Memòria d'activitats juliol 2003 / juny 2004 - Televisió de Catalunya

Memòria d’activitats
juliol 2003 / juny 2004

Índex
Presentacions 3
1. Fundació La Marató de TV3
Introducció 7
Òrgans de govern: Patronat i Comissió Assessora 8
2. La Marató de 2003
Introducció 11
Sensibilització i difusió 13
Comunicació 21
Organització i logística 22
Patrocini 25
3. Tancament de comptes 27
4. Recerca biomèdica
Introducció 29
Convocatòria d’ajuts 30
Avaluació dels projectes de recerca 32
Adjudicació dels ajuts 34
Seguiment dels projectes 37
Finalització dels projectes. Simposium 39
La Marató del 1997. Resum de les memòries finals 41
5. Divulgació 175
© 2005 Fundació La Marató de TV3
Direcció: Miquel Vilar
Coordinació i redacció:
Begonya Garcia i Batllori
Correcció i traducció al castellà:
Francesc X. Navarro
Traducció a l’anglès: Peter Harvey
Disseny gràfic: Zink comunicació
Impressió: NG Nivell Gràfic
Tiratge: 1.100
Dipòsit legal:
L’elaboració d’aquesta Memòria ha estat
possible gràcies al suport d’Abertis.
Fundació La Marató de TV3
Ganduxer, 117
08022 Barcelona
Tel. 93 444 48 30
www.fundaciomaratotv3.org
a/e: fundaciomaratotv3@ccrtv.com

Joan Majó, director general de la Corporació Catalana de Ràdio i Televisió
i president de la Fundació La Marató de TV3
Omplir de fites
aconseguides les
nostres memòries
Aquesta Memòria recull les activitats dutes a
terme per la Fundació La Marató de TV3 des
del juny del 2003 fins al juliol del 2004, un
any ple d’iniciatives, feina i il·lusió.
El públic es pot imaginar que la tasca dels
professionals que treballen per aconseguir
fer un programa estrella com és La Marató
de TV3 es limita a un període que comença
i s’acaba amb el programa. Aquesta percepció
no es correspon amb la realitat. En
estreta col·laboració amb els responsables
del programa, la Fundació La Marató de TV3
treballa durant tot l’any en un llarg circuit que
comença amb la tria del tema del programa
i s’acaba amb el desenvolupament dels
projectes de recerca que, finalment, esdevindran
millores en els tractaments i, com a
conseqüència, de la qualitat de vida de molts
malalts. D’aquesta manera, els ciutadans,
Televisió de Catalunya i la comunitat científica
han anat lligant, en el transcurs de dotze
edicions, i mitjançant un engranatge molt
ben concertat, un instrument de solidaritat
plenament consolidat avui dia que la
Fundació coordina d’ençà de la seva creació.
Un exemple de tot aquest procés és el
resum de les activitats que es van dur a
terme durant el 2003: la campanya de
sensibilització i difusió de les malalties
respiratòries cròniques, tema de La Marató
del 2003; l’acte solemne de lliurament de
guardons als investigadors guanyadors que
van presentar els projectes de La Marató del
2002, dedicada a les malalties inflamatòries
cròniques; el IV Simposium, celebrat el 14
d’octubre, que va tractar sobre les malalties
genètiques hereditàries (tema de La Marató
del 1997) i en el qual es van presentar les
conclusions dels 35 projectes de recerca
biomèdica que van ser finançats. Aquestes
memòries van ser publicades i distribuïdes
als principals centres de recerca del país.
Informar, conscienciar i mobilitzar els
ciutadans de Catalunya són tres dels
objectius que persegueix el programa de
La Marató i la Fundació. Els més de 4,27
milions d’euros recaptats en l’edició del 2003
han permès finançar 27 projectes de recerca
biomèdica d’un total de 105 que es van
presentar al concurs d’ajuts. Sens dubte, la
recaptació és una part vital d’aquesta gran
escola de ciutadania, el tret de sortida d’un
període que dura anys. La Marató comença
a tenir un seguiment important a la societat
civil, va molt més enllà d’una recollida de
diners i reforça, cada any amb més solidesa,
la qualitat de la sanitat al nostre país. Encara
queda molt per fer, moltes malalties per
combatre... Per deixar constància d’aquesta
evolució “maratoniana”, anirem omplint de
fites aconseguides les nostres memòries,
any rere any. Serà per no oblidar-nos que
la victòria definitiva és només una part
d’aquest camí que anem fent entre tots.
PRESENTACIONS | 3

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
Dr. José J. Navas, vicepresident segon de la Fundació La Marató de TV3
i coordinador de la Comissió Assessora
Gestió rigorosa i
reconeixement de la
comunitat científica
La Fundació La Marató de TV3, després
de vuit anys de funcionament, ha consolidat
una marca de prestigi i una metodologia de
funcionament que ha generat l’adhesió
i solidaritat dels ciutadans, fet que li ha
permès aconseguir una captació de recursos
rellevant.
La gestió rigorosa des del punt de vista
científic, tant del tema escollit cada any, com
de l’avaluació competitiva dels projectes de
recerca per un panel institucional d’experts,
han proporcionat a la Fundació La Marató de
TV3 el respecte i el reconeixement de la
comunitat científica.
La investigació està deixant de ser una
aventura personal, individual, per esdevenir
un objectiu estratègic de les institucions i
dels països. És per això que l’impacte científic
i social dels resultats obtinguts amb els
recursos utilitzats és una fita irrenunciable.
Sabem que en aquests moments, el finançament
dels projectes d’investigació biomèdica
als nostres hospitals catalans, procedent de
la Fundació La Marató de TV3, ocupa entre
el tercer i cinquè lloc entre les agències de
finançament públic i privat de les fundacions
d’investigació de l’àmbit hospitalari.
A més d’aquest impacte econòmic sobre la
recerca biomèdica a l’hospital, la Fundació
La Marató de TV3 està en el procés
d’avaluar les conseqüències de la investigació
finançada per la Fundació, com la difusió
de coneixement, creació de línies d’investigació,
la formació d’investigadors i la transferència
tecnològica.
En definitiva, el projecte de la nostra
Fundació ha arribat a un nivell de consolidació
i maduresa com per introduir els
elements d’avaluació de les conseqüències
d’aquest magnífic esforç de finançament
de la investigació biomèdica en problemes
prioritaris de salut, basat en la generositat
dels ciutadans.

Miquel Vilar, director de la Fundació La Marató de TV3
El cost zero com
a compromís
D’ençà de 1996, any de la seva creació,
la Fundació La Marató de TV3, entre altres
activitats, administra i controla els recursos
aportats pels milers de ciutadans que
responen, any rere any, a la crida de
La Marató de TV3.
Aquesta resposta solidària envers les
persones que pateixen les malalties i el seu
entorn familiar i la confiança feta a TV3 com
un mitjà considerat de referència personal,
obliguen la Fundació a actuar en les seves
competències amb la rigorositat i transparència
més exigents.
Volem donar a conèixer, doncs, les principals
dades de la nostra activitat en el període
juliol 2003-juny 2004, entre la qual la
campanya de sensibilització i difusió de
La Marató de TV3 i el suport organitzatiu i
logístic al programa. També creiem oportú
exposar els resultats dels projectes finançats
sobre les malalties genètiques hereditàries
(La Marató de 1997) i explicar la situació de
les avaluacions científiques i econòmiques
dels projectes que s’estan desenvolupant.
Però encara és més important retre comptes
sobre la destinació final dels recursos
econòmics aconseguits amb La Marató,
i poder subratllar que La Marató, en tota la
seva complexitat, pugui realitzar-se amb un
cost zero, i que per cobrir els costos, tant
de les activitats extraordinàries del programa
com del funcionament de la Fundació,
no s’hagi d’esmerçar cap quantitat de la
recaptació obtinguda per donacions.
Escau, ara, destacar la col·laboració del
Departament de Benestar i Família i de les
empreses que estan al darrere de La Marató
–Bassat Ogilvy, La Caixa, PWC Auditores,
Telefónica i Tradia– sense les quals no
podríem dur-la a terme, com també dels
patrocinadors del programa i de les més
de 200 empreses d’arreu del país que fan
la seva aportació en productes i serveis
a les diverses seus des d’on s’organitza
La Marató: Palau Sant Jordi, Fira de Girona,
Universitat de Lleida i Port de Tarragona.
Tots ells són col·laboradors necessaris
perquè els resultats siguin els desitjats.
També destaquem l’estreta col·laboració
amb l’Agència d’Avaluació de Tecnologia
i Recerca Mèdiques, pel seu assessorament i
decidit suport a la Fundació en l’organització
del simposi i en les avaluacions dels projectes
de recerca i de les seves memòries
anuals.
Al capdavall aquesta Memòria reforça la
informació que la Fundació subministra,
periòdicament per mitjà de la revista Món
Marató i continuadament mitjançant el lloc
web de la Fundació, de les seves activitats
de suport al programa La Marató i d’impuls
a la recerca biomèdica.
Finalment, quan passem comptes ho fem
amb el pronunciament positiu tant del
Departament d’Economia i Finances de la
Generalitat com de PriceWaterhouseCoopers.
PRESENTACIONS | 5

Fundació
La Marató de TV3
La Fundació La Marató de TV3 és la institució
de la Corporació Catalana de Ràdio i
Televisió creada el 1996 per dur a terme el
foment i la promoció de la recerca científica
d’excel·lència, entesa com la que es porta a
terme per científics i investigadors en centres
de recerca que provin, àmpliament, la seva
capacitat i qualitat de treball, en els camps
de la genètica molecular i biomèdica.
El foment i la promoció que constitueixen
l’objecte fundacional es desenvolupen,
fonamentalment, mercès als ingressos
aconseguits amb el programa La Marató
de TV3.
També constitueix objecte i finalitat de la
Fundació la sensibilització i la difusió sobre
les malalties de què es tracta en La Marató
de TV3, per mitjà de conferències informatives
a centres educatius i cívics, campanyes
i actes de participació ciutadana en general.
La Fundació és auditada pel Departament
d’Economia i Finances de la Generalitat i per
PriceWaterhouseCoopers.
FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3 | 7

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
Òrgans de govern
El Patronat
És I’òrgan de govern, representació,
administració i decisió de la Fundació.
Durant aquest exercici, el Patronat va aprovar,
a proposta de la Comissió Assessora, la
malaltia objecte de La Marató del 2004, el
càncer, i també les bases de la convocatòria
d’ajuts a la recerca biomèdica sobre les
malalties respiratòries cròniques i l’adjudicació
de recursos obtinguts en La Marató 2002 als
projectes de recerca sobre les malalties
inflamatòries cròniques.
El Patronat també va aprovar l’elaboració
de l’informe sobre “Avaluació de l’impacte
de la recerca biomèdica finançada amb fons
de La Marató de TV3”.
El treball va ser encarregat a l’Agència
d’Avaluació de Tecnologia i Recerca
Mèdiques (AATRM).
PRESIDENT:
Sr. Joan Majó
Director general de la Corporació Catalana
de Ràdio i Televisió
VOCALS:
Sra. Marta Aymerich
Directora del Consell Interdepartamental
de Recerca i Innovació Tecnològica (CIRIT)
El president del Consell d'Administració
de la CCRTV (representació rotatòria)
Sr. Francesc Escribano
Director de Televisió de Catalunya.
Vicepresident primer
Sr. Jordi Menéndez
Vocal del Consell d'Administració de la
Corporació Catalana de Ràdio i Televisió
Sra. Montserrat Minobis
Directora de Catalunya Ràdio
Sr. José J. Navas Palacios
Departament de Salut. Vicepresident segon
Sr. Marc Mateu
Director del programa La Marató de TV3
Sr. Antoni Segarra
Secretari general del Departament de
Benestar i Família
Sr. Esteve Mañá
Secretari, no patró
DIRECCIÓ EXECUTIVA
Sr. Miquel Vilar

La Comissió Assessora
És l’òrgan consultiu del Patronat responsable
de proposar les línies temàtiques per al
programa La Marató de TV3, les bases per
a la convocatòria pública d’ajuts a la recerca
provinents de La Marató, els metges
assessors del programa i les accions
per promoure la recerca d’excel·lència.
Està formada per representants de les
institucions cientificomèdiques més
importants del país. Es reuneix periòdicament
per convocatòria del seu coordinador,
que és el representant del Departament
de Salut, vicepresident segon del Patronat.
Durant l’exercici que presentem, la Comissió
Assessora va proposar al Patronat que la
malaltia objecte de La Marató del 2004 fos el
càncer, com també les bases de la convocatòria
per a la presentació de projectes sobre
les malalties respiratòries cròniques i l’adjudicació
dels recursos als projectes finançats
amb els fons de La Marató 2002, dedicada
a les malalties inflamatòries cròniques.
En aquest període, la Comissió Assessora va
proposar al Patronat l’elaboració de l’informe
“Avaluació de l’impacte de la recerca
biomèdica finançada amb fons de La Marató
de TV3”.
Dr. José J. Navas Palacios
Departament de Salut (coordinador)
Dra. Marta Aymerich
Directora del Consell Interdepartamental
de Recerca i Innovació Tecnològica (CIRIT)
Dr. Josep M. Borràs
Director científic de l’Institut Català d’Oncologia
Dr. Jordi Camí
Director de l’Institut Municipal d’Investigació
Mèdica
Dr. Juan Emilio Feliu Albiñana
Director general de l’Institut de Recerca de
l’Hospital Universitari de la Vall d’Hebron
Dr. Alberto de Leiva Hidalgo
Director de l’Institut de Recerca de l’Hospital
de la Santa Creu i Sant Pau
Dr. Romà Pallarés
Director científic de la
Fundació August Pi i Sunyer
Dr. Ricardo Pujol
Director científic de l’Hospital Universitari
Germans Trias i Pujol
Dr. Joan Rodés
President de la Fundació Privada Clínic
per a la Recerca Biomèdica
Sr. Marc Mateu
Director del programa La Marató de TV3
Sr. Miquel Vilar
Director executiu de la Fundació La Marató de TV3
Dr. Ernest Viñolas
Comitè científic de la Fundació J. Gol i Gurina
FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3 | 9

Marató 2003: malalties
respiratòries cròniques
En la reunió del Patronat del 23 d’octubre de
2002 es va acordar que La Marató de TV3
del 2003 tractés sobre les malalties respiratòries
cròniques, tot acceptant la proposta
de la Comissió Assessora.
La recaptació final aconseguida en la
dotzena edició de La Marató, mitjançant els
donatius, patrocinis i altres fonts d’ingressos
va ser de 4.279.265,01 euros.
La Marató de TV3 del 2003 va ser el
programa de més llarga durada –14 hores
continuades– dels que es van fer en qualsevol
de les cadenes de televisió d’àmbit
estatal. Va tenir una audiència mitjana del
4,9%, és a dir, una mitjana de 298.000
espectadors, amb una quota mitjana
del 18,9%.
CANALS DE DONATIUS
Donacions telefòniques* 3.009.255,34
Servicaixa 130.032,75
Internet 235.955,78
Transferències i ingressos directes 394.218,31
Patrocinis i altres 509.802,83
Total 4.279.265,01
* Els impresos que omplen els voluntaris el mateix dia de
La Marató amb les dades personals necessàries per fer
els donatius mitjançant la trucada telefònica són destruïts
un cop s’han comptabilitzat els imports i s’han resolt les
incidències que hi hagin pogut sorgir, en compliment
del que estableix la Llei orgànica 15/1999, de 13 de
desembre, de protecció de dades.
LA MARATÓ 2003 | 11

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
DADES GENERALS DE LA MARATÓ DE TV3 DE 2003
Hores de programa 14
Audiència total acumulada 3.366.000
Audiència mitjana d’espectadors 298.000
Audiència mitjana (%) 4,9
Quota mitjana de pantalla 18,9
Hores de programa especial a Catalunya Ràdio 4
RECAPTACIÓ DE LES DOTZE EDICIONS DE LA MARATÓ DE TV3
Leucèmia 1992
Síndrome de Down 1993
Càncer 1994
Cor 1995
Cervell 1996
Genèriques hereditàries 1997
Diabetis 1998
Trasplantaments 1999
Malalties mentals 2000
Sida 2001
Malalties inflamatòries cròniques 2002
Malalties respiratòries cròniques 2003
1.230.128
2.352.669
3.035.331
2.040.443
4.107.795
4.172.090
3.945.421
4.685.110
4.511.808
4.653.496
4.518.315
4.279.265

Sensibilització
i difusió
La Fundació participa, juntament amb el
Departament de Màrqueting de TV3 i de la
Direcció del programa La Marató de TV3, en
l’aprovació de la imatge, els eslògans i tot el
material de difusió de la campanya de sensibilització,
difusió i publicitat de La Marató.
L’agència de publicitat encarregada de la
creativitat de la campanya de l’edició 2003
va ser Bassat Ogilvy&Mather Comunicación.
L’eslògan escollit va ser: “Dóna’ns una mica
d’aire”.
MATERIAL DE PROMOCIÓ
Tríptics informatius 920.000
Cartells 53.000
Adhesius 200.000
Banderoles municipals 3.460
Opis 180
Cartells per a farmàcies 2.740
Conferències a les escoles
El dia 2 de novembre de 2003 es va iniciar
la campanya de sensibilització adreçada
a escoles i associacions de tot Catalunya.
En aquesta edició, es van dur a terme 2.650
conferències en centres educatius i cívics,
per un total de 105 professionals de la
medicina. Prèviament van ser convocats
a una sessió de formació al Col·legi de
NOMBRE DE CONFERÈNCIES ESCOLARS
Genèriques hereditàries 1997
Diabetis 1998
Trasplantaments 1999
Malalties mentals 2000
Sida 2001
Malalties inflamatòries cròniques 2002
Malalties respiratòries cròniques 2003
Metges, on també se’ls va lliurar la documentació
sobre aquestes malalties elaborada
especialment. Es va fer una edició especial
de 3.000 VHS de suport a les conferències.
En aquest context, TVC i la Fundació,
juntament amb el Departament de Benestar
i Família, van convocar el cinquè concurs
Pinta La Marató, amb l’objectiu de fomentar
l’esperit solidari que representa La Marató de
TV3 entre els escolars.
El jurat, format pels pintors Elisabet Sabala
i Joan Pere Viladecans, per Agustí Vilà, del
Departament de Benestar i Família i pels
directors del programa La Marató de TV3
i de la Fundació, Francesc Romero i Miquel
Vilar, respectivament, va premiar l’aula de
4t d’ESO de l’IES Serra de Marina de Premià
de Mar. Les aules de 2n de batxillerat, mòdul
Humanitats i Ciències de l’IES M. Lluïsa Cura
de Barcelona i de 2n de batxillerat A de l’IES
Ciutat de Balaguer, en van quedar finalistes.
Es van repartir 14.000 fullets amb les bases
del concurs i s’hi van presentar 57 murals.
El premi va consistir en un cap de setmana
per a tots els alumnes participants en el
mural a l’alberg de la Generalitat «Casa Gran»
d’Altafulla. El Departament de Benestar i
Família va sufragar-ne l’estada i el viatge.
1.063
1.357
1.595
1.883
2.497
2.226
2.650
LA MARATÓ 2003 | 13

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
CENTRES PARTICIPANTS EN EL V CONCURS PINTA LA MARATÓ
Badalona ColÆlegi Maristes Champagnat (4 aules)
Barcelona ColÆlegi Sagrats Cors (2 aules)
ColÆlegi Companyia Sta. Teresa de Jes s (3 aules)
Escola Sant Medir
Escola FP OSCUS
IES M. Llu sa Cura
Escola Immaculada Vedruna (2 aules)
Escola Men ndez Pidal (2 aules)
Centre d Integraci Social ASPACE
IES Vall d Hebron
Balaguer IES Ciutat de Balaguer (3 aules)
Bonavista Escola Joan XXIII (4 aules)
Calafell IES Cam de Mar
Cardadeu IES Arquitecte Manuel Raspall
Mataró ColÆlegi Mare de D u de Lourdes (3 aules)
Escola Sol Ixent
Móra d’Ebre ColÆlegi Santa Teresa (2 aules)
Navàs Escola Diocesana (3 aules)
Premià de Mar IES Serra de Marina
Reus IES Salvador Vilaseca
ColÆlegi Sant Josep (2 aules)
Roda de Ter IES Miquel Mart i Pol (6 aules)
Sant Fruitós de Bages IES Gerbert d Aurillac (3 aules)
La Seu d’Urgell UEC C ritas
Tona ColÆlegi Resid ncia PIUE
Tremp C ritas Diocesana d Urgell
Viladecans IES de Sales (5 aules)
Alumnes de 4t d’ESO de l’IES Serra de Marina de Premià de Mar, amb el seu mural guanyador.

Adhesió dels ajuntaments
La Marató de TV3 és un projecte que mou
voluntats diverses: individuals, col·lectives,
d’àmbit públic i privat. En aquest sentit, hi
ha un gran nombre de consistoris d’arreu de
Catalunya que també participen activament
en la difusió de La Marató amb l’adquisició
de pancartes per penjar als carrers principals
de la població que recorden als ciutadans
la seva cita anual amb La Marató.
Els ajuntaments que es van adherir a
La Marató en l’edició 2003 van ser 517,
dels quals 88 ho van fer per primer cop.
Les pancartes penjades van ser 855.
N’hi ha, però, que a més de penjar pancartes,
i per aprovació del seu ple, també hi fan
una aportació econòmica. En aquesta
edició van ser 13 els municipis que van
fer un donatiu directe: Sant Martí Sarroca,
Sant Julià de Ramis, la Garriga, Gallifa,
l’Ametlla del Vallès, Fondarella, Premià de
Dalt, Piera, Font-rubí, Fornells de la Selva,
Santa Maria de Martorelles, Salou,
Bonastre.
Adhesió dels teatres
El món del teatre –companyies teatrals
i sales– també va voler implicar-se a difondre
La Marató de TV3, per mitjà de la lectura, la
vigília de La Marató, d’un manifest d’adhesió
convidant el públic a trucar al telèfon
905111213.
Les sales que ho van fer en l’edició 2003 van
ser: Teatre Zorrilla, Jove Teatre Regina,
Teatre Nacional de Catalunya, Sala
Muntané, Versus Teatre, Teatre Auditori de
Granollers, Teatre Condal i Teatre Romea.
Activitats populars
Centenars d’associacions i entitats de
Catalunya organitzen desinteressadament i
per iniciativa pròpia activitats de promoció de
La Marató, que fan coincidir, en molts casos,
amb el mateix dia de l’emissió del programa.
D’altres es duen a terme en les dates prèvies
i fins i tot posteriors a La Marató.
L’edició del 2003 va mobilitzar un total de
1.566 entitats i associacions, i es van
organitzar 327 activitats populars arreu
del territori.
MUNICIPIS ADHERITS PER PRIMERA VEGADA A LA CAMPANYA DE LES PANCARTES
A Aiguafreda, Aiguaviva, Almacelles, Almenar, Arb cies, Arenys de Mar, Arenys de Munt, Aviny .
B Begur, Benifallet, Bigues i Riells, Blanes, Breda.
C Cabanes, Cabrera de Mar, Cadaqu s, Calafell, Camarles, Campllong, Canyelles, Castellar del
Vall s, Castellbisbal, Castellnou de Seana, Castell de Farfanya, Cerdanyola del Vall s, Colera,
Corbera de Llobregat.
F Figueres, Folgueroles, la Fuliola.
I Isona, Conca Dell .
J Jorba.
L Les, Llan .
M Masquefa, Massanes, Massoteres, Matadepera, Moi , Montblanc, Montgat, Montseny, Maslloren .
N Naut Aran.
O Oliana.
P Palafolls, Palam s, Els Pallaresos, el Pla de Santa Maria, la Pobla de Claramunt, Puigcerd ,
Puigverd de Lleida.
Q Queralbs.
R Roda de Bar , Rodony , el Rourell, Rub .
S Sallent, Sant Boi de Llu an s, Sant Carles de la R pita, Sant Cebri de Vallalta, Sant Climent
de Llobregat, Sant Feliu de Pallerols, Sant Fruit s de Bages, Sant Gregori, Sant Guim de Freixenet,
Sant Hip lit de Voltreg , Sant Iscle de Vallalta, Sant Lloren Savall, Sant Pere de Ribes, Sant
Quirze del Vall s, Sant Vicen de Castellet, Santa Maria de Palautordera, Santa Perp tua de
Mogoda, Sarroca de Bellera, Saus-Camallera-Llampaies.
T Tiana, Tona, Torrelles de Foix.
U Ulldecona.
V Vall-ll brega, Vandell s i l Hospitalet de l Infant, el Vendrell, Vilagrassa, Vilanova i la Geltr ,
Vila-seca, la Vilella Alta, Vinebre.
LA MARATÓ 2003 | 15

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
Des del mes d’octubre fins al mes de febrer,
es va incorporar a l’Àrea d’Operacions
Dolors Pena, per reforçar l’atenció a les
associacions, el seguiment de les activitats
populars i el repartiment de tot el material de
promoció que s’hi destina.
Edició del CD Concert dels 20 anys
L’any 2003, la Fundació va tornar a editar un
CD amb la intenció que la seva venda a les
empreses incrementés la recaptació obtinguda
en La Marató.
En coincidir amb la celebració dels 20 anys
de TVC i de Catalunya Ràdio, el CD editat
va ser l’enregistrament del Concert dels 20
anys, al Gran Teatre del Liceu, que va tenir
lloc durant el mes de juny.
L’Orquestra Simfònica del Vallès, els cors de
l’Orfeó Català, Lieder Càmera i la Polifònica
de Puig-reig van interpretar les cançons
més representatives dels cantautors i de les
formacions catalanes contemporànies més
importants, com ara Lluís Llach, Maria del
Mar Bonet, Joan Manuel Serrat, Sopa de
Cabra, Sangtraït, etc.
Pla
Segarra 5
Segrià 18 d’Urgell
8 Urgell 11
Conca de
Barberà 2
Garrigues 7
Terra Alta 3 Ribera
d’Ebre 9
Baix Ebre 5
Montsià 3
Val d’Aran
Alta Ribagorça
Pallars Jussà 2
Noguera 9
ACTIVITATS POPULARS PER COMARQUES
Pallars Sobirà 1
Alt Urgell
Andorra 1
Cerdanya 1
Solsonès 2 Berguedà 3
Anoia 7
Bages 8
Alt Penedès 9
En l’edició del 2003 es van editar un total de
7.900 CD, dels quals es van vendre 7.443
unitats. Per a la distribució d’aquest disc
compacte es va comptar amb la col·laboració
d’Abertis, Bodegas Miguel Torres, SA;
Braun Española, SA; Cafés Saula, SA;
Caixa de Tarragona; Caixa d’Estalvis de
Terrassa; Catalunya Ràdio; Cerestar
Ibérica, SL; Congelats Reunits, SA;
Denion Control y Sistemas, SA; Direcció
General d’Acció Cívica; EMESA; FCC, SA;
ICICT, SA; Nexans Iberia, SL, i
PriceWaterhouseCoopers, SL. Va ser
remarcable el suport d’Abertis pel nombre de
CD adquirits. Igualment agraïm la col·laboració
de Discant per la producció del disc.
Ripollès 3
Osona 8
Vallès
Oriental 14
Vallès
Occidental 21
Garrotxa 4
Barcelonès 39
Alt Camp 5
Garraf 3
Baix Llobregat 14
Priorat 6
Baix
Baix
Penedès 9
Camp 20 Tarragonès 3
Alt Empordà 5
Pla de
l’Estany
Gironès Baix
9
Empordà 8
Selva 23
Maresme 21

ACTIVITATS POPULARS PER A LA MARATÓ DE 2003
Població Entitat
Agramunt Agrupament Escolta d’Agramunt, Ass. de Dones L’Esbarjo,
Ass. Juvenil Penya Cloro
Agullana Societat La Conc rdia d’Agullana
Aitona Penya els Tabolls d’Aitona
Aiguamúcia Patronat Municipal de Turisme d’Aiguam rcia
Els Alamús Ass. de Dones dels Alam s
Albesa Ass. de Dones Punt de Trobada
Alcoletge Ass. de Dones d’Alcoletge
Alcover Ajuntament d’Alcover
L'Aleixar Colla de Joves de l Aleixar
Algerri Ateneu Penya Terr s
Almacelles IES Canig
L'Ametlla del Vallès Agrupaci Cultural de Dones l Ametlla del Vall s
Alpicat Ass. Cultural de Dones d’Alpicat
Anglès Agrupament Escolta Sant Miquel d’Angl s
Arbeca Ajuntament d’Arbeca
Arbúcies JAM - Joves d’Arb cies per la Marat
Arenys de Mar Ajuntament d’Arenys de Mar, AMPA Edifici Cass - Escola P blica Joan
Maragall, Organisme Aut nom Local - Resid ncia Geri trica
Artés Mares.com
Artesa de Segre Gimn s Altis
Ascó CEIP Sant Miquel, ColÆlectiu de Dones d’Asc
Avinyó Coordinadora d’Entitats Culturals i Esportives d’Aviny
Badalona Ass. de Ve ns IRIS-SOL-CASAGEMAS, Ass. d’Escoles de Dansa
de Badalona - A.E.D.B., Hospital Municipal de Badalona
Balaguer Ass. de Dones d’Almat , Ass. Resid ncia Geri trica Sant
Dom nec de Balaguer
Barcelona Ass. Asmatol gica Catalana, Ass. de Bombers Juvenils de Catalunya,
Ass. Esportistes Solidaris, Ass. Juvenil M Oberta Cor Obert Immaculada
Ball Gran, Casinos de Barcelona - INVERAMA, Centre Cultural el Casalet
del Tur , Club de Tennis Federats, Club Esportiu Els Dracs de l’Institut
Guttmann, Club Esportiu Laiet , ColÆlegi Sagrats Cors de Sarri ,
Colla Sant Medir Monumental, DIR - Clubs de Fitness, Discos Castell ,
Escola de Dansa Yisbell, Escola IPSE, Escola Universit ria d’Infermeria i
Fisioter pia Blanquerna, Extrem Team, Federaci Catalana de Tennis,
Federaci de Farm cies de Catalunya - FEFAC, F rum Samitier, Germandat
de Trabucaires, Geganters i Grallers de Sant Andreu, Glaxo Smith Kline,
Grup Torxa del Guinard , Hospitalitat Mare de D u de Lourdes de Barcelona
Laboratoris Almirall-Prodesfarma, L’Espai de Dansa i M sica, Llu ssos de
Gr cia, Marfil Santa Coloma - Futbol Sala, Mercat de l’Abaceria de Gr cia,
Mercat de Santa Caterina, Per l’altre Cor Cremat de Barcelona. Ajut al
Quart M n, Portal M sica, RCD Espanyol, Secci de la Dona del Foment
Martinenc, Societat de Medicina Familiar i Comunit ria, Teatre Nacional
de Catalunya, USAP de Barcelona
La Bisbal del Penedès ColÆlectiu Juvenil Arrauxats
Les Borges Blanques IES Josep Vallverd
Les Borges del Camp Ass. Cultural de Dones Borgenques
Breda Ajuntament de Breda
El Brull Centre d’Informaci del Brull - Parc Natural del Montseny
Cabrera de Mar Cabrera Solid ria
Calafell Ajuntament de Calafell
Caldes de Malavella Club de Futbol Sala Femen de Caldes
Caldes de Montbui Acci C vica Calderina
Caldes d'Estrac BAO-BAB Grup de Joves
Calella de la Costa Els Timbalers de Sant Quirze de Calella
Cambrils Ajuntament de Cambrils - Departament de Benestar Social, APA CEIP
Joan Ard vol, Mercat del P sit de Cambrils
Canet de Mar Uni de Botiguers i Comerciants de Canet de Mar
Canovelles AV Congost, Colla Gegantera de Canovelles, Comissi Sant Antoni Abat
Capellades Esplai Aliret de Capellades
Cardedeu AV de l Estalvi de Cardedeu, Ass. de Ve ns del Centre de la Vila de
Cardedeu
Cassà de la Selva Ajuntament de Cass de la Selva, R dio Cass de la Selva
Castellar del Vallès Agrupaci Entitats Esportives de Castellar del Vall s
R dio Castellar del Vall s - Emissora Municipal
Castellbell i el Vilar Ass. de Jubilats i Pensionistes de Castellbell i Vilar - Gent d’Edat
Castellbisbal Clariant Ib rica, SA
LA MARATÓ 2003 | 17

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
Població Entitat
Castelló d'Empúries Ajuntament de Castell d’Emp ries
Castellserà Ass. de Dones L’Esclat
El Catllar Agrupaci de Dones del Catllar
Centelles Espai de Joc
Cercs Ajuntament de la Vila de Cercs, Grup d’Esplai Estels
Cerdanyola del Vallès Aulos, Escola Municipal de M sica
Cervera Creu Roja Joventut - Cervera
Corçà Club de Futbol de Cor
Cornellà de Llobregat Club de Boxa Cornell
Cubelles TeleCubelles
Esplugues de Llobregat Espluga Viva
Falset IES Priorat
La Fatarella Escola Municipal de M sica de la Fatarella
Flix Ass. de Dones de Flix
Fornells de la Selva AMPA del ColÆlegi P blic Forn d’Anells
Freginals Ass. de Dones de Freginals
La Fuliola Ajuntament de la Fuliola
Garcia Colla de Diables - Drac Jorbiet
La Garriga CEIP Tagamanent
Girona Gremi Artes de Carnissers i Xarcuters de les Comarques Gironines
N Models Girona, O2 Centre Wellness - Parc del Migdia
Societat de Pesca Esportiva "La Canya" de Girona
Golmès Pere Mateu
La Granada Societat Recreativa i Cultural Casal de la Granada.
La Granadella Ass. de Dones El Roure
Granollers Centro Cultural Andaluz de Granollers,
Societat Coral Amics de la Uni de Granollers
Guardiola de Font-rubí Esplai El Gotim
Els Guiamets Ass. de Dones dels Guiamets
Guissona Escola de Dansa Montse Esteve
L'Hospitalet de l'Infant ¸rea de Cultura - Ajuntament de Vandell s i l Hospitalet de l Infant
L'Hospitalet de Llobregat Fila 12 - Ass. de Teatre de Can Serra
Hostalric Ajuntament d’Hostalric - Punt Informaci Juvenil
Igualada Escola Pia d Igualada, Fundaci Privada Cal Ble
Ivars d'Urgell Ass. de Dones de l’Estany d’Ivars i Vallvera
Jesús-Tortosa E.M.D. de Jes s
Juneda Ajuntament de Juneda, Ass. de Dones de Juneda
Linyola Ass. de Dones de Linyola - ADOLI
La Llacuna Pessebre Vivent de la Llacuna
Llagostera Club Handbol Llagostera
Llardecans Ass. de Dones l Espiga de Llardecans
Lleida Club Esportiu la Seu Vella, Equipament C vic de Lleida, IES Ronda
La Cucanya, Penya Barcelonista de Lleida i Prov ncia, Piscina Coberta
Municipal de Lleida
Llorenç del Penedès CEIP Les Cometes, Coral Harmonia de Lloren del Pened s, Societat
Cultural i Recreativa La Cumprativa
Lloret de Mar Ajuntament de Lloret de Mar - ¸rea d’Esports, El Puntet - Punt d’Informaci
Juvenil, Esplai Bimbirimboines, Grup de Teatre Somcomsom
Maials Uni Recreativa Maialenca
Malgrat de Mar Concert Coral Cor Aura
Manresa Ass. de Ve ns Vic-Remei, IES Guillem Cat - Branca Sanit ria
Marçà Ass. de Dones La Miloquera de Mar
Martorelles Club de Futbol Martorelles
Les Masies de Voltregà Ajuntament de les Masies de Voltreg
El Masnou Amics del Ferrocarril del Masnou - AFEM, ColÆlectiu del Poble del Masnou
Maspujols Ass. de Dones La D lia de Maspujols
El Masroig Ass. de Dones del Masroig
Massanes Ass. Amics de Massanes
Massoteres Ajuntament de Massoteres
Miami-Platja F rum Miami
El Milà Ajuntament del Mil

Població Entitat
Molins de Rei Club Natació Molins de Rei, Unió de Botiguers de Molins de Rei
Mollerussa Ass. de Dones Albada del Pla d'Urgell, Ass. per la promoció de
l'Espectacle Infantil i Juvenil - La Xarxa
Monells Escola Agrària de Monells
Montcada i Reixac Societat Cultural i Recreativa La Unió de Mas Rampinyo
Montgat Ass. Casc Antic Montgat - Secció Petanca
Montoliu de Lleida Ass. Cultural i Recreativa de Montoliu de Lleida
Mont-roig del Camp Unió de Dones de Mont-roig del Camp
Móra d'Ebre Ass. de Dones de Móra d'Ebre, Residència Natzaret
Navarcles Ajuntament de Navarcles
Navata Pessebre Vivent de Navata, Torremirona Club de Golf
Nulla Col·lectiu de Dones de Nulles
Olot Ass. d’Alumnes de l'Escola Pia d'Olot, Gimnàs Verd
Ordal Esplai Sol Neixent
Oristà Amics de La Marató del Municipi d'Oristà
Osor Casal de Jubilats i Simpatitzants de la Vall d'Osor
Palamós Ajuntament de Palamós, Club de Vela de Palamós
El Palau d'Anglesola Agrupament Escolta "Lo Merlet"
Les Pallargues AMPA de l'Escola Pública de Les Pallargues
El Perelló Agrupació Musical L'Emburgada, AMPA CEIP Jaume II
Piera CEIP Creixa
Grup del Barri Can Canals
Pira Anguera Associació Cultural
Planoles Ass. de Dones de Planoles
Platja d'Aro Ajuntament de Castell-Platja d'Aro - Àrea d'Esports, Ass. de la Gent
Gran de la Vall d'Aro i S'Agaró, Club Bàdminton Platja d'Aro, Colla
Els descarrilats de Platja d'Aro
La Pobla de Segur Ass. Cultura Comú de Particulars, Grup Escènic Lo Tamarro
Ponts Dones Mig Segre - DOMISE
El Prat de Llobregat Eurohandling BCN UTE
Prats de Lluçanès Ajuntament de Prats de Lluçanès - Regidoria de Serveis Socials
Premià de Dalt Ajuntament de Premià de Dalt
Premià de Mar Ajuntament de Premià de Mar, Ass. Cultural i Recreativa Carnestoltes,
Centre L'Amistat
Puigcerdà Couloir Extreme Sports
Puig-gros Ass. de Dones El Portal
Reus AMPA de l'Escola A.R.C.E., Fundació Privada Pare Robert Montserrat
Ribes de Freser Ass. de Jubilats i Pensionistes de Ribes de Freser
Riells i Viabrea Club Riells Viabrea
Riudarenes Esplai Parroquial Sant Martí de Riudarenes
Riudecanyes Grup de Dones de Riudecanyes
Riudecols Ass. de Dones de Puigcerver
Riudellots de la Selva Grup d’Esplai Parroquial de Riudellots de la Selva
Riudoms Bella Llar, Escola i Sala de Ball New York, L'Estudi. Centre de Dansa,
Escola de Ball de Saló i Gimnàs
Rodonyà Ass. de Dones "El Taller"
Rubí Joves Solidaris Rubí
Sabadell Aeroclub de Sabadell, Ass. de Veïns Creu Alta de Sabadell, ATTES
Ass. de Tennis Taula del Vallès, Centre Parroquial Sant Vicenç, Federació
Catalana de Perruqueries i Bellesa, Grup d'Amics de La Marató Sabadell,
IES Escola Industrial de Sabadell, Les Puntaires de Sant Oleguer, Mola TV,
Orquestra Simfònica del Vallès
Sallent Ajuntament de la Vila de Sallent
Santa Coloma de Gramenet Casal d'Amistat amb Cuba
Sitges Amics de la Sardana de Sitges
Solsona Consell Comarcal del Solsonès
Sort Consell Esportiu del Pallars Sobirà
Soses Ajuntament de Soses - Comissió de Festes
St. Adrià de Besòs Asociación de Mujeres Bienvenida
St. Boi de Llobregat Col·legi Llor
St. Carles de la Ràpita Ràpita Endavant
St. Cebrià de Vallalta Ajuntament de Sant Cebrià de Vallalta
St. Climent de Llobregat Ajuntament de Sant Climent de Llobregat
St. Cugat Sesgarrigues Ajuntament de Sant Cugat Sesgarrigues
LA MARATÓ 2003 | 19

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
Població Entitat
St. Esteve Sesrovires ARTVIU
St. Feliu de Guíxols Casal Tueda A.P.I.T.E.
St. Feliu de Llobregat Agrupació Cultural Folklòrica Sant Feliu de Llobregat, Ass. Balls d'Envelat
Santfeliuenc, Colla de Gegants de Sant Feliu de Llobregat
St. Fruitós de Bages Comissió Ciutadana 2000 m de Solidaritat
St. Hilari Sacalm Ass. Juvenil Carro del Mam, Ass. Via Crucis Vivent de Sant Hilari Sacalm
Casal x Joveshs
St. Jaume de Llierca Poligaris - Club d'Arquers de Sant Jaume de Llierca
St. Joan de les Abadesses Ass. de Jubilats i Pensionistes de Sant Joan de les Abadesses
St. Joan Despí Grup de Teatre "Els Pastorets" de TV3
St. Jordi Desvalls Societat Esportiva de Sant Jordi Desvalls
St. Llorenç de Morunys Ass. Cultural L'Estaca
St. Pere de Ribes Ass. de Ball de Saló Roquetes de Sant Pere de Ribes
St. Pere Molanta Grup de Joves de Sant Pere Molanta
St. Pol de Mar Centre Cultural i d’Esbarjo Sant Pol de Mar
St. Quintí de Mediona Ajuntament de Sant Quintí de Mediona
St. Quirze de Besora Agrupació Cívica i Cultural Bisaura
St. Sadurní d'Anoia Punt d'Informació Jove Índex
St. Vicenç dels Horts Agrupació Cultural Els Pirates de Molins de Rei
Sta. Coloma de Farners AMPA del Col·legi Josep Boada de Riudarenes,
Secció gimnàstica rítmica, Federació de Comerç de la Selva
Sta. Coloma de Queralt AMPA CEIP Cor de Roure
Sta. Maria de Palautordera UBIC de Palautordera
Sta. Maria d'Oló Ajuntament de Santa Maria d'Oló
Sta. Perpètua de Mogoda Ajuntament de Santa Perpètua de Mogoda, IES Estela Ibèrica
Subirats Grup POR GUSTO
Sudanell Ass. de Sudanell
Tagamanent Comunitat de Propietaris de Tagamanent
Tarragona Acció Cívica del Tarragonès, Ass. de Pares d'Alumnes del Col·legi
Sagrat Cor de Tarragona, CEIP Mare de Déu dels Àngels
Tàrrega Club d'Automobilisme Escuderia Tàrrega
Teià Ajuntament de Teià
Térmens Ajuntament de Térmens
Terrassa Biblioteca Central de Terrassa, Casal Cívic Pla de Bonaire, Cingle -
Centre d'Ensenyaments Secundaris
Tiana Taller de Cuina de Tiana, Ajuntament de Tiana
Tivissa Col·lectiu Solidari Xino-Xano
Tordera Agrupació L'Amistat de l'Alt Maresme de Tordera, Ajuntament de Tordera
Tornabous Ass. de Dones Esperança de Tornabous
La Torre de Cabdella Veïns de la Vall Fosca - Amics de La Marató
La Torre de l'Espanyol Ass. de Dones Bassa d'Oli
Torrefarrera Ass. Cultural de Dones L'Amistat de Torrefarrera
Torregrossa Ajuntament de Torregrossa
Torrelavit Veïns de Torrelavit
Torroja de Segarra Ass. de Dones El Lilà
Tortosa Consell Comarcal del Baix Ebre
Ulldecona DISCO-PUB VAYA1
Vallbona d'Anoia Agrupament Escolta Josep Masclans
El Vendrell Consell Esportiu del Baix Penedès, Esplai Zig-Zag, Jove Baix Penedès.
Consell Comarcal del Baix Penedès
Verdú Ass. de Dones L'Argila, Llar d'Avis Tercera Joventut de Verdú
Vilablareix Grup Municipal d'ERC de Vilablareix
Viladrau Amics de Viladrau
Vilafant Ass. de Judo de l'Alt Empordà
Vilagrassa Ass. de la Dona El Roser
Vilalba dels Arcs Ass. de Dones de Vilalba dels Arcs
Vilanova de Bellpuig Ass. de Dones Anjua
Vilanova de Meià Ass. de Dones La Coma de Meià
Vilanova del Vallès Ass. de Dones La Lluna, Centre Social del Jubilat "Àngel de la Guarda",
Comissió Marató Vilanova del Vallès
Vilanova d'Escornalbou Ass. de Dones de Vilanova d'Escornalbou i L'Arbolet
Vilassar de Mar UE Vilassar de Mar
La Vilella Baixa Ajuntament de la Vilella Baixa
Vinyols i els Arcs Ass. Cultural El Replà
Ciutat de Mallorca Universitat de les Illes Balears
Perpinyà Casa de Perpinyà
Principat d’Andorra Crèdit Andorrà, Gran Valira

Comunicació
El dia 29 d’octubre, al Saló d’Actes de TVC,
la Fundació va convocar la premsa per
informar del contingut de la campanya de
sensibilització i de difusió de La Marató.
S’hi va presentar, entre altres materials,
l’edició especial d’un VHS dirigit als centres
educatius i cívics d’arreu de Catalunya.
La repercussió que va tenir en els mitjans de
premsa escrita generalista i comarcal va ser
molt important (99 impactes), com també
van mostrar molt d’interès les emissores de
ràdio comarcals i locals (22 mitjans), amb
entrevistes i reportatges especials sobre
La Marató.
Accions de difusió
· Publicació de 38 pàgines d’anuncis als
mitjans de premsa escrita.
· Emissió de falques radiofòniques per
diverses emissores de ràdio del país.
· Encartament de 60.000 fullets en el
suplement dominical del diari Avui.
· Col·locació de 180 opis pels carrers de
Barcelona, TMB, l’Hospitalet de Llobregat
i Girona.
· Col·locació de 3.460 banderoles a les
ciutats de Barcelona, Girona, Lleida,
Tarragona, i a diverses poblacions catalanes:
Badalona, Banyoles, Figueres, l’Hospitalet
de Llobregat, Manresa, Miami Platja, Montroig,
Olot, Palamós, Reus, Sabadell, Sant
Joan Despí, la Seu d’Urgell, Tàrrega,
Terrassa i Tortosa. També va participar en
la campanya de difusió la Ciutat de Mallorca.
· Presència de 3 camions amb publicitat
pels carrers de Barcelona, Girona i
Tarragona.
Presentació de la campanya de sensibilització i difusió de La Marató 2003 als mitjans de comunicació,
celebrada a l’Auditori de TVC.
LA MARATÓ 2003 | 21

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
Organització
i logística
El mes de setembre s’inicien les reunions de
la Comissió de Coordinació, formada, a més
dels representants de la Fundació i TV3, pels
representants del Departament de Benestar i
Família, de La Caixa, PriceWaterhouseCoopers
i de Telefónica, empreses col·laboradores
habituals amb La Marató de TV3.
Aquesta Comissió es reuneix amb l’objecte
de dur a terme la planificació de les activitats
prèvies necessàries per a l’èxit de La Marató.
Direcció General d’Accions
Comunitàries i Cíviques del Departament
de Benestar i Família: col·labora en la
coordinació de la campanya de promoció
social i les tasques dels voluntaris que fan
possible la recepció de trucades a les
diverses seus, els serveis de guarda-roba,
d’ordre, d’àpats, etc.
Bassat Ogilvy & Mather Comunicación:
responsable de la creativitat de la campanya
de promoció social i de difusió de La Marató.
Caixa d’Estalvis i Pensions de Barcelona:
organitza el processament de les dades
referents a les donacions i el cobrament
posterior i prepara la documentació de
tancament de La Marató.
PriceWaterhouseCoopers: estableix els
controls i les verificacions de les donacions,
amb l’auditoria posterior de la Fundació, tot
donant la màxima fiabilitat i transparència.
Telefónica: instal·la les línies telefòniques
necessàries per rebre donacions. Aquestes línies
estan distribuïdes entre les seus de Barcelona,
Lleida, Girona, Tarragona i els estudis de TV3.
Tradia: transporta el senyal d’àudio i vídeo
de les activitats exteriors mitjançant les
unitats mòbils desplaçades, que fan els
enllaços terrestres i via satèl·lit.
Seus telefòniques
Les donacions es van fer per mitjà d’un
ingrés directe o transferència bancària, per
Internet, pel Servicaixa i mitjançant la trucada
al 905111213 el mateix dia del programa
La Marató.
Per atendre les trucades, la Fundació va
posar en funcionament 5 seus telefòniques
repartides territorialment –Barcelona: Palau
Sant Jordi i Hall de TV3; Palau Firal de
Girona; Universitat de Lleida, i Cobert 1
del Port de Tarragona.
Els caps de seu s’incorporen durant
un període de dos mesos (novembre
i desembre) per endegar les tasques
necessàries per al bon funcionament
de La Marató.

