Dra. Laura Pujols Tarrés Hospital Clínic i Provincial

EFECTES DELS INHIBIDORS REVERSIBLES DEL
PROTEASOMA SOBRE ELS MECANISMES IMPLICATS
EN LA INFLAMACIÓ I EL REMODELAT EN L’ASMA
Investigadors principals:
Dra. Laura Pujols i Tarrés
Hospital Clínic i Provincial de Barcelona
Dr. Cristóbal Mezquita Pla
Facultat de Medicina UB
Durada: 3 anys

1. Resum
L’asma és un malaltia inflamatòria crònica de la via respiratòria que
afecta fins a un 10% de la població dels països industrialitzats i que
es caracteritza per una hiperreactivitat i obstrucció de les vies aèries.
En aquest procés participen tant cèl·lules inflamatòries, com els
eosinòfils i els limfòcits Th2, com cèl·lules estructurals, com ara les
cèl·lules endotelials i els fibroblasts. Els glucocorticoides són els
agents antiinflamatoris més efectius per al tractament de l’asma.
D’altra banda, hi ha pacients, especialment els asmàtics greus, que
no responen al tractament. De fet, es pensa que el procés de
remodelat de les vies aèries que s’observa en els pacients asmàtics
respon poc al tractament amb glucocorticoides.
Els inhibidors reversibles del proteasoma són uns fàrmacs que
inhibeixen l’activitat del proteasoma de la cèl·lula, tot impedint la
degradació de múltiples proteïnes cel·lulars que són degradades
d’una manera natural per aquest complex cel·lular. Els inhibidors
reversibles del proteasoma actualment són emprats en el tractament
del mieloma múltiple. Hi ha proves en la bibliografia mèdica que
indiquen que, a més d’antiangiogènics, aquests fàrmacs podrien tenir
efectes antiinflamatoris i antifibròtics. No obstant això, els efectes
cel·lulars i moleculars dels inhibidors reversibles del proteasoma en
cèl·lules d’origen no cancerós són pràcticament desconeguts.
L’objectiu del nostre estudi fou determinar la capacitat de l’inhibidor
reversible del proteasoma MG262 de disminuir les respostes
inflamatòria i angiogènica de cèl·lules diana implicades en l’asma
crònica, així com examinar la capacitat d’MG262 d’augmentar els
efectes antiinflamatoris i antiangiogènics dels glucocorticoides. Com a
objectius concrets ens vam proposar d’investigar els efectes
antiinflamatoris i antifibròtics de l’MG262, comparant-lo amb els
glucocorticoides, en cultius cel·lulars de fibroblasts d’individus
2

controls i de pacients asmàtics (subprojecte 1), com també investigar
l’efecte antiangiogènic d’MG262 en cultius cel·lulars de fibroblasts i de
cèl·lules endotelials humanes (subprojecte 2).
2. Resultats
SUBPROJECTE 1
1. Efecte de l’MG262 sobre la proliferació, l’apoptosi i el cicle
cel·lular
La incubació de fibroblasts nasals amb MG262 (0,1-10.000 nM)
durant 24 hores produeix una disminució significativa i dosidependent
(p < 0,01) de la proliferació cel·lular, sense arribar a assolir el 50%
d’inhibició. Aquesta disminució és molt més marcada a les 48 i 72
hores d’incubació amb MG262 (p < 0,001 a cada temps), i es
produeix tant en fibroblasts d’individus controls (n= 8; IC50= 10,6 nM
a les 48 h) com en fibroblasts de pacients asmàtics (n= 8; IC50= 7,5
nM a les 48 h). L’administració de dexametasona (DEX) durant 3 i 5
dies provoca, en canvi, una disminució feble (25% als 5 dies) però
significativa de la proliferació cel·lular en els fibroblasts controls (n=
8; p < 0,001) però no en fibroblasts de pacients asmàtics (n= 8; ns).
La incubació de fibroblasts nasals amb MG262 (50 nM) durant 48 hr
produeix un augment de l’activitat caspasa-3. A les 24 hr d’MG262 no
s’observa activació de la caspasa-3 però sí una pèrdua del potencial
de la membrana mitocondrial, indicativa d’apoptosi primerenca. La
DEX, en canvi, no produeix activació de caspasa-3 en cap temps
analitzat.
La incubació de fibroblasts nasals amb MG262 (50 nM, 24 h, n= 6)
provoca una marcada disminució de les fases S (2%; p < 0,05) i
G2/M (4%; p < 0,05) i un augment de la fase G0/G1 (93%; p <
0,05) del cicle cel·lular, comparat amb les cèl·lules incubades amb
3

