pollution-exposed mice
(abstract). Toxicology Letters, 109 (suppl.1):34, 64,
1999.
BORRÀS, M., LLACUNA, S., GÓRRIZ, A.,
SÁNCHEZ, A., SALGADO, J.M., NADAL, J.
Effects of a coal-fired power plant on element
contents in arthropods (abstract). Toxicology Letters,
95 (suppl. 1):234, 1998.
BROTONS, L., MAGRANS, M., FERRÚS, L.,
NADAL, J. Direct and indirect effects of pollution on
the foraging behaviour of forest passerines during the
breeding season. Canadian Journal of Zoology, 76:
556-565, 1998.
CACHO del,E., ESTRADA-PEÑA, A.,
SÁNCHEZ,A. i SERRA-COBO,J. 1994.
Histological response of Eptesicus serotinus
(Mammalia: Chiroptera) to Argas vespertilionis
(Acari: Argasidae). J. Wildlife Deases, 30(3): 340-
345.
DELGADO E, BORRÀS M, NADAL J. Genotoxic
assessment of urban dumping sites: Comet Test in
wood mouse circulating lymphocytes (abstract).
Toxicology Letters, 116suppl.1:91, 2000.
ESTEBAN, J.G., AMENGUAL, B. i SERRA-COBO
J. 2000. Composition and structure of helminth
communities in two populations of Pipistrellus
pipistrellus (Chiroptera: Vespertilionidae) from
Spain. Folia Parasitologica, 48: 143-148.
GÓMEZ, R, BORRÀS, M, RAMÍREZ-PULIDO, J,
NADAL, J. Estudio de la contaminación atmosférica
en el área de México DF: examen histopatológico
en Peromyscus maniculatus. (abstract). Revista de
Toxicología, 18(3):156.
GÓRRIZ A, LLACUNA S, DURFORT M, NADAL
J. A study of the ciliar tracheal epithelium on
passerine birds and small mammals subjected to air
pollution: ultrastructural study. Arch Environ Contam
Toxicol 27:137-142, 1994
GÓRRIZ A, LLACUNA S, RIERA M, NADAL
J. Effects of air pollution on hematological and
plasma parameters in Apodemus sylvaticus and Mus
musculus. Arch Environ Contam Toxicol 31:153-158,
1996.
LLACUNA S, GÓRRIZ A, DURFORT M, NADAL
J. Effects of air pollution on passerine birds and
small mammals. Arch Environ Contam Toxicol 24:
59-66, 1993.
LLACUNA S, GÓRRIZ A, RIERA M, NADAL J.
Arch Environ Contam Toxicol 31:148-152, 1996.
LLACUNA S, GÓRRIZ A, SANPERA C, NADAL
J. Metal accumulation in three species of Passerine
birds (Emberiza cia, Parus major and Turdus
merula). Arch Environ Contam Toxicol 28:298-303,
1995.
SALGADO JM, LLACUNA S, GÓRRIZ A,
BORRÀS M, NADAL J. Effects of a coal-fired
power plant on arthropod biodiversity. Toxicology
Letters, suppl 1/88, 95, 1996.
SALGADO, J., GÓRRIZ, A., LLACUNA,
S., BORRÀS, M., NADAL, J. Efectos de la
contaminación atmosférica procedente de las
emisiones de la central térmica de Cercs (Catalunya,
NE de España) sobre la biodiversidad de artrópodos.
Revista de la Sociedad Mexicana de Historia Natural,
Vol. XLVII, pp., 1997.
Unitat de Toxicologia Experimental
i Ecotoxicologia (UTOX-PCB)
18