Voluntaris i línies telefòniques
Cadascuna de les seus repartides territorialment
per Catalunya disposa d’un determinat
nombre de línies que, en l’edició del 2003,
van ser ateses pels 2.734 voluntaris
procedents de les 210 associacions i entitats
de voluntariat.
També hi van participar com a voluntaris
treballadors de TV3, de Catalunya Ràdio i de
les empreses de la CCRTV i representants de
la societat civil, empresarial i del món polític.
Empreses que van donar suport
a La Marató
A totes les seus:
Aigua Sant Aniol; Bimbo, SA; Blachere;
Bombons Blanxart; Cadí Formatges i Mantega;
Café Saula; Casademont Indústria Càrnia;
Cepac; Cobega, SA; Comercial Bolsera, SA;
Chupachups, SA; Danone, SA; Eckes Granini
Iberica; Establiments Viena, SA; Ferfor;
Freixenet; Frit Ravich, SL; Gelats Menorquina;
Grup Borges Jordi Pons, SL; Kenwood Ibérica;
Llet de Catalunya, SL; Massegur; Mercabarna,
SA; Nestlé España, SA; Portell, Vins i Cabes;
Regionals Renfe; Serunión; Servei Estació;
Telepizza; Transports Azkar, SL; Transports
Montjuïc; Xocolates Las Comas-Cemoi, SA.
Palau Sant Jordi
Aramark; Barcelona Promoció; Ben Fumat; Casa
Gay; Club de Fitness DIR; Col·lectiu Osona
Cuina; Dasler; DHL Espress; Dyna-mobel; Flors
Navarro; Focus; Foix de Sarrià; Fomento de
Construcciones y Contratas, SA; Galerias del
Tresillo; Gremi de Flequers de Barcelona; Grup
Soteras; Ikea; J. Bárzano, SA; Julià; Marcelo Vilà,
SA; Meym Gestion Integral de Mantenimiento;
New Components; Pastisseria Escribà; Radio
Taxi 033; Semon; Tecno Antena Sistemas; Torres
Alquiler de Calefacción; Transports Metropolitans
de Barcelona; UGT de Catalunya; Wall Video.
Palau Firal de Girona
Bellsola; Bonal, SL; Borges; Congresos Girona;
Ecosan Sanitaris Portàtils; Escola d'Hostaleria de
Girona; Fersix; Freesia; Fritravich; Fruites Danés;
Furgoempordà-Llicència Hertz; Girona Fruits,
S.Coop.Ltda.; Gremi de Flequers de les
Comarques Gironines; Hotel Carlemany; Hotel
Costabella; Insema, SA; Jordi Pons, SL; Liderou;
Lloguers i Muntatges Pous, SL; Manantial Sant
Hilari; Massegur; Miquel Alimentació Grup;
Mirame Publicidad Dinamica; Pastisseria
Castelló; Peixos Puignau, SA; Rètols Gispert;
Santdalmai, SA; Securitas Seguridad España;
Servis Complet, SA; Transportes Azkar, SL;
Vedella Bencriada; Videoson; Vivers Muner.
Universitat de Lleida
ACTEL; Associació Aspros; Cafès Batalla
2000; Casa Piqué; Comertel, SA; Elecson;
Empresa Municipal de Serveis Comunitaris;
Escola d'Hoteleria de Lleida; Fotografia Gómez
Vidal; Hotel NH Pirineos; Pastisseria Pons;
Pastisseria Tugues; Perfumeria La Primavera;
Restaurant Fonda del Nastasi; Restaurant
Tasta-pans; Rètols Garcia; Seinsa; Valls
Comercial Fripan.
Cobert núm. 1 del Port de Tarragona
Automàtic Tarraco; Civit Floristeria; Christian's
Servic; Complex Educatiu de Tarragona;
Establiments Viena; Fruites Civit, S.L.; Gremi de
Forners de Tarragona; Guimerà SA; Hotel Astari;
Hotel Lauria; Jordi Pons S.L.; La Botiga del Cafè
/ Cafès Brasilia; M. Dolors Ciurana xarcuters;
Marinada Tarragona SL; Material per a
l'Hostaleria Jofre; Pastisseria Conde; Pastisseria
Font; Pastisseria Geneve; Pastisseria Marmol;
Pastisseria Palau; Pastisseria Rovira; Pastisseria
Sanromà; Pastisseria Trill; Pastisseria Viver;
Propaganda Portàtil SL; Publicitat Borrell; Ral-
Decoració; Ribes i Casals; System So.
DISTRIBUCIÓ DE LES LÍNIES TELEFÒNIQUES I DELS VOLUNTARIS
Barcelona* Girona Lleida Tarragona Altres Total
Línies telefòniques 537 52 52 75 716
Voluntaris 1.709 160 180 220 2.269
Nombre de trucades
Procedència
52.493 8.538 4.953 6.569 1.118 73.671
* S hi sumen el Palau Sant Jordi i el Hall de TVC.
LA MARATÓ 2003 | 23

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
COL·LECTIUS DE VOLUNTARIAT AMB LA MARATÓ
Població Entitat
Alcarràs Amics de la Cultura Tradicional
L'Aleixar A.D.A - Ass. de Dones
Alella Ass. de Dones Montserrat Roig d'Alella
Algerri Ateneu Penya Tarros
Amer Grup d’Esplai la Teranyina
Badalona C.E. Lluís Ma Chanut, El Micaquer, Esplai i Temps Lliure
Barcelona A.C.A.M, Ader·Ass. Malalts de Ronyó, Afanoc, Afas, Agrupament Scout Gandhi, Aiv,
Ambit Maria Corral, Aplic, Asem, Ass. de Dones Taxonera, Ass. d'Extres de Catalunya,
Ass. Palas Atenea, Ass. Pere Relats per Ancians, Ass. Taller Ocupacional Ariadna,
Ass. Veïns Sant Andreu del Palomar, Ass. Alzheimer Catalunya, Ass. Asmatològica Catalana,
Ass. Asmatològica de Lleida, Ass. Benestar i Desenvolupament, Ass. Bipolars de Catalunya,
Ass. Catalana Parkinson, AVV Navas, Barnataris, Caliu del Foc, Càritas Diocesana - Barcelona,
Casal Català del Carmel, Casal de Sords de Barcelona, Catsar, Centre d'esplai el Drop,
Centre d'Esplai Santa Maria de Gràcia, Centre Juvenil Sant Andreu, Centre Passatge,
Club Escolaris Sarrià, Club Esportiu d'Activitats de Muntanya, Col·legi Sagrat Cor Sarrià,
Conex - Barcelona, Creu Roja, Ensems, Escola Sant Ignasi Sarrià, Escoltes Catalans,
Esplai Espurna, Esplai Natzaret i Betània, Esplai Tonxué, Fatec, Fundació Ajuda i Esperança,
Fundació Catalana Aspanias, Fundació Catalana Paràlisi Cerebral, Fundació Catalana Tutelar de
Disminuïts Psíquics, Fundació Malalts Mentals de Catalunya, Fundació Pere Tarrès, Fundació Pere Tarrés,
Gramic, Grup d'Amics Gais, Hospital de Dia d’Esclerosi Múltiple, Hospital General de Catalunya,
Hospital Sant Gervasi, Hospitalitat Mare de Déu de Lourdes, Justícia i Pau, La Dona, Diàleg i Catalunya,
L’Hora de Déu, Llar Mare de Neu de Gràcia, Lliga Reumatològica Catalana, Mountain Wilderness Catalunya,
Nexe Fundació, Oficina Voluntariat Evangèlic, Once, Química Farmacèutica Bayer, Residència la Verneda,
Rotaract, Secot, Servei Solidari, Tercera Edat pel Tercer Món, Unió Esportiva Horta, Voluntaris 2000
Bescanó Agrupació Sardanista Avi Guillem
Les Borges Blanques Grup de Teatre Nissaga
Cabrera de Mar Cabrera Solidària
Cabrils Ass. Voluntaris de Cabrils Bona Terra
Caldes de Montbui Acció Cívica Calderina
Cambrils Col·lectiu de dones Vilafortuny
Capellades Fundació Consorts Guasch
Castellar del Vallès Fundació Obra Social Benèfica
Castellvell del Camp Unió de Dones
Cerdanyola del Vallès AV Can Xarau, Esplai i Fa Sol
Corbera de Llobregat Centre d'Esplai Corbera, Afa Baix Llobregat, Fundació de l'Esplai
L'Espluga de Francolí Casal de l’Espluga de Francolí
Esplugues de Llobregat Ass. Voluntaris Sant Joan de Déu, Fundació Finestrelles, Grup d'Esplai Espurnes, Voluntaris Sant Joan de Déu
Figueres Ass. Voluntariat Figueres/Alt Empordà
Gelida Esplai Mainada
Girona Adac, Adarg, Asstem, Confraria Mare de Déu dels Dolors, Esclerosi Múltiple Girona, Fadesia
La Caixa - Girona, Mifas, Voluntaris Penitenciaris
Granollers Ampa Granularius, Col·lectiu d'esplais Barris
Guardiola de Berguedà Grup d’Esplai Penyes Altes
L'Hospitalet de Llobregat Ass. Disminuïts Físics l'Hospitalet, Ass. Trasplantats Cardíacs, Club Sant Feliu,
Facultat d'Odontologia, Gent de Pau, Hospital Universitari de Bellvitge,
Nens i Joves amb Cardiopàtia, Vocalia Drogodependències AV
Igualada Atlas, Escola Àuria Apinas
Jorba Ampa Col·legi Montclar
Juneda Agrupació Sardanista de Juneda, Ass. contra el Càncer de Juneda
Lleida Adells, Aecc, Ampa les Heures, Ass. Aspros, Ass. Anti Sida Lleida,
Ass. Familiars Alzheimer Lleida, AV Blocs Joan Carles, AV Capa d'Or Sot de Fontana,
AV Magisteri Zona Alta,Càritas Diocesana - Lleida, Casal Cívic de Lleida, Castellers de Lleida,
Esclat - Ass. Solidaritat i Servei Sta. Teresina, Esplai Sant Pau, Estudiants Nacionalistes - Lleida,
Fapac, Federació Cases Regionals de Lleida, Federació d'Associacions de Veïns de Lleida,
Fundació Esclerosi Múltiple, Jubilats i Pensionistes Arques de Rueca, Organització de Veïns de Pardinyes
Manlleu Comunitat Propietaris Manlleu, Grup Sardanista Ocellets del Ter
Manresa Voluntariat St. Joan de Déu
Mataró Voluntaris per al Futur
Molins de Rei Centre Esplai Mib
Mollerussa Acudam
Mollet del Vallès Aramo
Montcada i Reixac Esplai Sesa
Móra d’Ebre Ass. de Dones Móra d'Ebre
Olot Alba - Ass. de Dones de la Garrotxa
Parets del Vallès Solidaris de Parets
El Pla de Sta. Maria Catesplai Planenc

Població Entitat
El Prat de Llobregat Ass. Catalana contra el Càncer
Reus Ass. Parkinson Comarques Tarragona, Esclerosi Múltiple Tarragona
Riudoms Esplai del Casal Riudomenc
La Roca del Vallès Esplai La Xiruca
Rosselló Ass. de Dones Alkanissia, Coral Flor l'Espígol
Rubí Agrupament Escolta Albada, Club Minusvàlids Horitzó
Sabadell Grup d’Esplai Gràcia, Sid Moskitia
Solsona Agrupament Esplai del Solsonès
St. Cugat del Vallès Fundació Privada Jeroni Moragues
St. Esteve Sesrovires Esplai Trapella
St. Joan les Fonts Escola Municipal de Belles Arts
St. Vicenç dels Horts Flor de Neu, Fundació Privada Iris
Sta. Coloma de Gramenet Agrupació de Veïns Barri Fondo, Ayupa, Centre d’Esplai Mainada,
Centre Excursionista Puigcastellar, Grupo de Mujeres Barrio Can Mariner
Sta. Oliva Colla Gegantina Santa Oliva
Sta. Perpètua de Mogoda Voluntaris Forestals
Tarragona Agrupament Escolta la Salle Torreforta , Amics dels Imigrants, Ass. Aurora,
Ass. Ment i Salut "La Muralla", Astafanias, Ateneu Cultural Dones Campclar
Casal Cívic Campclar, Ceradai de Catalunya, Colla Cossetània
Terrassa Ass. Coordinadora d'ajuda Unida- Acau, Centre d'Esplai Sant Llorenç
Col·lectiu de dones Ca n’Anglada, Grup de Joves Ekipo Parásito, Voluntaris Terrassa
Torelló Càritas Interparroquial Torelló
Valls Esplai Esquirols, Les Jaume Huguet
El Vendrell Grup de Dones del Vendrell
Vilafranca del Penedès Camí Solidari
Vilanova i la Geltrú Ass. Voluntaris pel Garraf, Societat Sardanista Dansaires Vilanovins
Vimbodí Grup de Grallers la Palanca
Patrocini
Per finançar la campanya de sensibilització i
de difusió de La Marató de TV3, i també per
ajudar a sufragar les despeses del seu
funcionament, la Fundació du a terme una
campanya de captació de recursos, cercant
aportacions econòmiques de les empreses.
Empreses que van patrocinar
l’edició 2003:
Novartis
AstraZeneca
Carburos Metálicos
Glaxo Smith Kline
Almirall Prodesfarma
Fundació Agrupació Mútua
Titan
Fòrum Samitier
DAMM
FIATC
Boehringer Ingelheim
Marc Martí
Café Saula
Aigua Sant Aniol
LA MARATÓ 2003 | 25

Tancament
de comptes
En l’exercici 2003-2004, la Fundació
va obtenir un total de 4.484.069 euros,
provinents de donacions, patrocinis i altres,
i d’interessos bancaris.
Els recursos obtinguts es destinen a finalitats
fundacionals: activitats de sensibilització i de
difusió i a finançar projectes de recerca de
les malalties respiratòries cròniques, objecte
de La Marató del 2003.
Les despeses d’administració de la
Fundació són cobertes amb els interessos
bancaris que generen els donatius i, si la
INGRESSOS
Donatius 3.769.462,18
Patrocini i altres 509.802,83
Interessos bancaris 204,804,44
Total ingressos 4.484.069,45
APLICACIONS
xifra obtinguda és insuficient, es completa
amb els recursos obtinguts de patrocini.
Els diners procedents de donatius
s’esmercen, en la seva totalitat, en les
finalitats fundacionals de suport a la
recerca biomèdica i a la sensibilització
sobre la malaltia de què tracta La Marató.
Els comptes anuals de l’exercici que
presentem van ser auditats favorablement
per PriceWaterhouse Coopers Auditors.
El Departament d’Economia i Finances
està elaborant actualment l’auditoria
d’aquest exercici.
Finalitats fundacionals (A i B) 4.094.873,94 91,32%
A. Ajuts a projectes de recerca 3.344.269,38 74,58%
B. Activitats de sensibilitzaci i difusi 750.604,56 16,74%
Despeses d’administració 389.195,51 8,68%
Total aplicat 4.484.069,45 100%
Sensibilitzaci
i difusi 16,74%
Administraci 8,68%
TANCAMENT DE COMPTES | 27
74,58% Recerca

Recerca biomèdica
Els recursos de La Marató potencien la
investigació científica d’excel·lència, consoliden
equips científics i mèdics i constitueixen
una de les fonts de finançament més
importants per a la recerca biomèdica a
Catalunya.
Els projectes finançats per La Marató tenen
un període de desenvolupament que supera
els tres anys. Per això, en aquesta Memòria
d’activitats, hi surten reflectides totes les
gestions –econòmiques i científiques– que
s’hi van dur a terme, tot coincidint amb
diverses edicions de La Marató.
Així, durant l’exercici juliol 2003-juny 2004,
la Fundació va fer pública la convocatòria
d’ajuts de La Marató del 2003, dedicada a les
malalties respiratòries cròniques, i va avaluarne
els 105 projectes presentats, segons la
gestió de l’Agència d’Avaluació de
Tecnologia i Recerca Mèdiques. En aquest
període, la Fundació també va aprovar
l’adjudicació dels fons obtinguts durant
La Marató del 2002, centrada en les
malalties inflamatòries cròniques, a un total
de 20 projectes de recerca biomèdica, i va
organitzar el IV Simposium, acte en el qual
els investigadors que van finalitzar els seus
projectes de recerca biomèdica sobre les
malalties genètiques hereditàries, tema que
va centrar La Marató del 1997, van presentar
els seus resultats a la comunitat científica
i a la societat en general.
A continuació, detallem el conjunt d’actuacions
fetes en l’àmbit de la recerca durant
l’exercici juliol 2003-juny 2004, i també els
resums de les memòries finals presentats
en el IV Simposium.
RECERCA BIOMÈDICA | 29

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
Malalties respiratòries cròniques. La Marató 2003
Convocatòria d’ajuts
Acabada La Marató del 2003, el Patronat va
aprovar, acceptant la proposta de la Comissió
Assessora, les bases de la convocatòria
pública per a la presentació de projectes.
La convocatòria va ser anunciada a la
premsa i al web de la Fundació. Igualment,
es va enviar per correu electrònic a tots
els centres hospitalaris i universitaris que
desenvolupen recerca biomèdica. S’hi van
presentar un total de 105 projectes de
recerca. D’aquests, 51 corresponien a
malaltia pulmonar obstructiva crònica
(MPOC), 24 a asma, 2 a MPOC i asma
conjuntament i els 28 restants a altres
malalties respiratòries cròniques.
La majoria dels projectes presentats eren
unitaris, 86, i la resta, 19, coordinats entre
dos o més grups de recerca de centres
diferents. En els projectes coordinats es
poden incloure grups de recerca de fora
de l’àmbit territorial previst pels estatuts
de la Fundació.

CENTRES DELS EQUIPS DE RECERCA QUE VAN PRESENTAR PROJECTES
EN LA CONVOCATÒRIA DE LA MARATÓ 2003
Centres Projectes unitaris Projectes coordinats Subprojecte*
Hospital Clínic i Provincial de Barcelona 11 5 1
Hospitals Vall d’Hebron 10 1 2
Hospital de la Santa Creu i Sant Pau 8 2 -
Hospital Universitari Germans Trias i Pujol 7 2 -
Consorci Hospitalari del Parc Taulí. Sabadell 6 - 1
Institut Municipal d’Investigació Mèdica 6 - 2
Ciutat Sanitària i Universitària de Bellvitge 5 - -
lles Balears 5 1 2
Fundació Jordi Gol i Gurina 4 - -
Centre Superior d’Investigacions Científiques 3 1 1
Universitat Autònoma de Barcelona 3 1 1
Universitat de Barcelona 3 - 3
Hospital de Mataró 2 - -
Hospital Universitari Joan XXIII. Tarragona 2 - -
Institut de Recerca Oncològica 2 1 -
Parc Científic de Barcelona 2 - -
Agència de Salut Pública de Barcelona 1 - 1
Hospital de Santa Caterina. Girona 1 - -
Hospital de Viladecans 1 - -
Hospital Mútua de Terrassa 1 1 -
Hospital Universitari Arnau de Vilanova. Lleida 1 - -
Hospital Universitari Sant Joan de Déu 1 1 1
Universitat Pompeu Fabra 1 - -
Escola Politècnica Superior de Vic - - 1
Harvard Medical School. Boston. EUA - - 1
Hospital de Terrassa - - 2
Hospital Duran i Reynals - 1 -
Hospital General de l’Hospitalet - - 1
Hospital Gregorio Marañón. Madrid - - 1
Hospital Josep Trueta de Girona - 1 -
Hospital Sant Jaume. Olot - - 1
Hospital Universitari Sagrat Cor - - 1
Institut Universitari de Ciència i Tecnologia - - 1
Universidad del País Vasco - - 1
Universitat de Chieti. Itàlia - - 1
Universitat Politècnica de Catalunya - 1 3
University of Gent. Bèlgica - - 1
University of Rochester. EUA - - 1
Total projectes unitaris 86
Total projectes coordinats 19
Total projectes presentats 105
*Aquests subprojectes formen part de projectes coordinats presentats per altres centres
RECERCA BIOMÈDICA | 31

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
Malalties respiratòries cròniques. La Marató 2003
Avaluació dels
projectes de recerca
Finalitzat el termini de la convocatòria, la
Fundació va registrar i revisar els projectes
presentats i els va enviar a l’Agència
d’Avaluació, Recerca i Tecnologia Mèdiques
(AATRM), que és l’encarregada de gestionar
el procés d’avaluació, seguint un procediment
que en garanteix la rigorositat i transparència.
1. Selecció dels avaluadors
El Comitè Científic de l’AATRM i la Comissió
Assessora de la Fundació van elaborar una
llista de professionals experts en les malalties
respiratòries cròniques, basada en la seva
experiència, tant en la metodologia de
recerca com en l’avaluació de projectes, tot
valorant la seva producció científica durant
els darrers anys. En aquesta edició, es van
seleccionar 52 avaluadors procedents de
14 països: Regne Unit (17 avaluadors), Itàlia
(7), EUA (7), Bèlgica (5), Canadà (3),
Dinamarca, Suècia, Espanya i Alemanya
(2 cadascun) i França, Holanda, Noruega,
Nova Zelanda i Suïssa (1).
2. Procés d’avaluació dels projectes
presentats al concurs
Cada projecte que es presentà a concurs
es va assignar a dos avaluadors de manera
independent.
En una primera etapa, es va revisar el projecte
de manera anònima, tenint en compte la
qualitat, la rellevància científica i sociosanitària,
el rigor metodològic i la novetat, referent
al coneixement ja existent en la bibliografia
mèdica internacional.
En una segona etapa, els avaluadors van
estudiar la composició de l’equip investigador,
i també la seva experiència prèvia en la
línia de recerca. Un cop finalitzada aquesta
etapa, es va convocar a Barcelona un comitè
seleccionador format per un grup reduït dels
avaluadors, que van ordenar els projectes en
una classificació de qualitat. Dels projectes
presentats, la Comissió Assessora de la
Fundació va revisar el resultat dels experts
i en funció dels recursos econòmics disponibles,
va proposar al Patronat el finançament
dels projectes seguint l’ordre del rànquing.

AVALUADORS DELS PROJECTES DE RECERCA PRESENTATS A LA CONVOCATÒRIA DE LA MARATÓ 2003
ID Avaluador Organisme País
1 Akdis, Cezmi Swiss Institute of Allergy and Asthma Research Suïssa
2 Ambrosino, Nicolino Azienda Ospedaliera Universitaria Pisana Itàlia
3 Andreakos, Evangelos Imperial College London Regne Unit
4 Barnes, Peter Imperial College London Regne Unit
5 Beasley, Richard Medical Research Institute of New Zealand Nova Zelanda
6 Bjerrum, Lars University of Southern Denmark Dinamarca
7 Blanc, Paul University of California EUA
8 Brown, Jeremy Imperial College London Regne Unit
9 Calverley, Pma University of Liverpool Regne Unit
10 Caramori, Gaetano* University di Ferrara Itàlia
11 Chakir, Jamila Laval Hospital Research Center (Québec) Canadà
12 Chambers, Rachel Imperial College London Regne Unit
13 Chung, KF Imperial College London Regne Unit
14 Clini, Enrico University of Modena Itàlia
15 Currie, Graeme Aberdeen Royal Infirmary Regne Unit
16 Das, Pranab Kumar* University of Amsterdam Holanda
17 Decramer, Marc University Hospital of Leuven Bèlgica
18 Fernández, Carmen* Stockholm University Suècia
19 FitzGerald, Mark University of British Columbia Canadà
20 Foxwell, Brian Imperial College London Regne Unit
21 Fujiwara, Paula Int. Union Against Tuberculosis and Lung Disease França
22 Garcia, Joe GN Johns Hopkins University EUA
23 García-Río, Francisco Hospital Universitario La Paz Espanya
24 Groneberg, David* Umboldt University Berlin Alemanya
25 Grossman, Ronald Medicine University of Toronto,Credit Valley Hospital Canadà
26 Jones, Peter Lloyd University of Colorado EUA
27 Kay, AB Imperial College London Regne Unit
28 Larche, Mark Imperial College London Regne Unit
29 Lee, Daniel Ipswich Hospital Regne Unit
30 Melbye, Hasse University of Tromso Noruega
31 Nava, Stefano Fondazione S. Maugeri Itàlia
32 Newell, Marie-Louise Imperial College London Regne Unit
33 Niederman, Michael Winthrop University Hospital SUNY at Stony Brook EUA
34 Openshaw, Peter Imperial College London Regne Unit
35 Price, David University of Aberdeen Regne Unit
36 Quarcoo, David Umboldt University Berlin Alemanya
37 Rodenstein, Daniel Université Catholique de Louvain Bèlgica
38 Spradling, Philip Centers for Disease Control and Prevention EUA
39 Stevens, Wim University of Antwerp Bèlgica
40 Stockley, RA Queen Elizabeth Hospital Regne Unit
41 Sverremark-Ekström, Eva Stockholm University Suècia
42 Thorne, Claire Imperial College London Regne Unit
43 Tobías, Aurelio Universidad Carlos III de Madrid Espanya
44 Ulrik, Charlotte* Hvidovre Hospital Dinamarca
45 Van Cauwenberge, Paul University of Ghent Bèlgica
46 Verleden, Geert M University Hospital Gasthuisberg Bèlgica
47 Vianello, Andrea* University City Hospital Itàlia
48 Villarino, Margarita E Centers for Disease Control and Prevention EUA
49 Vitacca, Michele Fondazione S. Maugeri Itàlia
50 Vordermeier, Martin VLA Weybridge Regne Unit
51 Whitsett, Jeffrey Cincinnati Children's Hospital Medical Center EUA
52 Zanconato, Stefania University of Padova Itàlia
RECERCA BIOMÈDICA | 33

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
Malalties inflamatòries cròniques. La Marató 2002
Adjudicació i acte de
lliurament dels ajuts
Durant l’exercici econòmic juliol 2003-juny
2004, el Patronat va aprovar l’adjudicació
dels fons obtinguts durant La Marató del
2002, dedicada a les malalties inflamatòries
cròniques, a 20 projectes de recerca
biomèdica, d’un total de 80 projectes
presentats a concurs.
La Fundació La Marató de TV3 va convocar
els guardonats a un acte acadèmic públic
de lliurament de guardons a la Sala d’Actes
de la Facultat de Ciències de la Universitat
de Girona.
L’acte va ser copresidit pel rector de la
Universitat de Girona, Joan Batlle, i pel
conseller de Sanitat i Seguretat Social,
Xavier Pomés. L’acte també va comptar amb
la presència del president i del director de
la Fundació, Vicenç Villatoro i Miquel Vilar,
respectivament, i d’Alícia Granados,
vicepresidenta segona i coordinadora de
la Comissió Assessora de la Fundació.
El Dr. Miquel Àngel Gassull Duro, cap
del Servei d’Aparell Digestiu de l’Hospital
Universitari Germans Trias i Pujol de
Badalona, va ser convidat a fer una
conferència que va tractar sobre “Malalties
inflamatòries cròniques, velles patologies
emergents”.
Projectes guanyadors
Dr. Doroteo Acero Fernandez
Hospital Universitari Doctor Josep Trueta.
Girona
Dra. Maria Pla de Solà-Morales
Escola Politècnica Superior UdG
Dr. Richard Day
St. Mark's Hospital. Academic Institute. London
Efecte terapèutic dels probiòtics en la
malaltia de Crohn activa i del seu mecanisme
d'acció. Estudi pilot prospectiu, aleatoritzat
a doble cec comparant nutrició enteral més
una composició simbiòtica versus nutrició
enteral més placebo durant quatre setmanes
251.637,00 €
Dr. Juan Aguilar Piera
Facultat de Farmàcia UB
Regulació dels nivells del factor activador
de plaquetes com a factor etiològic en la
malaltia inflamatòria intestinal
141.950,00 €
Dr. Fernando Albericio Palomera
Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona
Disseny i síntesi de pèptids i peptidomimètics
com a agents terapèutics amb capacitat
antiinflamatòria
179.750,00 €
Dra. Anna Bigas Salvans
Institut de Recerca Oncològica
Dr. Guy Haegeman
University of Gent. Belgium
Dr. Dirk Elewaut
Gent University Hospital. Belgium
Recerca de noves estratègies terapèutiques
per a artritis crònica autoimmune basades
en la transrepressió dels esteroides
360.000,00 €

Dra. Ester Boix Borràs
Facultat de Ciències UAB
Mecanisme d'acció de proteïnes i pèptids
antimicrobians del sistema immunitari.
Implicació en la patogènesi de les malalties
inflamatòries intestinals
101.814,00 €
Dra. M. del Carmen Caelles Franch
Facultat de Farmàcia UB
Mecanismes d'interferència dels glucocorticoides
amb les rutes de MAPK com a base
de la seva acció antiinflamatòria. Potenciació
de l'acció antiinflamatòria dels glucocorticoides
actuals
180.000,00 €
Dr. Xavier Calvet Calvo
Hospital de Sabadell
Estudi medicolegal de l'adequació de la
cobertura per incapacitat en pacients amb
malaltia de Crohn. Anàlisi de la jurisprudència,
disseny d'un score de discapacitat i
avaluació del grau actual de cobertura
sociosanitària
125.000,00 €
Dra. Maria Esteve Comas
Hospital Mútua de Terrassa
Dr. Josep Mañe Almero
Hospital Universitari
Germans Trias i Pujol
Utilitat de l'avaluació de l'apoptosi de
cèl·lules mononuclears de la mucosa intestinal
de pacients amb malaltia inflamatòria
intestinal per predir l'aparició de refractarietat
a esteroides. Relació amb l'activació del
factor de transcripció NFkB i la transcripció
de citocines
149.825,00 €
Dr. Fernando Fernández Bañares
Hospital Mútua de Terrassa
Formes menors de colitis microscòpica:
definició segons criteris histològics objectius
i valoració d'incidència, característiques
clíniques i resposta al tractament
24.662,00 €
Dr. Miquel Àngel Gassull Duro
Hospital Universitari
Germans Trias i Pujol
Dra. Ester Fernández Gimeno
Facultat de Veterinària UAB
Dr. Miguel Chillón Rodríguez
Centre de Biotecnologia Animal i Teràpia
Gènica UAB
Dr. José Carlos Perales Losa
Facultat de Medicina UB
Noves estratègies de teràpia gènica per al
tractament de la malaltia inflamatòria intestinal:
la silenciació de l'expressió de TNF-alfa
en la sobreexpressió d'interleuquina-10
359.744,00 €
Dr. Gabriel Gil Gómez
Institut Municipal d'Investigació Mèdica
Identificació de proteïnes senyalitzadores de
l'apoptosi induïda per glucocorticoides com
a dianes per al desenvolupament de fàrmacs
antiinflamatoris
180.000,00 €
Dra. Cristina López Rodríguez
Centre de Regulació Genòmica
Dr. José Francisco Aramburu Beltrán
Facultat de Ciències de la Salut
i de la Vida UPF
Dr. Juan Miguel Redondo Moya
Centro Nacional de Investigaciones
Cardiovasculares Carlos III
Regulació i paper funcional dels factors de
transcripció NFAT5 i NFATC en la resposta
inflamatòria: estudi in vivo i in vitro
360.000,00 €
Dra. Consuelo Modesto Caballero
Hospital Universitari Vall d'Hebron
Artritis inflamatòries de la infància: estudi
prospectiu de la seva incidència i prevalença
a Catalunya
111.384,00 €
Dra. Rosa M. Morillas Cunill
Hospital Universitari
Germans Trias i Pujol
Assaig clínic pilot fase III, doble cec, aleatoritzat,
controlat amb placebo i multicèntric
sobre la utilitat d'associar Metronidazol a
Azatioprina en la prevenció de la recurrència
postquirúrgica en la malaltia de Crohn
74.880,00 €
Dra. Montserrat Núñez Juárez
Hospital Clínic i Provincial
de Barcelona
Qualitat de vida relacionada amb la salut en
pacients amb artritis reumatoide a l'àmbit
de Catalunya
65.000,00 €
RECERCA BIOMÈDICA | 35

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
Dra. Mercè Pérez Riba
Institut de Recerca Oncològica
Dr. Angel Messeguer Peypoch
Institut d'Investigacions Químiques i Ambientals
Caracterització funcional de la interacció
calcipressina 1-calcineurina i aplicació al
desenvolupament de noves vies terapèutiques
per al tractament de la malaltia de Crohn
180.000,00 €
Dr. Josep Maria Piqué Badia
Hospital Clínic i Provincial de Barcelona
Dr. Raúl Méndez de la Iglesia
Centre de Regulació Genòmica
Dr. Ángel Lanas Arbeloa
Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa.
Zaragoza
Efectes dels antiinflamatoris no esteroïdals
sobre el curs de la malaltia inflamatòria intestinal.
Estudi dels mecanismes de susceptibilitat
i desenvolupament d'eines de diagnosi
358.534,00 €
Dr. Francesc Posas
Facultat de Ciències de la Salut
i de la Vida UPF
Dr. Angel R. Nebreda
European Molecular Biology Laboratory.
Heidelberg
Dr. Manolis Pasparakis
European Molecular Biology Laboratory.
Monterotondo
Anàlisi genètica del paper de la MAPK p38
en inflamació
131.000,00 €
Dr. Adolfo Rio Fernández
Hospital Universitari Germans Trias i Pujol
Dr. Antonio Suárez García
Facultad de Farmacia. Granada
Dr. German Soriano Pastor
Hospital de la Santa Creu i Sant Pau
Perfil d'expressió gènica en la malaltia
inflamatòria intestinal
296.640,00 €
Dr. Raimon Sanmartí Sala
Hospital Clínic i Provincial de Barcelona
Dra. Isabel Haro Villar
Institut d'Investigacions Químiques
i Ambientals
Dra. Marta Larrosa Padró
Hospital de Sabadell
Dr. Alejandro Balsa Criado
Sociedad Española de Reumatología
Anticossos contra pèptids citrulinats en
l'artritis reumatoide de curta evolució:
significació diagnòstica i pronòstica
244.080,00 €

Seguiment
dels projectes
La Fundació va signar un conveni amb
cadascun dels investigadors principals
dels projectes, en el qual s’especifiquen les
condicions del finançament i es va fer efectiu
el primer pagament.
Els projectes tenen, com a màxim, una
durada de tres anys i el pagament es fa
anualment en les quantitats acordades en
el pla de finançament.
1997 1
Abonada la primera anualitat, no es fa cap
pagament posterior sense l’avaluació positiva
de la memòria econòmica i de la científica.
La Fundació realitza el control econòmic
i de despesa dels projectes, i l’AATRM,
n’avalua la memòria científica de l’anualitat
corresponent.
CONTROL ECONÒMIC I CIENTÍFIC DE PROJECTES DE RECERCA. EXERCICI JULIOL 2003-JUNY 2004
Edició Convenis Memòria Memòria Memòria Memòria Diners destinats
La Marató (pagaments) 1a anualitat 2a anualitat Final Resum simposi
1998 1 5 21 37 156.289,48
1999 10 30 18 801.371,57
2000 29 43 1.282.365,47
2001 32 918.515,40
2002 40 1.471.625,72
Total memòries gestionades 267
Total finançat 4.630.167,64
RECERCA BIOMÈDICA | 37

Malalties genètiques hereditàries. La Marató 1997
Finalització dels
projectes. Simposium
La Fundació va convocar els investigadors
finançats amb els recursos obtinguts en La
Marató del 1997, perquè en una reunió
científica exposessin de manera pública –a la
societat en general i a la comunitat científica
en particular– els resultats aconseguits en el
desenvolupament dels projectes finançats
amb el suport dels ciutadans.
En el IV Simposium, que es va celebrar el
14 d’octubre de 2003 al Saló d’actes del
Departament de Salut, hi van participar els
investigadors dels 35 projectes finançats i va
ser organitzat conjuntament amb l’Agència
d’Avaluació de Tecnologia i Recerca
Mèdiques.
Amb les memòries finals elaborades pels
investigadors, es va editar un llibre en format
CD-ROM, en tres idiomes, destinat als
especialistes i als principals centres de
recerca de dins i fora del país.
Per a l’organització del IV Simposium es va
comptar amb el suport d’AstraZeneca.
Presentació d’una de les memòries finals dels projectes sobre les malalties genètiques hereditàries, que van
ser finançats amb els fons de La Marató de 1997
RECERCA BIOMÈDICA | 39

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
INVESTIGADORS PRINCIPALS
Dr. Josep M. Aran Perramon pàg. 41
Institut de Recerca Oncològica
Dra. M. Lourdes Arbonés de Rafael pàg. 45
Institut de Recerca Oncològica
Dra. Montserrat Baiget Bastús pàg. 48
Hospital de la Santa Creu i Sant Pau
Dr. Jordi Barquinero Máñez pàg. 50
Institut de Recerca Oncològica
Dr. Lluís Bassas Arnau pàg. 53
Fundació Puigvert
Dr. Jaume Bertranpetit Busquets pàg. 56
Facultat de Ciències de la Salut i de la Vida. UPF
Dr. Xavier Bonfill Cosp pàg. 60
Consorci Hospitalari Parc Taulí
Dra. Fàtima Bosch Tubert pàg. 62
Facultat de Veterinària. UAB
Dr. Juan Emilio Felíu Albiñana
Hospital Universitario Clínica Puerta de Hierro.
Madrid
Dra. Ana María Carrió Ybáñez pàg. 67
Hospital Clínic i Provincial de Barcelona
Dr. Joan X. Comella Carnicé pàg. 69
Facultat de Medicina. UdL
Dr. Jordi Garcia-Fernàndez
Facultat de Biologia. UB
Dr. Alexandre Darnell Tey pàg. 79
Hospital Clínic i Provincial de Barcelona
Dr. Carles Enrich Bastus pàg. 82
Facultat de Medicina. UB
Dr. Joan Escarrabill Sanglas pàg. 87
Ciutat Sanitària i Universitària de Bellvitge
Dr. Xavier Estivill Pallejà pàg. 90
Institut de Recerca Oncològica
Dr. Emilio Fernández Álvarez pàg. 94
Hospital Universitari Sant Joan de Déu
Dr. Antonio G. de Herreros Madueño pàg. 99
Institut Municipal d'Investigació Mèdica
Dr. Fausto García Hegardt pàg. 101
Facultat de Farmàcia. UB
Dr. Ernest Giralt Lledó pàg. 105
Facultat de Química. UB
Dr. Daniel Grinberg Vaisman pàg. 108
Facultat de Biologia. UB
Dra. Amparo Chabás Bergón
Corporació Sanitària Clínic
Dr. Alfons Macaya Ruiz pàg. 111
Hospital Maternoinfantil Vall d’Hebron
Dr. Ricard Marcos Dauder pàg. 114
Facultat de Ciències. UAB
Dr. Albert Marín Pérez pàg. 118
Consorci Hospitalari Parc Taulí
Dra. Montserrat Milà Recasens pàg. 121
Hospital Clínic i Provincial de Barcelona
Dr. Marc Miravitlles Fernández pàg. 124
Hospital General Universitari Vall d’Hebron
Dra. Pura Muñoz Cánoves pàg. 128
Institut de Recerca Oncològica
Dra. Joaquima Navarro Ferreté pàg. 133
Facultat de Medicina. UAB
Dra. Virginia Nunes Martínez pàg. 138
Institut de Recerca Oncològica
Dr. Manuel Palacín Prieto
Facultat de Biologia. UB
Dr. Pedro Barceló Reverté
Fundació Puigvert
Dr. Rafael Oliva Virgili pàg. 142
Hospital Clínic i Provincial de Barcelona
Dr. César Picado Vallés pàg. 146
Hospital Clínic i Provincial de Barcelona
Dr. Emili Gelpí Monteys
Institut d’Investigacions Biomèdiques
de Barcelona. CSIC
Dr. Antonio Moreno Galdó
Hospital Maternoinfantil Vall d´Hebron
Dr. Manuel Roig Quilis pàg. 151
Hospital Maternoinfantil Vall d'Hebron
Dr. Carles Solsona Sancho pàg. 157
Fundació August Pi i Sunyer. UB
Dr. Eduardo Fidel Tizzano Ferrari pàg. 160
Hospital de la Santa Creu i Sant Pau
Dr. Víctor Volpini Bertran pàg. 164
Institut de Recerca Oncològica
Dr. Antonio Zorzano Olarte pàg. 167
Facultat de Biologia. UB

Títol del projecte:
Una nova estratègia de teràpia gènica per a la fibrosi quística:
correcció de mutacions en el gen CFTR utilitzant
oligonucleòtids híbrids RNA/DNA
Investigador principal
Josep M. Aran Perramon
Institució
Institut de Recerca Oncològica
Membres de l’equip
David de Semir, Anna Avinyó, Sara Larriba, Virginia Nunes, Teresa Casals i Xavier Estivill
14.355.000 PTA
MEMÒRIA FINAL
1. Resum del projecte original
I - Objectius
La fibrosi quística (FQ) és una malaltia idònia per a la
teràpia gènica, ja que no té un tractament adequat, és
relativament comuna, letal i monogènica. No obstant
això, les actuals estratègies d’addició gènica utilitzades
en els assajos clínics de teràpia gènica per a l’FQ
són ineficaços. L’objectiu principal del projecte és
l’avaluació del potencial terapèutic dels oligonucleòtids
híbrids RNA/DNA per a la correcció in situ de
mutacions específiques en el gen CFTR. S'establirà
també l’eficàcia d’aquests oligonucleòtids modificats
en la restauració in vivo, en cèl·lules humanes, de
l’expressió de la proteïna CFTR i de diversos paràmetres
fisiopatològics que es troben alterats en els teixits
epitelials dels pacients afectats d’FQ.
Com a objetius concrets per assolir, destaquen:
- Disseny, síntesi i caracterització d'oligonucleòtids
híbrids RNA/DNA per a la correcció de mutacions en
el gen CFTR.
- Optimització del vehicle no viral de transferència dels
oligonucleòtids híbrids RNA/DNA en les cèl·lules de
l’epiteli respiratori.
- Correcció genètica i funcional de mutacions en el
gen CFTR mitjançant oligonucleòtids híbrids
RNA/DNA, en línies cel·lulars epitelials d’FQ amb
mutacions caracteritzades.
II - Disseny
La metodologia de treball s’ha desglossat en dos
grans apartats, que corresponen a: A) l’obtenció dels
oligonucleòtids híbrids, B) la seva optimització i aplicació
en línies cel·lulars epitelials de pacients amb FQ.
Les cèl·lules de l’epiteli respiratori de pacients afectats
d’FQ són el model més idoni i el que s’utilitzarà per a
l’estudi de l’efecte dels oligonucleòtids híbrids en la
reparació genètica i funcional de mutacions en el gen
CFTR.
S’assumeix que les modificacions configurades en els
oligonucleòtids híbrids, com també l’optimització del
seu vehicle de transferència a cèl·lules epitelials
respiratòries els aportarà una major estabilitat i eficàcia
de penetració i biodistribució. Això es traduirà en una
major freqüència de correcció de la mutació analitzada.
A) Obtenció dels oligonucleòtids híbrids RNA/DNA.
A causa del coneixement de la seqüència de DNA
genòmic del gen CFTR i de les seves alteracions en
forma de mutacions causants de la fisiopatologia de
RECERCA BIOMÈDICA | 41

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
l’FQ, s’emprendrà el disseny inicial dels oligonucleòtids
híbrids d’acord amb estudis experimentals previs
(Cole-Strauss et al. (1996) Science 273: 1386; Kren et
al. (1998) Nature Med. 4: 285).
B) Introducció in vitro dels oligonucleòtids híbrids en
cèl·lules de l’epiteli respiratori.
Per a aquests estudis es disposa de la línia cel·lular
IB3-1 (Zeitlin et al. (1991) Am. J. Resp. Cell. Mol. Biol.
4: 313), aïllada originàriament de l’epiteli bronquial
d’un pacient amb FQ, amb un genotip heterozigot:
ÆF508/W1282X. Això ens possibilitarà l’estudi de la
correcció genotípica i fenotípica mitjançant els
oligonucleòtids híbrids dirigits cap a la mutació
W1282X, la ÆF508, o ambdues a la vegada. El fet
que puguem actuar corregint dues mutacions
diferents en la mateixa línia cel·lular ens permetrà fer
comparacions més fiables quant als percentatges de
reversió d’ambdues mutacions a partir dels diversos
oligonucleòtids modificats. A més, s’estudiaran altres
línies cel·lulars epitelials amb fenotip homozigot, com
les cèl·lules CFPAC-1 (A.T.C.C.), de genotip
ÆF508/ÆF508, per a la correcció específica de la
mutació majoritària ÆF508, etc.
1. Optimització del vehicle de transfecció.
A fi d’utilitzar el vector no viral que resulti més eficient
en la introducció dels oligonucleòtids híbrids en el
nucli de les cèl·lules epitelials, fonamentalment s’assajaran
dos tipus de vectors de transferència, la utilització
dels quals ha estat prèviament documentada:
a. Conjugats amb lípids catiònics de diverses
composicions.
b. Conjugats amb el policatió polietilenimina (PEI).
2. Assajos de biodistribució i estabilitat.
Per determinar l’eficiència de la transfecció i el destí
dels oligonucleòtids híbrids una vegada transfectats,
es desenvoluparan diverses tècniques per avaluar:
a. Incorporació cel·lular.
b. Estabilitat intracel·lular.
mitjançant un marcatge fluorescent dels oligonucleòtids
híbrids.
3. Anàlisi genòmica dels percentatges de correcció i
de la verificació de les mutacions.
A fi de calcular els percentatges de correcció que es
produeixin com a conseqüència de l’administració
dels diversos oligonucleòtids sobre les cèl·lules
epitelials de pacients amb FQ, i de verificar aquestes
correccions, s’utilitzaran diversos mètodes.
a. Assaig d’hibridació del DNA genòmic.
b. Assaig de genotipació i anàlisi electroforètica.
c. Seqüenciació directa dels clons.
4. Anàlisi de les conseqüències de la correcció de les
mutacions en l’expressió del gen CFTR.
Per demostrar l’efecte corrector dels oligonucleòtids
híbrids sobre les mutacions estudiades es faran
diversos assajos genètics i de caracterització:
a. Anàlisi quantitativa i qualitativa dels transcrits revertits.
b. Presència i localització de la proteïna CFTR.
5. Anàlisi funcional de la correcció de les mutacions.
La correcció genotípica de les mutacions en el gen
CFTR hauria de suposar la reversió del fenotip d’FQ
que caracteritza les cèl·lules epitelials estudiades. Això
s’analitzarà mitjançant diversos assajos funcionals,
entre els quals cal destacar:
a. Anàlisi de la secreció de clorurs.
b. Assajos d’adherència bacteriana.
c. Assajos de resposta inflamatòria (producció d’IL-8).
III - Pla de treball
El pla de treball proposat té una durada de tres anys.
Primer any
1. Disseny, síntesi i purificació d’oligonucleòtids híbrids
dirigits contra les mutacions més freqüents, com
ÆF508 i W1282X.
El procediment d’optimització dels oligonucleòtids
híbrids és un procés iteratiu, amb múltiples cicles de
síntesi i purificació a fi d’aconseguir la màxima eficàcia
correctora d’aquests.
2. Transfecció dels oligonucleòtids híbrids a les línies
cel·lulars epitelials.
Els assajos d’acoblament dels oligonucleòtids híbrids
als diferents vehicles no virals i la introducció dels
corresponents complexos a les línies cel·lulars
epitelials estudiades són el primer pas per aconseguir
l’apropament dels oligonucleòtids terapèutics a les
seqüències mutades en els nuclis cel·lulars.
Els experiments de biodistribució, estabilitat i citotoxicitat
dels oligonucleòtids híbrids introduïts en les línies
cel·lulars epitelials ens donaran informació de la
integritat i localització d’aquests a l’interior cel·lular,
com també dels seus efectes sobre la proliferació
cel·lular. Aquests importants paràmetres contribuiran a
optimitzar tant l’estructura dels oligonucleòtids com el
vehicle no viral administrat.
Segon any
1. Eficàcia correctora dels oligonucleòtids híbrids.
L’eficàcia terapèutica dels oligonucleòtids híbrids
sintetitzats dependrà en última instància de la seva
capacitat per corregir les mutacions analitzades en el
gen CFTR. És per això que els estudis encaminats a
analitzar el percentatge de correcció de les mutacions,
com també a verificar la reversió d’aquestes, tenen
una importància essencial.
Tercer any
El tercer any s’havia previst consolidar la tecnologia de
la correcció de mutacions induïda pels oligonucleòtids
híbrids desenvolupada durant els dos primers anys en
les línies cel·lulars epitelials.
D’una banda, es tractava de caracteritzar el fenotip de
les línies cel·lulars epitelials en el cas que aquestes
haguessin pogut ser reparades:
1. Conseqüències funcionals de l’expressió de la
proteïna CFTR.
L’expressió funcional de la proteïna CFTR tindrà
conseqüències directes per a la reversió dels paràmetres
fisiopatològics d’FQ presents en les línies
cel·lulars epitelials estudiades.
Si es pogués assolir amb èxit l’anterior apartat, s’aplicaria
la tecnologia dels oligonucleòtids híbrids per a la
reparació específica de diferents mutacions existents
en l’epiteli respiratori de pacients amb FQ.
Si la correcció de les mutacions estudiades resulta
ineficient en les línies cel·lulars epitelials d’FQ, es
considerarà el desenvolupament d’estratègies alternatives
de reparació gènica dirigida en aquestes
cèl·lules, com la tecnologia SFHR (small fragment
homologous replacement).
2. Resultats
Segons els objectius proposats, els resultats finals
d’aquest projecte de recerca han estat els següents:

A) Caracterització del nostre model cel·lular
1. Mitjançant seqüenciació del DNA genòmic de la
línia cel·lular d’epiteli bronquial IB3.1, procedent d’un
pacient amb FQ, hem confirmat tant el genotip
heterozigot compost ÆF508/W1282X d’aquestes
cèl·lules, com les seqüències que envolten aquestes
mutacions. L’anterior resultat ens ha permès dissenyar
i sintetitzar diversos oligonucleòtids híbrids i oligonucleòtids
curts de cadena senzilla dirigits a corregir la
mutació W1282X, present en les nostres cèl·lules. A
més, hem optimitzat la metodologia de purificació
d’aquests oligonucleòtids, tot obtenint sempre uns
rendiments més grans del 30% amb una puresa al
voltant del 99%, necessària per als experiments de
transfecció cel·lular.
2. S’ha estudiat la presència i expressió de gens
implicats en la reparació de mutacions específiques
(tipus MMR, mismatch repair) i la recombinació
homòloga en les cèl·lules IB3.1. D’una banda,
emprant la tècnica de FISH s’ha confirmat l’absència
de macrodeleccions i/o reordenaments cromosòmics
en els cromosomes 2, 3, i 7, que contenen els gens
implicats en MMR. D’altra banda, a partir d’mRNA
aïllat de les cèl·lules IB3.1 i utilitzant encebadors
específics, s’ha confirmat per RT-PCR l’expressió dels
gens MMR: MSH2, MSH6, MLH1 i PMS2, i dels gens
implicats en recombinació homòloga i reconeixement
de mismatchs: Rad51, Rad52 i RPA. Aquests
resultats suggereixen la integritat dels mecanismes de
reparació tipus MMR en les cèl·lules IB3.1.
3. S’ha establert la competència reparadora tipus
MMR de les cèl·lules IB3.1. En primer lloc, s’ha confirmat
l’absència d’inestabilitat de microsatèl·lits en
aquestes cèl·lules. En segon lloc, mitjançant un assaig
bioquímic in vitro amb extractes cel·lulars, s’ha avaluat
directament la competència reparadora de mismatchs
de diferents tipus cel·lulars induïda pels oligonucleòtids
híbrids RNA/DNA. Les cèl·lules IB3.1 tenen capacitat
de reparació tipus MMR, malgrat que la seva eficiència
és de 5 a 10 vegades menor quan es compara amb
les cèl·lules hepàtiques, les més eficients emprant
aquest tipus de mecanisme reparador.
B) Estudis d’optimització de la incorporació, localització
i estabilitat dels oligonucleòtids correctors en
el nostre model cel·lular
1. Hem posat a punt un mètode quantitatiu per mesurar
la incorporació de lipoplexes i poliplexes, contenint els
oligonucleòtids, en les cèl·lules epitelials emprant la
citometria de flux. Amb aquest mètode hem analitzat de
manera ràpida les millors condicions per obtenir la
màxima incorporació de l’oligo corrector amb la mínima
toxicitat dels diversos lipoplexes i poliplexes utilitzats.
S’han establert les condicions òptimes per aconseguir
prop del 100% d’incorporació cel·lular dels oligonucleòtids
correctors a les cèl·lules IB3.1 sense toxicitat, utilitzant
tant els poliplexes amb PEI com els lipoplexes amb
citofectina com a vehicles de transfecció.
2. A fi de poder esbrinar en tot moment la biodistribució
dels oligonucleòtids correctors incorporats en les
cèl·lules epitelials de manera inequívoca hem posat a
punt una tècnica de monitorització per microscòpia
confocal utilitzant oligonucleòtids fluorescents. S’ha
pogut establir que una fracció important de les
cèl·lules transfectades presenta localització nuclear. A
més, hem analitzat també el patró de colocalització
intracel·lular dels lipoplexes i poliplexes, tant amb un
marcador d’endocitosi induïda per receptors (TRITCtransferrina),
com amb un marcador de fase fluida
(TRITC-Dextrà). La no colocalització dels complexos
oligonucleòtid-vehicle no víric amb el marcador
TRITC-transferrina ens ha indicat que la incorporació
d’aquests complexos no és induïda per receptors.
D’altra banda, la colocalització parcial dels poliplexos
amb el marcador TRITC-dextrà ens ha indicat que
aquests complexos s’incorporen via endocitosi
adsortiva (pinocitosi) o via difusió a través de la
membrana citoplasmàtica, mentre que la no colocalització
dels lipoplexes amb TRITC-dextrà ha indicat la
utilització d’un altre mecanisme d’incorporació cel·lular
per aquests complexos.
3. S’ha posat a punt una nova metodologia per analitzar,
tant qualitativament com quantitativament, el
percentatge de degradació dels oligonucleòtids
correctors, tant si es troben en el medi extracel·lular
com intracel·lular. Aquesta metodologia és sensible,
senzilla i ràpida, i no utilitza radioactivitat. Es basa en
la utilització d’oligonucleòtids marcats amb fluorescència,
la seva extracció dels fluids biològics o extractes
cel·lulars mitjançant fenol cloroform, i el seu posterior
fraccionament per PAGE. L’anàlisi i quantificació dels
electroferògrams fluorescents resultants es realitza a
partir del programari Genescan. Així, s’ha establert
l’estabilitat extra- i intracel·lular dels oligonucleòtids
híbrids formant part de poliplexes i lipoplexes incubats
amb cèl·lules IB3.1. Tot i que s’havia descrit que els
oligonucleòtids híbrids són extremament estables,
nosaltres hem observat que presenten una susceptibilitat
significativa a la degradació per part de 3’exonucleases
presents en el sèrum (70-80% a les 24
h). A més, els vehicles PEI i citofectina gairebé no
ofereixen protecció respecte de la degradació.
C) Posada a punt d’un mètode quantitatiu per
determinar el percentatge de correcció de
mutacions produïda pels oligonucleòtids correctors
a partir de DNA genòmic
1. Hem posat a punt un nou mètode quantitatiu per
determinar el percentatge de correcció de mutacions
produïda pels oligonucleòtids correctors a partir de
DNA genòmic extret de les cèl·lules tractades. Aquest
nou mètode es ràpid, senzill, precís i no empra
radioactivitat. La detecció de delecions o insercions
de tres o més nucleòtids es fa mitjançant una PCR en
fase exponencial amb encebadors fluorescents i
posterior genotipatge dels productes resultants. La
sensitivitat de detecció d’aquest mètode és de prop
d’un 4% de correcció. Per insercions/delecions de
menys de tres nucleòtids o canvis de nucleòtid, s’ha
d’afegir una etapa addicional a l’anterior metodologia:
un assaig d’OLA (oligonucleotide ligation assay) abans
de genotipar els productes resultants d’aquesta
reacció. Hem establert les condicions de PCR-OLA
òptimes per obtenir productes quantificables per
genotipatge. Hem observat també que la Tsc DNA
ligasa que actualment estem utilitzant és molt més
específica que la Taq DNA ligasa tradicionalment
emprada en reaccions de lligament de l’OLA. La
sensitivitat de detecció emprant l’OLA és també molt
propera al 4% de correcció de la mutació estudiada
(interval de confiança: 95%).
RECERCA BIOMÈDICA | 43

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
D) Estudis de correcció utilitzant oligonucleòtids
1. Hem realitzat estudis d’estructura-activitat en les
cèl·lules IB3.1, analitzant el percentatge de correcció
de la mutació puntual W1282X, present en heterozigosi
en aquestes cèl·lules, induït per acció d’un
determinat oligonucleòtid corrector. Les diverses
estructures d’oligonucleòtid híbrid (CSO-1, CSO-1C,
CSO-2 i CSO-3) i d’oligonucleòtid curt de cadena
senzilla (CSO-4 i CSO-4C) dissenyades no han produït
els resultats esperats i, per tant, sembla que no són
capaces d’induir correcció de la mutació W1282X en
el gen CFTR de les cèl·lules IB3.1, almenys en nivells
detectables pel nostre mètode quantitatiu anteriorment
descrit. Així, el percentatge d’al·lel salvatge en el
locus W1282X no ha resultat estadísticament diferent
entre les cèl·lules tractades amb els diferents oligonucleòtids
correctors i les cèl·lules control no tractades,
o tractades amb un oligonucleòtid control irrellevant. A
més, l’anàlisi per genotipatge de més de 100 clons
derivats d’una sola cèl·lula procedent d’un pool de
cèl·lules tractades amb l’oligonucleòtid híbrid teòricament
més optimitzat (CSO-3) no ha revelat l’existència
de cap clon corregit.
E) Estudis de correcció utilitzant SFHR
1. A partir de DNA genòmic d’individus normals, i utilitzant
encebadors específics flanquejant l’exó 10 (on es
troba la mutació F508del.) i l’exó 20 (on es troba la
mutació W1282X) del gen CFTR, hem generat mitjançant
PCR fragments de DNA contenint l’exó 10 salvatge
—430 pb—, i l’exó 20 salvatge —310 pb. Aquests
fragments s’han desnaturalitzat per escalfament a
98 ºC durant 10 min i refredament ràpid, tot generant
fragments de DNA de cadena senzilla (SFHR).
2. Mitjançant experiments d’electroporació, hem
introduït aquests SFHR en les cèl·lules epitelials IB3.1 a
fi de reparar la mutació F508del, o la mutació W1282X
presents en aquestes cèl·lules. Sorprenentment, utilitzant
aquesta metodologia semblava que estàvem
obtenint unes eficiències de correcció genòmica prou
significatives analitzades als 3-6 dies posttransfecció:
10-30% per a la mutació F508del., i unes 6 vegades
més baixa (2-5%) per a la correcció de la mutació
W1282X en el mateix tipus cel·lular. A més, semblava
que aquestes eficiències de correcció també eren
dependents de la dosi d’SFHR administrada.
De totes maneres, una caracterització més exhaustiva
d’aquesta metodologia de reparació ens ha fet adonar
que els fragments de DNA (SFHR) utilitzats per reparar
les mutacions estudiades ens estan interferint significativament
en la quantificació, mitjançant PCR, del
percentatge de correcció d’ambdues mutacions en
les cèl·lules IB3.1.
Així doncs, segons els resultats obtinguts en aquest
projecte, tant la utilització d’oligonucleòtids híbrids
d’RNA/DNA i d’altres oligonucleòtids més curts de
cadena senzilla, com de fragments de DNA de
cadena senzilla (SFHR) per estimular el reconeixement
i la modificació específica de seqüències de DNA en el
gen CFTR, no han estat capaces de produir una
correcció significativa de les mutacions W1282X i
F508del en el nostre model de cèl·lules epitelials
procedents d’un pacient amb FQ de genotip heterozigot
compost (F508del/W1282X), tot i que hem
caracteritzat i optimitzat exhaustivament la seva
incorporació en aquestes cèl·lules utilitzant diversos
vectors no vírics. Per tant, sembla que la reparació
dirigida del gen CFTR és un procés ineficient en les
cèl·lules epitelials bronquials amb FQ. Caldran millores
addicionals en els oligonucleòtids correctors i SFHR
(estructura, incorporació nuclear, o capacitat d’estimular
els mecanismes endògens de reparació gènica) per
poder assolir nivells terapèutics de correcció de
mutacions en aquestes cèl·lules.
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
L’impacte que el nostre projecte de teràpia gènica per
a la fibrosi quística pot tenir en l’àrea de la salut és
d’una gran rellevància, no només pel que fa al tractament,
sinó també per a la prevenció de les manifestacions
clíniques d’aquesta malaltia genètica, la més
comuna entre individus d’origen europeu. El desenvolupament
de noves vies de tractament causal per a la
fibrosi quística pot tenir conseqüències d’enorme
importància en l’establiment d’una solució terapèutica
definitiva per revertir o prevenir les manifestacions
pulmonars dels seus pacients, les quals suposen un
alt cost sanitari. Existeix, actualment, una enorme
conscienciació ciutadana per a la lluita contra les
patologies hereditàries, i l’aplicació de tècniques
innovadores com ara la teràpia gènica per corregir-les
és un desig compartit per la major part de la societat.
Malauradament, els resultats que es desprenen del
nostre treball indiquen que, malgrat que la correcció
de mutacions en un nivell genòmic seria l’estratègia
ideal per revertir les manifestacions clíniques de l’FQ,
les tecnologies de reparació gènica actuals no estan
encara prou desenvolupades per poder assolir una
freqüència de correcció terapèutica, almenys en les
cèl·lules epitelials bronquials afectades d’FQ. De totes
maneres, els avenços continuats en aquesta àrea de
recerca permetran disposar de noves eines moleculars
(oligonucleòtids, fragments de DNA...) optimitzades
per a la reparació in situ de mutacions en el gen
CFTR, amb eficiències cada vegada més properes a
assolir nivells terapèutics, la qual cosa produirà una
millora definitiva de les manifestacions fisiopatològiques
de la fibrosi quística.
4. Publicacions
De Semir, D.; Pétriz, J.; Avinyó, A.; Larriba, S.; Nunes, V.;
Casals, T.; Estivill, X., Aran, J.M. (2002) Non-viral vector-mediated
uptake, distribution and stability of chimeraplasts in human airway
epithelial cells. J. Gene Med. 4:308-322.
De Semir, D.; Avinyó, A.; Larriba, S.; Nunes, V.; Casals, T.; Estivill,
X., Aran, J.M. (2002) Quantitative assessment of chimeraplast
stability in biological fluids by polyacrylamide gel electrophoresis
and laser-assisted fluorescence analysis. Pharm. Res. 19:914-918.
De Semir, D.; Nadal, M.; González, J.R.; Larriba, S.; Avinyó, A.;
Nunes, V.; Casals, T.; Estivill, X., Aran, J.M. (2003) Suitability of
oligonucleotide-mediated cystic fibrosis gene repair in airway
epithelial cells. J. Gene Med. 5: En premsa (publicat en línia: 18
feb 2003; DOI 10.1002/jgm.374).
De Semir, D., Aran, J.M. (2003) Misleading gene conversion
frequencies due to PCR artifacts using small fragment homologous
replacement. (sotmès).

Títol del projecte:
Desenvolupament d’un model murí per a teràpia gènica
de la sordesa congènita hereditària a causa de
mutacions en el gen de la Connexina-26
Investigador principal
Maria Lourdes Arbonés de Rafael
Institució
Institut de Recerca Oncològica
Membres de l’equip
Bàrbara Montserrat, Núria López, Assumpció Bosch, Maria L. Arbonés, Raquel Rabionet i Xavier Estivill
18.368.350 PTA
MEMÒRIA FINAL
1. Resum del projecte original
Quan es va sol·licitar aquest projecte, es desconeixia
quines mutacions en el gen GJB2 que codifica la
connexina 26, en el locus DFNB1, és la causa més
freqüent de sordesa familiar congènita recessiva en la
població mediterrània. Aproximadament el 50% dels
pacients amb mutacions en aquest gen presenten
una mutació concreta, la 35delG, en homozigosi.
Aquesta mutació provoca l’aparició d’un codó STOP
al residu 13 que origina una proteïna truncada no
funcional. D’altra banda, es desconeixia que la
connexina 26 forma les unions gap de les cèl·lules del
teixit epitelial i connectiu de la còclea de rata adulta.
Aquestes unions semblen tenir una funció important
per al correcte reciclatge de ions K+, des de les
cèl·lules ciliades a l’endolimfa, necessària per mantenir
el potencial endolimfàtic i la transmissió del senyal
acústic. D’acord amb aquestes dades, es va hipotetitzar
que la transferència del gen GJB2 normal a les
cèl·lules epitelials i de suport de la còclea podrien
restaurar el potencial endolimfàtic i, en conseqüència,
la recuperació de l’audició. Atès que el knockout de
GJB2 en ratolí és letal embrionari, els objectius que es
van proposar van ser el següents: 1) desenvolupar
mitjançant el sistema Cre/loxP recombinasa un model
knockout condicional deficient en la funció de GJB2 a
la còclea, i 2) fer estudis de transferència de gens al
sistema auditiu perifèric del ratolí mitjançant la utilització
de virus adenoassociats recombinants.
La identificació de mutacions en gens d’altres
connexines associades a sordesa sindròmica i no
sindròmica, i a altres malalties hereditàries ens va
portar a plantejar, en el decurs d’aquest projecte, els
següents objectius: 1) analitzar la seqüència codificant
de tots els gens de beta-connexines coneguts en
pacients de sordesa congènita amb un patró d’herència
dominant o recessiva a la població espanyola, i 2)
determinar el patró d’expressió dels gens de les betaconnexines
implicades en sordesa a la còclea del
ratolí al llarg del desenvolupament.
2. Resultats
Anàlisi mutacional dels gens de les beta-connexines
GJB1 (connexina 32), GJB2 (connexina 26),
GJB3 (connexina 31), GJB4 (connexina 30.3) i
GJB5 (connexina 31.1) en pacients amb sordesa.
L’estudi es va realitzar en mostres de DNA d’unes 200
persones sordes no relacionades, entre les quals hi
havia casos de sordesa prelingual i casos de sordesa
progressiva d’inici en la infància o en l’adult, i en les
RECERCA BIOMÈDICA | 45

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
quals prèviament s’havien analitzat les mutacions més
freqüents en sordesa a Espanya: la mutació 35delG
en GJB2 i la mutació A1555G en el DNA mitocondrial.
L’anàlisi es va fer mitjançant la tècnica d’SSCP (singlestrand
conformation polymorphism) i seqüenciació
dels fragments de PCR amb patró anòmal.
L’anàlisi del gen GJB2 ha permès identificar 13
mutacions d’error de sentit diferents que causen
sordesa d’herència recessiva i que representen un
30% dels casos amb sordesa recessiva o esporàdica.
D’altra banda, s’han identificat dues mutacions que
causen sordesa d’herència dominant que representen
el 4% de les famílies dominants estudiades. Amb la
col·laboració del Dr. Willecke (Universitat de Bonn),
s’han fet estudis funcionals en línies cel·lulars que
expressen de manera estable diferents formes
mutades del gen GJB2 (M1V, M34T, L90P, R127H,
F161S, P173R, i R184P). Els resultats van mostrar
que algunes d’aquestes formes mutades (M1V,
P173R i R184P) no són capaces de sintetitzar proteïna,
mentre que d’altres (M34T, L90P) que sí que
codifiquen una isoforma estable, no formen hemicanals.
No es van detectar alteracions funcionals per la
isoforma R127H, la qual cosa indicaria que es tracta
d’un polimorfisme i no d’una mutació.
L’anàlisi del gen GJB3 en pacients amb sordesa, va
permetre identificar diferents polimorfismes (SNP) i
dues mutacions d’error de sentit. Els estudis d’associació
van demostrar que aquestes mutacions no són
la causa de sordesa en les famílies analitzades. En
detectar-se una d’aquestes mutacions en una família
amb sordesa i neuropatia perifèrica, es va fer l’estudi
mutacional d’aquest gen en 110 pacients amb
neuropatia perifèrica de causa genètica desconeguda.
En una de les famílies es va identificar una mutació
dominant (D66del) que resulta en la deleció d’un
residu aspàrtic en la posició 66 de la proteïna.
Aquesta mutació causa neuropatia perifèrica i sordesa
progressiva caracteritzada per una gran variabilitat
fenotípica, des de casos amb neuropatia severa a
casos simptomàtics. Estudis d’expressió van indicar la
presència de transcrits GJB3 a la còclea i al nervi
auditiu i ciàtic del ratolí, tot mostrant en aquest últim
cas una distribució similar a la del gen GJB1, que en
humans és responsable de la neuropatia perifèrica
associada al cromosoma X.
No es va identificar cap mutació que cosegregués
amb la malaltia en els altres gens analitzats.
Els resultats globals d’aquesta anàlisi indiquen que, a
part de GJB2, mutacions en altres gens de betaconnexines
no són causa freqüent de sordesa en la
població espanyola.
Anàlisi del patró d’expressió del gens GJB1,
GJB2, GJB3, GJB5 i GJB6 durant el desenvolupament
de l’oïda interna del ratolí.
L’estudi es va fer mitjançant hibridació in situ en
etapes embrionàries i postnatals que són claus per al
desenvolupament de les diverses estructures de la
còclea del ratolí.
Els gens GJB1 i GJB3 s’expressen en diferents tipus
cel·lulars de la còclea i en diversos estadis del
desenvolupament, tot mostrant un patró d’expressió
durant el desenvolupament molt diferent al dels gens
de la connexines 26 i 30. L’expressió de GJB1 i GJB3
és molt elevada ja des de l’inici de la formació de la
vesícula òtica, tot observant-se la presència de
transcrits específics al mesènquima que envolta
l’epiteli coclear i alguns punts d’expressió dins l’epiteli.
Destaca una expressió transitòria d’ambdós gens en
les cèl·lules ciliades de l’òrgan de Corti i de GJB1 en
les cèl·lules basals i intermèdies de l’estria vascular.
Amb un patró molt diferent, el gen GJB5 presenta una
expressió molt lleu i restringida a algunes cèl·lules de
la membrana de Reissner, als fibròcits del lligament
espiral i al limbe espiral en ratolins nounats. El gen
GJB1 no s’expressa a la còclea adulta, mentre que se
segueix observant expressió de GJB3 en determinats
fibròcits del lligament espiral i del limbus espiral. Els
gens GJB2 i GJB6 en la còclea adulta mostren un
patró d’expressió molt similar, tot observant-se la
presencia d’ambdós transcrits en cèl·lules del
lligament espiral, del limbus espiral, de l’estria vascularis
i en les cèl·lules epitelials no sensorials de l’òrgan
de Corti. Aquests resultats indiquen que l’expressió
del gens de connexines està altament regulada i que
les connexines 26 i 30 podrien tenir funcions
redundats.
Estudi de transferència de gens mitjançant
adenovirus i virus adenoassociats (AAV) a l’oïda
interna del ratolí.
En una primera aproximació, i per tal de poder identificar
vectors virals que puguin ser eficaços per transferir
gens a les cèl·lules de la còclea de ratolí in vivo,
s’ha determinat l’eficiència i el tropisme de diversos
vectors virals (adenovirus i tres serotips d’adenoassociats;
AAV2, AAV4, i AAV5) que contenen o bé el gen
marcador LacZ o el gen que codifica la proteïna
verda, GFP (green fluorescence protein) en explants
coclears de ratolí nounat. Aquests explants es poden
mantenir en cultiu fins a dues setmanes, tot romanent
intacta tant l’estructura de l’òrgan de Corti com la
viabilitat de les cèl·lules de suport i de les cèl·lules
ciliades. Els resultats obtinguts indiquen que els AAV
assajats tenen tropisme exclusiu per a alguns tipus de
cèl·lules de suport de l’òrgan de Corti, però no per a
les cèl·lules ciliades, mentre que els adenovirus
infecten ambdós tipus cel·lulars. El serotip AAV5 és el
que mostra eficiència d’infecció més elevada. Tenint
en compte aquest resultats, els experiments de
transducció in vivo es van dur a terme utilitzant
adenovirus com a vector.
Entre els diversos mètodes quirúrgics assajats per
accedir a l’oïda interna del ratolí i avaluar l’eficàcia in
vivo de l’administració de vectors virals dins la còclea,
la intervenció retroauricular ha estat la més eficaç; té
l’avantatge de reduir considerablement el temps
quirúrgic, de disminuir la mortalitat intraoperatòria i,
sobretot, de permetre una aproximació molt més
còmoda a la finestra rodona amb un control constant
de l'artèria estapedial, que es pot conservar sempre.
Mitjançant punció directa de la finestra rodona i utilitzant
títols elevats de partícules víriques, s’han aconseguit
bons nivells d’expressió del gen transduït dins la
còclea del ratolí.
Obtenció d’un model murí deficient en l’expressió
de connexina 26 en l’oïda interna.
Malgrat els esforços realitzats, no s’ha aconseguit
generar un model de sordesa pel gen de la connexina
26. Per generar aquest model s’havia d’obtenir una

línia de ratolí transgènic que expressés l’enzim Cre
recombinasa en les cèl·lules de suport de la còclea,
on s’expressa el gen de la connexina 26, i que fes
possible la deleció in vivo de l’exó codificant d’aquesta
connexina en aquestes cèl·lules. Els esforços realitzats
per aconseguir aquest ratolí transgènic han estat
infructuosos perquè es coneixen molt pocs gens
d’expressió restringida a la còclea i cap d’ells té el
mateix patró d’expressió que el gen GJB2.
Els resultats obtinguts en l’estudi d’expressió dels
gens de beta-connexines han demostrat que, almenys
en el ratolí, el patró d’expressió del gen d’una altra
connexina, GJB6, és molt similar al de la connexina
26, tot suggerint que el ratolí knockout d’aquest gen
podria ser un bon model de sordesa. D’altra banda,
estudis del nostre laboratori i d’altres han demostrat
que mutacions en el gen GJB6 causen sordesa en
humans. Per últim, estudis recents han demostrat que
l’eliminació d’aquest gen en el ratolí causa sordesa
profunda, produïda per una manca total de potencial
endococlear, però no afecta la viabilitat de l’animal
(Human Molecular Genetics 12: 13, 2003). En conjunt,
aquestes dades indiquen que el millor model animal de
què es disposa per assajar estratègies terapèutiques
vàlides per la sordesa a causa de mutacions en els
gens GJB2 i GJB6 és el knockout de la connexina 30.
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
Els resultats obtinguts en l’estudi mutacional del gen
de la connexina 26 i dels altres gens de beta-connexines
implicats en sordesa té una aplicabilitat directa en
el diagnòstic i consell genètic de la sordesa congènita
hereditària a Espanya. Els implants coclears són
l’única realitat possible actual per al tractament de la
sordesa congènita prelingual, però implica la destrucció
de la còclea del pacient. Els implants coclears són
més eficaços si la intervenció es du a terme en nens
petits, abans d’adquirir la parla. L’anàlisi de gens
candidats pot facilitar un diagnòstic precoç de la
sordesa i la possibilitat de realitzar un implant coclear
abans que la deficiència neurosensorial es manifesti.
L’estudi d’expressió dels diversos gens de connexines
a l’oïda interna és el primer pas per entendre la
fisiopatologia de la sordesa a causa de mutacions en
aquests gens.
Per últim, els resultats obtinguts en els estudis de
transducció de gens mitjançant vectors virals obren
una nova via d’investigació que pot ser útil per al
tractament de la sordesa causa per mutacions en els
gens de les connexines 26 i 30, o altres tipus de
sordesa congènita no sindròmica amb una causa
molecular coneguda.
4. Publicacions
López-Bigas N, Rabionet R, de Cid R, Govea N, Gasparini P,
Zelante L, Arbonés ML, Estivill X. Splice-site mutation in the PDS
gene may result in intrafamilial variability for deafness in pendred
syndrome. Human Mutation 14:520-6, 1999.
Rabionet R, Zelante L, López-Bigas N, D'Agruma L, Melchionda
S, Restagno G, Arbonés ML, Gasparini P, Estivill X. Molecular
basis of childhood deafness resulting from mutations in the GJB2
(connexin 26) gene. Human Genetics 106:40-4, 2000.
López-Bigas N, Rabionet R, Martínez E, Bravo O, Girons J,
Borragan A, Pellicer M, Arbonés ML, Estivill X. Mutations in the
mitochondria tRNA Ser(UCN) and in the GJB2 (connexin 26) gene
are not modifiers of the age at onset and severity of hearing loss
in spanish patients with the 12S rRNA A1555G mutation. The
American Journal of Human Genetics 66:1465-67, 2000.
López-Bigas N, Melchionda S, de Cid R, Grifa A, Zelante L,
Govea N, Arbonés ML, Gasparini P, Estivill X. Identification of five
new mutations of PDS/SLC26A4 in Mediterranean families with
hearing impairment. Human Mutation 18(6):548, 2001.
López-Bigas N, Olive M, Rabionet R, Ben-David O, Martínez-
Matos JA, Bravo O, Banchs I, Volpini V, Gasparini P, Avraham KB,
Ferrer I, Arbonés ML, Estivill X. Connexin 31 (GJB3) is expressed
in the peripheral and auditory nerves and causes neuropathy and
hearing impairment. Human Molecular Genetics 10:947-52, 2001.
Rabionet R, López-Bigas N, Arbonés ML, Estivill E. Connexin
mutations in hearing loss, dermatological and neurological
disorders. Trends in Molecular Medicine, 8:205-11, 2002.
Wattenhofer M, Di Iorio V, Rabionet R, Dougherty L, Pampanos
A, Schwede T, Montserrat-Sentis B, Arbonés L, Estivill X,
Gasparini P, Scott HS, Antonarakis SE. Mutations in the
TMPRSS3 gene are a rare cause of childhood nonsyndromic
deafness in Caucasian patients. Journal of Molecular Medicine
80:124-31, 2002.
Thonnissen E, Rabionet R, Arbonés ML, Estivill X, Willecke K, Ott
T. Human connexin26 (GJB2) deafness mutations affect the
function of gap junction channels at different levels of protein
expression. Human Genetics 111:190-7, 2002.
López-Bigas N, Arbonés ML, Estivill E, Simonneau L. Expression
profiles of the connexin genes, Gjb1 and Gjb3, in the developing
mouse cochlea. Mechanisms of Development-Gene Expression
Patterns 2:113-7, 2002.
Estivil X, López-Bigas N, Rabionet R, Bravo O, Girons J,
Arbonés ML. mtDNA mutation and progressive deafness:
modifying factors of a common mutation causing late onset
deafness. The American Journal of Human Genetics 65
(suplement): A270:1509, 1999.
López-Bigas N, Olive M, Rabionet R, Bravo O, Banchs I, Volpini
V, Ferrer I, Arbonés ML, Estivill X. An amino acid deletion in the
human connexin 31 gene (GJB3) is associated with sensorineural
deafness and hereditary sensory neuropathy. The American
Journal of Human Genetics 67 (suplement 2): A2326:413, 2000.
Rabionet R, Thönnissen E, Bosch A, Montserrat-Sentís B,
López-Bigas N, Borragán A, Arbonés ML, Willecke K, Estivill X.
Identification and functional analysis of aminoacid variants in the
connexin26 (GJB2) gene. The American Journal of Human
Genetics 69 (suplement): A69:2404, 2001.
RECERCA BIOMÈDICA | 47

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
MEMÒRIA FINAL
1. Resum del projecte original
Objectiu general
Estudi de la inestabilitat del gen de la distròfia
miotònica (DM).
Objectius específics
1. Determinar si la grandària de l'al·lel DM que el
pacient va heretar correlaciona amb la severitat de la
malaltia i amb l'edat d'aparició dels símptomes.
Actualment la determinació de la dimensió d'un al·lel
DM es realitza mitjançant mètodes convencionals que
no tenen en compte ni el mosaïcisme somàtic de la
mostra d’estudi ni l'edat del pacient en el moment
d'efectuar la determinació. Proposem emprar la
tècnica d’SP-PCR que mostra el patró de diversitat
al·lèlica existent i facilita la determinació de l'extrem
inferior de la distribució dels al·lels esmentats (indicador
de la grandària de l'al·lel DM heretat).
2. Analitzar l'expansió CTG en diversos teixits de
pacients amb formes clíniques diferents de la malaltia:
formes congènites, formes clàssiques i formes
benignes/asimptomàtiques. La utilització de la tècnica
Títol del projecte:
La inestabilitat genòmica i les malalties hereditàries:
estudi de la inestabilitat somàtica i germinal del gen
de la distròfia miotònica (DM) o malaltia d’Steinert
Investigador principal
Montserrat Baiget Bastús
Institució
Hospital de la Santa Creu i Sant Pau
27.288.600 PTA
d’SP-PCR permetrà estudiar la presència de
mosaïcisme somàtic en diversos tipus de cèl·lules i
analitzar si hi ha una correlació amb l'afectació dels
diversos teixits.
3. Analitzar les expansions CTG en les cèl·lules
germinals de pacients DM (mostres d'esperma) i en
les cèl·lules somàtiques de la seva descendència
(mostres de cèl·lules nucleades de sang perifèrica). El
comportament del gen DM durant la transmissió s'ha
analitzat, únicament, comparant la dimensió de l'al·lel,
en sang, del progenitor i del fill. En el moment de
prendre aquestes dues mostres, hi ha una diferència
entre 20 i 40 anys en l'edat d'ambdós, per la qual
cosa no s'ha tingut en compte el procés d'expansió
progressiva i edat-dependent que ha sofert l'al·lel DM.
A fi d'analitzar el comportament intergeneracional de
l'al·lel DM, proposem l'estudi (mitjançant SP-PCR) i la
comparació del patró d'expansió CTG en les cèl·lules
germinals del progenitor i en la descendència.
4. Seguir l'herència dels al·lels premutats en famílies
DM i analitzar els increments de dimensió durant les
transmissions. Determinar si el sexe del progenitor
que transmet la premutació és un factor determinant
en la inestabilitat de la regió CTG.

2. Resultats
S'ha posat a punt i s'ha emprat la tècnica Small-Pool
PCR (SP-PCR) que mostra el patró de diversitat
al·lèlica existent i facilita la determinació de l'extrem
inferior de la distribució dels al·lels amb expansió
patològica present en la mostra d’estudi. La dimensió
i la distribució d'aquests al·lels és l'únic indicador de la
grandària de l'al·lel DM heretat.
S'han analitzat les expansions CTG en les cèl·lules
germinals de pacients DM (mostres d'esperma) i en
les cèl·lules somàtiques de la seva descendència
(mostres de cèl·lules nucleades de sang perifèrica). A
fi d'analitzar el comportament intergeneracional de
l'al·lel DM, s'ha fet l'estudi (mitjançant SP-PCR) i la
comparació del patró d'expansió CTG en les cèl·lules
germinals del progenitor i en la descendència. Hem
confirmat que el mecanisme mutacional en la línia
germinal masculina és diferent del que es postula que
s’esdevé en la línia somàtica i que el nivell de variació
és molt variable entre individus diferents. En totes les
transmissions analitzades, la dimensió dels al·lels
presents en la mostra d'esperma del pare se
sobreposa al que s’observa en les cèl·lules somàtiques
dels seus descendents. Aquestes dades
indiquen que en la interpretació de les transmissions
dels al·lels DM quan s'utilitzen únicament tècniques
convencionals, cal considerar la possibilitat que les
diferències estiguin amagades per l'expansió somàtica
en el progenitor, que hem demostrat que és
dependent de l'edat del pacient.
S'ha fet l'estudi de la freqüència i la inestabilitat dels
al·lels DM portadors d'una premutació. S'ha identificat
la presència d'al·lels premutats tant en familiars de
pacients amb un diagnòstic de DM com en alguns
individus de la població general. Aquests al·lels
premutats no s'associen amb un fenotip clínic, però
són molt inestables i susceptibles de patir expansions,
especialment si l'individu transmissor és un home. Per
tant, la transmissió d'un al·lel DM premutat, especialment
si el transmet un home, comporta un risc alt que
apareguin pacients DM en les generacions següents.
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
El diagnòstic genotípic de la distròfia miotònica és útil
en tres circumstàncies:
i) Diagnòstic de confirmació, en individus simptomàtics.
ii) Diagnòstic presimptomàtic.
iii) Diagnòstic prenatal.
És d'interès i aplicació en el diagnòstic prenatal:
- La demostració que els al·lels DM amb un nombre
de repeticions CTG igual o menor a 33 es transmeten
de manera estable i que la inestabilitat durant la
transmissió apareix quan es transmeten al·lels que
tenen més de 38 repeticions.
- El fet que les aparents "contraccions" que s'observen
en algunes transmissions de l’al·lel DM, són en
realitat expansions germinals amagades pel mosaïcisme
somàtic del progenitor transmissor.
4. Publicacions
M. Baiget, L. Martorell. Triplet expansions into diverse phenotypes.
Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 1999; 37:S23
L. Martorell, D. Monckton, J. Gámez, M. Baiget.
Intergenerational dynamics of the CTG repeat in Myotonic
Dystrophy: role of age dependent somatic mopsaicism and male
germline instability. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine,
1999; 37:S139
The International Myotonic Dystrophy Consortium (IDMC). New
nomenclature and DNA testing guidelines for myotonic dystrophy
type I (DM1). Neurology 2000;54:1218-1221.
L. Martorell, DG. Monckton, J. Gamez, M. Baiget. Complex
patterns of male germline instability and somatic mosaicism in
myotonic dystrophy type I. European Journal of Human Genetics
2000;8:423-430.
T. Pampols, J.A. Arranz, R. Artuch, M. Baiget, F. Borja, P.
Biones, T. Casals, A. Chabás, MJ. Coll, E. Del Rio, C. Domínguez,
X. Estivill, P. Gallano, M. Girós, M. Martínez, A. Maya, M. Mila, E.
Margarit, L. Martorell, E. Monros, V. Nunes, N. Potau, M. Puliol, J.
Oriola, A. Ribes, E. Riudor, M. Rodes, E. Tizzano, M.A. Vilaseca, V.
Volpini. Errors congènits del metabolisme (ECM). Pediatria
Catalana 2000; 60:561-570. C. Zühlke, J. Atici, L. Martorell, U.
Gembruch, M. Kohl, W. Göpel, E. Schwinger.
Rapid detection of expansions by PCR and nonradioactive
hybridization: application for prenatal diagnosis of Myotonic
Dystrophy. Prenatal Diagnosis 2000; 20:66-69.
L. Martorell, DG. Monckton, A. Sánchez, A. López de Munain,
M. Baiget. Frequency and stability of the myotonic dystrophy type
1 premutation. Neurology 2001; 56:328-336.
RECERCA BIOMÈDICA | 49

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
MEMÒRIA FINAL
1. Resum del projecte original
La teràpia gènica de les malalties hereditàries que
afecten el sistemapoètic actualment està limitada per
tres grans obstacles: la necessitat de tractaments
mieloablatius (condicionament) per facilitar l'empelt en
els receptors de les cèl·lules trasplantades, la pèrdua
d'expressió dels transgens a llarg termini i, com s'ha
demostrat molt recentment, almenys en algunes
malalties, un risc real de mutagènesi (i oncogènesi) per
inserció. Aquest últim punt està sent objecte d'intens
estudi en actualment. Quant als dos primers, s'estan
desenvolupant nous vectors que proporcionin una
expressió més estable dels transgens, i d'altra banda,
s'estan assajant pautes de condicionament que siguin
mínimament mieloablatives i ben tolerades. Per a les
malalties en què la correcció del defecte molecular
comporta un avantatge selectiu per a les cèl·lules,
com s’esdevé en certes immunodeficiències, la
teràpia gènica té moltes més possibilitats d'èxit.
Dissortadament, per a la immensa majoria de
malalties no es preveu que la correcció molecular
proporcioni a les cèl·lules cap mena d’avantatge
selectiu, la qual cosa obliga a optimitzar al màxim tots
Títol del projecte:
Desenvolupament de vectors retrovírics optimitzats
per a la malaltia granulomatosa crònica
Investigador principal
Jordi Barquinero Máñez
Institució
Institut de Recerca Oncològica
Membres de l’equip
Jordi Barquinero, Marta Garcia, Alba Gómez, Herena Eixarch i Àlex Bote
7.860.682 PTA
els altres elements (vectors, protocols de transducció,
etc.) i a facilitar l'empelt o utilitzar tractaments mieloablatius
no mancats de toxicitat. En aquest sentit, la
malaltia granulomatosa crònica (MGC) és paradigmàtica.
No haver tingut en compte aquests fet ha estat
sens dubte determinant en el fracàs dels primers
assajos de teràpia gènica.
A fi d'aprofundir en aquest últim aspecte s'ha investigat
la necessitat de mieloablació per aconseguir un
empelt estable i l'expressió dels transgens a llarg
termini en un model murí. En aquest sentit, s'ha
establert la durada i l'estabilitat de l'expressió de
transgens en el sistema hematopoètic murí a llarg
termini (15 mesos) després del trasplantament de
cèl·lules transduïdes amb vectors integratius (retrovirals).
A més a més, s'ha investigat la relació entre dosi
de mieloablació (irradiació corporal total), dosi de
cèl·lules trasplantades, efecte de la manipulació ex
vivo de les cèl·lules i nivell d'empelt hematopoètic, i
s'ha comprovat que el nivell d'expressió dels
transgens en el teixit hematopoètic murí a llarg termini
després del trasplantament és independent de la dosi
de mieloablació emprada, fet que suggereix que en
tots els casos en què es produeix un empelt estable,
per petit que sigui, probablement s'indueix tolerància

immunològica en teràpies gèniques hematopoètiques i
no hematopoètiques.
2. Resultats
En relació amb els objectius plantejats, es van dur a
terme els estudis següents:
1) Anàlisi de l'expressió a llarg termini dels
transgens in vivo.
Es va analitzar l'expressió d'un transgèn (EGFP) en el
sistema hematopoètic de ratolins (n=10) sotmesos a
irradiació letal (10 Gy) i trasplantats amb 5x105
cèl·lules de medul·la òssia singènica transduïda. Es va
observar una estabilitat en els nivells d'expressió en
cèl·lules de sang perifèrica de ratolins receptors
durant els 15 mesos de seguiment (figura 1). I es va
observar el mateix en altres teixits hematopoètics
analitzats (medul·la òssia i melsa), com també en els
receptors de trasplantaments secundaris, fins a 4
mesos després del trasplantament
(dades no mostrades).
Figura 1. Expressió del gen marcador (EGFP) en les
cèl·lules hematopoètiques dels animals receptors
després del trasplantament (15 mesos). La gràfica de
l'esquerra mostra els resultats corresponents als
ratolins individuals, en els quals s'observa una gran
heterogeneïtat en els patrons evolutius. La gràfica de
la dreta correspon al valor de la mitjana de tots els
animals analitzats.
Aquests resultats indiquen no sols que l'expressió de
transgens en el sistema hematopoètic murí després
de la transducció retrovírica pot ser molt estable a
llarg termini, sinó que probablement també s'indueix
tolerància immunològica respecte del producte del
transgèn (si no fos així es produiria una disminució
progressiva o una desaparició de les cèl·lules que
expressessin el transgèn).
2) Estudiar la necessitat de mieloablació per a
l'empelt de les cèl·lules hematopoètiques
transduïdes en el model murí.
A la vista dels resultats comentats abans, vam iniciar
un estudi en què s'analitzava la influència de la dosi
de mieloablació, la dosi cel·lular i la manipulació ex
vivo sobre l'empelt a llarg termini de les cèl·lules
hematopoètiques transduïdes. El resum d'aquest
treball es mostra en les tres figures següents.
Figura 2. Disseny experimental.
Figura 3. Empelt hematopoètic en els diversos grups
de ratolins trasplantats, 5 mesos després del trasplantament.
Es representen les rectes de regressió corresponents
als tres tipus de trasplantament hematopoètic
efectuats (línia contínua: animals trasplantats amb
0,5x106 cèl·lules transduïdes; línia discontínua:
animals trasplantats amb 5x106 cèl·lules fresques, i
línia de punts: animals trasplantats amb 5x106
cèl·lules transduïdes).
RECERCA BIOMÈDICA | 51

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
Figura 4. Expressió del transgèn (EGFP) en les
cèl·lules de medul·la òssia procedents del donant, 5
mesos després del trasplantament. Es representen els
percentatges de cèl·lules que l'expressaven en el grup
de ratolins que presentaven microquimerisme i en el
que presentaven macroquimerisme.
En resum, els resultats obtinguts indiquen que hi ha
una relació directa entre la dosi de mieloablació
(irradiació corporal total) i el nivell d'empelt hematopoètic
observat, un fet ja conegut i esperat, però també
que dosis baixes de radiació (2-3 Gy) permetien
empelts estables a llarg termini (5 mesos), i que en els
empelts petits, incloent-hi els microquimerismes
hematopoètics (

Títol del projecte:
Estudi de la variabilitat fenotípica en pacients
amb azoospèrmia: anàlisi de les mutacions
i dels nivells d’expressió tissular del gen CFTR
Investigador principal
Lluís Bassas Arnau
Institució
Fundació Puigvert
Membres de l’equip
Sandra Sonache, Sara Larriba, Dolors Ramos, Xavier Giménez, Lluís Bassas i Teresa Casals
16.927.875 PTA
MEMÒRIA FINAL
1. Resum del projecte original
1.1. Objectius principals
a) Caracteritzar les mutacions del gen CFTR en
homes afectats d’esterilitat i azoospèrmia idiopàtica i
determinar la participació de l’esmentat gen en els
diferents fenotips.
b) Analitzar l’mRNA del gen CFTR en mostres de
biòpsia i/o cultius primaris dels teixits on s’expressa
(testicle, epidídim, epiteli nasal, limfòcits). Estudiar
l’expressió i quantificació dels transcrits.
1.2. Objectius secundaris
c) Estudiar la proteïna CFTR anòmala. Determinar el
seu pes molecular i el seu potencial de fosforilació.
d) Definir, als teixits on s’expressa, la localització
cel·lular de la proteïna CFTR.
e) Desenvolupar cultius primaris de diferents teixits en
pacients d’interès.
1.3. Disseny
1.3.1. Pacients
Homes amb diagnòstic clínic d’esterilitat conjugal
involuntària, i que presenten un fenotip d’azoospèr-
mia. El protocol d’estudi preveu una avaluació
completa que identifiqui el tipus de lesió i els factors
de risc associats. La mostra per estudiar serà de 75 a
100 individus.
1.3.2. Mètodes
L’estudi clínic andrològic, realitzat a la Fundació
Puigvert, inclourà anamnesi general i específica,
exploració física completa, i exploracions analítiques i
complementaries protocol·litzades pel Servei
d’Andrologia.
Els estudis biòpsics testiculars seran realitzats amb
finalitat diagnostica i assistencial amb informació i
consentiment previs.
L’estudi molecular del gen CFTR s’efectuarà en
mostres de sang perifèrica i de diferents teixits dels
pacients. L’obtenció de DNA i RNA d’aquestes
mostres permetrà caracteritzar les mutacions i els
transcrits del gen CFTR. Les principals tècniques
aplicades seran l’electroforesi en gradients de gels
desnaturalitzants (DGGE) i l’anàlisi conformacional de
cadena senzilla (SSCA). Els patrons desconeguts es
caracteritzaran per seqüenciació.
Els estudis d’expressió en teixit es realitzaran a partir
de l’RNA, per mitjà de síntesi de cDNA. La caracterització
preliminar de la proteïna CFTR es realitzarà amb
RECERCA BIOMÈDICA | 53

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
anticossos específics i Western blot.
L’anàlisi estadística es basarà en mesuraments
descriptius i en la comparació de freqüències entre
grups, prova de 2.
1.4. Pla de treball
1) Durant la primera i la segona anualitat preferentment,
es farà la selecció i estudi dels pacients
candidats, homes afectats per esterilitat conjugal amb
alteracions idiopàtiques de la producció espermàtica o
anomalies genitourinàries de possible origen congènit.
S’iniciarà l’anàlisi histològica quantitativa de les
mostres testiculars.
2) Paral·lelament a la inclusió de pacients, s’extraurà
DNA de sang perifèrica. El rastreig del gen CFTR i
seqüenciació dels patrons no coneguts es concentrarà
en la segona i tercera anualitat.
3) Obtenció d’RNA de teixits i l’anàlisi preliminar dels
transcrits i de l’expressió es durà a terme durant la
tercera anualitat.
4) L’avaluació dels resultats, durant tot el període del
projecte, finalitzarà amb una interpretació del paper
del gen CFTR, el seu nivell d’expressió i localització.
2. Resultats
2.1. Mutacions del gen CFTR en azoospèrmies
obstructives congènites
Els resultats dels estudis realitzats en pacients amb
obstrucció congènita per agenèsia de conductes
deferents confirmen que una proporció del 85%
d’homes amb agenèsia bilateral i del 36% de pacients
amb agenèsia unilateral presenten una o dues
mutacions del gen CFTR. En els casos en què hi ha
altres anomalies urogenitals associades, com l’agenèsia
renal, presenten mutacions en el 17,4% dels
casos, en comparació amb el 4% que s’observa en la
població general.
Curiosament, els pacients amb agenèsia renal aïllada
presentaren també un percentatge de mutacions
elevat (15%). Aquesta última dada contrasta amb
treballs sobre poblacions nord-europees i americanes,
i podrien representar una característica diferencial de
la població estudiada.
El tipus de mutacions observades respon a un patró
característic, netament diferent del que es troba en la
fibrosi quística clàssica. La variant mutant 5T és la
més freqüent (33% de totes les mutacions trobades),
seguida de la mutació F508 (25%), i amb menor
freqüència G542X (6%), L206W (5%), R117H (5%) i
altres 6 mutacions.
La clara relació entre l’agenèsia dels conductes
deferents (bilateral i unilateral) i un particular patró de
mutacions del gen CFTR aporta informació fonamental
sobre l’etiologia i el consell genètic i reproductiu.
2.2. Mutacions del gen CFTR en lesions testiculars
idiopàtiques
La freqüència de mutacions del gen CFTR en pacients
amb azoospèrmia i oligozoospèrmia idiopàtica és del
25,3%, mentre que en l’azoospèrmia obstructiva
adquirida el percentatge és similar al de la població
general (4%). Aquestes dades s’afegeixen a les
publicades recentment per altres autors en diversos
articles, i que mostren opinions controvertides sobre la
possible associació entre alteracions testiculars i
mutacions CFTR. En tot cas, el debat científic roman
obert, i convida a continuar estudiant la implicació del
gen CFTR en la regulació de l’espermatogènesi i la
maduració espermàtica.
2.3. Processament i expressió del gen CFTR en el
testicle
La mutació més freqüentment detectada en els
fenotips descrits (IVS8-6 5T) ocasiona un processament
alternatiu del gen quan s’expressa en els teixits.
L’anàlisi per mitjà de transcripció inversa i reacció en
cadena de la polimerasa (RT-PCR) en biòpsies testiculars
indica que la longitud del fragment IVS6-8 (T) es
correlaciona amb la proporció de transcrits alternatius.
L’anàlisi histològica mostra que la presència d’aquest
processament aberrant està relacionat amb una
disminució parcial del nombre de cèl·lules espermàtiques
que arriben a la maduració completa.
2.4. Expressió testicular del gens relacionats amb
CFTR
Estudis anteriors realitzats en teixit intestinal havien
suggerit un possible mecanisme de regulació recíproca
entre el gen CFTR i altres gens relacionats que
també tenen una funció de transport. Es va estudiar la
transcripció dels gens MDR1 i MRP per mitjà d’RT-
PCR en teixit testicular per determinar si s’observava
un mecanisme de compensació entre aquests gens i
el CFTR en cas de mutacions. Els resultats mostraren
que la regulació de l’expressió és independent, i que
per tant no es confirmava cap mena d’interacció. Tot i
que el testicle no és l’òrgan més sensible a les alteracions
del gen CFTR, es tracta de les primeres dades
publicades sobre la interacció entre aquests dos
grups de gens en un teixit humà in vivo.
2.5. Estudi del gen del receptor d’andrògens
Es va estudiar el gen del receptor d’andrògens a fi de
complementar l’estudi genètic en pacients amb lesió
testicular idiopàtica, ja que durant els últims anys
s’han publicat treballs que indiquen una possible
implicació de la longitud d’un fragment de repeticions
en tàndem (CAGn) a l’exó 1 d’aquest gen. L’estudi es
va completar amb l’anàlisi de possibles mutacions en
els exons que determinen la unió a la hormona (4 a 8).
Els resultats no mostren diferències entre els pacients
infèrtils i la població control fèrtil. Tampoc no s’identificaren
mutacions en els exons analitzats en cap dels
pacients.
2.6. Estudi de microdelecions del cromosoma Y
També per assegurar una avaluació exhaustiva de les
causes d’esterilitat, es va considerar obligat realitzar
un estudi de microdelecions de certes regions (AZFa,
AZFb, AZFc) del braç llarg del cromosoma Y (Yq). La
pèrdua d’una o més d’aquestes regions sembla
relacionada amb defectes de l’espermatogènesi. Els
nostres resultats mostren que un 7,3% dels pacients
amb oligozoospèrmia o azoospèrmia severa tenen
delecions, en un percentatge similar al descrit a la
literatura.
2.7. Conclusions
Les mutacions del gen CFTR determinen un fenotip
d’esterilitat associada a defectes congènits de la via
seminal derivada del conducte de Wolff, i també
semblen relacionar-se amb altres malformacions

enals. D’altra banda, és possible que el gen CFTR
tingui una funció rellevant en l’espermatogènesi, ja
que s’expressa en teixit testicular, i els pacients amb
defectes de la maduració espermàtica tenen una
freqüència de mutacions més elevada que els homes
fèrtils normals.
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
Els objectius principals del projecte s’han assolit
plenament. La col·laboració entre el Centre de
Genètica Mèdica i Molecular (IRO) i la Fundació
Puigvert ha aportat informació rigorosa i clínicament
rellevant sobre el paper del gen CFTR en la producció
dels fenotips estudiats.
La confirmació que l’agenèsia dels conductes
deferents (bilateral i unilateral) està fortament relacionada
amb un particular patró de mutacions del gen
CFTR aporta informació fonamental sobre l’etiologia i
el consell genètic i reproductiu. En conseqüència, els
protocols i directrius assistencials aplicats als pacients
amb aquestes alteracions (i a les seves cònjuges
femenines) ja inclouen actualment l’estudi del gen
CFTR. Això evitarà en el futur la transmissió de les
alteracions esmentades, i en particular l’aparició de
casos de fibrosi quística greu en els fills d’aquestes
parelles, concebuts per mitjà de les modernes
tècniques de reproducció assistida.
L’associació entre mutacions del gen CFTR i les
azoospèrmies secretores, tot i que menys important,
aporta una nova contribució al debat sobre la relació
entre ambdues entitats. Des del punt de vista dels
autors, està clar que cal seguir estudiant la implicació
del gen CFTR en la regulació de l’espermatogènesi i la
maduració espermàtica. La transcendència clínica
dels resultats obtinguts queda subratllada pel fet que
s’han estudiat simultàniament tots els factors de risc
coneguts (genètics i no genètics) implicats en l’esterilitat
masculina en un grup important de pacients, i s’ha
inclòs un grup control.
4. Publicacions
Teresa Casals, Lluís Bassas, Susana Egozcue, María D. Ramos,
Javier Giménez, Ana Segura, Ferran García, Marta Carrera, Sara
Larriba, Joaquim Sarquella, Xavier Estivill. Heterogeneity for
mutations in the CFTR gene and clinical correlations in patients
with congenital absence of vas deferens. Human Reproduction,
15:1476-1483 (2000)
Sara Larriba, Lluís Bassas, Susana Egozcue, Javier Giménez,
María D. Ramos, Oscar Briceño, Xavier Estivill, Teresa Casals.
Adenosine triphosphate-binding cassette superfamily transporter
gene expression in severe male infertility. Biology of Reproduction,
65:394-400 (2001)
Lluís Bassas, Sara Larriba, Ana Segura, Susana Egozcue,
Teresa Casals. Mutaciones del gen CFTR y su relación con las
alteraciones genitourinariasy de la fertilidad masculina. En: ASESA
(ed.) Temas de actualidad andrológica. Madrid: Jarpyo Editors,
2001, p. 273-287
Sara Larriba, Teresa Casals, Joaquim Sarquella, Erwin Amaya,
María D. Ramos, Javier Giménez, Virginia Nunes, Lluís Bassas.
Estudio Molecular de la infertilidad masculina secretora en una
muestra de la población española. Revista Iberoamericana de
Fertilidad y Reproducción Humana, 18 (supl 1):124-127 (2002)
RECERCA BIOMÈDICA | 55