medi sol (S: 12%, G2/M: 21%, G0/G1: 61%). En concordança amb
aquests resultats, l’MG262 (10 nM, 24 h) inhibeix completament la
incorporació de timidina a l’ADN, tot provocant un aturada del cicle
cel·lular en la fase G0/G1. L’aturada de la progressió del cicle cel·lular
induït per MG262 es produeix per via acumulació de les proteïnes
supressores del cicle cel·lular p21 i p27.
Els efectes de la DEX sobre el cicle cel·lular són, en canvi, molt
menys marcats. Així, la DEX (1.000 nM, 3 dies, n= 6) provoca una
lleugera disminució de la fase G2/M (5%; p < 0,05), comparat amb
les cèl·lules incubades amb medi de cultiu (7%), sense provocar
canvis significatius en les fases G0/G1 i S del cicle cel·lular. Aquesta
lleu disminució de la proliferació cel·lular induïda per DEX no va
lligada a l’augment de p21 i p27.
2. Efecte de l’MG262 sobre l’expressió i la localització
subcel·lular d’RGα.
La incubació de fibroblasts nasals amb DEX (1.000 nM) durant 6, 12 i
24 hores produeix una disminució dependent de temps de l’expressió
de l’ARNm i la proteïna de l’RGα. En els mateixos temps, l’MG262 (50
nM) provoca una disminució de l’expressió de l’ARNm de l’RGα, sense
alterar significativament els nivells de la proteïna. La coincubació de
DEX i MG262 impedeix la regulació a la baixa de l’RGα induïda per la
DEX (figura 1).
Figura 1. Imatge representativa de l’efecte de la coincubació
d’MG262 i DEX (24 h) sobre l’expressió de l’RGα en fibroblasts
4

nasals. S’observa que la incubació amb DEX sola disminueix
l’expressió proteica de l’RGα i que l’addició de l’MG262 impedeix la
davallada de l’RGα induïda per la DEX. La imatge inferior mostra
l’expressió de la proteïna constitutiva β-actina, tot mostrant igual
càrrega proteica en tots els pous.
La incubació de fibroblasts nasals amb DEX (100 nM) indueix un
augment de la translocació de l’RGα al nucli cel·lular, essent màxim
als 60 minuts i mantenint-se al nucli durant tot el període
d’administració de DEX (180 minuts). La incubació amb MG262 sol
(500 nM, 3-6 h) provoca un augment de l’RGα al nucli cel·lular. La
coincubació amb DEX i MG262 sembla potenciar l’efecte de cadascun
per separat.
3. Efecte de l’MG262 sobre l’activació de l’NF-κB i l’expressió
de gens dependents d’NF-κB.
La incubació de fibroblasts nasals amb MG262 impedeix la
translocació al nucli induïda per TNFα o IL-1β de la subunitat p65 de
l’NF-κB i provoca l’acumulació de la forma fosforilada de l’inhibidor de
l’NF-κB, I-κBα.
L’MG262 (500 nM, 4 h) inhibeix en un 50% la producció d’IL-6 tant
en els fibroblasts d’individus controls com en els de pacients asmàtics
(n= 6; p < 0,05 per a cada grup). En el mateix temps d’incubació i
en els dos tipus cel·lulars, la DEX provoca una marcada inhibició
dosidependent de la producció d’IL-6 (p < 0,01 per a cada grup). La
inhibició de la producció d’IL-6 per part de la DEX (10 nM) fou
sensiblement superior en els fibroblasts d’individus controls (35% de
reducció; p < 0,05 comparat amb el medi) que en els fibroblasts de
pacients asmàtics (27% de reducció; ns comparat amb el medi). La
5