SERRA-COBO J. LÓPEZ-ROIG M., MARQUÈS
BONET i MARTÍNEZ-RICA J.P. 2000. Body
condition changes of Miniopterus schreibersii in
autumn and winter. La Terre et la Vie, 55: 351-360.
SERRA-COBO J., AMENGUAL B., ABELLÁN
C. i BOURHY H. 2002. European Bat Lyssavirus
Infection in Spanish Bat Populations. Emerging
Infectious Deases, 8(4): 413-420.
SERRA-COBO, J., MARQUÈS, T. i MARTÍNEZ-
RICA, J.P. 2000. Ecological segregation between
Rana pyrenaica and Rana temporaria, and
differential predation of Euproctus asper on their
tadpoles. Netherland J. Zoology, 50(1): 65-73.
SERRA-COBO,J., BARBAULT,R. i ESTRADA-
PEÑA,A., 1993. Le gouffre de San Pedro de Los
Griegos (Oliete, Teruel, Espagne): un refuge de
biodiversité sans équivalent en Europe. Rev.Ecol. (La
Terre et la Vie), 48: 341-348, París.
SERRA-COBO,J., LACROIX,G. i WHITE, S.
1998. Comparison between the ecology of the new
European frog Rana pyrenaica and that of four
Pyrenean amphibians. Journal of Zoology, 246:
147-154.
SERRA-COBO,J., SANZ,V. i MATÍNEZ-RICA,J.P.
1998. Migratory movements of Miniopterus
schreibersii in the north-east of Spain. Acta
Theriologica, 43(3): 271-283.
Sotmès per a publicació:
BORRÀS, M., LLACUNA, S., GÓRRIZ, A.,
SÁNCHEZ-CHARDI, A., SALGADO, JM. AND
NADAL, J.
Deposition and mobilization. Direct and indirect
effects of a coal-fired power plant on metal contents
in arthropods, birds and mammals.
(Arch Environ Contam Toxicol)
Unitat de Toxicologia Experimental
i Ecotoxicologia (UTOX-PCB)
19

5. Control sanitari d’animals d’experimentació
La recomanació de la Federation of
European Laboratory Animal Science
Associations, FELASA, per al control
sanitari dels estabularis preveu l’anàlisi
bacteriològica, vírica, parasitològica
i histopatològica d’una mostra de
(com a mínim) 10 animals cada tres
mesos, encar que aquest nombre es pot
reduir si la unitat compta amb un grup
sentinella especialment exposat al risc de
contaminació (Lab Animals, 36:20-43,
2002).
Els agents patògens a descartar, per als
rosegadors, inclouen:
CONTROLS SANITARIS PERIÒDICS
n Parasitologia
– Ectoparàsits: àcars, artròpodes, dermatòfits
– Endoparàsits: helmints, protozous,
Encephalitozoon
n Bacteriologia
– Bordetella bronchiseptica
– Pasteurella multocida
– Corynebacterium kutscherii
– Salmonella sp
– Clostridium piliforme (Tyzzer)
– Helicobacter sp
– Mycoplasma pulmonis
n Serologia
– MHV
– Theiler (GDVII)
– Parvo NS1
– Reo 3
– Sendai
– PVM
– MVM
– EDIM
– Hantan
– Toolan H1
Els controls d’anatomia patològica han
d’incloure una necròpsia completa (amb
examen de pell, cavitat oral, glàndules
salivals (rata), sistema respiratori,
aorta (conill), cor, fetge, melsa, tracte
gastrointestinal, ronyons, suprarrenals,
tracte urogenital i nòduls limfàtics.
L’estudi histopatològic és recomanable,
si bé no imperatiu, que inclogui, a
més de les lesions macroscòpiques
trobades, tots els òrgans esmentats.
Normalment es limitarà a una tinció
topogràfica rutinària (hematoxilina/
eosina), si bé pot ser necessari fer recurs
a tècniques especialitzades per tal de
poder diagnosticar prou acuradament
determinades patologíes.
No és necessari insistir en la importància
que presenta l’adequat control dels
“reactius biològics” per a la qualitat de la
recerca i per a la homologació dels resultats
obtinguts, especialment si aquests han de
formar part d’estudis normalitzats.
Les recomanacions de FELASA s’han
d’entendre com el seu propi nom
Unitat de Toxicologia Experimental
i Ecotoxicologia (UTOX-PCB)
20

indica, és a dir, com un conjunt de
consells raonable, però dotat d’una certa
flexibilitat, de manera que aquelles unitats
d’experimentació animal que actualment
no realitzen cap tipus de control puguin
anar-se adaptant a aquesta dinàmica d’una
manera progressiva. En aquest sentit és
possible contemplar el disseny d’estratègies
analítiques de diferents nivells.
La UTOX-PCB ofereix la possibilitat
de centralitzar i gestionar aquests
procediments, partint dels animals vius.
Es realitzen in situ:
n Extracció de sang i separació i congelació
dels serums
n Necròpsia
n Histopatologia
n Anàlisi de presència/absència de
Mycoplasma pulmonis (PCR)
n Anàlisi de presència/absència
d’Helicobacter (PCR)
S’externalitza:
n Estudi de paràsits externs i interns
(preparació a la Unitat, diagnòstic
Universitat de Barcelona)
n Bacteriologia (Universitat de Barcelona)
n Anàlisi virus (serologia) (laboratori
privat)
Unitat de Toxicologia Experimental
i Ecotoxicologia (UTOX-PCB)
21