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
MEMÒRIA FINAL
1. Resum del projecte original
Aquest projecte pretenia intentar escatir l'origen,
l’expansió i el manteniment en les poblacions de la
malaltia genètica recessiva més freqüent en
poblacions d'origen europeu, la fibrosi quística. Els
objectius concrets eren: a) l'estudi de la distribució
geogràfica mundial d'haplotips compostos per sis
polimorfismes en el gen CFTR; b ) modelar els
mecanismes de manteniment de la fibrosi quística en
poblacions d'origen europeu; c) interpretació de la
distribució geogràfica dels diversos mutants del gen
CFTR que causen fibrosi quística (CF).
El disseny i pla de treball previst per a l'assoliment
dels objectius proposats va consistir en:
a.1) Tipatge de quatre Short Tandem Repeats (STR) i
dos Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) en uns
2.000 cromosomes corresponents a 18 poblacions
que representen tots els grans grups humans.
a.2) Creació d'una base de dades amb els resultats i
tractament numèric d'aquests.
a.3) Interpretació dels resultats; possible detecció de
la regió d'origen de les principals mutacions causants
de fibrosi quística.
Títol del projecte:
La història natural de la fibrosi quística:
interpretació geogràfica de la variació genètica
Investigador principal
Jaume Bertranpetit Busquets
Institució
Facultat de Ciències de la Salut i de la Vida. UPF
6.999.000 PTA
b.1) Modelatge dels possibles efectes de la deriva i la
selecció en les freqüències de mutants CF.
b.2) Estudi mitjançant models de coalescència dels
possibles efectes del creixement de la població sobre
els mutants CF.
b.3) Sobre el mateix model de coalescència, calcular
els coeficients de selecció necessaris per generar les
freqüències actuals de CF.
c.1) Construcció, a partir de fonts bibliogràfiques i de
dades aportades per altres autors, d'una base de
dades de freqüències relatives de les diverses
mutacions causants de CF en pacients.
c.2) Anàlisi de la base de dades: caracterització de la
diversitat genètica de mutacions causants de CF en
poblacions europees diferents.
c.3) Interpretació, en termes d’història demogràfica,
dels resultats obtinguts en l'objectiu anterior.
2. Resultats
Tipatge del microsatèl·lit IVS1CA del gen CFTR
A partir de l’anàlisi de la variació al·lèlica existent en
aquest nou microsatèl·lit del gen CFTR observem que
és altament informatiu en totes les poblacions
humanes on s’ha tipat, les quals comprenen una
representació de poblacions que abasten tots els

continents pot ser utilitzat per al consell genètic en la
fibrosi quística, ja que ens pot aportar informació nova
en estudis familiars en què la mutació CF que afecta
una família en concret és desconeguda i pot confirmar
la informació obtinguda amb els tres microsatèl·lits que
es tipen rutinàriament en consell genètic (IVS8CA,
IVS17bTA i IVS17bCA). En diagnòstic prenatal, com
més informació s’obtingui, més fàcil serà detectar
possibles contaminacions de teixit matern en el tipatge
de teixit fetal, i així evitar errors de diagnosi.
L’estudi de la variació en un sol locus ens reafirma el
model de substitució o també anomenat com sortida
d’Àfrica (Out of Africa) en l’evolució dels humans
moderns, en mostrar-nos un major nombre d’al·lels i
també els valors d’heterozigositat esperada, més alts en
les poblacions africanes analitzades que no pas en les
poblacions no africanes. Aquests resultats són semblants
al panorama mitjà descrit per conjunts de microsatèl·lits.
La inclusió d’un nou microsatèl·lit permet formar
haplotips més llargs juntament amb altres marcadors
ja coneguts, tot augmentant la resolució dels haplotips
per a estudis evolutius, com intentar entendre l’origen
i la dispersió de les mutacions CF més importants.
Anàlisi genètica de la regió CFTR
Hem dut a terme l’anàlisi de sis polimorfismes (quatre
microsatèl·lits i dues substitucions nucleotídiques)
localitzats en el gen CFTR, en gairebé 2.000
cromosomes d’individus no afectats de CF, en 18
poblacions humanes repartides per tot el món.
L’estudi ens mostra importants diferències tant en les
freqüències al·lèliques com en les freqüències haplotípiques
entre les diverses poblacions. Hem de
remarcar, però, que mentre que les poblacions
subsaharianes tenen una diversitat al·lèlica en els
microsatèl·lits més gran comparada amb la resta de
poblacions, les diversitats haplotípiques que presenten
no són especialment majors.
El tipatge de les dues substitucions nucleotídiques
(T854 i TUB20) en mostres de primats no humans ens
ha permès inferir l’estat ancestral més probable de
l’haplotip format per ambdues substitucions (1-2), que
alhora coincideix amb l’haplotip més freqüent en la
nostra mostra. Malgrat això, aquest haplotip no és el
que porta associada la major diversitat d’haplotips
pels quatre microsatèl·lits (IVS1CA-IVS6aGATT-
IVS8CA-IVS17bTA) com es podria esperar. Aquest fet
recau en l’haplotip 2-2, tot suggerint que aquest
haplotip derivat seria també molt antic.
Observant les variances de les distribucions al·lèliques
dels diversos microsatèl·lits per poblacions, veiem que
aquestes estan determinades més pel locus que per
la població, tot existint molta heterogeneïtat en les
diversitats dels quatre microsatèl·lits, molt probablement
a causa de taxes diferents de mutació entre ells.
El rang de polimorfisme trobat va des de 2 al·lels que
representen gairebé el 100% dels cromosomes pel
locus IVS6aGATT fins a 36 al·lels diferents trobats en
el locus IVS17bTA. Els microsatèl·lits emprats en el
nostre estudi es coneixen a partir de la seqüència
complerta del gen CFTR i excepte un (IVS17bCA),
n’hem tipat tota la resta, és a dir que són una mostra
no esbiaixada de la representació de l’heterogeneïtat
entre els microsatèl·lits en una determinada zona
genòmica.
Si analitzem la variació en els microsatèl·lits en funció
del background d’SNP, mesurat amb l’AMOVA, veiem
que la variabilitat dels microsatèl·lits és major entre els
diversos backgrounds haplotípics que entre les
poblacions, és a dir, que el background genètic
predomina sobre el background poblacional en
l’estructura de la variació genètica dels STRP en la
regió del gen CFTR, i suggereix que les substitucions
nucleotídiques que van generar el background haplotípic
van precedir la diferenciació de les poblacions
humanes actuals. El valor d’FST per background
d’SNP més alt correspon al microsatèl·lit IVS6aGATT,
tot confirmant la baixa taxa de mutació en aquest
locus respecte dels altres tres microsatèl·lits i no pas
una taxa de mutació major seguida de constriccions
en la mida dels al·lels. Aquesta és una visió original en
l’estudi de la diversitat genètica humana i té implicacions
en la comprensió de la variació des de dues
dinàmiques complementàries: la del genoma i la de
les poblacions. Moltes vegades s’ha tractat les
poblacions humanes com a entitats clarament definides
però, sorgeix l’evidència que la genealogia dels
gens (o regions del genoma) té arrels molt més
profundes que no la genealogia (o història) de les
poblacions i, per tant, que les inferències a poblacions
del passat a partir de les actuals pot estar mancada
de sentit.
Origen de les mutacions CF més importants
La fibrosi quística és la malaltia autosòmica recessiva
més comuna en les poblacions d’origen europeu, i
afecta un de cada 2.500 individus. Causada per
mutacions al gen CFTR, només 5 de les més de
1.000 mutacions descrites presenten freqüències
globals superiors a l’1% en els cromosomes CF
(mutacions ∆F508, G542X, G551D, N1303K i
W1282X). La mutació ∆F508 és la majoritària i
comprèn el ~ 70% dels cromosomes CF.
Per tant, és més versemblant que cada mutació CF
hagi sorgit en aquella població on el background
haplotípic al qual està associada sigui més freqüent
entre els cromosomes normals. Cal tenir en compte,
però, que algunes d’aquestes mutacions poden ser
molt antigues i, per tant, la composició actual de la
població pot no reflectir la de la població on es va
originar la mutació.
En cercar aquests backgrounds haplotípics en les
poblacions humanes actuals, observem que són rars:
només es troben esporàdicament en alguna població
de l’Orient Mitjà, europea o asiàtica. Hem de remarcar,
però, que són els haplotips majoritaris associats
específicament a la mutació ∆F508 (21-6-23-1-31-2 i
21-6-17-1-31-2) els que gairebé no es troben enlloc
(només en una població de l’Orient Mitjà i en una
d’europea); i és en incloure altres haplotips filogenèticament
relacionats que n’apareixen traces en més
poblacions europees i una asiàtica.
Construint un arbre de màxima versemblança
incloent-hi cromosomes no portadors de mutacions
CF (poblacions de tot el món) i cromosomes CF
portadors de les cinc mutacions, veiem clarament que
el principal factor estratificador és el background
genòmic (el fet de portar mutacions CF o no) i no pas
la població, fet que confirmaria una edat antiga,
preneolítica, de les mutacions.
RECERCA BIOMÈDICA | 57

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
Així doncs, no tindria sentit el fet de buscar un lloc
d’origen d’unes mutacions que probablement són
més antigues que les mateixes poblacions actuals i
que ja estarien presents en els humans abans del
procés de formació dels grups humans actuals, és a
dir l’etnogènesi i història demogràfica de la humanitat.
La diversitat genètica de mutacions causants de CF
Malgrat que actualment encara queda per identificar
una fracció important de mutacions (en funció de la
població, fins a un 60% de les mutacions resta
desconegut), hi ha descrits més de 1.000 al·lels en el
gen CFTR que produeixen fibrosi quística.
Moltes mutacions, especialment ∆F508, deuen ser
úniques i segurament molt velles. Amb una edat
calculada de 50.000 anys, ∆F508 és la mutació que
presenta una freqüència més alta en la població
europea, en variar des del 50% a Espanya i Itàlia, fins
al 80% a Dinamarca. Altres al·lels causants de fibrosi
quística amb una freqüència rellevant són G542X
(freqüència d'1,5%), N1303K (freqüència d'1,3%) i
W1282X (amb un 1,2%).
El model més apropiat per descriure l'espectre de les
mutacions causants de fibrosi quística sembla el
model d'infinits al·lels, en el qual cada mutació
produeix un nou al·lel; segons si causen o no malaltia,
la freqüència gènica pot ser dividida en dos grups:
al·lels normals (p) i al·lels que causen malaltia (q). Dins
aquesta fracció, cada mutació pot ser considerada
neutra, ja que totes o bé tenen les mateixes o
semblants manifestacions fisiològiques o bé causen
esterilitat masculina i, per tant, tenen el mateix
coeficient de selecció.
En un cas anàleg s'ha comprovat que la diversitat dins
la fracció d'al·lels mutants depèn de la taxa de mutació
i de la grandària de la població, però no del coeficient
de selecció o del grau de dominància.
S'ha postulat que l'elevada freqüència de la fibrosi
quística és causada per fenòmens de selecció a favor
d'heterozigot més que per fenòmens de deriva o una
taxa alta de mutació, ja que, en el model de ratolí, els
heterozigots mostren una resistència superior a la
pèrdua de fluid per la toxina colèrica. Així, el còlera i
altres malalties infeccioses relacionades amb la pèrdua
de fluids intestinals podrien haver exercit una pressió a
favor de les mutacions causants de pèrdua de funció.
Tanmateix, aquest fet no explica el patró de diversitat
que s'observa en les diverses poblacions, el qual
estaria lligat més a altres factors, com la deriva i la
migració. En aquest sentit, el registre arqueològic trobat
al continent europeu mostra traces de dues transicions
demogràfiques que poden haver afectat la variació
genètica. La primera, relacionada amb la colonització
del continent per l'Homo sapiens sapiens, se situaria a
uns 45.000 anys abans del present, durant el paleolític
superior, i una segona, durant el neolític i l'expansió de
l'agricultura, uns 10.000 anys abans del present. Entre
ambdues, durant l'últim període glacial (uns 18.000-
20.000 anys abans del present), les poblacions podrien
haver confluït en, segurament, tres refugis (glacial
refugia), a partir dels quals s'haurien expandit posteriorment
durant el període mesolític.
En aquest treball s'ha recopilat informació d'un gran
nombre de poblacions per estudiar el patró de diversitat
dels al·lels causants de fibrosi quística a través del
continent europeu.
Els estudis de correlació entre la latitud i els càlculs de
MAX, DMIN, ΘHMAX i ΘHMIN calculats a partir de les
freqüències gèniques de les 94 poblacions van
mostrar valors negatius i molt significatius (Correlació
de Pearson de —0,6 (p

L'alta correlació negativa observada entre la freqüència
de ∆F508 i les dues valoracions de diversitat és
una indicació de l'elevat pes que té aquesta mutació
en valorar la diversitat. Si s'elimina de la diversitat
aquesta mutació, la diversitat resultant D´ (tant la
màxima com la mínima) no mostra cap tipus de
correlació amb la latitud; si s'aplica una correlació
parcial entre la latitud i les D controlades per a ∆F508
s'obtenen correlacions negatives que, o no són significatives,
o estan al límit de la significació.
Aquestes dades i el fet que s'hagi establert una
correlació positiva entre el grau d'incidència de la
fibrosi quística i la mutació ∆F508 són indicatius d'un
grau més gran de diversitat al Sud, ja que l'espai
deixat per ∆F508 tindria la mateixa diversitat, però
aquesta seria més gran al Sud, on la freqüència de
∆F508 és menor i representa un menor percentatge
respecte de la incidència.
Ja que les taxes de mutació per a les diverses
poblacions han de ser la mateixes, la presència de
correlació entre les dues ΘH i la latitud ha de ser
indicativa d'unes dimensions de població efectives
diferents, les quals serien superiors al Sud i menors al
Nord. Els estudis SAAP realitzats per a DMAX, DMIN,
F508, van mostrar un patró que va variar des de valors
positius significatius fins a valors negatius significatius,
tot indicant la presència d'una clina. Els mapes de
DMAX, DMIN i ∆F508 van permetre establir el sentit i
direcció de la clina: els valors de diversitat augmentaven
en direcció Sud-est i disminuïen en sentit Nord-oest.
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
Per tenir un coneixement aprofundit d'una malaltia
genètica cal no sols comprendre’n la base genètica,
sinó també descriure’n la història natural. Aquesta
descripció abasta el lloc d'origen de la variant patogènica
que després es va expandir a la resta de la
població, com també quan va aparèixer, és a dir, la
seva edat. Conèixer aquests factors ens ajuda a
entendre el perquè de l'existència de malaltia genètica,
ja que una deducció molt simple ens porta a
pensar que serà sempre molt poc freqüent, ja que en
produir malaltia, impedeix o disminueix la probabilitat
de passar el gen a la descendència i, per tant,
s'aniran eliminant de la població.
Una malaltia genètica greu i molt comuna en les
poblacions d'origen europeu és la fibrosi quística, que
afecta 1 de cada 2.500 nadons. La malaltia cursa
principalment amb una patologia respiratòria obstructiva
amb infeccions cròniques i recurrents que afecta
la supervivència de l'individu. Les causes genètiques
d'aquesta malaltia són conegudes, i s’han descrit fins
avui al voltant de 1.000 mutacions diferents en el gen
CFTR que la causen. Algunes d'aquestes variants
patogèniques són molt més freqüents i més esteses
en la població que d’altres, i la mutació principal és
una pèrdua de tres nucleòtids. Aquesta mutació
s’anomena ∆F508 i està aproximadament en dos
terços de tots els cromosomes portadors de fibrosi
quística. Només quatre mutacions més (G542X,
N1303K, G551D i W1282X) es troben amb unes
freqüències globals superiors a l’1% entre els
cromosomes portadors. Així mateix, a part de les
variants patogèniques o mutacions, poden haver-hi
altres variants no patogèniques o polimòrfiques que es
troben en tots els individus. La combinació d'aquestes
variants constitueix un rerefons genètic que permet
identificar els genomes que porten determinades
combinacions de variants genètiques.
En el decurs de la història de les poblacions, cada
mutació patogènica va aparèixer sobre un cert
rerefons genètic; es coneixen els rerefons associats a
les principals mutacions productores de fibrosi quística,
i s'ha observat que són clarament distints als
trobats en els cromosomes normals, fins i tot en
genomes d'individus de la mateixa població. De fet,
hem observat que els cromosomes que presenten
una mutació són molt més semblants entre ells,
independentment de la població de què provinguin,
que amb els cromosomes que no presentin la
mutació i pertanyin a la mateixa població. Hi ha un
rerefons genètic específic dels cromosomes amb
determinades mutacions per a fibrosi quística,
independentment de la variació geogràfica.
Podem hipotetitzar que les mutacions van aparèixer en
aquelles poblacions en què els esmentats rerefons han
estat més freqüents i, per tant, es podria reconèixer el
lloc d'origen d'una mutació veient en quines poblacions
mundials el rerefons genètic associat a una mutació és
freqüent entre els cromosomes no mutats. Una de les
informacions que podria portar és on aquestes
mutacions no van ser eliminades quan es van originar i
postular factors ambientals que les poguessin mantenir.
Analitzant els rerefons en cromosomes no portadors
en poblacions de tot el món, hem vist que el rerefons
genètic associat a les principals mutacions causants
de fibrosi quística (∆F508, principalment) està pràcticament
absent en la població mundial sana. El resultat
sorprenent és que cap població té una freqüència
suficient com per suggerir una població d'origen.
També sabem que l'edat d'aquesta mutació en
concret és molt antiga i dataria aproximadament de fa
uns 40.000 anys. Aquesta edat ens portaria clarament
a èpoques preneolítiques. El present treball mostra
que el problema de buscar una població d'origen de
la malaltia, de fet no té sentit, ja que la malaltia (o
mutació) seria més antiga que el procés d'etnogènesi
que hauria originat en les pròpies poblacions europees.
El temps d'evolució del genoma, incloent-hi la
generació de variants productores de malalties, és per
tant molt més antic que l'edat de les poblacions
humanes. Els nostres gens i les malalties que s’hi
associen mostren un llegat llunyà, més antic que la
nostra pròpia història.
4. Publicacions
Mateu E, Calafell F, Bonné-Tamir B, Kidd JR, Casals T, Kidd KK
and Bertranpetit J. (1999). Allele frequencies in a worldwide
survey of a CA repeat in the first intron of the CFTR gene. Hum
Hered 49:15-20.
Mateu E, Calafell F, Lao O, Bonné-Tamir, B, Kidd, JR, Pakstis A,
Kidd, KK and Bertranpetit, J (2001) Worldwide genetic analysis of
the CFTR region. Am J Hum Genet 68: 103-117.
Mateu E, Calafell F, Ramos MD, Casals T, Bertranpetit J (2002)
Can a place of origin of the main Cystic Fibrosis mutations be
identified? Am J Hum Genet 70:257-264.
Lao O, Andrés AM, Mateu E, Bertranpetit J, Calafell F. Spatial
patterns of cystic fibrosis mutation spectra in european populations.
Eur J Hum Genet (en premsa).
RECERCA BIOMÈDICA | 59

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
MEMÒRIA FINAL
1. Resum del projecte original
Introducció
La identificació dels assajos clínics reclama una
estratègia de recerca exhaustiva, global i no esbiaixada
de la literatura, tenint en compte les conegudes
limitacions de la recerca electrònica en les bases de
dades més importants en ciències de la salut. Des de
la Col·laboració Cochrane s’estan impulsant diverses
iniciatives per identificar assajos clínics controlats en
totes les malalties, països i especialitats.
Objectiu principal
Identificar els assajos clínics amb distribució aleatòria
sobre fibrosi quística i distròfia muscular tipus
Duchenne i miotònica, realitzats internacionalment i a
Espanya, des del 1948 al 2000.
Objectius secundaris
1. Anàlisi descriptiva de les principals variables d'interès
dels assajos clínics realitzats a Espanya.
2. Facilitar l'accés i difusió dels assajos clínics identificats
per considerar-los en futures revisions sistemàtiques
i metanàlisis, mitjançant incorporació al Registre
Títol del projecte:
Identificació i descripció d’assajos clínics
en fibrosi quística i distròfies musculars (1948-2000)
Investigador principal
Xavier Bonfill Cosp
Institució
Consorci Hospitalari Parc Taulí
Membres de l’equip
Raquel Rivero, Xavier Bonfill, Marta Roque, Josep Ma. Garcia i Gerard Urrutia
2.454.000 PTA
d'Assajos Clínics de la Col·laboració Cochrane.
3. Anàlisi comparativa dels resultats internacionals i
nacionals obtinguts, desagregats per la producció
anual, patologies investigades i les diverses estratègies
d'identificació per les quals han estat recuperats.
4. Valorar l'exhaustivitat de totes les fonts d'informació
consultades i els possibles biaixos de publicació.
Metodologia
1. Per a la identificació exhaustiva d'assajos clínics
sobre FQ i DM s'ha realitzat una estratègia de recerca
electrònica i manual tant per a l'àmbit internacional
com nacional; i específicament per a la identificació
dels assajos clínics realitzats a Espanya, s'ha dut a
terme una revisió de tesis doctorals, localització
d'assajos clínics no publicats patrocinats per la
indústria farmacèutica i identificació d'assajos clínics
registrats en la Base de Dades Espanyoles d'Assajos
Clínics (BDEEC).
2. Per a l'anàlisi dels resultats obtinguts en l'àmbit
internacional i nacional s'han fet les comparacions i
anàlisis pertinents a partir de les bases de dades
Procite® creades per a l’FQ i DM.

2. Resultats
S'han identificat, en l'àmbit internacional, un total de 931
assajos clínics sobre fibrosi quística i 41 sobre distròfia
muscular, recuperats únicament per recerca manual, el
31% per a l’FQ i el 12% per a la DM, recuperats en
duplicat mitjançant recerca manual, i electrònica el 51%
per a l’FQ i 73% per a la DM, i únicament per recerca
electrònica, el 19% per a l’FQ i el 15% per a la DM. En
l'àmbit nacional s'han identificat 3 assajos clínics sobre
fibrosi quística, identificats per recerca manual (33%),
recerca manual i electrònica (33%) i, per mitjà del
contacte amb els laboratoris farmacèutics i la consulta
de la BDEEC (33%). En l'àmbit nacional, per a la distròfia
muscular s'ha identificat 1 únic assaig clínic, recuperat
per recerca manual i electrònica.
Conclusions
1. Els resultats obtinguts constaten la gran diferència
de producció d'assajos clínics en l'àmbit internacional
i nacional, i la necessitat d'impulsar la recerca clínica
experimental a Espanya.
2. De l'anàlisi descriptiva dels assajos clínics realitzats a
Espanya, a més a més de les limitacions comentades
quant a la identificació, s’ha de destacar la manca
d'informació que conté l’informe corresponent, necessària
per a la valoració crítica posterior i per a la utilització
de les dades en futures revisions sistemàtiques.
3. Aquest primer pas d'identificació d'assajos clínics
es completa amb la incorporació dels resultats
obtinguts al registre internacional d'assajos clínics
creat per la Col·laboració Cochrane (CCTR), que
permet l'accés a assajos clínics no publicats i assajos
clínics que estan publicats en revistes no indexades
en les bases de dades electròniques.
4. Metodòlogicament, aquests resultats han permès
confirmar, a més, la necessitat d'incloure la recerca
manual i altres fonts d'informació com a estratègies
indispensables per a la identificació d'assajos clínics, i
també verificar les ja conegudes limitacions de les
bases de dades electròniques.
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
La identificació i difusió d'assajos clínics són necessàries
per fer futures revisions sistemàtiques, i aquestes
ho són, alhora, per a una atenció sanitària més segura
i efectiva. Les revisions sistemàtiques basades en
assajos clínics controlats amb distribució aleatòria
ofereixen el major grau possible d'evidència científica i
proporcionen la informació més fiable sobre els
efectes diferencials de les diverses alternatives sanitàries.
Això té com a causa el disseny metodològic dels
assajos clínics, atès que minimitzen la possibilitat de
biaixos o errors sistemàtics, i esdevé així el principal
tipus d'estudi quan es pretenen comparar diverses
intervencions sanitàries. Aquesta és el fi últim de la
identificació d'assajos clínics, i a causa de les dificultats
existents en les bases de dades electròniques,
són necessàries altres estratègies d'identificació.
Per això, la Col·laboració Cochrane, d'una banda ha
posat en marxa un procés de recerca manual internacional
i, d’una altra, ha creat un Registre d'Assajos
Clínics (CCTR), que actualment conté 307.872 assajos
clínics identificats per mitjà de recerca electrònica i
manual, i que es pot ser consulta en la revista electrònica
The Cochrane Library, en el qual hi ha registrats els
assajos clínics identificats en aquest projecte. Aquest
registre, d'una banda, permet un accés directe al
coneixement existent sobre un determinat tema, la qual
cosa és d'utilitat per al mateix pacient, i per al clínic
amb vista a la presa de decisions en la seva pràctica
clínica. D'altra banda, és un instrument útil per a l'investigador,
perquè li permet identificar prioritats i conèixer
aquells temes que necessiten més investigació, millorar
la metodologia de futurs assajos clínics controlats i
evitar redundàncies en la recerca, i a més que el procés
de realització de revisions sistemàtiques sigui més
eficient, atès que els participants en els grups de revisió
poden centrar-se en l'anàlisi dels assajos clínics sense
dedicar temps i recursos a localitzar-ne.
Amb aquest treball s'han identificat en l'àmbit internacional
un total de 931 assajos clínics sobre fibrosi
quística i 41 sobre distròfia muscular, recuperats
únicament per recerca manual, el 31% per a l’FQ i el
12% per a la DM, recuperats per duplicat mitjançant
recerca manual i electrònica el 51% per a l’FQ i 73%
per a la DM, i únicament per recerca electrònica, el
19% per a l’FQ i el 15% per a la DM. En l'àmbit
nacional s'han identificat 3 assajos clínics sobre fibrosi
quística, identificats per recerca manual (33%), recerca
manual i electrònica (33%) i, per mitjà del contacte
amb els laboratoris farmacèutics i la consulta de la
BDEEC (33%). En l'àmbit nacional, per a la distròfia
muscular s'ha identificat 1 únic assaig clínic, recuperat
per recerca manual i electrònica.
La comparació de resultats obtinguts internacionalment
(931 per a l’FQ i 41 per a la DM) i a Espanya (3 per a
l’FQ i 1 per a la DM), posa en relleu l'escàs nombre
d'assajos clínics realitzats a Espanya. Destaca la major
importància atorgada a l'estudi de les alternatives
terapèutiques per a l’FQ respecte de la DM. En part, això
és a causa de l'ampli nombre de tractaments farmacològics
que són avaluats per a l’FQ però no per a la DM,
perquè no és la terapèutica indicada per a aquesta.
Es pot subratllar una característica comuna de tots ells,
que és la manca d'informació bàsica, com és el període
de realització de l'estudi i seguiment, l’àmbit de realització,
les fonts de patrocini, l'explicitació dels mètodes
d'aleatorització i emmascarament, i l’explicitació del
càlcul de la dimensió de la mostra, els criteris d'inclusió i
exclusió dels participants, l'informe de pèrdues o
abandonaments. Respecte de l'anàlisi estadística, no
sempre s'especifica la mesura estimada de l'efecte de la
intervenció de les variables de resultat i la justificació de
l'anàlisi estadística proposada.
Amb l'aportació dels assajos clínics identificats en
aquest projecte al Registre Central d'Assajos Clínics de
la Col·laboració Cochrane, fonamentalment els realitzats
a Espanya per la dificultat d'identificació ja comentada
(revistes espanyoles no indexades, assajos clínics no
publicats...), s'aconsegueixen evitar duplicitats i esforços
innecessaris i, per tant, facilitar el treball a les persones
interessades en revisions sistemàtiques sobre els tractaments
actuals per a l’FQ i DM, o simplement per als qui
estiguin interessats a consultar tota l'evidència existent.
En aquest sentit, la identificació i posterior difusió dels
assajos clínics identificats en aquest treball sobre
fibrosi quística i distròfia muscular permetran conèixer
i accedir als resultats de les investigacions realitzades,
sobretot, i facilitar l'accés a la investigació nacional,
per les dificultats ja comentades, tot identificant-los
per mitjà de les bases de dades electròniques.
RECERCA BIOMÈDICA | 61

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
Títol del projecte:
Animals transgènics models d’intolerància
a la fructosa i glucogenosi muscular
Investigador principal
Fàtima Bosch Tubert · Juan Emilio Felíu Albiñana
Institució
Facultat de Veterinària. UAB · Hospital Universitario Puerta de Hierro. Madrid
Membres de l’equip
Equip Fátima Bosch: Judith Agudo, Ana Arbós, Eduard Ayuso, Jennifer Barrero, Assumpció Bosch, Alba
Caselles, Ivet Elias, Tura Ferrer, Sylvie Franckhauser, Miquel Garcia, Mónica George, Virginia Haurigot, Antonio
Hidalgo, Ainara Magdaleno, Xavier Martínez, Maria Molas, Joel Montané, Marta Moya, Sergio Antonio Muñoz,
Pedro José Otaegui, Anna Pujol, Carles Roca, Carles Hug Ros, Albert Ruzo, Ariana Salavent i Mireia Zaguirre
IMEMÒRIA FINAL
1. Resum del projecte original
1.1. Objectius i disseny
El present projecte planteja dos objectius principals:
1. Desenvolupament d’un animal transgènic per a
l’estudi de la intolerància hereditària a la fructosa.
L’objectiu d’aquesta part del projecte és obtenir un
model experimental d’intolerància hereditària a la
fructosa (IHF) mitjançant la sobreexpressió hepàtica
de fructocinasa (FK). Per dur a terme aquest objectiu
es proposa l’obtenció de ratolins transgènics que
sobreexpressin en fetge el gen quimèric promotor de
la P-enolpiruvat carboxicinasa (PEPCK)/FK. La hipòtesi
d’aquest estudi és que un augment del desequilibri
entre les activitats fructocinasa i aldolasa B al fetge
afavoriria, d’una banda, l’acumulació crònica de
fructosa 1-fosfat (F-1-P) en animals transgènics
alimentats amb una dieta que conté 30% de fructosa.
I, d’una altra, l’acumulació d’F-1-P de forma aguda
després de l’administració de fructosa per via oral o
intraperitoneal. En absència de fructosa en la dieta, els
animals transgènics no presentarien la malaltia.
L’obtenció d’aquest model permetria estudiar les
alteracions metabòliques que es produeixen al nivell
27.489.218 PTA
hepàtic a causa de la toxicitat aguda, però, sobretot,
per la toxicitat crònica de la fructosa. Això és de gran
interès, atès que no s’ha descrit cap model animal
capaç de reproduir les anomalies metabòliques que,
al nivell hepàtic, es produeixen per l’administració
crònica de fructosa en pacients amb IHF.
2. Desenvolupament d’un model animal amb glucogenosi
tipus VII. L’objectiu principal d’aquesta segona
part del projecte és l’obtenció de ratolins transgènics
mancats d’activitat 6-fosfofructo 1-cinasa muscular
(PFK-1) mitjançant mutagènesi dirigida del gen que
codifica la subunitat M de la PFK-1 (knock-out), a fi
d’obtenir un model animal de la glucogenosi tipus VII
o malaltia de Tarui. Aquesta malaltia té com a causa la
deficiència completa de l’activitat PFK-1 muscular
(homotetràmer M4), la qual provoca un bloqueig de la
via glucolítica, amb acumulació d’hexoses 6-fosfat
que es reorienten cap a la síntesi de glucogen, tot
provocant un quadre clínic de glucogenosi muscular.
L’obtenció d’aquest model animal de glucogenosi
tipus VII ens permetrà aprofundir en el coneixement
de les anomalies metabòliques resultants de la
deficiència en PFK-1 muscular. Així, el fet que sigui
una de les glucogenosis menys freqüents, juntament
amb l’absència d’un model animal amb patologia

muscular per deficiència en PFK-1, no ha permès un
estudi sistemàtic de la fisiopatologia d’aquesta
malaltia, ni l’avaluació de les adaptacions del múscul
deficient en PFK-1 respecte d’una situació en la qual
està bloquejada la principal font d’energia en
condicions anaeròbies. D’altra banda, aquest model
animal pot ser molt útil per assajar noves aproximacions
terapèutiques (de caire metabòlic/dietètic,
farmacològic o de teràpia gènica).
1.2. Pla de treball
1.2.1. Desenvolupament d’un model d’animal
transgènic amb intolerància a la fructosa.
1.2.1. Construcció del gen quimèric.
1.2.2. Obtenció de ratolins transgènics.
1.2.3. Creació de les colònies d’animals
transgènics en les quals es durà a terme l’estudi.
1.2.4. Anàlisi dels animals transgènics que
sobreexpressin fructocinasa.
1.2.4.1. Estudi de la toxicitat crònica a fructosa
(animals alimentats en dieta amb un 30% de
sacarosa durant períodes llargs de temps).
1.2.4.2. Estudi de la toxicitat aguda a fructosa.
1.2.2. Desenvolupament d’un model d’animal
transgènic amb glucogenosi tipus VII.
1.2.1. Obtenció d’un clon genòmic en ratolí
de la PFK-1 muscular.
1.2.2. Mapatge d’exons.
1.2.3. Obtenció del vector de recombinació.
1.2.4. Cultiu i transfecció de cèl·lules ES.
1.2.5. Microinjecció de blastocists i obtenció
d’animals transgènics.
1.2.6. Generació d’una colònia de ratolins
heterozigots i homozigots per la mutació.
1.2.7. Anàlisi de ratolins deficients en PFK-1 muscular.
2. Resultats
Durant el desenvolupament del projecte s’han dut a
terme les activitats que s’especifiquen tot seguit
conjuntament i de manera perfectament coordinada
entre els grups de Barcelona i Madrid:
2.1. Obtenció d’un animal transgènic per a l’estudi
de la intolerància hereditària a la fructosa.
En primer lloc, es va obtenir el gen quimèric
PEPCK/FK. Aquest gen està format per la fusió del
promotor del gen de la P-enolpiruvat carboxicinasa
(PEPCK) amb el gen de la fructocinasa (FK). Per això,
es va fusionar el fragment XbaI-BglII de -450 pb a +73
pb del promotor del gen de la PEPCK al cDNA de la
FK de rata. El cDNA de la FK s’ha introduït en el
segon exó de la -globina en el vector PEPCK/ -
globina, generat prèviament pel nostre grup. Aquest
vector permet l’expressió de gens exògens a fetge
d’animals transgènics.
2.1.1. Sobreexpressió de fructocinasa (FK) en
cèl·lules d’hepatoma.
Amb la finalitat d’obtenir un model cel·lular d’intolerància
a la fructosa i al mateix temps testar la funcionalitat
del gen quimèric, el grup de Madrid va sobreexpressar
el gen quimèric PEPCK/FK en cèl·lules d’hepatoma
de rata FTO-2B, que estan mancades d’activitat
aldolasa B. Després es va caracteritzar el clon
d’aquestes cèl·lules de major nivell d’expressió. En
condicions basals, cèl·lules FTO-2B transfectades van
presentar una activitat FK 4 vegades superior a les
cèl·lules control. En presència de dibutiril-AMPc i
dexametasona en el medi de cultiu, l’activitat FK va
augmentar en les cèl·lules transfectades, tot assolint
valors 8 vegades més elevats que en cèl·lules control.
Aquest increment en l’activitat FK en cèl·lules FTO-2B
provoca un gran increment de la concentració de
fructosa 1-fosfat en aquestes cèl·lules després de ser
incubades amb diferents concentracions de fructosa.
Tot i així, i a diferència del que està descrit per a fetge
i en hepatòcits aïllats i en cultiu, aquest increment en
fructosa 1-fosfat no es correspon amb una disminució
dels nivells cel·lulars d’ATP, ADP i AMP. La causa
d’això és que en les cèl·lules FTO-2B, una part
important de la fructosa s’incorpora a la via glucolítica
a través de l’hexocinasa, enzim que presenta més
expressió en les cèl·lules d’hepatoma que en els
hepatòcits. La disminució de la velocitat de creixement
de les cèl·lules FTO-FK davant l’acumulació de
fructosa 1-P pot ser causada per una alteració de la
fosforilació oxidativa causada per l’acumulació cel·lular
d’aquest ester fosfòric a través d’un mecanisme que
encara no coneixem.
2.1.2. Obtenció d’animals transgènics que sobreexpressen
fructocinasa (FK) al fetge.
Paral·lelament a la realització dels estudis in vitro, el
grup de Barcelona va microinjectar el gen quimèric
PEPCK/FK en òvuls fecundats de ratolí. Anàlisi per
Southern blot dels animals obtinguts va mostrar la
presència de 13 ratolins que havien incorporat el
transgèn (Tg5, Tg33, Tg35, Tg57, Tg62, Tg67, Tg71,
Tg78, Tg 83, Tg84, Tg91, Tg96 i Tg97). Amb
cadascun dels animals fundadors, es va establir una
colònia per poder determinar en la descendència
quina de les diverses línies presentava més nivell
d’expressió del gen quimèric PEPCK/FK. Per això es
va aïllar RNA total de fetge de ratolins controls i
transgènics i es va analitzar mitjançant Northern blot i
hibridació de les membranes amb el cDNA de la FK.
A més, el grup de Madrid va determinar l’activitat FK.
Després d’aquesta anàlisi, es va observar que les
línies que presentaven una major activitat FK eren la
L96 (2.6 vegades), la L84 (2.11 vegades) i la L71(1.52
vegades). En les altres línies d’animals transgènics, tot
i expressar el transgèn, el nivell d’activitat FK era
similar al dels ratolins control. Les línies L96, L84 i L71
es van ampliar ràpidament i es van establir colònies
d’aquests animals tant a Madrid com a Barcelona per
fer conjuntament l’anàlisi del fenotip.
2.1.3.1. Estudis de toxicitat aguda a fructosa en
ratolins que sobreexpresen FK.
Es van injectar intraperitonealment 0, 2,5 i 5 mg de
fructosa/g de pes a ratolins en dejú. L’administració
de fructosa va provocar un increment de la concentració
hepàtica d’F-1-P i una disminució del contingut en
ATP de manera dependent de la dosi del sucre
injectat. Els canvis van ser molt més marcats en els
ratolins transgènics que en els controls. Al mateix
temps es va determinar l’evolució tot al llarg del temps
de la concentració total de nucleòtids d’adenina (ATP
+ ADP + AMP) presents al fetge després de l’administració
de fructosa, i es va observar una progressiva i
marcada disminució en el contingut hepàtic d’aquests
nucleòtids, essent més acusada en els animals
transgènics que en els controls.
Així doncs, els animals transgènics presentaven una
major sensibilitat a la intoxicació per fructosa manifes-
RECERCA BIOMÈDICA | 63

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
tada per un increment en l’acumulació hepàtica d’F-1-
P i una caiguda més acusada dels nivells d’ATP i del
contingut total dels nucleòtids d’adenina. A més, quan
es va mesurar el contingut hepàtic de fosfat inorgànic
es va observar que, després de cinc minuts de l’administració
de fructosa, els animals transgènics presentaven
una caiguda de fosfat inorgànic de més del
80%, mentre que en els controls no s’observaven
canvis significatius. Posteriorment, als 15, 30 i 60
minuts es va produir una marcada disminució del
contingut hepàtic de fosfat inorgànic que va ésser
molt més pronunciada en els transgènics.
A més, en col·laboració amb el grup del Dr. Sebastián
Cerdán, del Laboratorio de Resonancia Magnética
Funcional del Instituto de Investigaciones Biomédicas
del CSIC, vam realitzar un estudi del metabolisme de
la fructosa mitjançant la tecnologia d’RMN de 31P.
Per això es va estudiar el contingut d’F-1-P, ATP i
fosfat inorgànic per RMN en preparacions ex vivo de
fetge de ratolins controls i transgènics que havien
estat perfosos amb una solució de fructosa (0,5, 2 o 5
mM). Els fetges dels ratolins transgènics presentaven
nivells de fructosa 1-P més elevats que els control
quan eren perfosos amb fructosa. A més, els fetges
dels ratolins transgènics també presentaven un major
descens en la concentració hepàtica d’ATP i una
major disminució en el contingut hepàtic de fosfat
inorgànic.
2.1.3.2. Estudis de toxicitat crònica a fructosa en
ratolins que sobreexpresen FK.
Per fer estudis de toxicitat crònica a fructosa, ratolins
de la línia L96 es van sotmetre a un tractament crònic
amb baixes i altes dosis de fructosa a l’aigua de
beguda. En primer lloc, es va fer un estudi a baixa
fructosa, i per això es va administrar 15,6 g
fructosa/litre d’aigua de beguda durant 6 mesos a
ratolins controls i transgènics. Si es té en compte que
els ratolins beuen un 8 ml d’aigua al dia, prenien una
dosi de 125 mg de fructosa/dia. Després d’aquest
període, els ratolins van ser sacrificats i en determinar
la glucèmia i la insulinèmia no es van observar diferències
significatives amb els ratolins controls tractats
també amb fructosa.
Vam iniciar una nova sèrie d’experiments i animals
control i transgènics van ser sotmesos durant 5, 8 i 11
mesos a una dosi més elevada, d’1,2 g fructosa/dia.
En finalitzar el tractament no es van observar diferències
significatives entre els animals controls i transgènics
en el pes, la glucèmia basal, els nivells plasmàtics
d’insulina i de les activitats alanina aminotransferasa,
aspartat aminotransferasa i fosfatasa alcalina, com
també en les concentracions plasmàtiques de lactat i
àcid úric. A continuació es van analitzar les activitats
de diferents enzims clau del flux glucolític/gluconeogènic
(glucocinasa, piruvat cinasa i fructosa 1,6-bifosfatasa)
i del metabolisme de la fructosa (FK, aldolasa B i
triocinasa). La ingestió de fructosa va provocar un
increment en les activitats piruvat cinasa i fructosa
1,6-bifosfatasa (FBPasa-1). No obstant això, no es
van observar diferències significatives en les activitats
enzimàtiques entre els animals transgènics i els
controls després de l’administració de fructosa.
L’activitat FK aldolasa B i la triocinasa van incrementar
per la ingestió de fructosa. Els increments observats
eren similars en ratolins transgènics i en ratolins
controls.
Per tant, els resultats obtinguts ens permeten afirmar
que el model animal desenvolupat que sobreexpressa
FK en el fetge és un model útil per a l’estudi de les
alteracions metabòliques hepàtiques causades per
l’administració aguda de fructosa en la IHF.
2.2. Desenvolupament d’un model animal amb
glucogenosi tipus VII
2.2.1. Clonatge i caracterització del gen de la PFK-1
muscular de ratolí 129.
2.2.1.1. Obtenció de sondes de cDNA de la fosfofructocinasa-1
(PFK-1) muscular.
La nostra estratègia es basava en l’eliminació dels
inicis de transcripció i traducció com també del primer
exó del gen PFK1-M per eliminar la seva expressió.
Amb aquesta finalitat vam generar sondes específiques
del gen de la PFK-1M que hibridarien amb
aquestes regions. Així, vam obtenir RNA total de
múscul de ratolí i es van fer diverses RT-PCR, tot utilitzant
com a encebadors, oligonucleòtids dissenyats a
partir de seqüències parcials del gen de ratolí publicades
(Nakajima H et al. 1994, Biochemical J. 303:449-
453). Aquests oligonucleòtids incorporaven en els
seus extrems les seqüències dianes d'enzims de
restricció per facilitar-ne el clonatge posterior. Així,
vam obtenir quatre productes de PCR, de 180, 226,
668, i 714 pb, que corresponien a les quatre
combinacions dels encebadors que ens amplificaven
la regió 5' del cDNA. Vam decidir utilitzar com a sonda
per al cribatge de la llibreria genòmica el fragment de
226 pb.
2.2.1.2. Obtenció dels clons genòmics de la PFK-1
muscular.
El pas següent va ser plaquejar la genoteca de ratolí
129v i realitzar el cribatge amb la sonda que havíem
obtingut. Es van aïllar tres clons que hibridaven amb la
sonda ( PFKM1 (16Kb), PFKM10 (16Kb), PFKM14
(17Kb)). Els tres clons van ser mapats mitjançant
anàlisi de restricció. Es van utilitzar múltiples enzims
de restricció per obtenir la màxima informació
possible, com també per facilitar la posterior obtenció
dels fragments que s’havien d’utilitzar com a braços
5’ i 3’ del vector de recombinació. Paral·lelament, es
van obtenir per RT-PCR sondes específiques per a
diferents exons i també per a la regió promotora. El
mapatge d’aquests clons va permetre identificar en el
clon PFKM14 la regió promotora amb els possibles
inicis de transcripció i també l’inici de traducció i el
primer exó coincidint amb mapes dels fragments
publicats del gen de ratolí.
2.2.2. Construcció del vector de recombinació.
Per a la construcció del vector de recombinació es va
utilitzar com a base el plasmidi pPNT. Aquest vector
incorpora el gen de resistència a neomicina eucariota
(Neo), i també el gen de la timidina cinasa (TK).
Aquests gens ens haurien de permetre fer, després,
una doble selecció, positiva i negativa, per seleccionar
els events de recombinació homòloga. La construcció
del vector de recombinació es va iniciar a partir dels
diversos fragments que havíem subclonat per caracteritzar
el clon PFKM14. Vam utilitzar un fragment de 5
Kb per a l’obtenció del braç 5’ i un fragment d’1.4 Kb
per al braç 3’. Després de diverses passes de subclonatge
en diferents plàsmids intermedis, es va obtenir
el vector de recombinació pPNT/PFK1MKO que es va
utilitzar posteriorment per a la disrupció del gen de la