coincubació amb MG262 i DEX no produeix una potenciació de l’efecte
inhibitori que s’obté en incubar ambdós fàrmacs per separat.
4. Efecte de l’MG262 sobre l’expressió de gens dependents de
GRE.
La incubació de fibroblasts nasals amb DEX (1.000 nM, 18 h)
produeix un augment de l’expressió dels ARNm dels gens diana dels
glucocorticoides MTII (n= 9; p < 0,05) i MKP-1 (n= 5; p < 0,05) que
és el doble que el de les cèl·lules incubades amb medi sol. En
comparació amb les cèl·lules incubades amb DEX sola, la
coadministració d’MG262 sembla augmentar l’expressió de l’ARNm de
MKP-1.
5. Efecte de l’MG262 sobre la síntesi de col·lagen.
La incubació de fibroblasts nasals amb MG262 durant 24 h provoca
una disminució dosidependent de l’expressió dels ARNm dels
col·làgens 1α1, 1α2 i 3α1 tant en fibroblasts d’individus controls (n=
7; p < 0,01; figura 2A) com en fibroblasts de pacients asmàtics (n=
5; p < 0,01). En canvi, en el mateix temps d’incubació, la DEX no
inhibeix de manera significativa l’expressió dels ARNm dels col·làgens
1α1 (figura 2B), 1α2 i 3α1 en cap dels dos tipus cel·lulars. La
coincubació amb MG262 i DEX no potencia l’efecte de cadascun per
separat.
A
Col·lagen 1 ! Col·lagen 1 1 / gen const. (RPII)
! 1 / gen const. (RPII)
8
6
4
2
0
MG262 ( nM)
*
†
†
- + + +
-
1 5 10
TGF" (5 ng/ml) +
†
+
- 50
B
*
-
-
+ + + +
- 0,1 10 1.000
8
6
4
2
0
Col·lagen 1 ! Col·lagen 1 1 / gen const. (RPII)
! 1 / gen const. (RPII)
TGF " (5 ng/ml)
DEX (nM)
6

Figura 2. Efecte de l’MG262 (A) i la DEX (B) sobre l’expressió de
l’ARNm del col·lagen 1α1 induïda per TGFβ en fibroblasts de mucosa
nasal sana. Les cèl·lules s’incubaren amb TGFβ en absència o
presència d’MG262 o DEX durant 24 h. * p < 0,05 comparat amb el
medi de cultiu sol; † p < 0,05 comparat amb l’efecte del TGFβ sol.
SUBPROJECTE 2
1. Efectes de l’MG262 sobre l’expressió del receptor VEGFR-1
en fibroblasts, cèl·lules endotelials i macròfags humans.
Utilitzant l’anàlisi Northern, hem observat que l’inhibidor reversible
del proteasoma MG262 disminueix l’expressió del receptor VEGFR-1
en fibroblasts obtinguts de pòlips nasals, a més d’inhibir l’expressió
en cèl·lules endotelials microvasculars humanes i en macròfags
humans. Les principals isoformes afectades són la forma completa de
membrana i les truncades intracel·lulars.
2. Efectes de l’MG262 sobre l’expressió de VEGF en cèl·lules
endotelials i fibroblasts humans.
L’acció de l’inhibidor reversible del proteasoma MG262 sobre
l’expressió del VEGF depèn del tipus cel·lular: disminueix l’expressió
del VEGF en macròfags humans però l’augmenta en fibroblasts.
3. Efectes dels inhibidors de la CDK9 (DRB, H7 i flavopiridol)
sobre l’expressió del receptor VEGFR-1.
Els inhibidors de la CDK9 –DRB, H7 i flavopiridol– fan disminuir
l’expressió de la isoforma soluble del receptor VEGFR-1 i mantenen
l’expressió de la isoforma que codifica el receptor de membrana.
Aquest efecte és l’oposat al que s’observa com a conseqüència de
7

