Dra. Laura Pujols Tarrés Hospital Clínic i Provincial
Dra. Laura Pujols Tarrés Hospital Clínic i Provincial Dra. Laura Pujols Tarrés Hospital Clínic i Provincial
l’acció de l’MG262, el qual estabilitzaria la CDK9. Els inhibidors de la CDK9 –DRB, H7 i flavopiridol– inhibeixen la fosforilació de la serina-2 dels heptapèptids del domini carboxiterminal de l’RNA polimerasa II. Aquesta fosforilació, en canvi, augmenta com a conseqüència de l’acció de l’MG262. 4. Caracterització d’una nova família d’isoformes truncades intracel·lulars del receptor VEGFR-1. El gen VEGFR-1 humà consta de 30 exons. Prèviament s’havia caracteritzat una isoforma amb els 30 exons que codifica el receptor transmembrana del VEGF anomenat VEGFR-1 i una forma soluble truncada extracel·lular derivada dels 13 primers exons amb una seqüència addicional derivada de l’intró 13 (sVEGFR-1). Aquest projecte ens ha permès caracteritzar cinc isoformes truncades intracel·lulars de l’VEGFR-1. L’anàlisi de les seqüències d’aquestes isoformes (dipositades al GenBank) mostra que codifiquen per proteïnes que han perdut els dominis extracel·lulars i posseeixen tots o una part dels dominis intracel·lulars. Les noves isoformes han estat designades: ti15VEGFR-1, ti15asVEGFR-1, ti18VEGFR-1, ti21VEGFR-1 i ti21asVEGFR-1. El prefix ti- indica “truncada intracel·lular”, i el nombre que segueix al prefix indica l’intró en el qual s’inicia el transcrit. Les isoformes ti15asVEGFR-1 i ti21asVEGFR-1 resulten de l’splicing alternatiu de les isoformes ti15 VEGFR-1 i ti21 VEGFR-1 respectivament. 5. Efecte de l’MG262 i dels glucocorticoides sobre l’expressió de la isoforma Ti21VEGFR-1 en fibroblasts. En fibroblasts obtinguts de pòlips nasals, l’MG262 suprimeix l’expressió de Ti21VEGFR-1 (figura 3). La Ti21VEGFR-1 és la isoforma truncada intracel·lular més abundant de VEGFR-1. La incubació dels fibroblasts amb DEX no afecta l’expressió de VEGFR-1. 8
Figura 3. Expressió de ti21Flt-1 en fibroblasts obtinguts d’un pòlip nasal (A) en comparació amb l’expressió d’actina (B). L’expressió per RT-PCR d’esquerra a dreta correspon a: 1) RNA de cèl·lules controls cultivades en DMEM amb 0,5% FBS, 2) RNA de cèl·lules tractades amb l’inhibidor reversible del proteasoma MG262 50 nM. 3) RNA de cèl·lules tractades amb DEX 1µM. 4) RNA de cèl·lules tractades amb MG262 i DEX a les concentracions indicades anteriorment. 6. Funció de les isoformes intracel·lulars de VEGFR-1. Per esbrinar la funció de les proteïnes VEGFR-1 hem realitzat experiments d’interferència amb oligonucleòtids localitzats als exons 18 (oligonucleòtid A), 21 (oligonucleòtid B), 25 (oligonucleòtid D), i 27 (oligonucleòtid C). L’oligonucleòtid A va interferir l’expressió de la isoforma ti15VEGFR-1. L’oligonucleòtid B va interferir l’expressió de les isoformes ti15VEGFR-1 i ti18VEGFR-1. Els oligonucleòtids C i D van interferir totes les isoformes. No obstant això, els resultats que vam obtenir utilitzant aquests oligonucleòtids (stealth siRNA d’Invitrogen) ens van suggerir la possibilitat d’estar observant falsos fenotips, a causa que els oligonucleòtids presentaven efectes fora de la diana. Per descartar aquesta possibilitat dels falsos fenotips, hem utilitzat un nou sistema d’interferència: Thermo Scientific Dharmacon on-target plus siRNA. Aquests nous oligonucleòtids presenten una modificació química que assegura una màxima especificitat. Els resultats de la interferència els vam analitzar determinant l’expressió de 384 gens 9
- Page 1 and 2: EFECTES DELS INHIBIDORS REVERSIBLES
- Page 3 and 4: controls i de pacients asmàtics (s
- Page 5 and 6: nasals. S’observa que la incubaci
- Page 7: Figura 2. Efecte de l’MG262 (A) i
- Page 11 and 12: funció del fibroblast suggereix qu
l’acció de l’MG262, el qual estabilitzaria la CDK9. Els inhibidors de la<br />
CDK9 –DRB, H7 i flavopiridol– inhibeixen la fosforilació de la serina-2<br />
dels heptapèptids del domini carboxiterminal de l’RNA polimerasa II.<br />
Aquesta fosforilació, en canvi, augmenta com a conseqüència de<br />
l’acció de l’MG262.<br />
4. Caracterització d’una nova família d’isoformes truncades<br />
intracel·lulars del receptor VEGFR-1.<br />
El gen VEGFR-1 humà consta de 30 exons. Prèviament s’havia<br />
caracteritzat una isoforma amb els 30 exons que codifica el receptor<br />
transmembrana del VEGF anomenat VEGFR-1 i una forma soluble<br />
truncada extracel·lular derivada dels 13 primers exons amb una<br />
seqüència addicional derivada de l’intró 13 (sVEGFR-1). Aquest<br />
projecte ens ha permès caracteritzar cinc isoformes truncades<br />
intracel·lulars de l’VEGFR-1. L’anàlisi de les seqüències d’aquestes<br />
isoformes (dipositades al GenBank) mostra que codifiquen per<br />
proteïnes que han perdut els dominis extracel·lulars i posseeixen tots<br />
o una part dels dominis intracel·lulars. Les noves isoformes han estat<br />
designades: ti15VEGFR-1, ti15asVEGFR-1, ti18VEGFR-1, ti21VEGFR-1 i<br />
ti21asVEGFR-1. El prefix ti- indica “truncada intracel·lular”, i el nombre<br />
que segueix al prefix indica l’intró en el qual s’inicia el transcrit. Les<br />
isoformes ti15asVEGFR-1 i ti21asVEGFR-1 resulten de l’splicing<br />
alternatiu de les isoformes ti15 VEGFR-1 i ti21 VEGFR-1<br />
respectivament.<br />
5. Efecte de l’MG262 i dels glucocorticoides sobre l’expressió<br />
de la isoforma Ti21VEGFR-1 en fibroblasts.<br />
En fibroblasts obtinguts de pòlips nasals, l’MG262 suprimeix<br />
l’expressió de Ti21VEGFR-1 (figura 3). La Ti21VEGFR-1 és la isoforma<br />
truncada intracel·lular més abundant de VEGFR-1. La incubació dels<br />
fibroblasts amb DEX no afecta l’expressió de VEGFR-1.<br />
8
Change language