PFK-1M. Aquest vector incorporava, així, dues regions
d’homologia que permetrien dirigir la recombinació de
forma que eliminaríem una regio 3´ del promotor, que
inclou l’inici de transcripció, i també el primer exó amb
l’inici de traducció del gen de la PFK1-M.
2.2.3. Electroporació i identificació dels clons de
cèl·lules ES recombinants.
2.2.3.1. Cultiu i selecció dels clons d’ES recombinants.
Es va fer una electroporació de les cèl·lules ES en
presència del vector de recombinació liniaritzat. A
continuació, es va sotmetre les cèl·lules a una selecció
positiva amb G418 i negativa amb ganciclovir. En el
nostre estudi vam observar com la selecció només
amb neomicina donava uns 250 clons per placa; en
canvi, l'addició de ganciclovir reduïa aquest nombre a
uns 30 clons per placa.
2.2.3.2. Anàlisi dels clons seleccionats.
Es van aïllar, amplificar i analitzar els clons que van
superar el procés de doble selecció. Per comprovar si
havien incorporat la modificació en el gen de la PFK-
1M vam obtenir DNA genòmic i es va analitzar per
Southern blot amb sondes específiques que ens
podien permetre diferenciar els clons en els quals
s’havia produït recombinació homòloga. Es van fer 4
experiments d’electroporació i s’obtingué un total de
348 clons que van superar la doble selecció. Dels
primers 250 clons, es van identificar 16 clons positius
per la recombinació homòloga que presentaven dues
bandes de 7 i 4,2 Kb que corresponien als al·lels
salvatge i mutat, respectivament. Per contra, en els
clons no modificats es podia observar una única
banda de 7 Kb, més intensa, que corresponia als dos
al·lels salvatges.
2.2.4. Obtenció de ratolins quimeres i knock-out pel
gen de la PFK1-M.
2.2.4.1. Microinjecció dels clons mutats en blastocists
i obtenció de ratolins quimeres.
Durant diversos dies es van fer 11 experiments de
microinjecció de cèl·lules ES positives a embrions en
estadi de blastocist. En cadascun d’aquests es van
injectar uns 15-20 blastocists amb 15-18 cèl·lules ES.
Es van transferir uns 145 embrions a l'úter de 16
femelles receptores de la soca CD1. Els embrions que
havien incorporat les cèl·lules ES donarien lloc a
ratolins quimeres, que es caracteritzen perquè
provenen alhora de l’embrió de la soca C57Bl6 i de
les cèl·lules ES de la soca 129/SV. Així, durant el seu
desenvolupament, una part dels teixits embrionaris
evolucionaran a partir de cèl·lules del blastocist
C57Bl6 i l'altra part serà contribució de les cèl·lules
ES 129/SV modificades genèticament. Com que la
soca de ratolins C57Bl6 té el pèl de color negre i la
129/SV agoutí (marró) els animals quimeres presentaven
regions de pèl negre i d’altres amb pèl agoutí.
Seguint aquest procediment vam obtenir quatre
animals quimera, tots mascles.
2.2.4.2. Obtenció d'animals knock-out.
Es van encreuar les quatre quimeres mascle amb
femelles de la soca C57Bl6. Així, les quimeres que
havien incorporat cèl·lules modificades genèticament
en la seva línia germinal donarien lloc a una part de la
descendència de la soca 129/SV. De l’encreuament
de les quatres quimeres mascle només els animals 1 i
3 van tenir descendència agoutí. La quimera 4 va
donar tota la descendència de color negre i la
quimera 2 va resultar estèril, ja que no donava cap
cria. La descendència de les quimeres 1 i 3 va ser
analitzada per tal d'identificar els ratolins que incorporaven
la mutació del gen de la PFK1-M en el seu
genoma. Això ens va permetre identificar els ratolins
heterozigots per disrupció del gen de la PFK1-M.
Aquests animals es van posar a encreuar-se entre ells
per obtenir una colònia d'animals homozigots per la
mutació.
2.2.5. Anàlisi fenotípica dels ratolins deficients en
PFK-1 heterozigots (KO +/-) i homozigots (KO -/-).
2.2.5.1. Anàlisi de l’expressió.
L’expressió del gen de la PFK1-M es va determinar
per Northern blot a partir d’RNA total de múscul
esquelètic de ratolins control i KO. Els ratolins KO +/presentaven
una disminució del 50% dels nivells
d’mRNA PFK1-M respecte dels controls, mentre que
els KO -/- no expressaven PFK1-M en el múscul.
2.2.5.2. Determinació de l’activitat enzimàtica i de
metabòlits.
La disminució en els nivells d’mRNA en el múscul
esquelètic dels ratolins KO +/- no es corresponia amb
una disminució de l’activitat enzimàtica PFK1-M. Això,
molt probablement era a causa de la compensació
generada via regulació al·lostèrica de la PFK-1 en
aquest teixit. L’absència total d’mRNA i, per tant, de
proteïna PFK1-M en el cas dels KO -/- es va traduir
en absència d’activitat enzimàtica en aquests ratolins.
Es va determinar la concentració de glucogen i
glucosa-6P en el múscul d’animals control i KO. En el
cas dels KO +/- no es van observar diferències significatives
en l’acumulació de glucogen i glucosa-6P
musculars. En canvi, es va detectar un gran increment
en la concentració d’aquests metabòlits en el múscul
esquelètic dels animals KO-/-. Per tant, aquests
resultats ens indicaven que havíem generat un animal
mancat d’activitat PFK-1 i que representava un nou
model de glucogenosi tipus VII.
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
En el desenvolupament del projecte hem aconseguit
els objectius que ens havíem plantejat, és a dir, hem
generat dos models animals de malalties hereditàries
humanes. Així, d’una banda, s’han obtingut animals
transgènics models d’intolerància familiar a la fructosa.
Aquests animals ens han permès conèixer els
mecanismes moleculars dels canvis metabòlics que
tenen lloc en el fetge. Per tant, ara ja disposem d’un
model animal que ens permetrà continuar aprofundint
en les alteracions que es produeixen no només en el
fetge, sinó també en altres teixits com a conseqüència
dels canvis en el metabolisme hepàtic. Això és molt
important per poder desenvolupar teràpies pal·liatives
per a aquesta malaltia. No obstant això, atès que es
tracta d’una malaltia hereditària i que el defecte
genètic (mutacions en el gen de l’aldolasa B) es
manifesta en el fetge, per tal de posar en marxa
teràpies curatives cal dissenyar aproximacions de
teràpia gènica que permetin expressar el gen terapèutic
al fetge. Per això, en aquest model en què està
alterada la via de metabolització de la fructosa per
sobreexpressió de l’enzim fructocinasa, la sobreexpressió
d’aldolasa B permetrà molt probablement
contrarestar les alteracions metabòliques. Així, actualment
els nostres grups han endegat un nou projecte,
com a continuació d’aquest projecte finançat per La
RECERCA BIOMÈDICA | 65

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
Marató de TV3, que se centra en el desenvolupament
de vectors virals, especialment virus adenoassociats
(AAV), que permeten l’expressió a llarg termini dels
gens d’interès al fetge. Així, AAV que continguin el gen
de l’adolasa B s’injectaran per via sanguínia al fetge
dels ratolins transgènics i s’estudiarà com es contraresta
el procés patològic. Aquest és el pas previ a
l’aplicació d’una teràpia gènica en pacients. Per tant,
el fet de poder disposar de models animals és clau a
l’hora d’assajar noves teràpies.
Per això, el segon model animal que hem generat en
aquest projecte és també de gran importància. Es
tracta del primer ratolí que desenvolupa una glucogenosi
de tipus VII per manca de l’enzim fosfofructocinasa-1
muscular (PFK-1). En aquest projecte hem assolit
la generació d’aquest model mitjançant la tècnica de
recombinació homòloga en cèl·lules embrionàries
pluripotencials i microinjecció de blastocists. Aquests
animals, tant els herozigots (deleció del gen en un
únic al·lel) com el homozigots (manca total de
l’expressió del gen), ens permetran ara continuar els
estudis moleculars de les alteracions que es produeixen
no només en el múscul esquelètic, sinó també en
molts altres teixits (cor, cervell, ronyons, pàncrees,
eritropoiesi, etc.) que també es veuran afectats per la
manca d’aquest gen. Això, permetrà conèixer millor la
patologia que pateixen els pacients i també a quines
altres alteracions els predisposa (per exemple, es
coneix que aquests pacients tenen tendència molt alta
a desenvolupar diabetis tipus 2). D’altra banda,
aquests animals també ens permetran desenvolupar
aproximacions de teràpia gènica per a aquesta
malaltia. El nostre grup està especialment interessat a
dirigir l’expressió del gen de la PFK-1 a múscul
esquelètic, tant utilitzant vectors virals (AAV) com no
virals (electrotransferència de plàsmids in vivo).
Actualment, ja disposem d’una gran experiència a
expressar gens a múscul i, per tant, en disposar
d’aquest model animal podrem investigar la capacitat
dels nostres protocols de teràpia gènica a revertir la
patologia.
Així doncs, considerem que poder disposar d’aquests
models animals constitueix el pas previ necessari per
desenvolupar noves teràpies que permetin en un futur
guarir pacients d’aquestes malalties hereditàries.
4. Publicacions
Díaz de Espada, M.; Sánchez-Gutiérrez, J.C.; Pujol, A.; García,
M.; Lechuga, C.G.; Parra, B.; Bosch, F. and Feliu, J.E. Impaired
Fructose Tolerance in Transgenic Mice Overexpressing
Fructokinase in Liver. ref. revista: (en preparació). Clave: A
Lechuga, C.G.; Díaz De Espada, M.; Sánchez-gutiérrez, J.C.;
Parra, B. And Feliu, J.E. Metabolic Changes in fto-2B Hepatoma
Cells by Overexpression of Rat Fructokinase. ref. revista: (en
preparació). Clave: A
Garcia, M.; Pujol, A.; Riu, E.; Arbós, A.; Ferre, T.; Otaegui, P.;
Roca, C.; Feliu, J.E. And Bosch, F. Targeted Disruption of Muscle
Type pfk1; A Potential Model of Type Vii Glycogen Storage
Disease. ref. revista: (en preparació).Clave: A

Títol del projecte:
Anàlisi de les delecions i dels gens implicats
en la síndrome de Williams
Investigador principal
Ana María Carrió Ybáñez
Institució
Hospital Clínic i Provincial de Barcelona
Membres de l’equip
Laia Rodríguez, Francisca Bellesta, Anna Soler, Dolors Costa, David Gómez i Rafael Oliva.
11.698.125 PTA
MEMÒRIA FINAL
1. Resum del projecte original
Objectiu principal
Establir la correlació genotip-fenotip en la població
espanyola afectada de síndrome de Williams (SW).
Objectius secundaris
1. Determinar la freqüència dels diversos nivells de
deleció.
2. Determinar l’origen parental de la deleció per
correlacionar amb possibles fenòmens d’imprinting.
3. Detectar possibles mutacions en els gens implicats
quan no s’observa deleció.
Disseny
Realització d’un cultiu cel·lular per obtenir cèl·lules en
metafase i/o interfase que permetin l’anàlisi mitjançant
FISH (hibridació in situ fluorescent) de la deleció
7q11.23, la sonda que s’utilitza per detectar-ho
hibrida en el gen que codifica per a l’elastina (ELN).
Extracció de DNA, tant de la sang del pacient com
dels progenitors, per dur a terme les proves moleculars
(anàlisi de pèrdues d’heterozigositat [LOH] i estudi
de mutacions).
Pla de treball previst
Primera fase
- Revaluació d’aquells casos amb sospita clínica de
SW i homozigots pel gen ELN.
- Anàlisi de l’origen parental de les delecions dels
gens ELN i LIMK1.
- Detecció de possibles mutacions en els gens ELN i
LIMK1 en aquells casos que no hagin mostrat
delecions i tinguin diagnòstic clínic clar d’SW.
Segona fase
- Anàlisi prospectiva dels nous casos amb totes les
tècniques desenvolupades durant la primera fase.
- Detecció de possibles mutacions en els gens ELN i
LIMK1 en aquells casos que no hagin mostrat
delecions i tinguin diagnòstic clínic clar d’SW.
- Correlació genotip-fenotip en els casos analitzats.
2. Resultats
Durant l’aplicació del projecte s’han analitzat un total
de 205 individus amb sospita clínica d’SW, pertanyents
a 204 famílies. D’aquests 205 casos, 65 han
estat confirmats com a positiu per alguna de les
tècniques emprades (en 8 casos no es disposava de
material per a la tècnica de FISH i en 5 casos l’estudi
molecular no va ser informatiu).
RECERCA BIOMÈDICA | 67

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
Estudi de la deleció 7q11.23
L’estudi mitjançant FISH ha mostrat una eficiència del
100% en el diagnòstic de la deleció.
L’anàlisi molecular, malgrat que no sempre ha estat
informatiu, ha permès aprofundir en l’etiologia de la
deleció i establir-ne l’origen parental en 58 casos
(patern en 28 i matern en 32). No s’han observat
diferències fenotípiques relacionades amb l’origen de
la deleció.
L’anàlisi molecular també ha permès establir els límits
de la deleció mitjançant l’estudi de LOH dels
marcadors microsatèl·lits més propers a la zona
comunament delecionada. Només en 5 casos no s’ha
pogut establir el límit centromèric com a conseqüència
de la manca d’informativitat dels microsatèl·lits
estudiats en aquestes famílies.
Estudi mutacional del gen de l’elastina (ELN)
Per l’anàlisi de mutacions en el gen ELN es van
seleccionar aquells pacients que no presentaven
deleció (FISH negatiu i/o estudi molecular amb
herència biparental), però sí estaven afectats d’alguna
patologia cardíaca, generalment estenosi supravalvular
aòrtica (SVAS).
En els 28 pacients seleccionats, l’anàlisi mutacional
dels 34 exons del gen ELN ha evidenciat:
6 polimorfismes intrònics: IV2nt+16C A, IVS8+nt9C T,
IVS11nt+25C A (2 pacients), IVS20nt+17T C,
IVS27nt+22T C i A698A.
1 polimorfisme a l’exó 29: IVS32nt-33C T, en 5
pacients.
De tots aquests polimorfismes s’ha calculat la
freqüència en la població afectada i s’ha comparat
amb població control. No s’ha observat desequilibri
de lligament.
2 canvis (G412R i G462W) en els exons 20 i 22, de
repercussió desconeguda, ja que no han estat
descrits en la literatura; podrien ser polimorfismes
mutacions missense, ja que afecten residus de glicina.
Ambdós canvis encara estan en procés d’estudi
familiar complet.
1 canvi que afecta la seqüència consensus d’splicing
de l’exó 20, pendent de confirmar mitjançant estudis
d’RNA.
Diagnòstic prenatal
S’han fet tres diagnòstics prenatals en tres de les
famílies amb un fill afectat d’SW i han estat normals.
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
Vessant científic
Aquest projecte ha permès diagnosticar 65 pacients
amb sospita clínica d’SW, determinar la dimensió de
la deleció i determinar-ne l’origen parental.
La posada en marxa de l’estudi mutacional del gen
ELN ha estat fonamental per posar de manifest canvis
genòmics en l’SW no descrits prèviament i que
encara són motiu d’estudi a fi de poder establir-ne la
possible implicació en l’etiologia de la patologia.
D’altra banda, la disponibilitat d’aquest estudi en el
nostre grup ha estat molt útil, ja que també ens ha
permès diagnosticar una nova mutació del gen ELN
(prèviament només se n’havien descrit 3) en una
família amb dos membres afectats de cutis laxa
dominant.
La sensibilitat i eficàcia de la tècnica de FISH la
converteixen en la tècnica d’elecció per a un diagnòstic
clínic ràpid i eficaç en la rutina assistencial.
Vessant social
L’assoliment d’un diagnòstic en ferm permet un
tractament més precoç dels problemes mèdics
associats i la realització de diagnòstic prenatal en
gestacions de risc, i millora el consell genètic i el
coneixement familiar de la possible evolució i les
complicacions mèdiques de l’individu afectat.

Títol del projecte:
Els factors neurotròfics i les seves vies de traducció
de senyal com a dianes terapèutiques en el
tractament de les malalties neurodegeneratives
Investigador principal
Joan X. Comella Carnicé · Jordi Garcia-Fernàndez
Institució
Facultat de Medicina. UdL · Facultat de Biologia. UB
Membres de l’equip
Equip Joan Comella: Daniel Sanchís, Marta Llobera, Nuria Balri, Roser Pane, Miquel F. Segura, Yolanda de
Pablo, Xavier Dolcet, Ma. José Pérez, Raffaella Gozzolino, Joan X. Comella, Rosa M. Soler i Laura Paya.
Equip Jordi Garcia: Anna Rosanas i Gemma Marfany
22.500.000 PTA
S'han generat dues memòries:
MEMÒRIA 1
1. Resum del projecte original
Aquest es un projecte coordinat entre dos laboratoris.
Aquí només es descriuen els objectius corresponents
al laboratori de Lleida (Línia de treball 1).
Objectiu general
Analitzar els mecanismes intracel·lulars desencadenants
per a l’activació dels receptors d’alta afinitat
pels factors neurotròfics (receptors tirosina cinasa) i
participació del calci intracel·lular o les proteïnes
regulades per ell (com calmodulina) en la modulació
de les vies activades per aquests receptors. Aquest
coneixement és bàsic per plantejar qualsevol estratègia
terapèutica basada en restauració o modificació
de la cascada de traducció produïda pels factors
neurotròfics.
Objectius específics
1. Mecanismes moleculars implicats en l’activació de
la via de les MAPK per despolarització de membrana i
per factors neurotròfics.
2. Modulació per calci/calmodulina de vies
intracel·lulars activades pels receptors de les neurotrofines.
Rellevància d’aquesta modulació en la funcionalitat
de les neurotrofines com a inductores de supervivència
neuronal.
3. Clonatge de proteïnes amb dominis d'interacció
amb calmodulina relacionades amb la via Ras/MAPK
en cèl·lules PC12.
Objectiu 1. Mecanismes moleculars implicats en l’activació
de la via de les MAPK per despolarització de
membrana i per factors neurotròfics
Temps d’inici de l’activitat: 1r any. Temps estimat per
assolir els objectius: 2 anys.
Des d’un punt de vista molecular, s’ha descrit que
tant l’estimulació de la via de les MAPK de tipus ERK
per estimulació dels receptors Trk com per despolarització
de membrana passen per l’activació de Ras.
D’acord amb els nostres resultats previs, volem
conèixer quin és el punt en què la calmodulina és
capaç de modular l’activació de la via de les MAPK
utilitzant per a això els antagonistes de calmodulina.
Hem observat per diferents mitjans que la calmodulina
és capaç de modular la fosforilació i l’activitat cinasa
d’ERK com s’ha descrit en apartats anteriors. Per a
això hem utilitzat assajos per mesurar l’activitat cinasa
en inmunoprecipitats d’ERK utilitzant MBP com a
proteïna substrat, inmunoprecipitació d’ERK i assaig
RECERCA BIOMÈDICA | 69

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
del seu estat de fosforilació amb anticossos antifosfotirosina
i assajos de Western blot en lisats totals amb
anticossos anti-fosfo-ERK. L’estat d’activació de Ras
s’analitzarà quantificant el quocient GTP/GDP. Un cop
situada l’entrada de la calmodulina en la de les MAPK
per sobre o per sota de Ras, es caracteritzarà el punt
de convergència de les dues vies. Si és per sobre,
existeixen tota una sèrie de proteïnes acobladores
descrites originalment com a transmissores de l’estat
d’activació de receptors tirosina cinasa, com Shc,
Grb2 i Sos. L’objectiu d’aquest punt és observar
l’estat d’acoblament d’aquestes proteïnes usant
tècniques de coimmunoprecipitació (per exemple
entre Grb2 i Sos o entre Grb2 i Shc), com també
l’estat de fosforilació d’Shc que és fosforilat pels
receptors tirosina cinasa en determinades tirosines.
Es pretén analitzar si la calmodulina és o no necessària
per a l’activació d’aquestes molècules. Recentment
s’ha descrit la implicació de dues proteïnes de la
família de les tirosina cinases que participen en la via
de senyalització de calci intracel·lular. Aquestes dues
proteïnes, Src i PIK2, podrien actuar seqüencialment
per activar la fosforilació en tirosines d’Shc. Un dels
objectius d’aquest apartat és caracteritzar la possible
modulació de la calmodulina en la participació d’Src
i/o PIK2 en l’estimulació d’aquesta via. Es pretén, a
més, analitzar si existeix regulació de la via per sota
de Ras. Per a això analitzarem l’estat d’activació raf i
MEK mitjançant assajos per conèixer el seu estat de
fosforilació (shift de mobilitat o anticossos anti-fosfo-
MEK) o de la seva activitat funcional (assajos de l’activitat
cinasa d’aquestes proteïnes). Quan s’hagi delimitat
el punt d’entrada de la modulació de la calmodulina
sobre la via Ras/MAPK, s’analitzarà si aquesta
modulació sobre aquest punt és directa o indirecta.
Per a això la Dra. Rocamora establirà les condicions
adequades per fer assajos de coimmunoprecipitació
entre la calmodulina i la proteïna que sigui el punt
d’entrada. Per a això es realitzarà un doble assaig.
Per una part, es precipitaran proteïnes amb calmodulina-sepharosa
en presència o absència de calci
(control negatiu) i aquests precipitats s’analitzaran per
Western blot per comprovar la presència de la proteïna
"punt d’entrada". L’assaig revers consistirà a
inmunoprecipitar aquesta proteïna i comprovar per
Western blot la seva associació amb calmodulina
mitjançant anticossos específics de què es disposa.
Aquests assajos podran, a més, ampliar-se veient si
en assajos de fosforilació in vitro existeix modulació de
la proteïna "punt d’entrada" per part de calmodulina
recombinant.
Objectiu 2. Modulació per calci/calmodulina de vies
intracel·lulars activades pels receptors de les neurotrofines.
Rellevància d´aquesta modulació en la funcionalitat
de les neurotrofines com a inductores de supervivència
neuronal
Temps d’inici de l’activitat: 1er any. Temps estimat per
acomplir els objectius: 3 anys.
Se sap que les cèl·lules PC12 presenten receptors per
a NGF (Trk) i per a GF (EGFR). Ambdós són receptors
de tipus tirosina cinasa. Encara que els dos activen la
via de les MAPK, el fenotip cel·lular final obtingut és
totalment diferent. EGF promou la divisió cel·lular,
mentre que NFG promou la diferenciació.
Molecularment les dues vies comparteixen tots els
elements de les cascades Ras/MAPK i, fins fa poc
temps, l’única diferència coneguda entre els dos
factors era que l’EGF estimulava la via de les MAPK
durant menys temps que l’NGF. Més recentment s’ha
caracteritzat una proteïna anomenada SNT que era
fosforilada específicament per l’activitat tirosina cinasa
del receptor Trk A i no per la mateixa activitat cinasa
del receptor d’EGF. Se sap que els factors neurotròfics
provoquen l’elevació dels nivells de Ca2+
intracel·lular i els nostres resultats previs suggereixen
que l’activació de la via de les MAPK per part dels Trk
depèn en part de la funcionalitat de la calmodulina
(vegeu antecedents).
Es pretén analitzar el possible requeriment de Ca2+
per a l’activació de la via de la MAPK per part dels
receptors Trk utilizant quelants d’aquest ió tant
intracel·lulars (BAPTA) com extracel·lulars (EGTA). L’ús
d’antagonistes dels canals de Ca2+ dependents de
voltatge i d’antagonistes de l’alliberament de Ca2+ a
partir de dipòsits intracel·lulars permetrà conèixer si el
Ca2+ mobilitzat prové de l’espai extracel·lular o dels
dipòsits intracel·lulars. S’utilitzaran tècniques de
mesurament directe de calci intracel·lular (microespectrofluorometria
amb Fura-2) després de l’aplicació dels
factors tròfics. A més, es pretén caracteritzar amb
detall si els antagonistes de la calmodulina participen
en l’activació de la via Ras/MAPK i si aquest efecte és
diferencial entre l’estimulació amb NGF respecte de
l’estimulació amb EGF. Una primera aproximació es
realitzarà estimulant les cèl·lules PC12 amb EGF i
NGF en presència o en absència dels antagonistes de
la calmodulina i observant l’estat final d’activació de la
via de les MAPK. Els resultats diferencials que s’obtinguin
respecte de l’estat final d’activació de la via són
extraordinàriament importants perquè podrien explicar
els efectes fisiològics diferencials entre ambdós
factors tròfics. S’analitzarà, a més, el punt de modulació
de la calmodulina sobre la via de la MAPK estimulada
a través de receptors TrkA. Per a això se seguirà
el mateix esquema proposat en l’objectiu 1.1.
Una altra de les vies importants que s’activen amb
l’estimulació d’aquests receptors és la via fosfatidilinositol
3-cinasa/Akt. S’ha suggerit que aquesta podria
ser la responsable dels efectes de supervivència
induïts pels factors tròfics. Recentment, a més, s’ha
demostrat que la calmodulina és capaç d’interaccionar
directament amb la fosfatidilinositol 3-quinasa i
modular su actividad. En el nostre laboratori hem
observat que els inhibidors de la calmodulina (W13)
són capaços de bloquejar els efectes neurotròfics del
BDNF sobre les motoneurones espinals d’embrió de
pollastre en cultiu. Per tant, seria interessant aprofundir
en aquest efecte i conèixer si els efectes sobre el
bloqueig de la supervivència causats pel W13 estan
mediats per un bloqueig de la via fosfatidilinositol 3cinasa/Akt.
Per a això disposem al nostre laboratori
dels assajos per mesurar l’activitat PI 3-K (formació de
PIP3) i Akt (immunoprecipitació d’Akt i assaig in vitro
amb H2B com a substrat o mesurament del seu estat
de fosforilació amb anticossos anti-fosfo-Akt). A més,
tenim el suport de la Dr. Rocamora per als assajos de
coinmunoprecipitació entre calmodulina i PI 3-K que
seran realitzats de forma similar al que s’ha proposat
en l’objectiu 1.1. Tots aquests resultats es correlacionen
amb efectes funcionals de l’inhibidor W13 sobre
motoneurones o cèl·lules PC12 estimulades amb
BDNF o NGF, respectivament. Els assajos consistiran

en mesuraments de viabilitat cel·lular i comprovació
que la disminució del nombre es correlaciona amb un
increment en el nombre de cèl·lules apoptòtiques,
tècniques plenament establertes al nostre laboratori.
Objectiu 3. Clonatge de proteïnes amb dominis d'interacció
amb calmodulina relacionades amb la via
Ras/MAPK en cèl·lules PC12.
Temps d'inici de l'activitat: 2n any. Temps estimat per
acomplir els objectius: 2 anys.
Aquest punt és una ampliació dels experiments de
coimmunoprecipitació de calmodulina i les proteïnes
de la via de Ras/MAPK o de PI 3K/Akt. Si la participació
de la calmodulina a la via Ras/MAPK implica l'activació
de Ras, serà d'interès estudiar la possible
existència d'un activador de Ras dependent de
calmodulina en PC12, tal com ha estat suggerit per a
certs tipus neuronals, com les neurones corticals de
rata. Aquest és el cas d'un intercanviador de Ras-
GDP a Ras-GTP, l’anomenat Ras-GRF, que té a la
seva seqüència proteica un domini IQ d'unió a
calmodulina necessari per a la seva activitat intercanviadora.
Aquesta proteïna no ha pogut ser demostrada
a la línia PC12. Així, també s'ha descrit l'existència
d'una família de proteïnes anàlogues a Ras (RIC, RIN i
RIT) que contenen un domini d'interacció a calmodulina,
tot i que cap d'elles no ha pogut ser detectada en
cèl·lules PC12.
Per aïllar homòlegs s'utilitzaria una biblioteca de cDNA
de cèl·lules PC12 de la qual es disposa al laboratori.
S' intentarien clonar els possibles homòlegs en PC12
d'aquestes proteïnes amb sondes específiques que
reconeixen seqüències conservades de les proteïnes
descrites. Alternativament, es plantejaria el clonatge
per homologia utilitzant tècniques de PCR amb
oligonucleòtids degenerats. Una vegada clonades es
realitzarien els abordatges estàndard per caracteritzar
la funció en la seva possible implicació en la senyalització
per despolarització de membrana.
2. Resultats
Resultats previs del nostre grup havien apuntat que la
calmodulina podria estar implicada en l’activació de
les MAPK de tipus ERK en neurones tractades amb
factors neurotròfics o bé estimulades amb entrades
controlades de ions Ca2+ com a conseqüència de
l’activitat elèctrica. Al llarg de la durada d’aquest
projecte el nostre grup ha estudiat els mecanismes
pels quals la calmodulina podria regular la via MAPK
en aquest dos paradigmes. El treball s’ha desenvolupat
en cèl·lules PC12 estimulades amb el factor
neurotròfic NGF o amb concentracions despolaritzants
de K+ en el medi de cultiu que indueixen una
despolarització de la membrana plasmàtica similar a la
produïda per l’activitat elèctrica.
En el cas de la despolarització de membrana ja
havíem descrit que el Ca2+ que entra en la cèl·lula a
través de canals Ca2+ dependents de voltatge que
s’obren durant la despolarització era necessària per a
l’activació de les ERK. Aquesta observació correlacionava
amb un possible paper de la calmodulina en
aquest procés, atès que la calmodulina és una de les
principals proteïnes que uneixen Ca2+ quan la seva
concentració s’incrementa en un nivell intracel·lular. En
el cas dels factors neurotròfics, aquesta correlació no
era tan directa, atès que existeixen resultats controvertits
en la literatura respecte de si les neurotrofines
incrementen o no els nivells de [Ca2+]i. Per això, en
primer lloc vam estudiar la importància del [Ca2+]i en
l’activació de les ERK induïda amb NGF, mitjançant
quelants selectius de calci extracel·lular (EGTA) i
intracel·lular (BAPTA-AM). Vam observar que els
bloquejants de calci extracel·lular no tenien cap efecte
sobre l’activació de les ERK causada per l’estimulació
amb NGF. Per contra, la preincubació de les cèl·lules
PC12 amb BAPTA-AM inhibia completament els
efectes estimuladors de les ERK causats per NGF. Els
mateixos resultats es podien observar si la via era
estimulada amb EGF. Això fa pensar que el calci
intracel·lular basal o l’alliberat a partir dels dipòsits
intracel·lulars (per exemple a través de la via PLCg )
està implicat en l’activació de les ERK. Vam aprofundir
aquests resultats en diverses direccions.
En primer lloc vam caracteritzar l’efecte del bloqueig
de la calmodulina sobre l’activació de les ERK. Per a
això hem utilitzat diferents inhibidors farmacològics de
la calmodulina, com per exemple el W13, el W7, el
calmidazol i la trifluoperazina, i hem comprovat que
tots ells inhibeixen l’activació de les ERK produïda pel
tractament amb factors neurotròfics o per la despolarització
de la membrana plasmàtica. En alguns casos
hem utilitzat anàlegs estructurals dels inhibidors, com
ara W12 (anàleg de W13) o W5 (anàleg de W7) per
comprovar l’especificitat dels efectes observats.
Aquest estudi es va fer extensiu a les motoneurones
espinals d’embrió de pollastre despolaritzades o
tractades amb BDNF, i els resultats obtinguts van ser
essencialment els mateixos que amb les PC12.
Les nostres dades, però, indiquen que hi ha diferències
respecte del mecanisme pel qual la calmodulina
regula l’activació de les ERK en el cas de la despolarització
de la membrana i amb el tractament amb
factors neurotròfics. En el cas de la despolarització,
els inhibidors de la calmodulina prevenen l’activació
de la via de manera sostinguda, mentre que en el cas
de l’estimulació amb NGF, l’efecte inhibitori és transitori
i només afecta els primer 15 minuts del tractament.
Després d’una hora de tractament amb NGF,
s’observa que encara hi ha una activació significativa
de les ERK que no està modificada per la presència o
absència dels inhibidors de la calmodulina. No obstant
això, aquest efecte transitori sembla funcionalment
rellevant per a la cèl·lula, ja que té repercussió en la
transcripció de gens íntimament lligats a l’activació de
les ERK. En aquest sentit, hem observat que els
inhibidors de la calmodulina bloquegen l’activació de
la cinasa RSK-2 responsable de la fosforilació i activació
del factor de transcripció CREB, responsable
alhora de la transcripció de c-Fos.
Un dels punts més importants de regulació de la via
Ras/MAPK és la GTPasa Ras. A més, s’han
descobert recentment tot un seguit de proteïnes amb
dominis d’interacció a calmodulina que poden,
directament o indirecta, regular la funció de Ras. Tot
plegat feia pensar que Ras fóra un bon candidat per
ser la proteïna diana que expliqui els efectes que hem
observat del bloqueig de la calmodulina sobre la via
ERK MAPK. Per tot això, tant l’anàlisi de l’activació de
Ras per despolarització de membrana com la seva
possible regulació per calmodulina va ser exhaustiu.
En primer lloc vam observar que Ras era necessari
per a l’activació de les ERK, atès que la sobreexpressió
d’una forma inactiva de Ras que competeix amb la
RECERCA BIOMÈDICA | 71

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
funció de la proteïna endògena, bloqueja l’activació de
les ERK tant en PC12 despolaritzades com tractades
amb NGF. En segon lloc vam observar que ambdós
tractaments induïen l’activació de Ras. Aquests
assaigs van ser realitzats amb dos mètodes: radioactiu
mesurant la proporció de Ras:GTP respecte de la
de Ras:GDP, i un mètode no radioactiu basat en la
proteïna de fissió GST-Raf-1-RBD (GST unida al
domini d’unió de Ras a Raf-1). Amb aquests assaigs
vam observar que els inhibidors de la calmodulina no
tenien cap efecte sobre l’activació de Ras. Tots
aquests resultats indiquen, per tant, que la regulació
de la via Ras/MAPK per la calmodulina té lloc per sota
de Ras a nivell d’alguna de les proteïnes regulades
directament o indirectament per Ras.
Per corroborar que l’efecte de la calmodulina té lloc
per sota de Ras, vam analitzar també l’activació i la
possible regulació per calmodulina de proteïnes
rellevants implicades en les vies de transducció més
importants que s’han descrit com a responsables de
l’activació de Ras. En el cas de la despolarització de
membrana, vam analitzar la fosforilació d’Shc, la unió
d’Shc a Grb2 i l’activació del receptor d’EGF, mentre
que en el cas del tractament amb NGF vam analitzar
l’activació del receptor TrkA, la fosforilació d’Shc i la
unió d’Shc a Grb2. En tots dos casos els resultats van
ser similars i van demostrar que els inhibidors de la
calmodulina no tenien cap efecte significatiu sobre
l’activació de les proteïnes esmentades després dels
tractaments amb NGF o després de la despolarització
de la membrana. Aquests resultats, per tant, reforçaven
encara més la idea que la proteïna diana modulada
per calmodulina estava situada per sota de Ras en
la cascada de transducció de senyal.
Ras activa una cascada de cinases, l’anomenada via
MAPK, que dóna lloc a l’activació de les ERK.
Aquesta cascada consta de tres membres, la
MAPKKK, la MAPKK i la MAPK (que en aquest cas
particular són les ERK). La MAPKK més ben coneguda
responsable de l’activació de les ERK és la MEK:
durant la primera anualitat es va analitzar l’activitat de
la MEK mitjançant: (1) assajos d’activitat cinasa en
immunoprecipitats de MEK i utilitzant ERK recombinat
com a substrat específic, i (2) amb anticossos que
reconeixen la forma fosforilada, i per tant activa, de la
MEK. Utilitzant aquestes aproximacions vam poder
comprovar que els inhibidors específics de la
calmodulina bloquejaven tant l’activitat com la fosforilació
de les MEK induïda tant per despolarització com
per tractament amb NGF. A més, amb el tractament
amb NGF, vam poder demostrar que la sobreexpressió
d’una forma constitutivament activa de MEK
anul·la l’efecte dels inhibidors de la calmodulina sobre
l’activació de les ERK. Aquests resultats, per tant, (1)
demostraven que la inhibició de la MEK observada en
presència dels inhibidors de la calmodulina era la
responsable de l’efecte observat sobre les ERK, i (2)
suggerien que la calmodulina estava regulant l’activitat
de les MAPKKK.
Les MAPKKK més ben conegudes responsables de
l’activació de MEK són els membres de la família de
Raf (A-Raf, B-Raf i C-Raf-1). L’anàlisi de l’activació
d’aquestes cinases i la seva possible regulació per
calmodulina es va realitzar mitjançant assajos de l’activitat
cinasa en immunoprecipitats selectius per a
cadascun dels membres de la família i utilitzant MEK1
recombinant com a substrat selectiu de fosforilació.
De manera sorprenent, en les cèl·lules despolaritzades
no vam poder observar una activació significativa de
cap d’aquestes isoformes de Raf. Per tant, respecte
de la despolarització de la membrana aquests
resultats suggerien l’existència d’una activitat
MAPKKK diferent de la dels Raf que seria modulada
per calmodulina i seria la responsable de l’activació de
les ERK a causa de despolarització de la membrana.
Per altra part, l’estimulació amb NGF va induir una
forta i ràpida activació de Raf-1, una activació suau
però sostinguda de B-Raf i nul·la activació de A-Raf.
Respecte de l’efecte dels inhibidors de la calmodulina
sobre aquests patrons d’activació vam poder comprovar
que Raf-1 s’inhibia completament, mentre que
l’activació sostinguda de B-Raf no estava afectada.
Aquests resultats donaven una explicació viable de
per què els inhibidors de la calmodulina tenien un
efecte transitori sobre l’activitat de les ERK en cèl·lules
PC12 tractades amb NGF.
En la part final d’aquest treball també vam demostrar
que existia una base estructural per explicar la regulació
que la calmodulina exercia sobre l’activació de
Raf-1, atès que en assajos de coprecipitació vam
comprovar que existia interacció entre les dues proteïnes.
La interacció era dependent de calci però no
estava afectada per l’estat d’activació de la via, és a
dir, tractament previ amb NGF. Els resultats addicionals
obtinguts van demostrar que la interacció no era
directa, perquè quan s’intentava la precipitació d’una
proteïna de fusió GST-Raf, purificada a homogeneïtat,
amb CaM-Sepharosa, la interacció no es produïa.
Aquests resultats s’han d’interpretar en el sentit que
probablement hi hagi altre proteïnes que estan
mediant aquesta interacció. Aquestes proteïnes
podrien ser importants en la regulació de l’activació de
Raf. En aquest sentit cal dir que l’activació de Raf és
un fenomen complex però que essencialment es
produeix en dues fases: (1) translocació de Raf a la
membrana com a conseqüència de l’activació de Ras
(Ras:GTP) amb el qual interacciona selectivament.
Una vegada a la membrana, (2) Raf-1 ha de ser
fosforilat almenys en dos residus (S338 i Y341). Es
desconeixen les cinases responsables d’aquestes
fosforilacions, però podria ser factible que fossin
cinases regulades per calmodulina. És en aquesta línia
en què volem continuar en el futur immediat. Creiem
que alguna de les cinases regulades per calmodulina i
més concretament la CaMKK, la CaMK I, la CaMK II o
la CaMK IV podrien estar implicades en la fosforilació
d’alguns dels residus rellevants de Raf-1. De fet, el
darrer any hem estat analitzant si els inhibidors de la
calmodulina estaven inhibint Raf-1 de forma directa o
indirecta. En aquest sentit, hom pot especular que la
calmodulina o alguna proteïna regulada per ella fossin
important cofactors per a l’activitat Raf-1. En aquest
sentit, el bloqueig de la calmodulina produiria el
bloqueig de Raf-1 sense alterar el procés d’activació
esmentat. Per contra, una explicació alternativa seria
que la calmodulina fos important per a l’activació de
Raf-1, bé sigui per la seva interacció amb Ras i la
seva translocació a membrana o bé regulant els
enzims que puguin fosforilar el residus 338 i 341. Per
tal d’esbrinar quina de les dues hipòtesis era la
correcta, vam iniciar una col·laboració amb el Dr.
Richard Marais de l’Institut del Càncer de Londres, que

ha desenvolupat anticossos capaços de reconèixer de
manera específica la S338 quan està fosforilada. Els
resultats indiquen que la calmodulina podria estar
implicada en la fosforilació d’aquest residu, atès que
els inhibidors de la calmodulina bloquegen completament
la fosforilació de la S338 després de l’estimulació
de les cèl·lules PC12 amb NGF. Aquest darrer any
també hem començat a clonar les diverses cinases
regulades per calmodulina esmentades anteriorment i
hem començat a generar les formes constitutivament
actives (no requereixen ni calci ni calmodulina per
estar actives) i les formes dominants negatives (tenen
mutada la lisina que uneix l’ATP en el procés de
fosforilació i són incapaces de fer-ho; per tant no
tenen activitat cinasa). Ja hem clonat i produït totes
les formes de la CaMKK, la CaMK IV i la I. De la
CaMK II, com que hi ha bons inhibidors (KN-62), de
moment els utilitzarem en comptes de les formes
mutants. Amb aquestes eines hem començat a
reanalitzar l’estat d’activació de les ERK després
d’estimulació de les cèl·lules PC12 amb NGF i estem
comprovant com està regulada l’activació de Raf.
Aquestes mateixes eines seran utilitzades per analitzar
la regulació de l’activació de la via PI3K/Akt (vegeu
més endavant).
En la mateixa línia de treball i gràcies a la col·laboració
de la Dr. Nativitat Rocamora, en un treball fet al
Departament de Biologia Cel·lular, Histologia i
Anatomia Patològica de la Facultat de Medicina de la
Universitat de Barcelona, hem pogut demostrat que
els receptors específics d’NGF estan localitzats en
determinats subdominis de la membrana plasmàtica.
Aquestes regions són anomenades "Lipid Rafts" i es
caracteritzen per presentar elevades quantitats de
colesterol en la composició. Els Lipid Rafts són zones
on se solen trobar diferents molècules implicades en
la transducció de senyals entre l’exterior de la cèl·lula i
l’interior del citoplasma. En aquest sentit, era força
controvertit si les PC12 contenien aquest tipus
d’especialització de subregions de la membrana
plasmàtica. L’estudi publicat al final de l’any 2000 va
permetre demostrar que les PC12 tenien Lipid Rafts i
que s’hi localitzaven els receptors Trk. A més, vam
poder demostrar que si s’alterava la composició de la
membrana citoplasmàtica amb substàncies que
variessin la composició lipídica i, en conseqüència,
s’alteressin els Lipid Rafts, no es produïa l’activació de
la via Ras/MAPK ERK causada per NGF, tot i que no
s’afectava la senyalització a través de la mateix via
causada per EGF.
El darrer any també hem dedicat molts esforços a
avançar en el coneixement de la regulació per calci i
per calmodulina de la via PI3K/Akt activada per NGF.
En aquest sentit, teníem evidències que la funcionalitat
de la calmodulina havia d’estar preservada perquè la
via pogués activar-se després d’estimular les cèl·lules
PC12 amb NGF. Més concretament, havíem observat
que si bloquejàvem la calmodulina o quelàvem el calci
intracel·lular, l’NGF era incapaç de produir la fosforilació
de l’Akt o d’estimular la seva activitat cinasa.
Aquest fenomen es produïa tant en PC12 i NGF com
amb motoneurones i BDNF. A més, en ambdós casos
el bloqueig comportava la ineficiència dels factors
neurotròfics i l’entrada de les cèl·lules en un procés
apoptòtic que podia ser revertit per la transfecció de
les cèl·lules amb formes constitutivament activades
d’Akt. L’anàlisi detallada de l’activació de la via ha
mostrat que, igual que passava amb l’activació
d’ERK, els passos inicials de la via PI3K/Akt no estan
alterats. Així, per exemple no es modifica la fosforilació
del receptor específic Trk, la fosforilació d’Shc, la unió
d’Shc a Grb2 o, el més important de tots, l’activitat de
PI3K. Entre l’activació de la PI3K i l’activació de l’Akt
hi ha molts pocs punts de regulació de la via. De
forma detallada podem dir que la PI3K genera fosfatidils
inositols de membrana que estan fosforilats en
posició 3’ (normalment prèviament fosforilats en
posició 4’ i 5’ per altres cinases). L’increment de PIP3
a la membrana suposa que aquelles proteïnes que
tenen un domini similar a plecstrina en la seva estructura
es transloquin a membrana. Entre aquestes
proteïnes hi ha l’Akt i la cinasa que la fosforila en
posició T308 (PDK1). Cal suposar que la cinasa
(encara desconeguda) que fosforila l’altre residu de
l’Akt rellevant per a la seva activació (S473) tingui una
regulació similar. Per acabar, cal dir que un altre punt
important és la regulació de la(es) fosfatasa(es) que
degraden els PIP3 de la membrana, com per exemple
PTEN. El bloqueig de la calmodulina o la retirada del
[Ca2+]i comporta la manca de fosforilació dels dos
residus de l’Akt. Això implica que el calci i la calmodulina
són cofactors necessaris per a les dues PDK o bé
que són necessaris per a la translocació de proteïnes
cap a la membrana plasmàtica després de l’aparició
dels PIP3 o bé que estan implicats en la regulació de
l’activitat de la fosfatasa (incrementant aquesta activitat
de tal manera que el PIP3 de membrana pràcticament
sigui inexistent tot i l’activació de l’Akt). Com ja
s’ha dit anteriorment, l’activitat cinasa de la PI3K no
està modulada per calci/calmodulina. Els experiments
més recents han demostrat que la presència d’inhibidors
de la calmodulina impedeix que hi hagi translocació
de proteïnes amb dominis plecstrina cap a la
membrana després d’activar la via PI3K amb NGF en
cèl·lules PC12. Aquest resultats s’han obtingut amb
proteïnes de fusió entre el domini plecstrina de l’Akt i
la proteïna verda fluorescent (GFP). Aquest resultats,
per tant, apunten que aquest sigui el punt de regulació
de la via per calci i calmodulina. No obstant això,
desconeixem encara si la regulació es produeix sobre
l’activitat de la fosfatasa o s’hi ha un problema amb el
citoesquelet de les cèl·lules. En el darrer any de
projecte proposem aprofundir en aquest mecanisme i
per això començarem a analitzar la funció de la PTEN
en cèl·lules PC12 tractades amb NGF. Així mateix
analitzarem la regulació de la seva activitat com a
conseqüència de variacions en la concentració de
calci intracel·lular o la presencia d’inhibidors de la
calmodulina. Per últim també volem conèixer quina és
la importància de les cinases (esmentades en apartats
anteriors) i les fosfatases (calcineurina) regulades per la
calmodulina en la regulació de l’activitat de la via Akt.
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
Tal com es podia esperar en un projecte com el
plantejat, el tipus de resultats obtinguts han estat
bàsics. És a dir, han suposat un increment considerable
del coneixement que tenim de determinats
processos més que no pas un avenç tangible sobre la
teràpia de determinades malalties. De totes maneres,
els resultats obtinguts són rellevants per a la patologia
RECERCA BIOMÈDICA | 73