l’acció de l’MG262, el qual estabilitzaria la CDK9. Els inhibidors de la
CDK9 –DRB, H7 i flavopiridol– inhibeixen la fosforilació de la serina-2
dels heptapèptids del domini carboxiterminal de l’RNA polimerasa II.
Aquesta fosforilació, en canvi, augmenta com a conseqüència de
l’acció de l’MG262.
4. Caracterització d’una nova família d’isoformes truncades
intracel·lulars del receptor VEGFR-1.
El gen VEGFR-1 humà consta de 30 exons. Prèviament s’havia
caracteritzat una isoforma amb els 30 exons que codifica el receptor
transmembrana del VEGF anomenat VEGFR-1 i una forma soluble
truncada extracel·lular derivada dels 13 primers exons amb una
seqüència addicional derivada de l’intró 13 (sVEGFR-1). Aquest
projecte ens ha permès caracteritzar cinc isoformes truncades
intracel·lulars de l’VEGFR-1. L’anàlisi de les seqüències d’aquestes
isoformes (dipositades al GenBank) mostra que codifiquen per
proteïnes que han perdut els dominis extracel·lulars i posseeixen tots
o una part dels dominis intracel·lulars. Les noves isoformes han estat
designades: ti15VEGFR-1, ti15asVEGFR-1, ti18VEGFR-1, ti21VEGFR-1 i
ti21asVEGFR-1. El prefix ti- indica “truncada intracel·lular”, i el nombre
que segueix al prefix indica l’intró en el qual s’inicia el transcrit. Les
isoformes ti15asVEGFR-1 i ti21asVEGFR-1 resulten de l’splicing
alternatiu de les isoformes ti15 VEGFR-1 i ti21 VEGFR-1
respectivament.
5. Efecte de l’MG262 i dels glucocorticoides sobre l’expressió
de la isoforma Ti21VEGFR-1 en fibroblasts.
En fibroblasts obtinguts de pòlips nasals, l’MG262 suprimeix
l’expressió de Ti21VEGFR-1 (figura 3). La Ti21VEGFR-1 és la isoforma
truncada intracel·lular més abundant de VEGFR-1. La incubació dels
fibroblasts amb DEX no afecta l’expressió de VEGFR-1.
8

Figura 3. Expressió de ti21Flt-1 en fibroblasts obtinguts d’un pòlip
nasal (A) en comparació amb l’expressió d’actina (B). L’expressió per
RT-PCR d’esquerra a dreta correspon a: 1) RNA de cèl·lules controls
cultivades en DMEM amb 0,5% FBS, 2) RNA de cèl·lules tractades
amb l’inhibidor reversible del proteasoma MG262 50 nM. 3) RNA de
cèl·lules tractades amb DEX 1µM. 4) RNA de cèl·lules tractades amb
MG262 i DEX a les concentracions indicades anteriorment.
6. Funció de les isoformes intracel·lulars de VEGFR-1.
Per esbrinar la funció de les proteïnes VEGFR-1 hem realitzat
experiments d’interferència amb oligonucleòtids localitzats als exons
18 (oligonucleòtid A), 21 (oligonucleòtid B), 25 (oligonucleòtid D), i
27 (oligonucleòtid C). L’oligonucleòtid A va interferir l’expressió de la
isoforma ti15VEGFR-1. L’oligonucleòtid B va interferir l’expressió de
les isoformes ti15VEGFR-1 i ti18VEGFR-1. Els oligonucleòtids C i D van
interferir totes les isoformes. No obstant això, els resultats que vam
obtenir utilitzant aquests oligonucleòtids (stealth siRNA d’Invitrogen)
ens van suggerir la possibilitat d’estar observant falsos fenotips, a
causa que els oligonucleòtids presentaven efectes fora de la diana.
Per descartar aquesta possibilitat dels falsos fenotips, hem utilitzat un
nou sistema d’interferència: Thermo Scientific Dharmacon on-target
plus siRNA. Aquests nous oligonucleòtids presenten una modificació
química que assegura una màxima especificitat. Els resultats de la
interferència els vam analitzar determinant l’expressió de 384 gens
9

