apunts 15 - IES Guillem Cifre de Colonya

Els gens que s'han d ' introduir, l'anomenat ADN passatger pot provenir dels elements següents:
6
- ADN d'una cèl . lula que ha estat fragmentat enzims de restricció.
- ARNm aïllat, que s'utilitza com a motlle per fabricar un ADN (gràcies a la transcriptasa
inversa)
- ADN sintetitzat artificialment. Això permet introduir mutacions i elaborar nous enzims
(enzims disseny).
Els dos darrers processos permeten que un bacteri (organisme en el qual no hi ha maduració de
l’ARNm) pugui fabricar proteïnes de cel·lules euçariotes, els gens de les . quals solen presentar
introns i exons.
Seqüènciació. Tècnica Sanger
Existeixen diverses tècniques de seqüènciació, la més emprada és la tècnica didesoxi o tècnica
Sanger.
Com a motlle s’utilitza una versió monocatenària de l’ADN
que s’ha de seqüènciar. S’empra com a encebador per a
iniciar la síntesi de l’ADN un curt oligonucleòtid
complementari. La base de la tècnica està en la introducció
de didesoxinucleòtids (ddNTP), és a dir nucleòtids
modificats de manera que el grup –OH del carboni 3’ està
substituït per un –H. Una vegada units a una cadena d’ADN,
aquesta ja no pot crèixer ja que no té l’extrem –OH en
posició 3’ (necessari per a l’addició de nucleòtids), així
doncs la incorporació d’un ddNTP implica el final de la
cadena.
Per a la realització d’aquesta tècnica es necesiten 4 tubs
separats; cada tub conté els nucleòtids necessaris per a la síntesi d’ADN. Un d’ells, el que actua
d’encebador, està marcat radiactivament. A més cada tub conté un dels ddNTP per acabar la cadena.
D’aquesta manera, per exemple, al tub G, hi ha ddGTP que s’incorpora a les cadenes que s’estan
sintetitzant, i la bloquejaran, just quan l’ADN moncatenari que es vulgui seqüenciar hi hagi un nucleòtid
de citosina (complementari a G).
Posteriorment els fragments dels quatre tubs, es passen a les plaques de gel I es radiografien per a
obtenir les bandes corresponents.
Selecció de transformants amb ADN clonat. Hibridació de colònies
La selecció de cèl.lules transformades amb ADN clonat és una de les tècniques més dificultoses ja que
es parteix d’un gran mombre de fragments d’ADN que es clonen en bacteris formant com una biblioteca
genòmica, un reservori per a l’obtenció de gens.
Es fa necessari, doncs, algun sistema per a “pescar” el clon que volem entre la resta de la biblioteca
genòmica. Per això cal emprar una sonda que actui com a “ham”, específic.
La tècnica consisteix en agafar un ARNm que codifica per a la proteïna que volem (per exemple insulina
del pàncreas) i mitjançant la transcriptassa inversa se sintetiza l’ADN corrresponent. Aquest ADNc és la
sonda necessari per a extreure la seqüència o gen que interessa la biblioteca genòmica.
IES Guillem Cifre de Colonya. BIOLOGIA BATXILLERAT 2. Professor: Tomeu Vilanova