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
humana, i encara més si tenim en compte que estem
analitzant en detall quins són els mecanismes que
controlen la supervivència o la mort de neurones.
Aquests mateixos mecanismes o molt similars
probablement siguin els que estan alterats en determinades
patologies humanes anomenades globalment
malalties neurodegeneratives. Avui sabem, per
exemple, que la via PI3K-Akt és la via més important
en la regulació de la supervivència neuronal. Aquesta
via normalment és activada pels factors neurotròfics a
través de receptors tirosina cinasa situats a la superfície
de la neurona. També sabem que tant el calci com
la calmodulina tenen un paper fonamental en l’activació
d’aquesta via. D’una banda, sabem que les
pujades moderades de calci poden activar-la. D’una
altra, sabem que necessitem una calmodulina funcional
i uns nivells mínims de calci intracel·lular perquè la
via pugui ser activada pels factors neurotròfics.
Aquestes dades, a més, reflecteixen que aquelles
neurones que son elèctricament més actives, i per
tant tenen nivells de calci intracel·lular superiors,
desenvolupen mecanismes que les fan més resistent
a la mort cel·lular.
D’altra banda, els nostres resultats obren vies alternatives
a l’administració de factors tròfics com a
mecanisme terapèutic en les malalties neurodegeneratives.
Fins ara l’eficàcia d’aquestes teràpies ha estat
molt limitada per raons diverses, com les dificultats de
travessar la barrera hematoencefàlica, la generació de
reaccions immunes contra els factors administrats i
altres. El fet de poder saber quines són les vies
rellevants en la regulació de la supervivència neuronal
ha de permetre generar compostos que puguin
activar selectivament aquestes vies en la població de
neurones que pateixen degeneració en les diverses
malalties neurodegeneratives.
MEMÒRIA FINAL 2
1. Resum del projecte original
L’objectiu principal d’aquest projecte és l’estudi de la
rellevància dels factors neurotròfics en la regulació de
la supervivència i mort neuronals. En concret, la línia
de treball 2, desenvolupada principalment al
Departament de Genètica de la Facultat de Biologia
de la Universitat de Barcelona, però en estreta
col·laboració amb el grup del Dr. Joan Comella, del
Departament de Ciències Mèdiques Bàsiques de la
Facultat de Medicina de la Universitat de Lleida,
pretén detectar i aïllar nous factors i receptors
neurotròfics utilitzant un animal model, del prevertebrat
arquetípic amfiox. En concret els objectius
d'aquesta línia són:
2.1. Aïllament i caracterització de factors i receptors
neurotròfics en el genoma d’amfiox: anàlisi de la seva
evolució en els vertebrats.
2.2. Estudi de l’expressió en embrions i adults, amb
especial èmfasi en la seva expressió en el sistema
nerviós: comparació amb els patrons en mamífers i
conclusions sobre homologia.
2.3. Producció de factors neurotròfics d’amfiox i inici
de l’estudi de la seva acció presumptament general
sobre cèl·lules en cultiu de neuroblastoma.
2. Resultats
Resum
Aquest projecte pretenia estudiar la rellevància dels
factors neurotròfics i altres famílies gèniques en la
supervivència i mort neuronals. En concret, la línia de
treball 2, principalment desenvolupada al Departament
de Genètica de la Facultat de Biologia de la Universitat
de Barcelona, pretenia aïllar nous factors i receptors
utilitzant un animal model, el prevertebrat arquetípc
amfiox. Els resultats del projecte han permès aconseguir
la majoria d’objectius proposats, en concret:
1. S’ha aïllat el gen que codifica per la proteïna
AmphiTrk, descendent directe del gen ancestral als
receptors Trk de vertebrats. Així, es conclou que el
sistema Trk/neurotrofines no és una invenció dels
vertebrats. L’estructura d’AmphiTrk suggereix que en
aquesta versió primitiva li manca la capacitat d’activar
una via de senyalització específicament relacionada
amb activitats neuronals tan avançades com l’aprenentatge,
la memòria, i el dolor.
2. El patró d’expressió d’Amphitrk durant el desenvolupament
embrionari remarca el paper original del
receptor, i possiblement del sistema Trk/neurotrofina,
en processos del sistema nerviós perifèric, específicament
sensorial.
3. S’han aïllat gens que codifiquen per caspases en el
genoma de l’amfiox. Aquestes representen formes
ancestrals que, si bé funcionalment són capaces d’induir
mort cel·lular apoptòtica en sistemes cel·lulars de
mamífer, no van lligades clarament a processos apoptòtics
in vivo, la qual cosa indica funcions ancestrals per
les caspases no lligades directament a apoptosi.
Consideració general
Aquesta línia de treball ha permès endinsar-se, per
primera vegada, en l’origen dels factors i receptors
neurotròfics, en un moment clau de l’evolució animal,
per tal d’entendre les bases que han generat l’alta
complexitat de sistemes de regulació de la supervivència
neuronal. La troballa d’AmphiTrk té alta rellevància
científica, segons el nostre parer, i en l’actualitat un
article sobre AmphiTrk està en procés de revisió en una
de les més rellevants publicacions mundials. Les
conclusions que el sistema neurotròfic s’originà abans
de l’origen dels vertebrats, que segurament no estava
involucrat en la determinació del sistema nerviós
central, sinó en el perifèric sensorial, i que la molècula
original era incapaç d’activar vies relacionades amb
funcions neuronals elevades, com la memòria, són
resultats de ciència bàsica que poden ajudar a aclarir la
complexitat del sistema en vertebrats superiors, i el seu
mal funcionament. Tanmateix, s’han descobert veritables
caspases (funcionalment) que no ho semblen in
vivo, fet que també obre noves visions i vies de recerca
en l’estudi de l’apoptosi. És temptador pensar que les
duplicacions gèniques de factors i receptors neurotròfics,
i d’altres molècules relacionades, amb canvis i
recrutament de vies involucrades en funcions superiors,
puguin haver estat a la base del que va fer que pacients
filtradors d’algues com l’amfiox esdevinguessin, evolutivament
parlant, furiosos i intel·ligents predadors, i les
seves preses, tal com vostès i nosaltres.
Exposició detallada dels resultats
Objectiu 1
S’ha aïllat, seqüenciat, i caracteritzat el gen AmphiTrk,

presumpte descendent directe de l’ancestre dels
receptors neurotròfics dels vertebrats. L’anàlisi de la
seva seqüència mostra una estructura molt similar a la
dels diferents Trk de vertebrats, destacadament en el
domini extracel·lular (fig. 1), a diferència dels gens
homòlegs descrits en altres invertebrats, que tenen
dominis extracel·lulars no relacionats amb els dels
vertebrats. De manera rellevant, AmphiTrk posseeix
els residus clau relacionats amb les vies de transdució
de senyal relacionades amb Ras, Erk i PI3K, però no
els relacionats amb la via de PLC , que ha estat
relacionada amb l’adquisició de funcions neuronals
elevades, com la memòria i l’aprenentatge. L’anàlisi
filogenètic, tant emprant les proteïnes completes, els
dominis extracel·lulars, o els dominis tirosina cinasa,
situen AmphiTrk a la base dels receptors neurotròfics
dels vertebrats (fig. 2).
Figura 1. Estructura del receptors trk’s de vertebrats
(A, B i C) i invertebrats (Lymnaea, Drosophila i amfiox).
AmphiTrk presenta una estrucutra típica dels trks de
vertebrat, notoriament en els dominis extracel.lulars.
C, clusters de cisteines; LRR, 2leucine-rich domain”,
IgG, dominis immunoglobulina; N-TE, extensió aminoterminal;
TM, domini transmembrana; TK, domini
tirosina-quinasa.
Figura 2. Arbre filogenètic de les seqüències trk de
vertebrats i inevrtebrats. AmphiTrk (Atrk) es situa a la
base de tots els receptors de vertebrats, amb alta
significació (boostrap de 926/1000).
S’han aïllat, seqüenciat i caracteritzat dues caspases
executores en amfiox: AmphCASP-6 i
AmphiCASP3/7. Ambdues es revelen ancestrals
respecte de dues de les famílies de caspases als
vertebrats (fig. 3). AmphiCASP-6 presenta un
prodomini, la qual cosa indica que l’ancestre de les
caspases 6 de vertebrats el posseïa, i alhora aclareix
la controvèrsia que actualment envolta la funció de la
caspasa 6 en vertebrats, que sembla presentar una
funció dual iniciadora per l’especificitat de substrat, i
executora per la manca de prodomini.
Figura 3. Relacions filogenètiques de les caspases.
Arbre de distàncies construït mitjançant el Neighbour
Joining Method a partir d'un alineament de la seqüència
aminoacídica de les caspases executores de
vertebrats, Drosophila i amfiox. AmphiCASP-3/7
Figura 3
apareix com a grup germà de les caspases -3 i -7 de
vertebrats, mentre AmphiCASP-6 s'agrupa amb la
família de la caspasa-6.
No s’han aïllat gens que codifiquin per neurotrofines,
malgrat els intensos esforços dedicats. Atesa l’estructura
del gen AmphiTrk, és molt probable que hi
existeixin, encara que la manca de similitud de
seqüència amb els homòlegs de vertebrats pot haver
impedit l’aïllament. Els esforços continuen, ara amb
finançament del Ministeri de Ciència i Tecnologia i de
la Unió Europea, i ja són a la nostra disposició genoteques
de BAC per intentar clonar-les per proximitat de
paralogia (clonatge posicional).
Objectiu 2
S’ha estudiat l’expressió d’AmphiTrk i les caspases
aïllades en embrions de l’amfiox, mitjançant hibridació
in situ. AmphiTrk s’expressa a partir de l’estadi de
nèurula en cèl·lules individuals aïllades, en principi en
posició lateroventral, però que més endavant en el
desenvolupament se situen en posició lateral. Aquesta
expressió és transient, i desapareix en estadi de
nèurula tardana. En estadis larvaris, s’expressa en la
porció ventroposterior de la "Hatschek pit", una
glàndula endocrina connectada al sistema nerviós
central a l’alçada del que en vertebrats seria el cervell
mitjà (fig. 4).
Figura 4. Expressió detectada per hibridació in situ
whole mount en embrions d’anamfiox. a) estadi de
nèurula jove amb cèl·lules epidèrmiques escampades.
b) larva, expressió en Hatscheck’s pit.
RECERCA BIOMÈDICA | 75

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
Figura 5. Expressió d’AmphiElav, etectada per hibridació
“in situ” whole mount en embrions d’anamfiox en
estadi de néurula jove amb senyal en cèl.lues epidèrmiques
escampades i en el tub, nerviós
Per esbrinar si les cèl·lules positives per AmphiTrk són
de llinatge nerviós, en concret cèl·lules sensorials
epidèrmiques, s’ha clonat i analitzat el gen AmphiElav,
homòlegs del qual s’empren com a marcadors
primerencs de llinatge neural (fig. 6). La hibridació amb
AmphiElav il·lustrà un patró de cèl·lules epidèrmiques
aïllades que recorda en gran mesura el d’AmphiTrk, a
més d’expressar-se en el tub nerviós central. En
l’actualitat s’està treballant amb la doble hibridació in
situ AmphiTrk/AmphiElav.
Per un altre cantó, per esbrinar si les cèl·lules positives
per AmphiTrk realment migren, característica no
descrita en l’embrió d’amfiox, es van dipositar cristalls
de DiI en la part ventral de nèurules joves, tot fixant-se
i detectant-se el senyal fluorescent en estadis més
tardans. Aquesta aproximació en embrions in vivo,
pionera en l’embriologia de l’amfiox, sembla que
indica que, certament, cèl·lules individuals resten
marcades lateralment (fig. 7), la qual cosa indica que
provenen, per migració de cèl·lules individuals, de
regions ventrals.
Figura 6. Seguiment de dipòsit de DiI en la superficie
ventral de neúrules joves. El colorant es disposità en
les regions indicades amb fletxes. Els embrions es van
desenvolupar fins les 24 h, es fixaren i s’observà sota
microscopi de fluorescencia: Algunes cèl.lules positives
es trobaven en posició lateral, el que indica que
han patit una migració ventral-dorsal
AmphiCASP-3/7 s’expressa des de l’estadi de gàstrula,
al mesoderm, mentre que AmphICASP-6 ho fa a
l’endoderm i al mesoderm (fig. 8). En estadis de
nèurula, AmphiCASP-6 s’expressa en tots els teixits
excepte l’epidermis, i AmphiCASP-3/7 al mesoderm
paraxial i la notocorda. Finalment, als estadis larvaris
AmphiCASP-3/7 manté el seu lloc d’expressió, mentre
que AmphiCASP-6 esdevé ubic. El treball d’expressió
de caspases en embrions d’amfiox es va complementar
amb estudis in vivo de l’apoptosi mitjançant la
tècnica TUNEL. Únicament estructures restringides,
com l’intestí embrionari, la regió anterior on es
formaran la boca i les estructures branquials, i la part
més posterior de la larva, presenten una reactivitat a la
tècnica TUNEL compatible amb un veritable procés
de mort fisiològica programada. Aquests resultats
indiquen que les caspases aïllades no tenen un paper
especialment rellevant en l’apoptosi durant el
desenvolupament embrionari dels prevertebrats, i que
seria una característica adquirida en el llinatge dels
vertebrat.
Figura 7. Anàlisi de l'expressió de les dues caspases
d'amfiox durant el desenvolupament mitjançant
hibridació in situ whole mount. Els organismes estan
orientats amb el pol anterior a la dreta i la part dorsal
a dalt. L'expressió s'inicia a l'estadi de gàstrula, on
AmphiCASP-3/7 es detecta al mesoderm i
AmphiCASP-6 al mesoderm i ectoderm. En l'estadi de
nèurula AmphiCASP-6 s'expressa a tots els teixits
excepte l'epidermis i AmphiCASP-3/7 al mesoderm
paraxial i la notocorda. Durant la fase final de nèurula i
en els estadis larvaris, AmphiCASP-3/7 es detecta a
tot arreu excepte a l'epidermis, mentre que
AmphiCASP-6 s'expressa ubíquament.
Objectiu 3
La producció de molècules codificades per gens
d’amfiox, per tal d’expressar-les i testar-les en
sistemes cel·lulars de vertebrats ha estat i és una
llarga cursa d’obstacles.
Respecte de les caspases, per confirmar que
AmphiCASP-3/7 era realment una caspasa, es van
haver de fer construccions amb el cDNA i es van
transfectar cèl·lules HEK 293T amb una versió
complerta del cDNA o amb una versió truncada a la
qual manqués el prodomini. Al cap de 36 hores de la
transfecció, aproximadament un 40% de les cèl·lules
que expressen AmphiCASP-3/7 exhibeixen blebbling
i/o condensació de la cromatina, valors molt
semblants als obtinguts per sobreexpressió de
caspasa-3 i caspasa-7 humanes. Tots aquests
resultats demostren que AmphiCAPS-3/7 és una
típica caspasa que indueix apoptosi quan s'expressa
en cèl·lules de mamífer (fig. 9). A més a més, les
diferències entre la capacitat d'induir mort de la
caspasa sencera i de la caspasa truncada suggerei-

xen que l'extrem aminoterminal d’AmphiCASP-3/7
funciona con un veritable prodomini.
Figura 8. Valoració d'apoptosis en cèl·lules HEK T293
transfectades amb els plàsmids indicats. AmphiCASP-
3/7 indueix apoptosis a un nivell semblant al que ho
fan caspase-3 i -7, mentre que la forma sense
prodomini (dCSP37) augmenta el potencial d’induir
apoptosis al doble.
Es van dur a terme dos abordatges per esbrinar si
AmphiCASP-3/7 era més semblant a la caspasa-3 o a
la caspasa-7 de vertebrats. En primer lloc es va
procedir a analitzar la seva especificitat de substrat
mitjançant assajos d'activitat caspasa sobre substrats
sintètics fluorogènics. La proteïna recombinant
d'AmphiCASP-3/7 produïda en E.coli talla eficientment
el substrat Ac-DEVD-afc, típic de caspases -3 i -
7. Per contra, el substrat de caspasa-6 Ac-VEID-afc i
de caspasa-8 Ac-IETD-afc no van ser processats per
aquesta proteïna (fig. 10). Aquest patró d’especificitat
és molt més semblant al de la caspasa-7 que al de la
caspasa-3. Com calia esperar, tant la mutació de la
cisteïna del centre catalític a serina, com la preincubació
amb els inhibidors z-VAD-fmk i z-DEVD-fmk,
inhibeixen completament l'activitat de l'enzim.
Figura 9. Valoració de la capacitat de processament
de diferents substrats fluorogènics de caspasa-3,
caspasa-7 i AmphiCASP-3/7 produïdes recombinants
en bacteris. AmphiCASP-3/7 té una especificitat de
substrat semblant a la de la caspasa-7, activitat que
és inhibida totalment quan es muta la cisteïna del
centre actiu i també en tractar els extractes amb
pèptids inhibidors de caspases.
D’una altra banda, es va fer ús de la línia cel·lular
humana MCF7, que és deficient en caspasa-3.
Aquestes cèl·lules no són capaces de degradar tota
una sèrie de substrats cel·lulars quan són tractades
amb un estímul apoptòtic, com ara la -fodrina i
DFF45. El processament de DFF45 és necessari per a
l’activació correcta de CAD, endonucleasa responsable
de la degradació internucleosomal del DNA,
fenomen que tampoc no s'observa en aquestes
cèl·lules. Es van transfectar transitòriament cèl·lules
MCF7 amb formes de les diverses caspases fusionades
a l'epítop FLAG, a fi de facilitar-ne la detecció. Tal
com calia esperar, l'expressió de caspasa-3 en
cèl·lules MCF7 restableix la capacitat d'aquestes
cèl·lules per processar tant -fodrina com DFF45, a
més a més de la degradació del DNA en forma de
ladder. Per contra, l'expressió ectòpica tant
d'AmphiCASP-3/7 com de la seva forma truncada no
provoca cap canvi en el fenotip apoptòtic de les
cèl·lules MCF-7, tot i que els nivells d'expressió que
s'assoleixen són comparables als de la caspasa-3 (fig.
11). Tots aquests resultats suggereixen que
AmphiCASP-3/7 és més semblant a caspasa-7 que
no a caspasa-3.
Figura 10. Cèl·lules MCF7 transfectades amb els
plàsmids indicats van ser induïdes a morir amb
500nM d'estaurosporina (+) o no tractades (-). A,
Anàlisi del processament de -fodrina i de DFF45
mitjançant Western blot. B, Anàlisi de la degradació
internucleosomal del DNA o ladder mitjançant gels
d'agarosa. L’única condició en la qual es recupera el
processament de les proteïnes analitzades i la
degradació del DNA és en cèl·lules transfectades amb
caspasa-3 tractades amb estaurosporina.
RECERCA BIOMÈDICA | 77

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
La caspasa executora descrita a amfiox és compatible
amb l'ancestre de les caspases -3 i -7 de vertebrats,
les quals haurien aparegut al llinatge de vertebrats per
duplicació d'un gen molt semblant a AmphiCASP-3/7.
Malgrat això, AmphiCASP-3/7 comparteix amb la
caspasa-7 una preferència gairebé exclusiva de tall
per pèptids DEVD, mentre que caspasa-3 és capaç
de tallar també VEID i IETD. La manca de complementació
de la línia MCF7 per AmphiCASP-3/7
demostra clarament que no és funcionalment equivalent
a caspasa-3. Totes aquestes dades ens porten a
proposar que caspasa-3 ha adquirit la majoria de les
seves innovacions funcionals durant l'evolució de
vertebrats, mentre que caspasa-7 hauria retingut una
condició més semblant a l’ancestral.
Respecte d’Amphitrk, s’ha clonat el cDNA complet, o
amb versions mutades en posicions clau responsables
de l’activació de les vies de transducció de
senyal, per tal d’estudiar la seva resposta a les
neurotrofines de mamífer en cultius cel·lulars. Malgrat
diverses estratègies emprades, que han inclòs la utilització
de green fluorescent protein, diversos epítops
(fig. 11) i diverses condicions de transfecció o de
cultiu de les cèl·lules un cop transfectades, no ha
estat possible encara obtenir suficient quantitat
d’Amphitrk a la membrana cel·lular (fig. 11), segurament
per una manca d’efectivitat del pèptid senyal
propi de l’amfiox. En l’actualitat s’està en procés de
substituir el pèptid senyal del gen pel pèptid senyal del
gen TrkB de ratolí, per tal d’aconseguir un correcte
processament de la proteïna en cèl·lules de mamífer.
Figura 11. Diferents construccions, estrategies, i
resultats de les transfeccions del gen AmphiTrk en
cèl.lules PC12 i cos.
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
La línia de recerca 2 és eminentment un projecte de
recerca bàsica, per la qual cosa no es preveia una
aplicació clínica immediata, sinó l’increment del
coneixement de famílies gèniques de gran rellevància
en el funcionament i la patologia del sistema
nerviós humà. El treball pot obrir nous punts de
vista per entendre aquest funcionament, tot emprant
l’anàlisi comparada i entenent l’origen íntim
d’aquestes molècules, algunes de les quals
s’empren experimentalment en el tractament de
malalties neurodegeneratives.
Cal no oblidar, però, que en aquest treball s’han aïllat
tres noves molècules (un receptor neurotròfic i dues
caspases executores), que no poden ser descartades
davant d’investigacions més aplicades.
4. Publicacions
M. Encinas, M. Iglesias, N. LlenchaA, J.X. Comella. Extracellularregulated
kinases and phosphatidylinositol 3-kinase are involved in
brain-derived neurotrophic factor-mediated survival and neuritogenesis
of the neuroblastoma cell line SH-SY5Y. Journal of
Neurochemistry 73: 1409-1421. 1999.
R.M.Soler, X.Dolcet, M.Encias, J.Egea, J.R.Bayascas,
J.X.Comella. Receptors of the glial cell line-derived neurotrophic
factor family of neurotrophic factors signal cell survival through the
phosphatidylinositol 3-kinase pathway in spinal cord motoneurons.
The Journal of Neuroscience 19:9160-9169. 1999.
J.Eges, C.Espinet, R.M.Soler, S.Peiro, N.Rocamora,
J.X.Comella. Nerve growth factor activation of the extracellular
signal-regulated kinase pathway is modulated by Ca2+ and
calmodulin. Molecular and Cellular Biology 20:1931-1946. 2000.
C.Espinet, X.Gomez-Arbones, J.Egea, J.X.Comella. Combined
use of the green fluorescent protein and fluorescent-activated cell
sorting to select pure populations of transiently transfected PC12
cells. Journal of Neuroscience Methods 100:63-69. 2000.
S.Peiro, J.Comella, C.Enrich, D.Martin-Zanca, N.Rocamora.
PC12 cells have caveolae that contain TrkA, caveolae-disrupting
drugs inhibit NGF-, but not EGF-, induced MAPK phosphorylation.
Journal of Biological Chemistry 275: 37846-37852. 2000.
V.J.Yuste, J.R.Bayascas, N.Llecha, I.Sánchez-López, J.Boix,
J.X.Comella. The absence of oligonucleosomal dna fragmentation
during apoptosis of imr-5 neuroblastoma cells. disappearance of
the caspase-activated DNase. Journal of Biological Chemistry
276: 22323-22331. 2001.
J.Egea, C.Espinet, R.M.Soler, X.Dolcet, M.Iglesias, N.Rocamora,
J.X.Comella. Neuronal survival induced by neurotrophins requires
calmodulin. Journal of Cell Biology 154:585-597. 2001.
J.R.Bayascas, V.J.Yuste, E.Benito, J.García-Fernàndez,
J.X.Comella. Isolation of AmphiCASP-3/7, an ancestral caspase
from amphioxus (Branchiostoma floridae). Evolutionary considerations
for vertebrate caspases. Cell Death & Differentiation 9:1078-
1089. 2002.
M.LLovera, J.Egea, M.Encinas, Y.dePablo, S.Peiro, D.Mertin-
Zanca, J.X.Comella, N.Rocamora. Calmodulin binds to TrkA:
Implications in the regulation of receptor cleavage. Journal of
Biological Chemistry (sotmès). 2003.
Bayascas, J. R.; Yuste, V.J.; Benito, E.; Garcia-Fernàndez, J.;
Comella, J.X (2002). Isolation of AmphiCASP-3/7, an ancestral
caspase from amphioxus (Branchiostoma floridae).
Evolutionaryconsiderations for vertebrate caspases. Cell Death
and Differentiation 9:1078-1089
Benito, E.; Patten, I.; Bayascas, J. R.; Comella, J. X.; Garcia-
Fernàndez, J. Trk neurotrophic receptors are not an invention of
vertebrates. Science (en revisió).

Títol del projecte:
Anàlisi clinicomolecular de la Poliquistosi renal autosòmica
dominant (PQRAD) i altres malalties quístiques renals
Investigador principal
Alexandre Darnell Tey
Institució
Hospital Clínic i Provincial de Barcelona
Membres de l’equip
Rosa Torra, Motserrat Milà, Cèlia Baderras, Carlos Nicolau, Laureano Pérez i Juan Antonio Camacho
13.716.625 PTA
MEMÒRIA FINAL
1. Resum del projecte original
Objectius
Anàlisi de lligament en famílies amb PQRAD amb els
objectius següents:
- Establir les diferències entre PKD1 i PKD2.
- Aconseguir identificar alguna família PKD3.
- Identificar famílies PKD1 que puguin ser objecte de
l'estudi de gens modificadors en la PQRAD.
Estudi de gens modificadors en la PQRAD:
- Cerca de pèrdues d'heterozigositat en el gen PKD1
en quists renals de ronyons de pacients poliquístics.
- Determinació del polimorfisme de l'enzim de conversió
en pacients poliquístics i establiment d'una correlació
dels tres diversos genotips amb l'edat d'inici de
diàlisi i la presència d'HTA.
- Estudi de compartició d'al·lels en parelles de
germans o oncle-nebot amb PQRAD i edat coneguda
de diàlisi. S'analitzaran microsatèl·lits de les regions
homòlogues a les descrites al ratolí com a modificadores
de l'evolució de la malaltia.
- Estudi d'expansions tot al llarg del genoma humà i
correlació de la presència d’aquestes amb una major
severitat de la malaltia.
Anàlisi de mutacions al gen PKD1, mitjançant SSCAseqüenciació
directa i correlació clínica (insuficiència
renal crònica terminal, hipertensió arterial, aneurismes
cerebrals i altres).
Anàlisi de lligament en famílies amb PQRAD.
Estudi mutacional directe al gen de la nefronoptisi
(NPH1).
Estudi de lligament de famílies amb malaltia medul·lar
quística amb el locus 2q13 (NPH1).
2. Resultats
Un dels objectius generals del projecte era dur a
terme l’anàlisi clinicomolecular d’individus afectats de
poliquistosi renal autosòmica dominant i, en particular,
introduir àmpliament l’anàlisi de lligament de les
famílies i començar la recerca de mutacions per poder
fer el diagnòstic directe de la malaltia.
En aquest sentit, hem estudiat amb anàlisi de
lligament més de 400 individus que pertanyen a 85
famílies amb història de poliquistosi renal autosòmica
dominant (PQRAD), el 85% dels quals mostren
lligament al gen PKD1 i un 15% al gen PKD2. Això ha
permès aprofundir en les diferències fenotípiques
entre els dos gens de la malaltia.
Pel que fa a l’estudi mutacional directe s’han descrit
RECERCA BIOMÈDICA | 79

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
noves mutacions tant al gen PKD1 com al gen PKD2,
a més d’algunes que ja havien estat descrites prèviament.
La recerca de mutacions ha estat molt més
rendible en les famílies PKD2; concretament, s’han
trobat 26 mutacions en un total de 30 famílies PKD2
estudiades, de les quals 10 són noves mutacions no
descrites prèviament. Totes les noves mutacions
descrites es preveu que donin lloc a una proteïna
truncada. Aquestes mutacions estan publicades i ja
es van descriure detalladament en la memòria de l’any
2000 (AM J Kidney Dis 2000, 36:728:734).
S’ha confirmat el resultat d’estudis previs, en el sentit
que el fenotip PKD2 és més benigne que el PKD1.
Hem determinat la proporció de pacients amb PQRAD
amb inici del tractament renal substitutiu després dels
63 anys. La prevalença de malaltia PKD2 entre els
pacients amb PQRAD d’edat avançada en IRCT és
almenys del 39,1%, la qual és gairebé tres vegades la
prevalença de la malaltia PKD2 entre la població de
PQRAD global (Am J Kidney Dis 2000, 36:728:734).
Malgrat que dins l’heterogeneïtat genètica d’aquesta
malaltia s’han descrit algunes poques famílies sense
lligament al gen PKD1 o PKD2, la qual cosa suggereix
l’existència d’un tercer gen PKD3, nosaltres no hem
identificat cap família PKD3 i, com altres grups de
recerca, dubtem que existeixi.
El mecanisme de formació dels quists renals o
cistogènesi és encara poc conegut. En aquest projecte
hem demostrat la validesa de la teoria dels two hit
(dos cops) en el procés de la cistogènesi, tant per a
PKD1 (Eur J Hum Genet 2000, 8:487-492) com per a
PKD2. Aquesta teoria, segons la qual la formació d’un
quist resulta de la inactivació de la còpia normal del
gen PKD1 per una mutació somàtica o segon cop,
recolza en el fet d’haver trobat pèrdues d’heterozigositat
als gens PKD1 i PKD2 en els quists estudiats de
ronyons de malalts poliquístics. A més de la pèrdua
d’heterozigositat, també hem demostrat mutacions
aïllades del gen PKD2 com a exemple de segon cop
(Am J Hum Genet 1999; 65: 345-352).
Un altre objectiu rellevant d’aquest projecte era
aprofundir en el coneixement d’altres gens que
poguessin modificar l’expressió de la malaltia o gens
modificadors. Amb aquest objectiu hem analitzat 150
mostres d’ADN de pacients afectats de PQRAD tipus
1 amb 3 polimorfismes del TGF-b situats al codó 10,
al codó 25 i a la regió flanquejant 5’, mitjançant
enzims de restricció. Els resultats obtinguts fins ara
demostren que no hi ha diferències significatives
quant a la supervivència renal entre els pacients amb
diferents genotips.
Per contra, els nostres resultats de l’estudi del
polimorfisme del gen de l’ECA mostra que els
pacients amb el genotip DD tenen un pitjor pronòstic
renal, basat en una supervivència renal i un percentatge
significativament superior de pacients que
comencen IRCT abans dels 50 anys. No hem trobat
diferències significatives quant a la prevalença d’hipertensió
entre els grups de malalts amb diferents
genotips (Am J Kidney Dis 1999, 34:273-278).
Per poder continuar treballant en aquest camp, hem
recollit ADN de 50 parelles concordants o discordants
PKD1, que seran utilitzades en un estudi multicèntric
europeu per intentar trobar gens modificadors de la
malaltia PQRAD.
Per últim, un dels objectius del projecte era ampliar
l’estudi clinicomolecular a altres malalties renals quístiques
hereditàries menys freqüents, com són la
nefronoptisi, la malaltia quística medul·lar o la poliquistosi
renal autosòmica recessiva.
En aquest sentit, s’han estudiat 11 famílies amb
nefronoptisi, en les quals s’ha detectat una deleció del
gen en homozigosi en 5 casos ( ja descrita prèviament),
però no en els altres 6 casos estudiats.
També s’han estudiat dues famílies amb malaltia
medul·lar quística que no han mostrat lligament amb
els locus descrits en la literatura.
Per últim, hem estudiat 10 famílies amb poliquistosi
renal autosòmica recessiva, que han mostrat lligament
pel locus 6p21. L’ADN d’aquestes famílies està en
procés de recerca de mutacions pel grup de Peter
Harris (Mayo Clinic, Rochester, MN, USA).
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
La rellevància dels resultats d’aquest projecte de
recerca radica tant en l’aspecte científic com en el
clínic. La implicació clínica fonamental és haver
optimitzat la diagnosi molecular de totes les malalties
estudiades, tant pel que fa a l’anàlisi de lligament com
a la recerca de mutacions.
L’anàlisi de lligament té una rellevància clínica especial
en el cas de la poliquistosi renal autosòmica dominant,
ja que permet diferenciar amb facilitat entre malalts
PKD1 i PKD2. Això separa els malalts poliquístics en
grups que tenen un pronòstic clínic diferent; en principi
el fenotip PKD2 és més benigne que el fenotip PKD1.
Al mateix temps ajuda a plantejar estudis sobre la
malaltia sense mesclar malalts d’un tipus i d’un altre,
com per exemple quan es vol estudiar la influència de
determinats polimorfismes en la progressió de la insuficiència
renal (Am J Kidney Dis 1999; 34: 273-278).
Ara bé, un cop establertes les diferències entre PKD1
i PKD2, té un considerable interès clínic el fet d’haver
demostrat la gran heterogeneïtat clínica de cadascuna
d’aquestes variants, la qual cosa fa que sigui poc
recomanable basar el pronòstic evolutiu d’aquestes
malalties exclusivament en el genotip. Aquestes
conclusions s’obtenen a partir del treball publicat
sobre prevalença de la malaltia PKD2 entre la població
de pacients poliquístics d’edat avançada (Am J
Kidney Dis 2000, 36:728-734).
Un segon resultat amb implicacions clíniques significatives
és que la recerca directa de mutacions, no
disponible de forma indiscriminada pel diagnòstic de
poliquistosi renal, pot resultar rendible en alguns
casos, com per exemple en malalts d’edat avançada
sense història familiar o sense familiars disponibles per
l’estudi de lligament. En aquest sentit, els autors van
poder diagnosticar per estudi mutacional directe un
nombre significatiu de subjectes aïllats amb malaltia
PKD2 (Am J Kidney Dis 2000, 36:728-734).
També era un objectiu fonamental d’aquest projecte
de recerca, amb potencials implicacions clíniques,
aprofundir en el coneixement d’altres gens que poden
modificar l’expressió de la malaltia poliquística. El fet
que malalts d’una mateixa família, i per tant portadors
de la mateixa mutació, tinguin sovint manifestacions
clíniques molt diferents, fa sospitar que hi ha altres
factors genètics, anomenats gens modificadors. Els
autors d’aquest projecte han trobat una associació
amb el gen de l’enzim conversor de l’angiotensina

(ECA), ja que determinats polimorfismes, els subjectes
DD, mostren una més ràpida progressió cap a la
insuficiència renal. L’interès d’aquest resultat radica en
les possibles implicacions terapèutiques, ja que els
inhibidors de l’ECA i els antagonistes dels receptors
de l’angiotensina podrien tenir un efecte protector
sobre la progressió de la malaltia, especialment entre
els malalts amb un genotip DD (Am J Kidney Dis
1999; 34: 273-278).
Altres aportacions científiques rellevants del projecte
han estat la demostració del fenomen dels dos cops o
two hit per explicar la formació dels quists renals en
les malalties PKD1 (Eur J Hum Genet 2000, 8:487-
492) i PKD2 (Am J Hum Genet 1999; 65: 345-352), la
descripció de noves mutacions en els gens de la
poliquistosi renal autosòmica dominant, la demostració
de l’absència d’heterogeneïtat genètica en la
poliquistosi renal autosòmica recessiva i l’estudi
molecular de malalties poc freqüents, com la
nefronoptisi o la malaltia quística medul·lar (pendents
de publicació). Les possibles implicacions dels
resultats obtinguts en aquests darrers treballs encara
estan per demostrar, però en qualsevol cas suposen
haver aprofundit en el coneixement de les bases
d’aquestes malalties, i cal esperar que aviat arribin a
tenir una rellevància clínica significativa.
4. Publicacions
Pérez-Oller L, Torra R, Badenas C, Milà M, Darnell A. Influence
of the Angiotensin Converting Enzyme polymorphysm in the
progression of renal disease in autosomal dominant polycystic
kidney disease. Am J Kidney Dis 1999; 34: 273-278.
Torra R, Badenas C, Pérez-Oller L, San Millán JL, Estivill X,
Darnell A. Demostration of a loss-of-function model for cystogenesis
in polycystic kidney disease type 2. Am J Hum Genet 1999;
65: 345-352.
Badenas C, Torra R, Pérez-Oller L, Talbot-Wright R, Torregrosa
V, Mallolas J, Darnell A. Loss of heterozygosity in renal and
hepatic epithelial cystic cells from PKD1 patients. Eur J Hum
Genet 2000; 8: 487-492.
Nicolau C, Torra R, Vilana R, Bianchi L, Gilabert R, Darnell A,
Brú C. Abdominal sonographic study of autosomal dominant
polycystic kidney disease. J Ultr Med 2000; 28: 277-282.
Torra R, Badenas C, Pérez-Oller L, San Millán JL, Nicolau C,
Oppenheimer F, Milà M, Darnell A. Increased prevalence of
polycystic kidney disease type 2 among elderly polycystic
patients. Am J Kidney Dis 2000; 36: 728-734.
RECERCA BIOMÈDICA | 81

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
Títol del projecte:
Anàlisi de les interaccions moleculars de la proteïna transmembrana de
la fibrosi quística (CFTR) amb la membrana plasmàtica de cèl·lules
epitelials. Paper de la CFTR en la infecció per Pseudomonas aureginosa
MEMÒRIA FINAL
1. Resum del projecte original
Amb aquest projecte d’investigació pretenem
demostrar que les interaccions de la CFTR amb altres
proteïnes de la membrana plasmàtica poden ser
responsables de la resistència a la infecció bacteriana.
Per intentar demostrar la nostra hipòtesi, ens hem
plantejat els objectius següents:
1) Anàlisi del targeting apical de la CFTR en cèl·lules
T84, Caco-2 i HT29:
- Implicació del citoesquelet de microtúbuls i microfilaments.
- Paper del CaM en el targeting apical de la CFTR.
- Implicació de la calmodulina i la CaM-dependent-
PKII i IV en el tràfic intracel·lular de la CFTR.
2) Comparació de l’expressió de les proteïnes de fusió
Rab-3 i Annexin V en les cèl·lules que expressen la
CFTR normal i les que expressen la mutació AF508.
3) Estudi del tràfic intracel·lular de la CFTR:
- Paper de la CFTR en l’acidificació del compartiment
endocític.
- Estudi dels efectes de la bacilomicina A en el pH
endosomal.
Investigador principal
Carles Enrich Bastus
Institució
Facultat de Medicina. UB
Membres de l’equip
Francesc Tebar, Noemí Andrés i Carles Enrich
20.650.000 PTA
- Efecte de la cloroquina i del W13 en la distribució de
la CFTR.
- Efecte d’altres pertorbadors del tràfic intracel·lular en
la distribució de la CFTR: BFA i WT.
- Estudi dels senyals bàsics de direccionament de la
CFTR (internalització, segregació en clathrin-coated
pits: tirosines, dileucines...).
4) Anàlisi del binding i la fagocitosi de bactèries en
cèl·lules que expressen la CFTR mutada:
- Estudi de les proteïnes de la membrana plasmàtica
en cèl·lules T84, Caco-2 i HT 29. Comparació entre
les cèl·lules que expressen i les que no expressen la
CFTR.
- Quantificació de receptors "asialo GM1" (implicats en
el binding de Pseudomonas aureginosa).
- Anàlisi de l’endocitosi i fagocitosi en diferents tipus
cel·lulars que expressen CFTR mutada.
Per poder acomplir els objectius enumerats
anteriorment, ens vam plantejar el pla de treball
següent:
1) Determinar la localització de la CFTR fent un estudi
immunocitoquímic amb diferents anticossos contra la
CFTR en cèl·lules que expressen aquesta proteïna
(T84, Caco-2 i HT29). Els resultats s’analitzaran amb
microscòpia electrònica i cofocal.

2) Estudi de la capacitat d’endocitosi de les cèl·lules
que presenten la mutació F508 en la CFTR. Per
aconseguir-ho, realitzarem assajos d’internalització de
lligands (tant de fase fluida com mediada per
receptors) amb boles de sefarosa i bacteris.
3) Transfecció de cèl·lules que de forma endògena no
presenten la CFTR amb el cDNA de la CFTR amb la
mutació F508. Estudi del targeting de la proteïna
mutada. Estudi del tràfic intracel·lular de la proteïna
normal i la mutada utilitzant una construcció de la
CFTR amb una proteïna fluorescent (GFP).
4) Anàlisi del pH en cèl·lules transfectades.
5) Estudi del mecanisme de transport de la CFTR des de
la membrana plasmàtica fins al compartiment endocític.
Tractament de les cèl·lules amb cloroquina, bafilomicina
A i antagonistes de la calmodulina (W13, W7).
6) Anàlisi dels compartiments intracel·lulars implicats
en el transport de la CFTR a la membrana plasmàtica
apical. Utilitzarem mètodes de fraccionament cel·lular
per a l’aïllament de diferents fraccions subcel·lulars:
Golgi, lisosomes, endosomes i membrana plasmàtica.
7) Estudi bioquímic de les fraccions aïllades: 2D-PAGE
i Western-blooting.
8) Estudi de l’expressió de proteïnes de fusió: Rab 3 i
Annexin V (canal de calci).
9) Microinjecció d’anticossos antiCFTR en cèl·lules
T84. Estudi dels nivells d’acidificació intracel·lulars.
Estudis d’internalització de diferents lligands marcats
amb fluorescència.
10) Immunoprecipitació amb antiCFTR, i anàlisi dels
complexos immunoprecipitats a partir de fraccions
purificades de membrana plasmàtica i de fraccions
intracel·lulars.
11) Assajos d’endocitosi i fagocitosi en diferents
soques cel·lulars que expressen la CFTR.
2. Resultats
Per fer els experiments de localització cel·lular,
d’immunoprecipitacions i detecció mitjançant la
tècnica Western-blotting de la CFTR, van ser expressats
diversos fragments de l’extrem carboxi-terminal
de la CFTR fusionats amb 6xHIS o GST i utilitzats per
immunitzar conills i obtenir els corresponents anticossos
policlonals. En la figura 1, on s’esquematitza la
tipologia de la CFTR (panell A), es mostren les
diverses construccions que s’han utilitzat, unides amb
GST o 6xHIS, per produir anticossos i per a la realització
de pull-downs (panell B). També es mostren els
fragments i la CFTR mutant o no fusionats amb la
green fluorescent protein, GFP, per dur a terme
Figura 1
estudis de localització in vivo (panell C).
Els anticossos purificats per cromatografia d’afinitat
han estat testats i es poden utilitzar tant per immunoprecipitar
com per a la detecció en Western-blotting
de la CFTR, tal com es mostra, a tall d’exemple, en la
figura 2. El sèrum obtingut dels conills inoculats amb
les construccions His-700 i His-900, i que contenen
els anticossos que reconeixeran la zona carboxiterminal
de la CFTR, van ser purificats per mitjà d’una
columna d’afinitat per augmentar-ne l’especificitat. Per
comprovar l’eficàcia de les fraccions purificades, es
van "blotejar" membranes, que contenien lisats de
cèl·lules COS-I transitòriament transfectades amb
GFP-CFTRwt, GFP-CFTR900 o cèl·lules control,
carrils 1, 2 i 3 respectivament (figura 2), amb els
respectius anticossos purificats i l’anticòs monoclonal
comercial (Genzyme)contra l’extrem c-terminal de la
CFTR com a control.
Figura 2
Els experiments d’immunolocalització cel·lular amb els
anticossos produïts per nosaltres no han donat
resultats positius, possiblement perquè la regió
immunogènica de la CFTR escollida està en una zona
important d’interaccions proteïna-proteïna i, per tant,
l’epítop pot estar, in vivo, emmascarat i no accessible.
Amb la intenció d’estudiar l’endocitosi del canal de Cl,
CFTR, que es troba a la membrana plasmàtica, i
diferenciar la de nova síntesi, s’ha emprat un anticòs
produït contra la part glicosilada extracel·lular de la
CFTR. En experiments de pre-embeding utilitzant
cèl·lules T-84 i un anticòs secundari conjugat a
partícules d’or, hem obtingut imatges de microscòpia
electrònica. Els resultats no han estat gaire positius,
creiem que per causa de la inespecificitat de l’anticòs
observada en experiments d’immunofluorescència. Tot
i així, en la figura 3 es mostren algunes de les imatges
obtingudes amb el microscopi electrònic.
Figura 3
RECERCA BIOMÈDICA | 83

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
Per a l’estudi de proteïnes que puguin interactuar amb
la CFTR, els mateixos fragments purificats en la
producció d’anticossos s’han utilitzat en experiments
de pull-down. En la figura 4 es mostra el resultat del
pull-down amb GST (carrils 1 i 3) i GST-CFTR300
(carrils 2 i 4) en lisats de cèl·lules T-84 marcades
metabòlicament amb 35S-metionina. Com es pot
observar al panell A, proteïnes separades en gel
d’SDS-PAGE, les fletxes indiquen les bandes que
s’uneixen a la columna de GST-CFTR300 (carrils 4) de
manera específica i al panell B es mostra com, en
experiments de coimmunoprecipitació (1:
antiCFTRcterm, 2: antiCFTR-Rdomini, 3: preimmune),
aquestes bandes concorden amb la -adaptina (AP-2)
i l’Ezrina (moesin) . S’ha descrit que l’E3KARP (50
kDa) és una proteïna d’unió a regions d’interacció per
a dominis PDZ, els quals estan a l’extrem c-terminal
de la CFTR (aas: 1477-1480, DTRL). A través de
l’E3KARP, la CFTR es pot unir de manera indirecta a
l’Ezrina (proteïna del citoesquelet de 82 kDa). La
CFTR és internalitzada a dins la cèl·lula per la via
dependent de clatrina. Recentment s’ha demostrat
que els aas tirosina-1424 i leucina-1427 estan
implicats en la interacció de la CFTR amb l’AP-2, la
qual és una proteïna adaptadora entre la CFTR i la
clatrina
Figura 4
Per a l’anàlisi d’altres proteïnes d’interacció amb la
CFTR, després de fer experiments de pull-down en
columnes de GST-CFTR-300 i columnes de GST com
a control (figura 5, carrils 1 i 2, respectivament) amb
lisats provinents de cèl·lules T-84 (presenten gran
quantitat de CFTR endògena) i cèl·lules COS-
1(transfectades amb GFP-CFTRwt), vam separar per
electroforesi en gels d’SDS-PAGE (10% acrilamida) les
proteïnes d’unió a les corresponents columnes. En la
figura 5 es mostra el patró de bandes obtingudes,
visualitzades després de revelar amb tinció de plata.
Les bandes específiques que apareixen en les
columnes de GST-CFTR300 (indicades amb lletres en
la figura 5) van ser retallades, digerides i seqüenciades
a través d’un seqüenciador MALDI. Els resultats
obtinguts en la base de dades MS-Fit Search s’adjunten
a aquesta memòria.
Figura 5
Per a l’estudi comparatiu en la localització subcel·lular
de la CFTR wt i la CFTR amb la mutació F508, causa
més freqüent de la malaltia de la fibrosi quística, s’han
expressat en cèl·lules COS-1 de manera transitòria
ambdues proteïnes, wt i F508, fusionades amb la
GFP en l’extrem N-terminal (descrit anteriorment que
no altera l’activitat de la CFTR). Tal com es pot veure
en la figura 6, mentre la GFP-CFTRwt té una distribució
esperable, marcatge perinuclear corresponent al
Golgi i marcatge a la membrana plasmàtica, la GFP-
CFTR F508 es deslocalitza i queda segrestada majoritàriament
al Golgi i reticle endoplasmàtic. Aquest
resultat ja ha estat descrit per altres autors i està lligat
a una reducció de la maduració i a l’incorrecte
plegament del mutant.
Figura 6
Ja que la CFTR s’internalitza per la via dependent de
clatrina, hem estudiat l’efecte de la sobreexpressió de
la GFP-CFTRwt, GFP-CFTR F508 i els fragments:
GFP-CFTR900, 700 i 300, en l’endocitosi de la
transferrina, unida al cromòfor TRITC durant 15
minuts, com a marcador d’internalització dependent
de clatrina. S’ha publicat recentment que el motiu de
la CFTR: tirosina1427-X-X-isoleucina1427 és el
responsable de la unió de la proteïna adaptadora AP-
2 a la CFTR. Com es pot observar en la figura 7, l’alta
expressió tant de GFP-CFTR300 o GFP-CFTR900,
fragments que poden unir AP-2, inhibeixen la internalització
de la transferrina (Tf-TRITC) possiblement per
un efecte de segrest de l’AP-2 necessària com a pont
entre el receptor de la transferrina i la clatrina. En
canvi, ni l’expressió del vector, GFP, ni del fragment
GFP-CFTR700 (no conté el lloc d’unió a la AP-2)
afecten negativament l’entrada de la transferrina.
Aquests diferents fragments poden servir com a eines
per a la realització d’estudis comparatius de proteïnes
que entren a la cèl·lula per vies diferents (dependent
de clatrina, fase fluida, caveoles...).

Figura 7
Es coneix que l’activitat de la CFTR, com a canal de
Cl-, està regulada per AMPc-PKA i PKC a través de la
fosforilació de diferents residus, en el domini R, de la
proteïna. Amb l’interès d’esbrinar si aquestes cinases
tenien algun paper sobre el trànsit de la CFTR,
cèl·lules COS-1 transfectades de manera transitòria
amb GFP-CFTRwt van ser tractades amb estímuls i
inhibidors diferents. Hem observat que activadors de
la producció d’AMPc (Forskolina), anàlegs no hidrolitzables
de l’AMPc (Bt2-AMPc) i per tant activant la
PKA o inhibint-la amb H-89, no s’afecta la localització
de la CFTR ni la internalització de transferrina. En
canvi, activant la PKC amb TPA (100nM) (anàleg de
l’ester de forbol, DAG) durant 30 minuts, es produeix
l’acumulació de la CFTR en endosomes engrandits
(FIGURA 8). Es coneix que l’activació de la PKC, i a
través de la proteïna Rab5, augmenta la fusió entre els
endosomes i permet la formació d’aquests endosomes
peculiars, on es concentren proteïnes endocitades
via clatrina i també, com hem descrit, la CFTR.
Figura 8
S’ha descrit que en la CFTR mutada, en la malaltia de
la fibrosi quística, s’afecta l’absorció de NaCl en teixits
epitelials i això interfereix en l’homeòstasi del pH
intracel·lular. A més s’ha observat que la fibrosi quística
provoca hiperacidificació dels orgànuls dependents
de la bomba Na+/H+ ATPasa, ja que la CFTRwt té un
efecte inhibidor sobre aquesta. El nostre interès ha
estat estudiar si l’expressió de les construccions GFP-
CFTR F508 o GFP-CFTRwt podien afectar d’alguna
manera l’endocitosi de transferrina o d’EGF. En la
figura 9 es pot observar que no hi havia cap efecte
destacable fins a 30 min d’internalització de l’EGF
marcat amb TRITC, però era sorprenent que després
d’1 hora d’afegir l’EGF on s’observava menys marcatge
intracel·lular (EGF-TRITC) era en les cèl·lules que
expressen GFP-CFTRwt (dades no mostrades).
Aquest resultats són molt preliminars i necessiten una
comprovació adequada; per tant, s’ha de ser molt
cautelós en la interpretació. En un futur immediat està
previst de fer experiments a temps més llargs d’incubació
amb EGF o transferrina per a l’estudi del
possible efecte de la CFTR en el reciclatge dels
corresponents receptors.
Figura 9
Finalment i referent al trànsit de la CFTR, ens agradaria
presentar els resultats obtinguts amb el W13,
antagonista de la calmodulina (CaM). Tot i que en
experiments de pull-down amb CaM purificada no
hem pogut observar interacció entre CFTR (provinent
de lisats de cèl·lules T-84) i CaM, la GFP-CFTRwt
queda retinguda en uns endosomes aberrants que es
produeixen després d’1 hora d’incubació amb W13
(10 µg/ml) (figura 10, indicats amb fletxes). Aquest
resultat coincideix amb els descrits per altres
receptors que queden retinguts per acció del W13, els
quals, però, a diferencia de la CFTR sí uneixen CaM
(receptor de la transferrina, de l’EGF, de la polimèrica
IgA, entre d’altres). Això ens permet concloure d’alguna
manera que l’efecte del W13 és de caràcter
general i no implica la unió de CaM als receptors
esmentats anteriorment.
Figura 10
RECERCA BIOMÈDICA | 85

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
És prematur determinar quines poden ser les implicacions
clíniques dels resultats obtinguts. Hi ha dues
parts potencialment d’interès: 1) la que fa referència al
control del tràfic de la CFTR i a l’endocitosi, i 2) la
referent a les interaccions de la CFTR amb altres
proteïnes a la membrana plasmàtica.
A més, una de les possibles aplicacions és l’ús dels
anticossos generats, especialment l’anticòs contra la
regió extracel·lular, per inhibir l’endocitosi, l’activitat
com a canal de Cl i, per extensió, la fagocitosi de
Pseudomonas.