implicats en l’apoptosi i en la via de l’NF-kB. Els resultats indiquen
que les formes truncades intracel·lulars inhibeixen l’expressió de gens
proapoptòtics (BCL10, BIK, BNIP3, CASP1, CASP2, CASP6, CASP8,
CASP14, DEDD, FAS, RIPK1, TNFRSF21, TNFSF10) i estimulen
l’expressió de gens antiapoptòtics (BIRC3, DAPK1). A més a més, les
formes truncades intracel·lulars activen la via de l’NF-kB (CARD4,
CARD15, LTB, TNFRSF).
7. Caracterització d’una nova isoforma truncada extracel·lular
del VEGFR-1.
També hem caracteritzat una nova isoforma extracel·lular amb una
cua C-terminal poliserina. Aquesta isoforma ha estat identificada
recentment per altres laboratoris, que l’han relacionat amb la
capacitat de la musculatura llisa vascular d’inhibir l’acció
vasodilatadora del VEGF. Aquesta observació suggereix la possibilitat
d’una acció semblant en la musculatura bronquial, que podria ser
important en la patogènia de l’asma bronquial i que serà objecte
d’investigació en un nou projecte.
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques dels resultats
finals
SUBPROJECTE 1
Les troballes més significatives d’aquest projecte són que l’inhibidor
reversible del proteasoma MG262 fa disminuir la proliferació dels
fibroblasts de la via aèria, provoca una aturada del cicle cel·lular i
finalment l’apoptosi. A més a més, concentracions no citotòxiques
d’MG262 fan disminuir la producció de la citocina proinflamatoria IL-6
i la síntesi de col·làgens. Tant la proliferació com la síntesi de
col·làgens dels fibroblasts són molt poc sensibles a l’efecte dels
glucocorticoides. En conjunt, l’efecte inhibidor de l’MG262 sobre la
10

funció del fibroblast suggereix que aquest fàrmac podria ser una
opció potencialment terapèutica en malalties que, com l’asma greu,
es caracteritzen per tenir un marcat component fibròtic i inflamatori.
Els resultats obtinguts en el nostre projecte són de gran utilitat per
testar la capacitat antiinflamatòria, antiangiogènica i antifibròtica
d’aquests fàrmacs en un model animal, essent aquest un assaig
obligatori abans de dur a terme assajos clínics en humans.
SUBPROJECTE 2
L’efecte antiinflamatori i antiangiogènic dels inhibidors del
proteasoma tindria lloc en part suprimint la via extrínseca que opera
mitjançant el VEGF i altres factors de creixement que activen el
VEGFR-1 i també suprimint la via intrínseca constitutiva,
caracteritzada per primera vegada en aquest projecte, que seria
independent del VEGF i altres factors de creixement. A més a més, la
caracterització en aquest projecte d’una nova isoforma soluble del
VEGFR-1 amb una cua C-terminal poliserina que, d’acord amb
resultats molt recents, és capaç de bloquejar l’efecte vasodilatador
del VEGF, suggereix que podria realitzar una funció similar a la
musculatura bronquial i contribuir a la broncoconstricció característica
de l’asma. Aquesta hipòtesi serà objecte d’investigació futura en el
nostre grup.
4. Publicacions
Pujols L, M Fuentes, L Fernández-Bertolín, I Alobid, N Agell, J Roca-
Ferrer, J Mullol, C Picado.
Little effect of glucocorticoids on fibroblast proliferation and collagen
production by upper airway fibroblasts. (Manuscrit en preparació.)
11

Pujols L, M Fuentes, L Fernández-Bertolín, I Alobid, N Agell, J Roca-
Ferrer, J Mullol, C Picado. Inhibition of airway fibroblast proliferation
and function by the proteasome inhibitor MG262. (Manuscrit en
preparació.)
Les seqüències de les cinc noves isoformes truncades intracel·lulars
de VEGFR-1 han estat dipositades al GenBank amb els codis de
referència següents: DQ836394, DQ836395, EF491868, EF491869 i
EF491870 (A new family of truncated intracellular isoforms of VEGFR-
1, lacking the extracellular domains of the molecule, may contribute
to the malignant phenotype of breast cancer cells). La seqüència de
la forma soluble extracel·lular amb la cua C-terminal de poliserina ha
estat dipositada al GenBank amb el codi: EU360600 (A new VEGFR-1
transcript coding for the extracellular domains of the protein followed
by a C-terminal polyserine tail). El manuscrit que descriu la
caracterització de les formes truncades intracel·lulars de VEGFR-1 ha
estat enviat per ser publicat. L’acceptació d’aquest manuscrit és un
requisit previ per publicar altres resultats del projecte.
12