Títol del projecte:
Impacte de la indicació precoç del suport ventilatori
sobre la qualitat de vida i la supervivència
en les malalties neuromusculars
Investigador principal
Joan Escarrabill Sanglas
Institució
Ciutat Sanitària i Universitària de Bellvitge
3.000.000 PTA
MEMÒRIA FINAL
1. Resum del projecte original
Introducció
Les malalties neuromusculars en la seva evolució
poden cursar amb afectació de la musculatura
respiratòria, i amb la insuficiència respiratòria com la
causa més important de mort en moltes d’aquestes
malalties. El tractament de la insuficiència respiratòria
per fracàs de la bomba ventilatòria, com succeeix en
aquestes entitats és la ventilació mecànica a llarg
termini. El moment d’instauració d’aquest tractament
és un tema encara controvertit, sobretot en aquelles
malalties d’evolució molt ràpida, com pot ser l’esclerosi
lateral amiotròfica. Si bé no hi ha dubtes en l’aplicació
de la ventilació mecànica quan es constata insuficiència
respiratòria, no hi ha consens en la instauració d’aquest
tractament en fases més precoces. En algunes ocasions
la ràpida evolució de la malaltia fa que la detecció del
fracàs ventilatori es produeixi en una situació clínica molt
avançada, en la qual la ventilació mecànica ja no és
efectiva o bé no es pot aplicar. D’altra banda, si aquest
tractament s’inicia en etapes molt precoces, sense
símptomes, pot ser que el benefici sigui escàs i empitjori
la qualitat de vida dels pacients en haver de seguir un
tractament durant moltes hores al dia.
Per aquest motiu vam planificar un estudi encaminat a
valorar l’eficàcia de l’aplicació de la ventilació mecànica
no invasiva de manera precoç, quant a la supervivència
i la qualitat de vida dels pacients amb malalties
neuromusculars.
Objectius
Objectiu principal
Conèixer si el suport ventilatori nocturn domiciliari
precoç (instaurat en el moment en què es detectin
trastorns respiratoris del son i abans de l’aparició
d’insuficiència respiratòria) en els pacients amb
malalties neuromusculars és capaç de:
- Endarrerir el deteriorament de la funció respiratòria.
- Alleugerir els símptomes respiratoris.
- Millorar la qualitat de vida.
- Augmentar la supervivència.
Objectius secundaris
1. Detectar els paràmetres respiratoris predictius de
l’evolució cap a la insuficiència respiratòria en aquests
pacients. I especialment, determinar si les alteracions
respiratòries del son són indicatives de l’aparició
d’insuficiència respiratòria.
2. Avaluar la correlació entre les alteracions respiratòries
del son inicials i l’afectació de la musculatura
diafragmàtica.
RECERCA BIOMÈDICA | 87

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
Metodologia
Projecte constituït per dos dissenys d’investigació:
1. Estudi experimental: assaig clínic aleatori i controlat,
en el qual s’inclouran aquells pacients que inicialment
o durant el seguiment presentin alteracions respiratòries
del son i que seran assignats de forma aleatòria a
dos grups:
- Grup de suport ventilatori (SV) precoç: iniciaran l’SV
nocturn al seu domicili.
- Grup control: no iniciaran l’SV fins a l’aparició d’insuficiència
respiratòria.
2. Estudi de cohorts prospectiu: els pacients que no
presentin alteracions respiratòries del son o que hagin
estat assignats al grup control (de l’estudi experimental)
s’inclouran en l’anàlisi dels factors predictius
d’aparició d’insuficiència respiratòria.
Subjectes de l’estudi
Pacients afectats de malalties neuromusculars (MNM)
amb una capacitat vital respiratòria inferior al límit de
la normalitat (80% del valor teòric).
2. Resultats
Des de l’inici del projecte s’han avaluat 52 pacients,
dels quals finalment 38 pacients van ser inclosos en
alguns dels dos estudis. Els motius d’exclusió dels 14
pacients restants van ser: indicació de suport ventilatori
en el moment de la primera valoració (8 casos),
rebuig de la possibilitat de suport ventilatori (2 casos) i
impossibilitat de seguiment dels controls (4 casos).
Durant els 3 anys de l’estudi s’hi han inclòs 38
pacients (25 homes, 13 dones), amb una edat mitjana
de 60 ± 12 anys i un temps d’evolució de la malaltia
neurològica de 26 ± 47 mesos. Els diagnòstics van
ser els següents: esclerosi lateral amiotròfica (28
casos), malaltia d’Steinert (4 casos) i altres miopaties
(6 casos). S’ha quantificat el temps d’evolució de la
malaltia en els pacients amb esclerosi lateral amiotròfica,
ja que la resta de pacients presenten en la seva
majoria malalties congènites amb tants anys d’evolució
de la malaltia com l’edat dels pacients. En el
moment d’inclusió en el projecte, el 35% dels
pacients tenien afectació bulbar, el 16% presentaven
dificultats per a l’expectoració i el 30% referien un cert
grau de dispnea en relació amb l’esforç, malgrat que
aquest últim paràmetre ha estat difícil d’avaluar pel fet
que molts d’aquests pacients tenen dificultats
importants en la mobilitat. Les principals característiques
clíniques dels pacients en el moment de ser
inclosos són les següents:
Taula 1 n = 38
Els símptomes clínics dirigits a avaluar l’afectació de la
musculatura respiratòria durant el son queden recollits
en la taula següent:
Taula 2 n = 38
L’avaluació de la qualitat de vida es va fer mitjançant
el qüestionari SF-12, que presenta dos components,
el component físic i el component mental, esmentats
com PCS i MCS, respectivament. La puntuació de
cadascun d’aquests dos paràmetres va de 0 a 100, i
els valors més baixos indiquen una pitjor valoració de
la qualitat de vida. En la taula 3 podem veure el
resultat d’aquests dos components en la valoració
inicial.
Taula 3 n = 38
Evolució de la supervivència
El conjunt de pacients inclosos en el grup d’intervenció
i, per tant, que van iniciar el suport ventilatori de
manera precoç han presentat una supervivència més
gran que els pacients del grup control: 14 ± 2 mesos
versus 8 ± 1 mesos (log rank test p = 0,02). En la
figura 1 es pot veure la representació gràfica de la
supervivència dels dos grups.

Qualitat de vida
La qualitat de vida es va observar amb l’administració
d’un qüestionari general sobre la autopercepció de la
salut (SF-12). Aquest qüestionari està constituït per
dos components, el component físic i el component
mental, esmentats com PCS i MCS, respectivament.
La puntuació de cadascun d’aquest dos paràmetres
va de 0 a 100, i els valors més baixos indiquen una
pitjor valoració de la qualitat de vida. Tant els pacients
del grup d’intervenció com els dels grup control tenen
puntuacions molt similars a l’inici de l’estudi. En els
dos casos el component físic és el que té la puntuació
més baixa, fet que s’explica per la incapacitat física
que provoca la malaltia.
Taula 4
No hem trobat diferències estadísticament significatives
en l’evolució de la percepció de la qualitat de vida
entre els dos grups. Tot i això, val la pena considerar
que el grup d’intervenció no presenta un empitjorament
de la valoració de la qualitat de vida, a diferència
del grup control.
Resultats de l’estudi prospectiu
Aquesta part del projecte ens ha servit per avaluar la
existència de factors que es puguin relacionar amb
l’aparició d’insuficiència respiratòria. Per aquest motiu
vam fer un estudi de correlació entre el temps d’aparició
de la insuficiència respiratòria un cop inclosos els
pacients dins el projecte i una sèrie de paràmetres de
funcionalisme pulmonar i de la polisomnografia
respiratòria en el moment d’inclusió en el projecte.
Com ja s’ha dit en l’apartat de la metodologia, en
aquesta part de l’anàlisi vam excloure aquells casos
de l’estudi prospectiu que durant el seguiment van ser
inclosos en el grup d’intervenció de l’estudi experimental.
En aquestes circumstàncies, el suport ventilatori era
iniciat abans de l’aparició d’insuficiència respiratòria.
Aquests resultats estan expressats en la taula 6.
Com ja queda reflectit en aquesta taula, l’únic factor
que es va correlacionar de forma significativa en
l’aparició d’insuficiència respiratòria va ser el valor
TC90 de la polisomnografia respiratòria. Aquells
pacients amb valors de TC90 més alts van presentar
insuficiència respiratòria abans que els pacients amb
TC90 més baixos.
Taula 5 n= 22 (&)
Tots aquests valors fan referència al moment d’entrada
dins l’estudi. (*) Coeficient de correlació
d’Spearman. (&) no es van avaluar els pacients que
van abandonar.
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
L’alteració de la funció respiratòria és present en
pràcticament tots els pacients en alguna fase de
l’evolució de la malaltia neurològica i, de fet, en la
majoria de casos la causa de mort es relaciona amb
la insuficiència respiratòria.
Les proves funcionals respiratòries són pronòstiques,
però no són predictives. Aquest fet fa difícil la indicació
de la ventilació d’una manera precoç, atès que
molt sovint l’alteració significativa de la funció
pulmonar es produeix sobtadament.
En el nostre estudi hem vist que la presència d’alteracions
respiratòries durant el son, tot i mantenir un
funcionalisme pulmonar conservat, és indicatiu de
l’aparició en poc temps d’insuficiència respiratòria. Per
tant, aquestes alteracions ens poden servir com a
indicadors sobre quan cal iniciar de manera precoç el
suport ventilatori.
Dins el grup de malalties neuromusculars, caldria
diferenciar aquelles en les quals l’evolució és molt
ràpida, com pot ser l’esclerosi lateral amiotròfica. En
aquesta malaltia l’aplicació del suport ventilatori de
manera precoç augmenta la supervivència. Aquest fet
és força rellevant, ja que es tracta d’una malaltia
ràpidament progressiva i que en l’actualitat no té
tractament, i que condueix a la mort del pacient en un
curt període de temps i en la majoria dels casos per
insuficiència respiratòria.
RECERCA BIOMÈDICA | 89

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
Títol del projecte:
Desenvolupament i caracterització de models murins de
sobreexpressió de gens continguts en la mutació genòmica DUP25,
implicada en els trastorns d’angoixa (pànic)
MEMÒRIA FINAL
1. Resum del projecte original
Els estudis genètics realitzats pel nostre grup han
identificat una mutació genòmica al cromosoma humà
15q24-26, que és un factor de susceptibilitat per
desenvolupar trastorn de pànic i altres trastorns
d’ansietat. L’objectiu principal d’aquest projecte ha
estat l’avaluació dels gens coneguts en la regió
genòmica definida per la mutació DUP25, alguns dels
quals poden ser responsables de les alteracions
fenotípiques observades en el trastorn de
pànic/ansietat i la laxitud articular. S’han generat
ratolins transgènics que sobreexpresen aquests gens.
Els estudis neuropatològics i conductuals d’aquests
models han permès definir l’efecte causal d’aquests
gens en el fenotip pànic/ansietat i constituir models
sobre els quals desenvolupar futures estratègies
terapèutiques per a aquesta patologia. Els objectius
concrets han estat:
1) Desenvolupar models murins de sobreexpresió de
gens continguts en la mutació genòmica DUP25,
característica dels pacients amb pànic/ansietat.
2) Avaluar anatomopatològicament, neurofarmacològi-
Investigador principal
Xavier Estivill Pallejà
Institució
Institut de Recerca Oncològica
27.451.600 PTA
cament i conductualment els models murins d’ansietat
desenvolupats.
3) Dur a terme estudis genètics de models murins de
crisis de pànic/ansietat existents i estudi de les
regions sintèniques humanes que es corresponguin
amb les de l’esmentat model animal.
4) Fer estudis farmacològics mitjançant agents
panicogènics i panicolítics per al tractament de
l’ansietat i altres patologies associades en els models
murins desenvolupats.
S’han desenvolupat models murins per a l’experimentació
genètica i farmacològica de l’ansietat i els
fenotips associats. S’han obtingut diverses línies de
ratolins transgènics que sobreexpressen de forma
individual gens que es troben duplicats en la mutació
genòmica DUP25. Per a la construcció del transgèn
s’ha fusionat el gen NTRK3 amb la regió promotora
reguladora del PDGFB (Platelet-derived growth factor).
Aquest promotor dirigeix l’expressió del transgèn de
manera específica al sistema nerviós central. El
transgèn s’ha microinjectat en oòcits fecundats
seguint protocols estàndard. S’ha analitzat la progènie
després de l’obtenció de DNA genòmic a partir de
fragments de cua de ratolí. S’han generat 4 línies de
ratolins transgènics independents. Per a cadascuna

de les línies s’ha determinat el grau d’expressió del
transgèn quant a RNA mitjançant Northern i quant a
proteïna mitjançant Western i immunohistoquímica.
Els models animals s’han avaluat mitjançant proves
conductuals relacionades amb l’ansietat que inclouen:
la reactivitat en un laberint en creu elevat, el paradigma
de transicions llum-foscor, la prova del reconeixement
olfactiu, les vocalitzacions ultrasòniques produïdes
després de la separació de la mare, les reaccions
respecte d’un predador natural com la rata, la resposta
a ensurt acústic o el patró de conducta en una
prova de camp obert. Es tracta de proves conductuals
sensibles totes al tractament amb fàrmacs de
caràcter ansiolític o panicolític. S’han realitzat estudis
farmacològics en models murins per a l’ansietat utilitzant
agents panicogènics i panicolítics. S’ha analitzat
la resposta dels animals en diverses proves conductuals
emprant fàrmacs panicogènics. S’ha estudiat la
reversió de les conductes ansioses pròpies de l’animal
amb diferents fàrmacs panicolítics.
2. Resultats
Generació de ratolins transgènics TgNTRK3-ki14 i
TgNTRK3
Per a la generació dels ratolins transgènics es va dur
a terme la microinjecció en oòcits fecundats del cDNA
humà d’NTRK3-ki14 (isoforma del gen amb un empelt
de 14aa al domini tirosina cinasa) i NTRK3 (isoforma
sense l’esmentat empelt), ambdós fusionats al
promotor del gen PDGFB, segons la metodologia
descrita. Es va escollir aquest promotor perquè s’ha
demostrat que és capaç de dirigir l’expressió del gen
fusionat de manera específica a cervell. L’anàlisi per
Southern blot va permetre identificar per a la
construcció PDGFB-ßglobina-NTRK3-ki14 tres línies
independents de ratolins transgènics i les altres dues
entre 5 i 10. Per a la construcció NTRK3 es van
obtenir tres línies independents que contenien 2, 2 i
10 còpies, respectivament.
Expressió d’NTRK3 en ratolins TgNTRK3-ki14 i
TgNTRK3
Els estudis d’expressió es van dur a terme en ratolins
TgNTRK3-ki14 i TgNTRK3. Els resultats van
demostrar que Ntrk3 de ratolí i NTRK3 humà
s’expressa, tant a nivell d’RNA, determinat per
tècniques d’RT-PCR, com a nivell de proteïna, com es
va observar després de l’anàlisi per Western blot i
immunohistoquímica. La quantificació dels nivells
d’expressió va permetre estimar que la quantitat de
proteïna en els ratolins TgNTRK3-ki14 és dues
vegades la dels animals control.
Caracterització fenotípica dels ratolins transgènics
S'han analitzat 2 línies de ratolins independents dels
TgNTRK3-ki14 i TgNTRK3, la qual cosa ha permès
detectar possibles efectes causat pel lloc d'integració
del transgèn en el genoma. Per determinar l'efecte de
la sobreexpressió d’NTRK3 en el desenvolupament es
van utilitzar mascles i femelles procedents de 8 llorigades
diferents. Es va emprar el test de Fox que reflecteix
la maduració del sistema nerviós central. En la
prova de redreçament, en la qual es mesura la
latència de l'animal a aconseguir la posició prona
després de col·locar-lo en posició supina, es va
observar una adquisició primerenca de resposta
madura en els ratolins transgènics respecte dels
controls. D'altra banda, els ratolins transgènics van
presentar una desaparició més primerenca dels
reflexos arcaics i una major reactivitat respecte d'estímuls
acústics. En les proves de desenvolupament
neuromotor es va observar una major activitat en els
ratolins transgènics, acompanyada d'una maduració
craniocaudal més ràpida que no sols es reflecteix en
l'adquisició d'una activitat motora madura (marxa),
sinó en la coordinació motora necessària per fer la
prova en la suspensió.
Caracterització general dels TgNTRK3-ki14 i
TgNTRK3
En aquesta fase es fa una avaluació general del
fenotip, que inclou proves sensoriomotores, activitat
exploratòria, conducta social, activitat locomotora en
situacions experimentals diferents, reactivitat emocional
i avaluació de la reacció de pànic/angoixa mitjançant
la prova de Mouse Defense Test Battery. Quan es
van detectar alteracions en alguna d'aquestes proves
inicials, s’aprofundí sobre l'aspecte que es va trobar
alterat, mitjançant el disseny d'una bateria específica
de proves. En les proves que impliquen una situació
aversiva, com ara la prova de llum/foscor (light/dark
test) o el O-maze, els ratolins transgènics mostraven
una major por als espais aversius (la zona desprotegida
de l’O-maze, i la part il·luminada del light/dark box),
amb la latència de pas significativament més gran.
Els ratolins transgènics mostraven més reactivitat en
les proves de reactivitat, tant mitjançant l’administració
d’estímuls acústics, com en les proves clàssiques de
reactivitat emocional. Tanmateix, en tests clàssics
d’ansietat com ara el plus maze, no s’observaren
diferències entre els controls i els transgènics en cap
dels paràmetres estudiats (preferència pels braços
oberts, percentatge de temps en braços
oberts/tancats). La reactivitat incrementada dels
animals respecte d’estímuls sensorials, es va traduir
en un major temor en diversos entorns experimentals.
Estudis esteorològics en TgNTRK3-ki14
En la present anàlisi es va estudiar el volum, el
nombre total de neurones i el nombre de neurones
anti-TH (tirosina hidroxilasa) en el Locus Coeruleus
(LC). Les càlculs dels volums es van obtenir separadament
en mascles i femelles controls vs TgNTRK3ki14.
No es van constatar diferències significatives en
cap dels grups analitzats. La quantificació del nombre
de neurones en l’LC no va mostrar diferències significatives
entre grups, si bé es va observar una tendència
no significativa a presentar una major cel·lularitat
en les femelles respecte dels mascles, tant en el grup
control com en el grup TgNTRK3-ki14. La quantificació
de la població neuronal immunoreactiva respecte
de l'anticòs antitirosina hidroxilasa, marcador de
neurones catecolaminèrgiques, no va mostrar diferències
significatives en el nombre absolut de neurones,
si bé en el grup d'animals transgènics, tant mascles
com femelles, va mostrar una tendència no significativa
a presentar un augment de neurones anti-TH
respecte dels controls. Aquestes tendències van
determinar que el percentatge de neurones noradrenèrgiques
vs neurones totals (100 neurones
AntiTH/neurones totals) estigués incrementat en els
animals TgNTRK3-ki14 respecte dels controls, tot
RECERCA BIOMÈDICA | 91

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
aconseguint aquestes diferències significació estadística
en les femelles, a causa del reduït nombre de
mascles control de què es disposava.
Experiments de microdiàlisi in vivo en TgNTRK3-ki14
En els experiments de microdiàlisi, els nivells
extracel·lulars de serotonina es van determinar mitjançant
microdiàlisi in vivo en ratolins control i TgNTRK3ki14
(pes = 20-25 gr). Els nivells basals no van
mostrar diferències significatives entre ambdós grups.
Després de la recollida de mostres basals durant 1,5
h, es va passar a la infusió a través de la cànula de
diàlisi de KCl (100 mm, 30 min a 1 ml/min). En
aquestes condicions d'estimulació es va produir un
increment (300-400%) significatiu en l'alliberament
presinàptic de dopamina que no va diferir en ambdós
grups experimentals. Aquestes dades indiquen que el
sistema serotoninèrgic conserva la integritat dels seus
mecanismes d'alliberament de neurotransmissor en
els ratolins transgènics, tot suggerint que el sistema
serotoninèrgic no ha estat afectat per la sobreexpressió
de TgNTRK3-ki14. Experiments inicials van
mostrar que la injecció intraperitoneal de dosis baixes
de lactat sòdic (0,5 mEq/kg) produïa un lleuger
increment en la concentració extracel·lular de serotonina
(125%) durant els primers 30 min després de
l'administració, que no s'observava en els animals
transgènics. A dosi més elevada (2,5 mEq/kg), l'efecte
panicogènic dels quals ha estat demostrat en rata, en
animals controls va produir un increment molt
important (1200%) de la concentració extracel·lular de
serotonina, que no va ser observable en ratolins
transgènics, en els quals l'increment aconsegueix
escassament un 300% respecte del valor basal, i sent
la diferència entre ambdós grups molt significativa
(P

Els nostres estudis han permès identificar que el gen
NTRK3 és un bon gen candidat per explicar el fenotip
de trastorn de pànic. Els estudis realitzats ens
informen sobre la patogènia d’aquests trastorns,
alhora que obriran noves possibilitats terapèutiques.
4. Publicacions
M Gratacòs, M Nadal, R Martín-Santos, MA Pujana, J Gago, B
Peral, L Armengol, I Ponsa, R Miró, V Volpini, A Bulbena, X Estivill.
A polymorphic genomic duplication on human chromosome 15 is
a major susceptibility genetic factor for panic and phobic disorder.
Cell 106: 367-379 (2001)
MA Pujana, M Nadal, M Gratacòs, B Peral, K Csiszar, R
González-Sarmiento, L Sumoy, X Estivill. Additional complexity on
human chromosome 15q: identification of a set of novel duplicons
(LCR15) on 15q11-q13, 15q24 and 15q26. Genome Research
11: 98-111 (2001)
L Sumoy, L Carim, M Escarceller, M Nadal, M Gratacòs, MA
Pujana, X Estivill, B Peral. HMG20A and HMG20B map to human
chromosomes 15q24 and 19p13.3 and constitute a distinct class
of HMG-box genes with ubiquitous expression. Cytogenetics Cell
Genetics 88:62-67 (2001)
MA Pujana, L Armengol, M Nadal, M Gratacòs, X Estivill.
Human chromosome 15q-q14 regions of rearrangements contain
clusters of LCR15 duplicons. European Journal of Human
Genetics 10:26-35 (2002)
P Gorwood, J Adès, L Bellodi, E Cellini, D A Collier, D Di Bella,
M Di Bernardo, X Estivill, F Fernandez-Aranda, M Gratacòs, J
Hebebrand, A Hinney, X Hu, A Karwautz, A Kipman, M-C
Mouren-Siméoni, B Nacmias, M Ribasés, V Ricca, C M Rotella, S
Sorbi y J Treasure. The 5HT-2 -1438G/A polymorphism in
anorexia nervosa: a combined analysis of 316 trios from six
european centres. Molecular Psychiatry 7:90-4 (2002)
L Armengol, M Gratacòs, M Nadal, M A Pujana, M Ribassés R
Martín-Santos, X Estivill. 5' UTR-region SNP in the NTRK3 gene is
associated with panic disorder. Molecular Psychiatry 7:928-930
(2002)
RECERCA BIOMÈDICA | 93

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
Títol del projecte:
Estudi de les proteïnes que intervenen en la patogènesi de les distròfies
musculars en la infància i adolescència. Correlacions clíniques,
immunohistoquímiques, bioquímiques i genètiques
MEMÒRIA FINAL
1. Resum del projecte original
Objectius
Com indica el títol del projecte, l'objectiu fonamental
ha estat la valoració mitjançant tècniques d'immunohistoquímia
i d'immunoblot l'expressió de les proteïnes
primàriament deficitàries i causants de les diverses
distròfies musculars en la infància, i també de la
interacció amb altres proteïnes components també del
sarcolema.
Disseny
1. L'anàlisi de les proteïnes es va fonamentar en les
tècniques d'immunohistoquímia i immunoblot, mitjançant
l'ús d'anticossos (Ac) monoclonals específics.
2. El projecte implicava també una anàlisi genètica i
l'establiment d'unes correlacions fenotip-genotip.
3. El material eren els pacients que acudien a
l'Hospital Sant Joan de Déu afectats d’una distròfia
muscular durant els tres anys que ha durat el projecte.
Així mateix, es disposava d'un important nombre de
biòpsies musculars (Banc) de pacients afectats de
diferents distròfies musculars.
Investigador principal
Emilio Fernández Álvarez
Institució
Hospital Universitari Sant Joan de Déu
21.587.500 PTA
2. Resultats
2.1. Expressió i interacció en els dèficits primaris
de distrofina
2.1.1. Fenotip distròfia muscular de Duchenne (DMD).
2.1.1. a- Anàlisi immunohistoquímica:
Es va efectuar l'anàlisi a 30 pacients afectats d'una
distròfia muscular de Duchenne (DMD), però a causa de
l'homogeneïtat dels resultats, se’n van analitzar només
15, els resultats del qual es comenten tot seguit.
La figura 1 esquematitza l'estructura de la membrana
muscular, per facilitar la comprensió del text
Figura 1.

1. Tots els pacients van mostrar una absència total de
distrofina, amb patrons immunohistoquímics d'1 (dins
l’score d'1 a 9), prèviament establert: score =1 dèficit
total; score =8 normalitat; score =9 sobreexpressió.
2. El dèficit de distrofina interaccionava amb tots els
components del complex sarcoglicà, produint dèficits
secundaris.
3. El component -sarcoglicà va ser el que més
dèficits secundaris va presentar, els scores van
oscil·lar entre 3 i 6, malgrat que la majoria de pacients
estaven dins l’score 5.
4. El component -distroglicà estava afectat clarament en
tots els pacients. La majoria van presentar un score de 6.
5. Tots els pacients, llevat d'un, van presentar una
sobreexpressió de la utrofina.
6. Dels 15 pacients, només en 2 el dèficit de distrofina
va produir un dèficit secundari de la merosina (els
scores van ser de 6 en ambdós pacients).
2.1.2. Fenotip distròfia muscular de Becker (DMB).
Els resultats exposats aquí corresponen a l'anàlisi de
17 pacients afectats de DMB.
a) Anàlisi immunohistoquímica
2.1.2.a. Distrofina
Tots els pacients menys 3, amb fenotip benigne
(inclosos en els grups d'afectació I i II), van presentar
un dèficit de distrofina amb els tres anticossos respecte
dels diversos dominis de la distrofina. Es van
observar mínimes diferències dels patrons immunohistoquímics
amb els diferents Ac en un mateix pacient.
La majoria dels pacients presentaven una reducció lleu
de la distrofina, amb els valors de 6 i 7 de l'escala de
valoracions com els més observats. En general, els
pacients menys afectats i inclosos en els grups I i II
presentaven els patrons més conservats, mentre que
en els més afectats, pertanyents al grup IV o outliers,
els patrons immunohistoquímics eren els més afectats.
2.1.2.b. Sarcoglicans
Tots els pacients van presentar almenys un dels
components del complex sarcoglicà alterat, encara
que 12 de 17 van presentar una reducció en els 4
components del complex sarcoglicà. Els components
i α γ -sarcoglicans eren els més reduïts. En general, es
va observar un paral·lelisme entre l'alteració dels
diversos components dels sarcoglicans i la reducció
de la distrofina. Com en la distrofina, es va objectivar
una correlació directa entre els diversos grups clínics i
el grau de disrupció dels patrons.
2.1.2.c. β-distroglicà
Tots els pacients van mostrar una reducció del βdistroglicà,
amb una relació directa amb els patrons
observats en els sarcoglicans i en la distrofina.
2.1.2.d. Utrofina
Una sobreexpressió de la utrofina va ser observada en
13 pacients de 16. No va ser observada en 3
pacients, 2 dels quals pertanyents al grup asimptomàtic.
El grau de sobreexpressió no va ser avaluat, però
en molts pacients aquest semblava més important
que la mateixa reducció de la distrofina.
2.1.2.e. Merosina
Només 1 pacient va presentar una lleu reducció de la
merosina, mentre que la resta de pacients van
mostrar una expressió normal.
2.1.2.f. Caveolin 3
Tots els pacients estudiats van mostrar patrons
immunohistoquímics normals.
b) Anàlisi per Western blot
L'anàlisi de la distrofina es va fer mitjançant l'ús de
l'Ac monoclonal mid rod, tots els components del
complex sarcoglicà, β -distroglicà i merosina.
1. Els valors de la distrofina i del β-distroglicà van ser
els més baixos en relació amb els diversos
components dels sarcoglicans (U Mann-Whitney
p

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
de proteïna causant del dèficit primari (γ-sarcoglicà).
2. Cal destacar que el component γ-sarcoglicà va ser
un dels més reduïts.
3. L'absència de γ-sarcoglicà no sempre va afectar el
component α-sarcoglicà.
4. En alguns casos les deficiències secundàries
s'expressaven en forma de mosaic en els
components α, i β -sarcoglicà.
5. La distrofina i el component δ-sarcoglicà estaven
discretament reduïts.
6. El component β-distroglicà estava totalment
conservat.
7. La utrofina estava sobreexpressada en tots els
pacients en què aquesta va poder ser avaluada (4 de
5 pacients).
2.2.1.d. Dèficit primari de γ-sarcoglicà amb mutació
∆ 521T
1. Només 2 de 4 pacients van mostrar una absència
total de la proteïna en qüestió, tot mostrant els altres
dos dèficits parcials.
2. Només 1 pacient va mostrar una reducció per a la
distrofina amb l'anticòs carboxi-terminal.
3. El component β-distroglicà estava parcialment
reduït en 2 pacients.
4. Un pacient va mostrar una reducció parcial del
component γ-sarcoglicà, amb un patró en mosaic
però sense alterar el component α-sarcoglicà. Un
patró d'interacció semblant va ser observat en aquest
mateix pacient en una biòpsia feta 5 anys més tard,
quan el patró anatomopatològic era molt més distròfic.
La germana d'aquest pacient va presentar un
patró d'interacció semblant al del germà, excepte una
discreta reducció en el component α-sarcoglicà i una
normalitat en el component β-sarcoglicà.
5. La utrofina estava sobreexpressada en tots els
pacients.
2.2.2. Resultat de l'immunoblot
Les troballes obtingudes en el blot corresponien
bàsicament als descrits en la immunohistoquímica. Les
dades de l'immunoblot van ser expressats amb relació
a la banda de miosina obtinguda al gel posblot.
1. La quantitat de α-sarcoglicà va oscil·lar entre 0%
(en el pacient afectat de dèficit de β-sarcoglicà) i el 70
%, amb una mitjana del 20%.
2. El component β-sarcoglicà va oscil·lar entre el 0%,
(pacient amb dèficit primari de β-sarcoglicà) i el 100%,
amb una mitjana del 70%.
3. El γ-sarcoglicà va oscil·lar entre el 0% (en els
pacients amb dèficit primari de γ-sarcoglicà) i el 10%,
amb una mitjana del 5%.
4. El δ-sarcoglicà va oscil·lar entre el 2% i el 100%,
amb una mitjana del 65%.
5. La distrofina va oscil·lar entre el 57 i el 93%, i amb
una mitjana del 65%.
6. La quantitat de β-distroglicà va variar entre el 10% i
el 55% (mitjana del 19%).
2.2.3. Resultats genètics
Els resultats de les mutacions s’esmenten tot seguit:
1) 1 pacient amb deficiència en α-sarcoglicà i mutació
(R77C).
2) 1 pacient amb deficiència en α-sarcoglicà i
mutació (R98H).
3) 1 pacient amb α-sarcoglicà mutació (565-567 ins T).
4) 5 pacients amb la mutació γ-sarcoglicà (C283Y).
5) 4 pacients amb la mutació γ-sarcoglicà ( ∆-521T).
2.3. Dèficit de merosina
Els 7 pacients que clínicament i immunohistoquímicament
eren compatibles amb un dèficit de merosina
van ser enviats per a estudi genètic de lligament al
cromosoma 6q22-23, on es localitza el gen LAMP 2.
De tots ells, només disposem de resultats en una
pacient amb dèficit parcial i imatges atípiques d'afectació
de substància blanca en l’RMN cerebral, en la
qual l'estudi va mostrar un lligament al locus del gen.
Així mateix, es va fer diagnòstic prenatal en una família
amb un fill afectat de distròfia muscular congènita
amb dèficit parcial de merosina, epilèpsia i defectes
de la migració neuronal. L'estudi (un dels primers
realitzats en pacients amb dèficit parcial de la proteïna)
va demostrar per estudi de lligament que el fetus
estava afectat. Després d'avortament terapèutic es va
fer estudi d'expressió proteica els resultats del qual no
van ser concloents.
2.4. Calpaïnopaties
1. Els 4 pacients indicats com a afectats d'un dèficit
de calpaïna 3 van mostrar un selectiu patró muscular
d'afectació, i diferint entre ells tan sols en el grau de
progressió.
2. Es van identificar quatre mutacions
(2362A>GTCATCT) en heterozigosi, la G222R, en
homozigosi, l'heterozigota (R748q., del 4pb 1785-
1788), i la (236AG>TCATCT); S744G també en
heterozigosi.
3. Tots els pacients van presentar una expressió
anormal de la proteïna. Només un pacient va mostrar
una expressió normal de la banda de 94 kDa, però
acompanyada d'una clara reducció dels fragments de
60 i 30 kDa.
4. No es va palesar cap correlació entre l'abundància
de proteïna i la severitat del quadre clínic.
2.5. Distròfia muscular d'Emery-Dreifuss
La figura 2 esquematitza les proteïnes nuclears
en qüestió.
Figura 2.
2.5.1. Forma lligada al cromosoma X.
En una família amb dos pacients homes afectats,
portadors d'una nova mutació (G994>A al lloc donor
splicing de l'exó 4 del gen STA), que havien estat ja
objecte d'una publicació prèvia (Manilal et al., Human
Molecular Genetics 1998), es va fer estudi d’RNA en
línies cel·lulars limfoblastoides (Dra. D. Reca,

Laboratoire de Biochemie et Génetique Moleculaire,
Hôpital Cochin, París), a fi de determinar l'efecte
d'aquesta mutació sobre l'expressió de la proteïna. Es
va demostrar que l’splice anormal produïa una deleció
frameshift en l’mRNA de 134 bp amb un codó stop
prematur en la posició 91 de l'exó 5, tot conduint a
l'aparició d'una proteïna truncada, correlacionant-se
amb l'absència d'emerina demostrada immunohistoquímicament
en múscul, En una família el fenotip de la
qual encaixava amb la malaltia, es va fer estudi
immunohistoquímic d'emerina en múscul que va
confirmar l'absència de la proteïna.
Posteriorment, processades les mostres de DNA per
la Dra. D. Recan, es va confirmar la presència de la
mutació G>A en el codó d'inici de la metionina en el
cas índex, la seva mare i una de les seves germanes.
2.5.2. Forma dominant
1. Els estudis genètics es van estendre a una família
amb fenotip característic i patró d'herència dominant
(mare i les dues filles afectades) practicat per la Dra. G.
Bonne, INSERM, París. Es va confirmar la presència de
la mutació R453W en el gen LMNA A/C en els 3 casos.
2. Una altra família en què la pacient presentava una
clínica compatible i antecedents familiars directes de
mort sobtada (mare i àvia per branca materna) va ser
estudiada per a aquest mateix gen, tot demostrant-se
la presència d'una nova mutació R541H que confirmava
el diagnòstic de la forma dominant d'Emery-
Dreifuss en aquesta família.
2.6. Malaltia de Danon
El seguiment de pacients afectats amb patrons
biòpsics de característiques distròfiques i fenotip
heterogeni va permetre identificar una llarga família de
tres generacions amb diversos membres afectats. La
simptomatologia dels homes era de miocardiopatia,
afectació esquelètica i retard mental. Mentre que
algunes mares patien exclusivament una miocardiopatia.
Orientat el quadre clínic com una possible malaltia
de Danon, es va fer l’estudi genètic del gen LAMP-2 i
la identificació de la proteïna en la biòpsia muscular,
estudis que van ser practicats pels Drs. Nishino I,
Sugie K i Kazuma S, del Department of Ultrastructural
Research National Institute of Neurosciencies, National
Center of Neurology and Psychiatry de Tòquio, Japó.
Estudis genètics: Tots els exons del gen LAMP-2 van
ser seqüenciats igual que els exones flanquejants de
gen en les mostres de DNA. Es va identificar una nova
mutació, la G138A en l'exó 2 del gen LAMP-2.
Aquesta mutació canviava el triptòfan de la posició 43
del codó (TGG) en un codó ‘stop’ (TGA). Els estudis
immunohistoquímics van confirmar una absència total
de proteïna. Els resultats han estat objecte d'una
publicació.
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
La majoria de proteïnes estudiades són components
estructurals de les membranes, ja siguin del sarcolema,
de la membrana interna nuclear o del lisosoma.
Poques són proteases. Com a components de les
membranes, la majoria estan interrelacionades, amb la
qual cosa un defecte primari en una repercuteix o pot
repercutir en una alteració de la resta de proteïnes.
Atès que el dèficit primari de la proteïna no sempre és
total, és de gran interès conèixer l'expressió secundà-
ria de la resta, a fi de poder determinar el defecte
proteic primari i orientar l'anàlisi genètica.
Exposem tot seguit la rellevància i aplicacions
clíniques amb relació a:
1. La proteïna o grup de proteïna estudiat.
2. La malaltia o expressió fenotípica.
1) La proteïna en qüestió: distrofina
a) Distròfia muscular de Duchenne
b) Distròfia muscular de Becker
a) Distròfia muscular de Duchenne
1. En tots els pacients el dèficit de la distrofina va ser
total per als tres Ac.
2. En tots els components del complex sarcoglicà es
va objectivar una reducció, amb especial afectació del
component γ-sarcoglicà.
3. El component β-distroglicà va ser també un dels
més compromesos.
4. Malgrat que en els dèficits primaris de distrofina, la
merosina pot ser parcialment deficitària, això no
provoca dificultats diagnòstiques en els dèficits
parcials de merosina, per l'existència en aquests
d'una normalitat en la distrofina.
5. La repercussió sobre la utrofina va ser clara i
evident. En tots els pacients estava sobreexpressada.
2) Distròfia muscular de Becker
En aquesta malaltia les interaccions adquireixen una
gran importància especialment en contrastar-les amb
les interaccions trobades en els sarcoglicans. Es
poden resumir com segueix:
1. Es va confirmar una acceptable correlació entre
l'expressió de la distrofina i el fenotip. L'expressió de
la distrofina era clarament menor en els fenotips més
greus, mentre que en les formes clínicament més lleus
la reducció de la distrofina va ser molt més discreta.
2. Igualment es va trobar una alteració entre el fenotip
o grau d'afectació clínica i la quantitat de distrofina.
3. El paral·lelisme també es va demostrar entre el
fenotip clínic i el grau de conservació o disrupció dels
diversos components del complex sarcoglicà.
4. La reducció en la distrofina es manifestava amb els
tres anticossos en la majoria dels casos, tot contrastant
amb la mínima afectació de la distrofina en els
dèficits primaris de sarcoglicà. Malgrat tot i respecte
d'un pacient determinat, aquest axioma podria ser
difícil d'acceptar.
5. Igual que en els pacients afectats de DMD, el
component β-distroglicà presentava una alteració
important, tot contrastant considerablement amb
l'alteració trobada en aquest component en els casos
de dèficit primari en algun component del complex
sarcoglicà. Aquesta troballa constitueix un important
factor d'ajuda en el diagnòstic diferencial dels dèficits
primaris en algun component del complex sarcoglicà.
6. En general, el patró d'interacció produït en els
sarcoglicans va ser tan considerable que el diagnòstic
basat en el major defecte proteic va ser difícil de dur a
terme, a causa de la global reducció dels diversos
components dels sarcoglicans.
7. Atès que la merosina es va trobar discretament
reduïda en alguns pacients, cal tenir en compte
aquest esdeveniment en els casos de dèficits parcials
de merosina.
8. Igualment, els estudis efectuats per immunoblot
van permetre establir un paral·lelisme entre el fenotip,
RECERCA BIOMÈDICA | 97

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
el grau de reducció en la distrofina i l'alteració en el
component β-distroglicà.
9. Podríem concloure, doncs, que una reducció dels
sarcoglicans juntament amb una reducció de la distrofina
mitjançant els tres anticossos podria suggerir
l'existència d'un trastorn primari de la distrofina.
10. L'estudi per immunoblot constitueix una important
ajuda en la identificació de duplicacions genètiques.
La sistemàtica avaluació dels pacients va permetre
identificar la presència de duplicacions en diversos
pacients. D'una gran importància diagnòstica va ser la
identificació d'una duplicació en dos germans, nen i
nena, amb clínica complexa i diferent. En el nen hi
havia un retard en el llenguatge i un trastorn de
comportament que traduïa l'existència d'un retard
mental. No obstant això, els dos presentaven una
alteració en les CK sèriques.
11. De la conclusió anterior es desprèn la necessitat
d'incloure en el cribratge del retard mental, l'anàlisi de
la CK sèrica.
12. Cal destacar que en la nostra sèrie de pacients es
va trobar un nombre reduït de delecions, tot contrastant
amb altres sèries publicades. La interpretació
d'aquests resultats està basada en l'existència d'unes
peculiaritats dels pacients que s'inclouen en la sèrie,
com la seva edat pediàtrica i el fet que hagin estat
recollits tots en un hospital pediàtric.
3) Sarcoglicanopaties
1. Malgrat que el nombre de pacients és molt reduït
per poder treure conclusions, els nostres 2 pacients
amb dèficit primari de α-sarcoglicà van ser clínicament
i genèticament heterogenis, tal com ja havia estat
reportat.
2. Tots els pacients afectats d'una deficiència en γsarcoglicà,
independentment del tipus de mutació,
van presentar un fenotip sever.
3. Si bé la proteïna primàriament va estar absent en la
majoria de pacients, en d’altres el dèficit va ser només
parcial.
4. Excepte en el pacient amb dèficit primari de βsarcoglicà,
en què es va objectivar una absència total
de tots els components del complex sarcoglicà, en la
resta de pacients l'alteració no seguia cap patró
característic.
5. Com a conseqüència de l'apartat anterior, una
aproximació diagnòstica del defecte primari basat en
el grau d'alteració dels sarcoglicans no es va poder
fer en tots els pacients.
6. La mutació trobada en el pacient afectat de βsarcoglicà,
consistent en la simple inserció de la timina
en la posició 565-567 del DNA, no havia estat descrita
anteriorment. Si bé no es va poder establir en
aquest pacient una correlació genotip-fenotip, no hi ha
dubte que la severitat del quadre clínic, l'expressió del
β-sarcoglicà i la disrupció de la resta de components
del complex sarcoglicà estan relacionats amb el tipus
de mutació trobada.
4) Calpaïnopaties
1. La confirmació genètica dels nostres pacients va
permetre reafirmar el fenotip del dèficit de calpaïna 3.
2. Al nivell de les extremitats, la feblesa es concentrava
en els serrats, deltoide i bíceps (en l'ordre descrit),
mentre que l'afectació en les extremitats inferiors, per
ordre de severitat van ser: adductors, psoes, isquioti-
bials i glutis, mentre que els quàdriceps estaven molt
més preservats.
3. Els nostres 4 pacients van contribuir a la caracterització
de la calpaïna 3 en els pacients amb mutacions, com
també a la interacció amb altres proteïnes (disferlina).
4. Tots els nostres pacients van mostrar una expressió
anormal de la proteïna detectada en un o diversos
anticossos utilitzats, CALP 3 (94 Kd), CALP 3 (30 Kd),
CALP 3 (60 Kd).
Distròfia muscular Emery-Dreifuss
4.1 Forma X-linked
-1. En tots els pacients (pertanyents a dues famílies
diferents), es va objectivar una absència total d'emerina.
Troballa ja reportada per altres autors.
-2. La presència d'una cardiomiopatia en un dels
casos índex i en algunes de les mares va confirmar
que l'expressió de la proteïna és màxima en el múscul
cardíac, i igualment de la musculatura esquelètica.
-3. L'evidència que la mutació (G994>A), al lloc donor
splicing de l'exó 4 del gen STA, és la responsable de la
patogènesi del quadre clínic, va quedar palesa en
efectuar l'estudi de l'expressió de la mutació en l’mRNA.
4.2 Distròfia muscular Emery Dreifuss forma dominant.
-1. Es van confirmar les dues mutacions, (R453W) i
(R541H) en el gen LMNA, responsables del quadre
clínic en les dues famílies prèviament descrites.
L'última de les quals no havia estat encara reportada.
-2. Els estudis d'expressió de la proteïna al múscul
mitjançant immunohistoquímica van confirmar l'escassa
utilitat diagnòstica en aquesta forma clínica, ja que
si bé la proteïna està reduïda, la producció de proteïna
produïda per l'al·lel sa (malaltia dominant), no permet
establir el diagnòstic.
5) Malaltia de Danon
1. El diagnòstic i l’anàlisi dels pacients va evidenciar
l'existència d'una heterogeneïtat clínica, en particular
de la miocardiopatia.
2. Del treball es desprèn també la importància de
l'estudi patològic i també de la identificació de les
subtils vacuoles per a la sospita diagnòstica.
3. La importància de fer un diagnòstic precoç ve
determinat no sols per establir un consell genètic, sinó
també per prevenir la síndrome de la mort sobtada
que poden presentar aquests pacients.
4. L'estudi de l'expressió de la LAMP-2 en va confirmar
la total absència, com també la causa patogènica
de l'afecció.
5. La mutació G138A tampoc no havia estat descrita.
4. Publicacions
Anderson L.V.B., Davison K, Moss J. A., Richard I, Fardeau M,
Tome F, Hübner C, Lasa A, Colomer J, Beckmann J .
Characterization of Monoclonal Antibodies to Calpain 3 and
Protein Expression in Muscle from Patients with Limg-Girdle
Muscular Dysrophy Type. Am J Patholog, 1998, 153:1169-1179.
Colomer J. Sarcoglicanopatías. Rev Neurol 1999, Jan 16-3;28
(2):150-3 Review. Spanish.
Colomer J, Iturriaga C, Bonne G, Schwartz S, Manilal S, Morris
G.E, Puche M. Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular
dystrophy: a new family with late diagnosis. Neuromuscular
Disorders 2002,12(1): 19-25.
Sugie K, Yamamoto, Murayama K, Colomer J, Iturriaga C, et al.
Clinicopathological features of genetically confirmed Danon
disease. Neurology 2002 (en premsa).

Títol del projecte:
Adenopoliposi familiar: caracterització de gens
involucrats en l’aparició d’adenomes en l’epiteli intestinal
Investigador principal
Antonio García de Herreros Madueño
Institució
Institut Municipal d’Investigació Mèdica
Membres de l’equip
Clara Francí, Josep Baulida, Sandra Guaita, Isabel Puig, Ariadna Vigós, Barbara Motserrat, Crtistina Agustí,
David Casagolda, Judit Grueso i Fran Sánchez-Aguilera
17.000.358 PTA
MEMÒRIA FINAL
1. Resum del projecte original
L’aparició de pòlips en l’intestí de pacients amb
poliposi familiar (FAP) és causada per mutacions en el
gen APC, que produeixen la ruptura de la proteïna
codificada per aquest gen. Alteracions similars en
APC apareixen no només en FAP sinó en tumors
esporàdics de còlon. La generació de pòlips en
l’intestí deguda a la inactivació d’APC està mediada
per β-catenina; l’APC mutat és incapaç de controlar
l’activitat transcripcional de la β-catenina. Així, els
responsables de la gènesi d’adenomes serien gens
activats i inhibits pel complex β-catenina-TCF.
És per això que, originalment, aquest projecte es va
plantejar els objectius següents:
1. Identificació de gens activats pel complex transcripcional
β-catenina-TCF en línies cel·lulars epitelials
intestinals i tumors del mateix origen.
2. Caracterització del paper d’aquests gens i de la
seva implicació en la tumorigènesi colònica.
A fi d'assolir aquests objectius es va idear una estratègia
per a la identificació de gens expressats diferencialment
en cèl·lules amb activitat transcripcional
mediada per β-catenina (BMT) alta i baixa (clons
obtinguts de la línia cel·lular SW-480). En principi, es
va pensar a fer un cribratge de gens expressats en
aquestes cèl·lules amb una sonda sostreta amb cDNA
obtinguts de línies cel·lulars amb baixa BMT.
Posteriorment es comprovaria l'expressió diferencial
dels clons mitjançant Northern Blot i s'identificarien els
gens positius després de la seva seqüenciació.
Malgrat mantenir els mateixos objectius finals, el pla
de treball va ser modificat a causa de la publicació de
diversos articles en el període existent entre la presentació
del projecte i l’acceptació. En aquests articles es
mostraven els resultats de cribratges massius amb
sondes d’mRNA corresponents a gens induïts per -
catenina-TCF-4. Els articles esmentats són els corresponents
als grups del Dr. Vogelstein i col·laboradors
(utilitzant la tècnica del SAGE - Science 281: 1509-12,
1998) i de Mann i col·laboradors (analitzant gene
arrays, PNAS 96: 1603-8, 1999). Per tal de no provar
de competir de manera directa amb aquests grups,
l’orientació del treball va ser modificada, i es plantejaren
uns objectius més concrets.
Per aquesta raó els objectius concrets del projecte van ser:
1. Estudiar la possible regulació del complex
transcripcional β-catenina-TCF-4 de certs gens
concrets. Els gens candidats d’aquest estudis s’han
RECERCA BIOMÈDICA | 99

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
escollit perquè la seva expressió és menor en cèl·lules
transfectades amb baixa activitat de β-catenina-TCF-
4, que no pas aquelles en què l’activitat d’aquest
complex és alta. També s’han volgut caracteritzar
gens que poguessin ser responsables d’algunes
propietats que posseeixen les cèl·lules amb elevada
activitat del complex, per exemple una mobilitat
incrementada. Hem provat també de caracteritzar
l’activitat d’aquests gens i la seva possible rellevància
en el procés de tumorigènesi.
2. Caracteritzar quins altres factors estan modulant
l’activitat del complex β-catenina-TCF-4. Diversos
laboratoris –i entre d’altres, el nostre (Baulida et al.
Biochem. J. 1999, 344: 565-570)– han demostrat que
l’activitat d’aquest complex pot ésser regulada en
cèl·lules que presenten mutacions (truncacions) a la
proteïna APC que la incapaciten per participar en la
degradació de β-catenina. Aquestes dades assenyalen
que hi ha altres factors que presumiblement
regulen el transport de -catenina al nucli o bé la seva
interacció amb el factor TCF-4. Nosaltres hem
estudiat, en concret, factors que possibiliten l’existència
de nivells més elevats de β-catenina lliure, com el
regulador transcripcional snail.
Com he esmentat anteriorment, els objectius finals del
projecte no van canviar. En la meva opinió, les modificacions
van fer que tingués una viabilitat més gran i
que s’incrementessin les possibilitats d’assolir
resultats positius. Crec que els resultats obtinguts
aquest any avalen el canvi d’objectius.
2. Resultats
En aquest apartat només volem resumir els resultats
més importants i definitius.
1. Caracterització del factor transcripcional snail com
a inductor de la transició epiteli-mesènquima.
a) Snail està implicat en la repressió d'E-cadherina que
ocorre en les últimes fases de la tumorigènesi epitelial.
b) Snail reprimeix també l'expressió d'altres gens
específics d'epiteli que contenen caixes CACCTG en
el seu promotor, com MUC-1.
c) L’expressió d’snail modula la transcripció mediada
per β-catenina en cèl·lules epitelials intestinals.
d) Snail indueix l'expressió de gens mesenquimals,
com fibronectina, LEF-1 o ZEB. Aquest darrer gen és
capaç també de reprimir l'activitat del promotor d'Ecadherina
i pot contribuir a la repressió d'aquest gen
observada en cèl·lules mesenquimals o epitelials amb
característiques invasives.
e) Snail indueix l'expressió d’APC i altres gens relacionats
amb mobilitat.
f) L'expressió d’snail s'indueix en aquelles situacions
experimentals en què cèl·lules epitelials són forçades
a desdiferenciar a mesènquima. En concret, en
l'expressió d’snail està involucrada la ruta de transmissió
de senyal en la qual participa la cinasa ILK-1; la
inhibició d'aquesta cinasa restaura l'expressió d'Ecadherina
alhora que disminueix snail.
g) Snail cicla entre el nucli i el citosol en cèl·lules
epitelials i mesenquimàtiques. La sortida del nucli està
controlada per la fosforilació d'una seqüència específica
rica en serines.
2. Regulació de l’activitat de la β-catenina com a
coactivador transcripcional.
a) L'estructura de la β-catenina està controlada per la
fosforilació d'un residu de tirosina situat en l'últim
armadillo repeat de la molècula. La presència
d'aquesta modificació provoca que la cua carboxilterminal
disminueixi la seva activitat pel domini central
d'aquesta proteïna i quedi així accessible a altres
cofactors responsables de l’activació transcripcional.
b) La activitat del complex -catenina-TCF-4 està
controlada també per la placoglobina, una proteïna
similar a la β-catenina capaç d’unir-se també a TCF-4.
La placoglobina s’uneix al TCF-4 en una seqüència
propera a la responsable d’unir la β-catenina i
impedeix la interacció del complex TCF-4 amb el DNA.
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
El projecte va ser plantejat amb l'objectiu d'obtenir
resultats d'interès bàsic. Encara que l'estudi no tenia
aplicabilitat a curt termini, els nostres resultats ofereixen
certes perspectives d'ús pràctic. El nostre estudi
ha permès caracteritzar el paper d'un nou gen, snail,
l'expressió del qual modula el procés d'invasió
tumoral. De fet, la possible utilització d'aquest gen
amb fins diagnòstics del grau d'invasió d'un tumor, o
per a la determinació de cèl·lules metastàstiques
circulants, ha estat recentment plantejada per diversos
autors.
A més, el nostre estudi s'ha dirigit també a determinar
com es regula l'activitat transcripcional de la -catenina,
fins a l'any passat l'únic blanc conegut de l'acció
del gen APC. Recentment s'ha descrit l’acció d’APC
en l’estabilització de microtúbuls i, de manera menys
evident, una implicació d'aquest gen en la migració
cel·lular. Les nostres dades, tot indicant que un gen
clau en l'adquisició de mobilitat com és snail indueix
l’expressió d’APC, donen suport a la hipòtesi que
aquest gen està implicat en moviment cel·lular.
Hem pogut caracteritzar també la placoglobina com
un regulador negatiu de l'activitat transcripcional de la
-catenina i entendre millor com es modula la interacció
d'aquesta proteïna amb altres efectors implicats
en aquesta activitat.
Per tot això, creiem que els resultats són particularment
rellevants per entendre com mutacions en el gen APC
donen lloc a la formació d’adenomes i són necessàries
per a ulteriors fases del procés de tumorigènesi colònica.
4. Publicacions
Batlle, E.; Sancho, E.; Francí, C.; Domínguez, D.; Monfar, M.;
Baulida, J.; García de Herreros, A. "Snail is a repressor of Ecadherin
gene expression in epithelial tumor cells". Nature Cell
Biology, 2, 84-89 (2000).
Tan, C.; Costello, P.; Sanghera, J.; Domínguez, D.; Baulida, J.;
García de Herreros, A.: Dedhar, S. "Inhibition of integrin-linked
kinase (ILK) suppresses -catenin-Lef/Tcf-dependent transcription
and expression of E-cadherin repressor, snail, in APC (-/-) human
colon carcinoma cells". Oncogene, 20, 133-136 (2001).
Piedra, J.; Martínez, D.; Castaño, J.; Miravet, S.; Duñach, M.*;
García de Herreros, A.* (*ambdós autors signen com a autors per a
correspondència) "Regulation of ß-catenin structure and activity by
tyrosine phosphorylation". J. Biol. Chem. 276: 20436-20443 (2001).
Miravet, S.; Piedra, J.; Miró, F.; Itarte, E.; García de Herreros,
A.*; Duñach, M.* (*ambdós autors signen com a autors per a
correspondència) "The transcriptional factor Tcf-4 contains
different binding sites for -catenin and plakoglobin". J. Biol.
Chem. 277, 1884-189 (2002).

Títol del projecte:
Caracterització molecular de les mutacions en els gens
de l’HMG-CoA liasa i HMG-CoA sintasa mitocondrial
que causen deficiències genètiques hereditàries
Investigador principal
Fausto García Hegardt
Institució
Facultat de Farmàcia. UB
Membres de l’equip
Fausto García, Antonio G. Cordente, Dolors Serra, Maria Irene Vázquez, David Sebastián, Assia Bentevibel,
Guillem Plasencia, Guillermina Asins i Laura Herrero
22.359.475 PTA
MEMÒRIA FINAL
1. Resum del projecte original
Objectius principals
1) Anàlisi molecular de les mutacions presents en els
gens de l’HMG-CoA liasa i HMG-CoA sintasa
mitocondrial responsables de l’acidúria 3-hidroxi-3metil
glutàrica i de la deficiència en HMG-CoA sintasa
mitocondrial.
2) Estudi de la distribució de mutacions responsables
d’aquestes deficiències genètiques en la població
mediterrània, europea, espanyola i catalana.
3) Estudi de la implicació del canvi G109T del gen de
l’HMG-CoA liasa en el procés d’splicing.
4) Fixació del fenotip corresponent a la deficiència en
HMG-CoA sintasa mitocondrial, encara no descrit fins ara.
Objectiu secundari
5) Conèixer noves mutacions que determinin aminoàcids
encara no descrits com a importants per a l’activitat
d’aquests dos enzims. Estudi cinètic de l’activitat
enzimàtica mitjançant mutagènesi dirigida i sobreexpressió
en cultius cel·lulars, en cas que es consideri
interessant.
Disseny i procediments
Pacients. Els pacients són obtinguts mitjançant els
contactes que té el nostre grup amb hospitals i
laboratoris de referència de tot Europa. Els estudis
bioquímics són realitzats al laboratori de referència per
distingir la deficiència en HMG-CoA liasa i la deficiència
en HMG-CoA sintasa. També es mesura l’activitat
HMG-CoA liasa a partir de fibroblasts i, si és possible,
l’activitat HMG-CoA sintasa que solament es pot
realitzar a partir d’una biòpsia de fetge (teixit que
expressa aquest gen).
Anàlisi de les mutacions. Per a l’estudi de les
mutacions presents en els gens HMG-CoA liasa o
HMG-CoA sintasa mitocondrial s’utilitza el DNA
obtingut a partir de mostres de sang, o bé l’RNA
purificat a partir de cultius de fibroblasts obtinguts per
biòpsia de pell dels pacients i individus control. A
partir del DNA genòmic s’amplifica cadascun dels
exons dels gens i se’n determina la dimensió i se’n fa
la posterior seqüenciació automàtica. Quan és
possible obtenir RNA, llavors mitjançant la tècnica
d’RT-PCR s’amplifiquen fragments solapants de tot el
cDNA i es també se’n determina la mida i es fa la
posterior seqüenciació.
No es realitzen estudis d’SSCP perquè els dos gens
RECERCA BIOMÈDICA | 101

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
tenen una llargada tan curta (1600 bp) que permet la
seqüenciació directa de tots els fragments amplificats.
Les mutacions determinades per seqüència, són
recomprovades per anàlisi de restricció.
Estudis d’expressió. Si es considera necessari s’estudia
l’expressió endògena dels gens mutats en els
cultius de fibroblasts mitjançant les tècniques de
Northern i Southern.
Mesurament de l’activitat enzimàtica. Si es considera
interessant se sobreexpressen els cDNA mutats i
control per determinar la pèrdua d’activitat que
produeix la mutació en cada cas. Per a això cal fer
una mutagènesi dirigida adequada en el plàsmid
d’expressió control, transfectar cèl·lules eucariotes
(cel·lules cos-7) i determinar l’activitat enzimàtica.
Alternativament, l’activitat enzimàtica HMG-CoA
sintasa es pot determinar mitjançant la transfecció de
les cèl·lules Mev-1 (cèl·lules deficients en HMG-CoA
sintasa i, per tant, auxòtrofes pel mevalonat) amb el
cDNA mutat o salvatge i determinar la seva capacitat
de supervivència en un medi deficient en mevalonat.
Pla de treball
- El diagnòstic molecular de les deficiències en HMG-
CoA liasa i HMG-CoA sintasa mitocondrial en els
pacients prèviament diagnosticats bioquímicament es
farà durant els 3 anys del projecte.
- La definició del fenotip dels pacients amb deficiència
en HMG-CoA sintasa mitocondrial es durà a terme
entre el segon i tercer any del projecte.
- L’estudi de l’splicing alternatiu provocat per la
mutació G109T en el gen de la HMG-CoA liasa es
farà entre el segon i tercer any del projecte.
- La determinació dels aminoàcids implicats en la unió
al substrat, i l’estudi de l’estructura tridimensional dels
enzims HMG-CoA liasa i HMG-CoA sintasa mitocondrial,
es durà a terme el tercer any del projecte.
2. Resultats
1. Anàlisi molecular de les mutacions presents en
els gens HMG-CoA liasa i HMG-CoA sintasa
mitocondrial HMG-CoA liasa
Pacient 1 (origen marroquí): deleció homozigota de 2
T en l’exó 9 del gen que comporta un canvi en el
marc obert de lectura i la formació d’una proteïna
truncada.
Pacient 2 (argentí): mutació Asp204Asn en els dos
alels. Es tracta d’una mutació nova, molt pròxima al
centre actiu (His 233) en el model tridimensional predit
per a la proteïna.
Pacient 3 (anglès): gran deleció en els 2 alels que
abasta des dels exons 2 al 7 inclosos. Es tracta d’una
mutació nova.
Pacient 4 (anglès): mutació Ser201Tyr en els 2 alels.
Es tracta d’una mutació nova, que afecta l’entrada del
substrat segons el model tridimensional predit per a la
proteïna.
Pacient 5 (anglès): inserció de una G en l’exó 8 que
afecta la Leu285. Produeix un canvi en el marc de
lectura de l’mRNA. Es tracta d’una mutació heterozigota
nova. En l’altre alel s’ha trobat el canvi d’una G
per una A en la posició 4 de l’entrada d’intró 5.
Aquesta segona mutació també és nova i provoca
l’aparició d’un patró d’splicing anormal en què apareix
de forma clara un transcrit amb la deleció de l’exó 5.
Pacient 6 (germà): mutació homozigota missense
S75R. Es tracta d’una mutació nova, que afecta
l’entrada del substrat al centre actiu segons el model
tridimensional predit per a la proteïna.
Pacient 7 (marroquí): no s’ha trobat cap mutació en
cap dels 2 alels.
Pacient 8 (italià): presenta dues mutacions noves, una
de tipus heterozigot S25F, i l’altra de tipus homozigot
Gly203Glu. La primera de les mutacions és molt
propera al punt de tall del pèptid senyal de transport a
mitocòndries. La segona de les mutacions és molt
propera al centre actiu de la proteïna.
Pacients 9, 10 i 11 (espanyols): homozigots per la
mutació mediterrània (G109T) que introdueix un codó
d’aturada. En els tres pacients l’estudi d’RT-PCR
revela la presència d’un splicing alternatiu de l’exò 2,
tal com està descrit en la literatura.
Pacients 12 i 13 (pakistanesos): homozigots per la
mutació G109A (E37K). Es tracta d’una mutació nova,
atès que tot i afectar el mateix nucleòtid que la
mutació mediterrània, el canvi que introdueix és una
adenina en comptes d’una timina.
Pacient 14 (espanyol): homozigot per la mutació nova
T575C (F192S).
Pacient 15 (francès): homozigot per la mutació nova
A598T (I200F).
Pacient 16 (francès): heterozigot per la mutació
mediterrània, i heterozigot per la deleció CT de l’exò 6.
Diagnòstic prenatal a partir d’amniòcits: mare i pare
espanyols heterozigots per la mutació mediterrània.
Resultat: el fetus és heterozigot per la mutació mediterrània
i, per tant, no presenta la malaltia.
HMG-CoA sintasa mitocondrial
Pacient 1 (alemany): heterezigot per les mutacions
G212R i R500H. La mutació G212R és d’origen
patern i la mutació R500H d’origen matern. Ambdues
mutacions s’ha demostrat que produeixen una pèrdua
de funcionalitat de l’enzim per transfecció de les
cèl·lules Mev-1 (cèl·lules deficients en HMG-CoA
sintasa) i incapacitat de revertir el fenotip (auxotrofisme
pel mevalonat).
Pacient 2 (alemany): heterozigot per les mutacions
G212R i IVS5+1g>a. La segona mutació produeix una
alteració de l’splicing normal (pèrdua de l’exò 5) i dóna
lloc a una proteïna no funcional.
Pacient 3 (anglès): heterozigot per les mutacions
R188H i M307T, la primera d’origen matern i la
segona d’origen patern. Un germà del pacient 2 és
heterozigot per la mutació M307T.
Pacient 4 (anglès): és un germà del pacient anterior al
qual se li ha diagnosticat la malaltia a nivell genètic
(heterozigot per R188H i M307T) però no se li havia
fet el diagnòstic bioquímic ni clínic amb anterioritat.
Població control: també s’ha realitzat un estudi sobre
100 individus control alemanys per determinar la
presència d’heterozigots per les mutacions G212R i
R500H. No s’ha trobat cap heterozigot per cap de les
dues mutacions.
2. Estudi de la distribució de les mutacions més
freqüents en la població mediterrània, europea,
espanyola i catalana
Els estudis realitzats amb els pacients de l’àrea mediterrània
revelen la presència de les dues mutacions més
freqüents: l’anomenada mutació mediterrània
(c109G>T) i la deleció CT 504-5 de l’exó 6.
La mutació mediterrània es troba en 11 pacients: 1

marroquí, 1 turc, 2 portuguesos (un d’ells de nacionalitat
francesa) i 7 espanyols. De tots ells, 9 són
homozigots i 2 heterozigots. En total són 20 els alels
afectats per aquesta mutació.
A la Península ibèrica s’han descrit 3 mutacions
diferents en un total de 10 pacients: 8 tenen la
mutació mediterrània (6 homozigots i 2 heterozigots).
A Catalunya encara no es disposa de cap pacient que
pateixi aquesta deficiència.
La deleció CT 504-505 es troba en 3 pacients (1
homozigot i 2 heterozigots) que tenen en l’altre alel la
mutació mediterrània. Dos dels pacients són d’origen
espanyol i l’altre portugués.
Així doncs, la mutació mediterrània, descrita per
primera vegada pel nostre grup, esdevé la mutació
més nomenada a la bibliografia, i també la mutació
més freqüent a la Península ibèrica.
3. Estudi del patró d’splicing diferencial produït
per les mutacions en el gen de l’HMG-CoA liasa
S’ha estudiat l’splicing constitutiu amb mRNA d’individus
control. Els resultats mostren, a més del transcrit
normal, un transcrit amb la deleció dels exons 5 i 6, i
un altre transcrit amb la deleció dels exons 5, 6 i 7.
Els percentatges dels transcrits alternatius són petits,
per sota del 10%.
Les mutacions estudiades, molt sovint potencien l’splicing
constitutiu alternatiu i, en alguns casos, generen
nous transcrits.
La mutació mediterrània (c109G>T), produeix un nou
splicing alternatiu amb un transcrit normal que és
quantitativament el més important, i que conté un
deleció de l’exó 2. Tots els pacients amb aquesta
mutació presenten el mateix patró.
La mutació c602G>A, trobada en el pacient 4
d’origen anglès, produeix un increment de l’splicing
constitutiu alternatiu. Així, a més de presentar el
transcrit normal, presenta dos transcrits alternatius, un
amb la deleció dels exons 5 i 6, i l’altre amb la deleció
dels exons 5, 6 i 7.
La mutació c598A>T , trobada en el pacient 15
d’origen francès, produeix també un increment de
l’splicing constitutiu, per bé que no tan intensament
com en el pacient anterior. Probablement la proximitat
espacial de les dues mutacions c602 i c598 està
relacionada amb els efectes semblants que aquestes
dues mutacions provoquen sobre l’splicing.
Les mutacions trobades en el pacient 5, d’origen
anglès, originen un splicing alternatiu amb 4
transcrits: un normal, un amb deleció de l’exó 5, un
altre amb deleció de l’exó 5 i 6, i un amb deleció dels
exons 5, 6 i 7.
En el pacient 16 d’origen francès es troben dues
mutacions que ja han estat descrites pel nostre grup,
la mutació mediterrània i la deleció CT 504-505 de
l’exó 6. L’splicing que generen aquestes mutacions és
la superposició dels patrons d’splicing de cada una de
les mutacions per separat. Així trobem la presència
d’un transcrit normal, un transcrit amb la deleció de
l’exó 2, un transcrit amb la deleció de l’exó 6 i un
transcrit amb la deleció dels exons 5 i 6.
4. Fixació del fenotip corresponent a la deficiència en
HMG-CoA sintasa mitocondrial, no descrit fins ara.
- De l’estudi de tots els pacients que hem analitzat al
nostre laboratori, i en col·laboració amb el Dr.
Jophannes Zschocke d’Alemanya, hem proposat el
fenotip següent per a la deficiència en HMG-CoA
sintasa mitocondrial humana:
- El primer episodi de la malaltia té lloc el primer any
de vida, en forma de coma hipoglucèmic esdevingut
després d’una gastroenteritis, diarrea i escassa
ingesta d’aliment durant un o pocs dies.
- El nivells d’acilcarnitines en sang és normal. És
l’única patologia de la utilització d’àcids grassos que
presenta nivells normals d’acilcarnitina en dejú.
- Els nivells d’àcids grassos lliures en sang són
superiors als observats en una persona normal en
dejuni de 24 hores.
El patró d’àcids orgànics en orina és inusual però
característic d’aquests pacients, amb una elevada
presència d’àcids dicarboxílics i metabòlits mitocondrials
i la total absència de cossos cetònics.
- Els estudis de la tolerància al dejuni demostren que
és molt curta (al voltant de 12 hores), inferior a la que
provoquen les altres malalties de la via de degradació
dels àcids grassos.
- La deficiència en HMG-CoA sintasa mitocondrial no
sembla que afecti cap teixit de rellevància (fetge o
múscul cardíac), no interfereix en el metabolisme
energètic de la mitocòndria i en general es manifesta
com una malaltia lleu sempre que s’evitin els episodis
de dejuni.
- El diagnòstic de la malaltia pot ser difícil si no es recullen
les mostres adequades (sang i orina) durant l’episodi
d’hipoglucèmia i són acuradament interpretades.
- L’estudi de les mutacions genètiques a partir d’una
mostra de sang es presenta com el millor mètode per
confirmar el diagnòstic bioquímic, perquè la mesura
de l’activitat enzimàtica exigiria una biòpsia de fetge,
difícil d’obtenir.
5. Conèixer noves mutacions que determinin aminoàcids
encara no descrits com a importants per a l’activitat
dels dos enzims.
Amb aquest propòsit s’han seguit els punts següents:
a) Predicció de l’estructura tridimensional de l’HMG-
CoA liasa humana i de l’HMG-CoA sintasa mitocondrial.
La identitat entre les seqüències d’aminoàcids de la
família de proteïnes HMGL-like (de la qual la HMH-
CoA liasa humana és membre) i la proteïna hisA de
Thermotoga maritima (l’estructura de la qual es coneix
per cristal·lització) ens ha permès construir un model
tridimensional per a la proteïna HMG-CoA liasa
humana utilitzant com a motlle el cristall de la hisA de
T. maritima.
L’estructura tridimensional predita per a l’HMG-CoA
liasa humana és l’estructura de TIM barril formada per
un barril (alfa-beta)8 amb les fulles beta a l’interior i les
hèlixs alfa a l’exterior. En aquest model la cavitat
interna del barril presenta una concordança perfecta
amb l’estructura del substrat (hidroximetilglutaril-CoA)
en l’espai. En aquest model la histidina 233 (centre
catalític) queda en la part baixa de la cavitat interior,
just on s’hi ha d’assentar la part activa del substrat.
Per a la determinació del model estructural de l’HMG-
CoA sintasa mitocondrial humana hem utilitzat el
cristall de la beta-cetoacil ACP sintasa (el primer
enzim de la via de síntesi d’àcids grassos). L’HMG-
CoA sintasa mitocondrial i la beta-cetoacil ACP
sintasa presenten una elevada similitud en la seqüència
d’aminoàcids. Els dos enzims presenten la cisteïna
del centre actiu conservada.
RECERCA BIOMÈDICA | 103

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
L’estructura tridimensional predita per a l’HMG-CoA
sintasa presenta una cavitat interior, on s’escau la
cisteina 166 (centre actiu) i per on està previst que
entri l’acetoacetil-CoA.
b) Identificació dels aminoàcids importants per a l’activitat
i l’estructura dels enzims.
En el cas de l’HMG-CoA liasa, s’han localitzat en el
model estructural totes les mutacions missense
descrites fins al moment. En tots els casos les
mutacions descrites afecten aminoàcids de les fulles
beta que configuren la cavitat central.
El model ens ha permès hipotetitzar l’efecte que
produirien les diferents mutacions sobre l’activitat
enzimàtica.
Les mutacions R41Q, D42H, D204N, H233R i L263P
provoquen una canvi en l’entorn electroquímic del
centre actiu, probablement provocant una disminució
de la Kcat.
Les mutacions V70L, S75R i S201Y provoquen un
bloqueig en l’entrada del substrat a la cavitat central i
probablement provoquen un augment de la Km de
l’enzim.
En el cas de l’HMG-CoA sintasa mitocondrial, el
model tridimensional ens ha revelat la presència
d’alguns aminoàcids a una distància molt curta
(menys de 4 Angstroms) respecte de la Cys266.
Aquest aminoàcids són: Phe241, Leu263, Asn380,
His301 i la Met301 (aminoàcid mutat en un pacient).
c) Expressió dels cDNA salvatges i mutats i determinació
de les cinètiques enzimàtiques.
Per comprovar que els aminoàcids identificats en el
model provoquen els canvis esperats en l’activitat dels
enzims, es va decidir expressar els enzims salvatges i
mutats, i estudiar les cinètiques enzimàtiques.
En el cas de l’HMG-CoA liasa, el sistema d’expressió
escollit va ser l’expressió de la proteïna madura en
E.coli i determinació de l’activitat en extracte cru. Els
resultats són els següents: les mutacions S75R i
S201Y provoquen la pèrdua total de l’activitat de
l’enzim, probablement perquè impedeixen l’entrada
del substrat a la cavitat interior de l’enzim. En canvi, la
mutació D204N provoca una pèrdua d’activitat del
30%, una disminució important de l’estabilitat de la
proteïna expressada i un augment de la Km.
Probablement, el canvi de càrrega que comporta la
mutació d’un aspàrtic per una glutamina, interfereix en
l’activitat catalítica de l’enzim, alhora que repulsa
l’entrada del substrat.
En el cas de l’HMG-CoA sintasa mitocondrial, es va
provar d’expressar la proteïna en cèl·lules COS, però no
es van obtenir suficients nivells de proteïna soluble per
fer les cinètiques enzimàtiques. En aquests moments
s’està posant a punt el sistema d’expressió en llevats
(Saccharomyces cerevisae). Si la proteïna expressada és
soluble i activa es farà l’expressió dels mutants.
Consideració final
En aquest moment es tenen determinades les
mutacions genètiques en tots els pacients afectats
d’una deficiència en la via de la cetogènesi (enzims
HMG-CoA liasa o HMG-CoA sintasa mitocondrial) que
han arribat al nostre laboratori de diferents laboratoris
de referència d’Europa i Amèrica del Sud.
D’altra banda, s’ha pogut determinar que hi ha una
mutació (c109G>T) que és la més freqüent en la
població mediterrània, i en concret, a Espanya.
També s’ha pogut esbrinar que el gen de l’HMG-CoA
liasa pateix un splicing diferencial que es veu modificat
segons la mutació genètica.
Per primera vegada s’ha definit el fenotip associat a la
deficiència en HMG-CoA sintasa mitocondrial.
Finalment, s’ha realitzat un esforç important en la
determinació de l’estructura tridimensional dels
enzims i en la determinació dels aminoàcids
importants en la relació estructura-funció.
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
1. L’estudi de les mutacions presents en els gens de
l’HMG-CoA liasa ens ha permès conèixer que en el
gen de l’HMG-CoA liasa hi ha una mutació que té una
freqüència majoritària en la població mediterrània en
general, i a Espanya en concret, que és la mutació
c109G>T, que nosaltres hem denominat mutació
mediterrània.
2. L’estudi de les mutacions en el gen de l’HMG-CoA
sintasa mitocondrial ens ha permès definir, per
primera vegada, el fenotip associat.
3. La descripció acurada del fenotip (clínic i bioquímic)
ha permès de fer amb certesa el diagnòstic bioquímic
de la malaltia i que no passi desapercebuda, com
s’esdevenia fins ara la majoria de les vegades. El no
diagnòstic de la malaltia suposa un risc greu (coma
hipoglucèmic, i fins i tot la mort) per al pacient
després d’un període de dejuni relativament curt (a
partir de 12 hores de dejuni). Pel contrari, el diagnòstic
primerenc de la deficiència suposa la prevenció dels
períodes de dejuni i una vida completament normal
per al pacient.
4. La definició de l’estructura tridimensional de l’enzim
i dels efectes que provoquen les diferents mutacions
en l’estructura i l’activitat de l’enzim, representen una
contribució important en el camp de les relacions
estructura-funció de les proteïnes.
5. Per primera vegada, s’ha definit el fenotip associat
a la deficiència en HMG-CoA sintasa mitocondrial.
4. Publicacions
Rosa Aledo, Johannes Zschocke, Juan Pié, Cecilia Mir, Sonja
Fiesel, Ertan Mayatepek, Georg F. Hoffmann, Núria Casals &
Fausto G. Hegardt. Genetic basis of mitochondrial HMG-CoA
synthase deficiency. Human Genetics (2001) 109:19-23.
Johannes Zschocke, Josef M Penzien, Rose Bielen, Nùria
Casals, Rosa Aledo, Juan Pié, Georg F. Hoffmann, Fausto G.
Hegardt i Ertan Mayatepek. Diagnosing mitochondrial HMG-CoA
synthase deficiency. The Journal of Pediatrics (2002) 140, 778-780.
Nuria Casals, Paulino Gómez-Puertas, Juan Pié, Ramón Roca,
Cecilia Mir, Rosa Aledo, Beatriz Puisac, Dolors Serra, Guillermina
Asins, Jacqueline Till, Alun C. Elias-Jones, Juan C. Crespo,
Nestor Chamoles, José E. Abdenur, Ertan Mayatepek, Guy
Besley, Alfonso Valencia, y Fausto G. Hegardt. The proposed ( )8
barrel structure of HMG.-CoA lyase as a framework for the
functional interpretation of missense mutations producing 3hydroxy-3-methylglutaric
aciduria (enviat per publicar al J. Biol.
Chem. i tornat per a revisió 2003).
Juan Pié, Nuria Casals, Beatriz Puisac y Fausto G. Hegardt.
Molecular Basis of 3-hydroxy-3-methylglutaric aciduria (mini-review
per invitació). Journal of Physiology and Biochemistry (2003).

Títol del projecte:
Disseny i síntesi de dendrímers peptídics per a l’administració
pulmonar de fàrmacs en malalts de fibrosi quística
Investigador principal
Ernest Giralt Lledó
Institució
Facultat de Química. UB
Membres de l’equip
Fernando Albericio, Miquel Pons, MIreia Royo i Ernest Giralt
25.830.000 PTA
MEMÒRIA FINAL
1. Resum del projecte original
Objectius de l’estudi
El present projecte té com objectiu el disseny i la
síntesi d’un carrier polimèric que permeti l’administració
pulmonar de fàrmacs en malalts de fibrosi quística.
Aquest carrier polimèric ha de tenir propietats aerodinàmiques
adients i al mateix temps permetre un
alliberament lent i perllongat del fàrmac en el teixit
pulmonar.
Aquest objectiu general es pot desglossar en
diversos objectius metodològics concrets:
1) Disseny, síntesi i estudi de les propietats físiques
d’una nova família de polímers basats en cadenes de
poliprolina. Optimització de la seva grandària i propietats
aerodinàmiques per aconseguir una deposició
total en el pulmó utilitzant dispositius DPI (inhaladors
de pols seca).
2) Estudi d’interacció fàrmac-polímer. Utilització dels
canvis conformacionals poliprolina I-poliprolina II per
atrapar fàrmacs en l’interior del polímer en un entorn
no aquós i químicament inert.
3) Estudi de la biodegradabilitat dels nous polímers.
Modulació de la seva estabilitat enfocat a la digestió
de proteases amb l’objectiu d’optimitzar l’alliberament
progressiu del fàrmac.
4) Avaluació preliminar de l’eficàcia terapèutica dels
nous polímers en el tractament de la fibrosi quística.
Modulació de l’activitat antimicrobiana d’antibiòtics
atrapats en el polímer. Utilització de sistemes model.
Breu síntesi del disseny, els procediments i els
mètodes descrits en el projecte original per tal d’assolir
els objectius esmentats
La biocompatibilitat, requeriment indispensable per a
un polímer que es vulgui fer servir com a carrier, no és
precisament una propietat destacable dels dendrímers
descrits fins ara. En aquest projecte s’ha dissenyat i
sintetitzat una nova família de dendrímers basats en
seqüències de poli(Pro), biodegradables per l’acció de
proteases dels teixits on es dipositen i perfectament
biocompatibles. A més a més es pretén aprofitar el
peculiar comportament d’aquest poliaminoàcid que
pot adoptar dues conformacions diferents, conegudes
com formes I i II. Les dues estructures secundàries
són helicoïdals i difereixen de les seves propietats
físiques i espectroscòpiques. Mentre que la forma I
presenta una disposició cis i és destrògira, la forma II
presenta una disposició trans i és levògira.
D’aquesta manera, l’hèlix trans està estesa i la cis és
RECERCA BIOMÈDICA | 105

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
més compacta i el dissolvent és allò que fa que adopti
la forma I i II. Així, segons el solvent podem obtenir un
nou polímer reticulat concèntricament que podrà tenir
l’habilitat de variar la mida i la forma, propietats
característiques útils per a l’encapsulament del fàrmac
sense l’ajut d’additius i per a les propietats aerodinàmiques
de la partícula final. Aquests nous compostos
estan formats per tres tipus d’unitats sintètiques
diferents: una molècula de simetria concreta
convenientment polifuncionalitzada que el treball de
nucli (a) sobre la qual s’ensamblen unitats sintètiques
de mida definida (b) que farien la funció de branques
del dendrímer i unes unitats trifuncionals (c) que
incorporades a l’extrem de les branques fan la funció
de ramificador sobre les quals s’incorporaran noves
unitats b, tot obtenint un polímer de diversos nivells
d’elongació en funció del nombre de vegades que
introduïm les unitats de síntesi b i c (figura1). Disposar
de diverses unitats a, b i c dóna lloc a un nombre
elevat de nous polímers que poden tenir diferents
característiques.
Un cop vist que el caràcter de xarxa modulable que
puguin tenir aquests nous polímers és útil per
encapsular el fàrmac, la seva alliberació vindrà donada
de manera espontània en produir-se la degradació del
polímer per proteases i el fenomen lent d’alliberament
vindrà marcat per la concentració de proteases en el
teixit diana i per la peculiar seqüència escollida
(poliPro).
Figura 1. Representació esquemàtica d’un dendrímer.
L’estratègia sintètica associada amb la preparació
d’un dendrímer consta de les etapes següents:
i) Elecció i síntesi del nucli o "core" (a). Aquesta etapa
és fonamental per definir la grandària i la forma del
polímer final.
ii) Definició i preparació de les subunitats trifuncionals
(c). En ser cadenes de poliprolina II la base d’aquests
polímers dendrítics, les subunitats b estaran formades
majoritàriament per L-prolina, mentre que les espècies
que donaran lloc a les ramificacions seran cis-4amino-L-prolina
(Amp) [àcid (2S,4S)-4-amino-1-pirrolidina-2-carboxílic].
Un dels avantatges addicionals que posseeix la utilització
dels residus de prolina i d’aminoprolina és que
permet utilitzar l’experiència adquirida en el nostre
grup en la síntesi de pèptids. De la mateixa manera,
l’esquema "protecció-desprotecció" serà el mateix
que el que s’utilitza en la síntesi peptídica. Les subunitats
bàsiques o blocs de construcció b2-c seran un
residu d’aminoprolina i deu o sis prolines [-
(Pro)5(Pro)5-Amp-] o [-(Pro)3(Pro)3-Amp-].
iii) Reaccions repetitives per creixement de les
diferents capes. Per a la presentació d’aquests tipus
de polímers existeixen dos tipus d’estratègies: (a)
divergent (la síntesi es realitza del nucli a la superfície
etapa rere etapa) i (b) convergent (la síntesi s’inicia en
la superfície i va confluint cap al nucli). En el present
projecte, s’utilitza una estratègia "convergent modificada"
basada en la nostra pròpia experiència de
síntesi convergent en fase sòlida. Aquesta estratègia
consisteix en: (a) la preparació en fase sòlida dels
fragments intermedis degudament protegits (blocs de
construcció b2-c); (b) la seva purificació i caracterització;
i (c) el seu ensamblatge en solució o en fase
sòlida des del nucli fins a la superfície.
Seguint aquesta estratègia, el control del producte
final ve donat per l’acurada purificació i caracterització
dels fragments intermedis.
iv) Funcionalització de la superfície del polímer.
Aquesta es du a terme a partir dels grups amino dels
últims residus de prolina.
Caracterització. Els polímers dendrítics es caracteritzen
utilitzant ressonància magnètica nuclear (RMN),
cromatografía d’exclusió molecular (SEC), espectrometria
de masses (MALDI TOF, HPLC-EM), viscositat
intrínseca, microscòpies de túnel i electrònica i raigs X
de dispersió.
Estudis d’interacció fàrmac-polímer. La determinació
de la capacitat que tenen els dendrímers per atrapar
en el seu interior els fàrmacs es du a terme per
tècniques espectroscòpiques i per EM.
Estudis de la biodegradabilitat dels nous polímers.
Aquests estudi es du a terme mitjançant l’anàlisi per
cromatografia líquida (HPLC) dels productes obtinguts
per digestió enzimàtica dels dendrímers.
Avaluació preliminar de l’eficàcia terapèutica dels nous
polímers en el tractament de la fibrosi quística. Es
determina la concentració inhibidora (CIM) de l’agent
antimicrobià mitjançant un mètode de microdilució
utilitzant caldo Mueller-Hintoni seguint les pautes del
National Comitte for Clinical Laboratory Standard.
Breu síntesi del pla de treball
Primera anualitat:
i) Disseny basat en estudis de dinàmica molecular dels
primers polímers de la sèrie.
ii) Síntesi del nucli (a). Síntesi de la unitat trifuncional
(c). Síntesi, purificació i caracterització de les subunitats
bàsiques o blocs de construcció (b2-c) degudament
protegits (Fmoc-Pro5)(Fmoc-Pro5)-Amp-OH o
(Fmoc-Pro3) (Fmoc-Pro3)-Amp-OH. Això últim es fa
mitjançant l’estratègia de la fase sòlida.
Segona anualitat:
iii) Ensamblatge de les diverses subunitats.
Caracterització del dendrímer.
iv) Avaluació de la interaccció fàrmac-polímer. Estudis
de biodegradabilitat.
v) Avaluació preliminar de l’eficàcia terapèutica dels
nous polímers en el tractament de la fibrosi quísitica.
Segona-tercera anualitat:
vi) Redisseny i preparació d’altres polímers, amb
l’objectiu de modular l’activitat antimicrobiana d’antibiòtics
atrapats en el polímer.
Tercera anualitat:
vii) Avaluació d’altres polímers i assaigs en model
animal de pneumònia.
2. Resultats
S’ha posat a punt una estratègia de síntesi de dendrímers
en fase sòlida que en permet l’obtenció d’una
manera eficaç i en alta puresa. Aquesta estratègia ens
ha permès obtenir diferents tipus de dendrímers
variant el nucli, la unitat trifuncional, la longitud de les
branques o la funcionalització de la superfície. Així

s’han obtingut diversos tipus de dendrímers de
generació 2, 3 i 4 que s’han caracteritzat per HPLC,
cromatografia d’exclusió i masses. Aquesta metodologia
permetrà en el futur la síntesi de biblioteques de
dendrímers variant els paràmetres anteriors a més a
més de la seqüència. Es pot dir que s’ha obtingut un
mètode general de síntesi de dendrímers de caràcter
peptídic.
S’ha comprovat que dendrímers de generacions
elevades poden assolir la conformació polipro II, però
no poden arribar a polipro I.
S’ha obtingut i caracteritzat un dendrímer de generació
1 fent servir com a ramificador c 4-aminoprolina.
S’ha estudiat el seu comportament estructural respecte
de diversos dissolvents, i s’ha observat que cal un
dendrímer de branca b de mida més llarga (n=14)
perquè es produeixi el pas de polipro II a polipro I i
viceversa.
S’ha comprovat per experiments d’espectroscòpia de
fluorescència que hi ha una interacció entre dendrímers
de poliprolina i l’antibiòtic ciprofloxacina en n-
PrOH-H2O (99.5:0.5) amb una estequiometria d’1 a 2
i una constant d’afinitat de 2.0X106 M-1. Els resultats
de microscòpia de fluorescència han demostrat que la
internalització dels dendrímers de poliprolina és
possible per mitjà d’un mecanisme d’endocitosi.
Aquests resultats posen de manifest la possibilitat
d’emprar els dendrímers de poliprolina com a nous
sistemes alliberadors de fàrmacs.
3. Rellevància i possibles aplicacions d’aquests
resultats
El resultats assolits en el present projecte obren les
portes a la utilització de dendrímers peptídics com a
sistema d’alliberament de fàrmacs.
Els avantatges d’aquests nous materials són els
següents:
1. Biocompatibilitat
A causa de la seva naturalesa peptídica.
2. Alliberament de fàrmacs lent
L’alliberament té lloc per hidròlisi enzimàtica del
dendrímer en el teixit hoste.
3. Possibilitat de controlar la velocitat d’alliberament
del fàrmac
Aquest control s’aconsegueix fent variar la composició
en aminoàcid D i L del dendrímer.
4. Mida de partícula petita i perfectament definida
(sistema totalment monodispers)
Aquesta propietat és conseqüència directa de la
naturalesa dendrimèrica del sistema.
5. Mida de partícula controlable a voluntat
Aquest control s’exerceix variant el nombre de
generacions i/o la longitud de les branques de la
molècula dendrimèrica.
En un context d’aplicació al control dels problemes
pulmonars associats a la fibrosi quística, totes les
propietats esmentades són rellevants, però de manera
molt especial les dues darreres. En efecte, una mida
de partícula petita, perfectament definida i controlable,
permetrà en el futur ajustar el disseny dels nostres
compostos de manera que, utilitzant aerosols, arribin
de exclusivament i amb gran rendiment als alvèols
pulmonars, sense "aturar-se" en cap altre punt del
recorregut. Una vegada al punt de destinació, la
digestió enzimàtica permetrà l’alliberament del fàrmac
de manera lenta i controlada. Aquesta estratègia pot
aplicar-se tant per lliurar molècules petites (com l’antibiòtic
ciprofloxacina utilitzat com a model en el nostre
estudi) com també fàrmacs més grans i sofisticats. Un
bon exemple pot ser-ne l’ús d’enzims del tipus
DNAsa. La naturalesa peptídica dels nostres dendrímers
fa que siguin perfectament compatibles amb la
naturalesa també peptídica d’enzims o anticossos
monoclonals.
En aquests moments, al nostre laboratori, estem
dissenyant una nova família de dendrímers rics en
prolina amb superfície fortament bàsica. Existeix la
possibilitat que aquestes molècules trobessin la seva
utilitat com a vectors sintètics per a transfecció
cel·lular en tractaments tipus teràpia gènica. Aquest
desenvolupament encara està, però, en una fase molt
preliminar.
4. Publicacions
L. Crespo, G. Sanclimens, M. Royo, E. Giralt, F. Albericio.
Branched poly(proline) peptides: an efficient new approach to the
synthesis of repetitive branched peptides. Eur. J. Org. Chem., 11,
1756-1762 (2002).
L. Crespo, G. Sanclimens, B. Montaner, R. Pérez-Tomás, M.
Royo, M. Pons, F. Albericio, E. Giralt. Peptide Dendrimers Based
on Polyproline Helices. J. Am. Chem. Soc., 124, 8876-8883
(2002).
L. Crespo, G. Sanclimens, M. Royo, M. Pons, F. Albericio, E.
Giralt. "Solid-phase synthesis of peptide dendrimers using polyproline
helices as building blocks". "Peptides 2000. Proceedings
of the 26th European Peptide Symposium". (J. Martinez and J. A.
Fehrentz, eds.), EDK, Éditions EDK, Paris, France, p. 801-802
(2001).
E. Giralt, M. Royo, M. Kogan, L. Crespo, G. Sanclimens, M.
Pons, F. Albericio. "Proline: A key building block in de novo
designed peptide molecules". "Peptides: Proceedings of the 17th
American Peptide Symposium" (R. Houghten, M. Lebl, G. B.
Fields and G. Barany, eds.), Kluwer-ESCOM, Academic
Publishers, Dordrecht, The Netherland, in press. California (USA)
2001
E. Giralt, M. Royo, M. Kogan, L. Crespo, G. Sanclimens, J.
Farrera-Sinfreu, M. Pons, F. Albericio. Proline-rich peptides: from
plants to dendrimers. Proocedings of the 3rd Hellenic Forum on
Bioactive Peptides, in press. Patras (Grecia) Març 2002
RECERCA BIOMÈDICA | 107

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
Títol del projecte:
Expressió i caracterització d’al·lels mutats causants de la malaltia
de Gaucher i de la Mucopolisacaridosi III A (Síndrome de Sanfilippo A).
Estudis preliminars per a teràpia gènica
MEMÒRIA FINAL
Investigador principal
Daniel Grinberg Vaisman · Amparo Chabás Bergón
Institució
Facultat de Biologia.UB · Corporació Sanitària Clínic
Membres de l’equip
Raül Santamaria, Lluïsa Vilafeliu, Anna Díaz-Font, Magda Montfort, Elena Garrido, Gessamí Sánchez,
Bru Cormand, Laura Cort, Mònica Cozar, Ma. Josep Coll, Helena Sellés i Josep Jarque
1. Resum del projecte original
Objectius concrets
- Expressió de diferents mutants del gen de la βglucocerebrosidasa,
implicats en la malaltia de
Gaucher en pacients espanyols, en un sistema
d'expressió de baculovirus. El mètode per fer aquesta
expressió es basa en la utilització del kit Bac to Bac
Baculovirus Expression System (Life Technologies),
utilitzant les cèl·lules Sf9 de Spodoptera frugiperda.
- Caracterització d'al·lels mutats del gen de la βglucocerebrosidasa.
Aquest objectiu consta de dos
aspectes. D'una banda, la caracterització del tipus de
mecanisme mutacional en els al·lels generats com a
resultat de processos de recombinació entre el gen
GBA i el seu pseudogèn. D'altra banda, l'anàlisi de les
proteïnes mutants derivades de l'expressió esmentada
en el punt anterior respecte d'activitat enzimàtica i
constants cinètiques.
- Anàlisi de l'origen de la mutació més prevalent en la
malaltia de Gaucher (N370S) i la seva incidència en la
població general. El primer d'aquests aspectes es
refereix a l'estudi d'haplotips de llocs polimòrfics
pròxims al gen GBA, tot continuant estudis preliminars
13.051.897 PTA
duts a terme pel nostre grup. El segon aspecte es
basa en l'estudi de DNA extret de sang seca en 3.000
nounats a Catalunya.
- Expressió de diversos mutants del gen de la sulfamidasa,
implicats en la mucopolisacaridosi III A o síndrome
de Sanfilippo A en pacients espanyols, en un
sistema d'expressió de baculovirus, semblant al
descrit per a la malaltia de Gaucher.
- Caracterització d'al·lels mutats del gen de la sulfamidasa.
Aquest objectiu també abasta dos aspectes.
D'una banda, la caracterització molecular dels al·lels
mutats presents en malalts espanyols de mucopolisacaridosi
III A. D'altra banda, l'anàlisi de les proteïnes
mutants derivades de l'expressió esmentada en el
punt anterior respecte d'activitat enzimàtica i
constants cinètiques.
- Optimitzar la tecnologia necessària per corregir els
gens mutats en cèl·lules de pacients d'aquestes
malalties, mitjançant la utilització de quimeroplasts, i
recuperar l'activitat enzimàtica normal com a experiments
preliminars per afrontar, en un futur, la teràpia
gènica d'aquestes patologies. L'estratègia per dur a
terme aquest objectiu consisteix en la introducció en
cèl·lules de pacients d'un oligonucleòtid quimèric
DNA/RNA que conté la seqüència silvestre per a la

mutació que cal corregir. Aquest procés es basa en
l'aparellament del quimeroplast a la zona cromosòmica
on es troba la mutació i la subsegüent correcció
d’aquesta pels enzims cel·lulars correctors d'aparellaments
erronis.
2. Resultats
Expressió de diversos mutants del gen de la
glucocerebrosidasa i caracterització de les proteïnes
resultants
L'expressió s'ha fet en cèl·lules Sf9 transfectades amb
baculovirus recombinants portadors del cDNA del gen
de la glucocerebrosidasa salvatge i dels al·lels mutats
següents: P182L, N188S, R257X, Y313H, E326K,
N370S, P391L, N392I, I402T, D409H, L444P, i dels
doble mutants E326K+N188S, i E326K+L444P. En
tots els casos se n'ha valorat l’activitat glucocerebrosidasa.
En el cas del cDNA salvatge, s'ha comparat
l'activitat enzimàtica i les constants cinètiques amb la
de fibroblasts cutanis conreats procedents d'individus
sans. Per als cDNA d'al·lels mutats, la comparació
amb fibroblasts de pacients s'ha fet només quan es
disposava de malalts homozigots per a aquesta
mutació.
El nivell d'activitat glucocerebrosidasa a partir de
l'expressió del cDNA salvatge (2.227 ± 577 nmol/hxmg
prot) és superior de 6-8 vegades al dels fibroblasts
conreats. Les constants cinètiques, la termolabilitat i
l'acció d'inhibidors en l'activitat glucocerebrosidasa
transfectada no difereixen significativament dels valors
trobats en els fibroblasts conreats.
L'activitat glucocerebrosidasa per als diversos al·lels
mutats expressada en percentatge de l'activitat de
l'al·lel salvatge és la següent:
P182L 1 %
N188S 65 %
R257X 0,4 %
Y313H 0,2 %
E326K 48 %
N370S 8 %
P391L 0 %
N392I 0 %
I402T 12 %
D409H 5 %
L444P 11 %
E326K+N188S 26 %
E326K+ L444P 7 %
Aquests resultats sembla que indiquen que les
mutacions N188S i E326K expressen un nivell d'activitat
enzimàtica residual important, pròxim o superior
al 50% del cDNA salvatge. Les mutacions N370S,
I402T, D409H i L444P tenen activitat catalítica baixa
però detectable, mentre que les mutacions P182L,
R257X, Y313H, P391L i N392I podrien afectar l'activitat
catalítica i/o l'estabilitat de la proteïna. Quant a
l'efecte d'E326K en els al·lels doble mutants
E326K+N188S i E326K+L444P, la seva presència
comporta la disminució de l'activitat enzimàtica en un
50% respecte dels valors dels al·lels N188S i L444P
expressats aïlladament.
Aquests estudis d'expressió s'han aplicat per caracteritzar
el nivell de glucocerebrosidasa residual en un
pacient amb ictiosi neonatal, una variant molt
infreqüent de la malaltia de Gaucher. Aquest treball
s'ha presentat en un congrés científic i actualment se
n'està elaborant el manuscrit corresponent.
Caracterització d'al·lels mutants del gen de la
glucocerebrosidasa produïts per recombinació
entre el gen GBA i el seu pseudogèn
Quant a la caracterització d'al·lels mutats del gen de
la glucocerebrosidasa produïts per recombinació entre
gen i pseudogèn, s'han completat dos treballs. D'una
banda s'ha identificat un nou al·lel Rec, el Rec-int2
(Cormand et al., Blood Cell Mol Dis, 26:409-416,
2000). D'altra banda, s'ha fet un estudi exhaustiu dels
distints reordenaments per recombinació entre els dos
grups de gens i pseudogens de la glucocerebrosidasa
i la metaxina, situats en 1q21. S'han analitzat 29
pacients amb al·lel RecNciI i 36 amb l'al·lel L444P. Un
dels resultats principals d'aquest treball ha estat la
comprovació que la majoria dels al·lels RecNciI es van
generar per conversió gènica. A més, s'han identificat
reordenaments (duplicacions i delecions) produïts per
entrecreuaments ocorreguts a 3’ del gen de la
glucocerebrosidasa, i que no estarien, per tant,
relacionats amb la malaltia de Gaucher. L'estudi
d'haplotips ha demostrat que l'alta freqüència d'al·lels
RecNciI associats a una duplicació genòmica polimòrfica
s'expliquen per un efecte fundador. Aquest treball
ha estat acceptat per ser publicat en Human Genetics
(Díaz-Font et al., en premsa).
Finalment, s'ha afrontat l'estudi d'un altre tema en
relació amb alguns al·lels mutats del gen de la
glucocerebrosidasa: el possible RNA decay produït
com a conseqüència de la presència d'un codó stop
prematur. En concret, es van estudiar els al·lels mutats
següents, de tipus sense sentit (nonsense) o de
petites insercions o delecions que donen lloc a canvi
en la pauta de lectura: R257X, W(-4)X, 1451delAC i
1098insA. El major nivell de decay es va trobar per a
l'al·lel R257X, i, en segon lloc, per a l’al·lel 1098insA.
Els altres dos al·lels no sembla que presentin RNA
decay.
Anàlisi de l'origen de la mutació més prevalent en
la malaltia de Gaucher (N370S) i la seva incidència
en la població general
Mitjançant una anàlisi d'haplotips es va estudiar
l'origen de la mutació més prevalent en la malaltia de
Gaucher. Aquest estudi en va demostrar l'origen únic,
tot confirmant resultats previs obtinguts pel nostre
grup amb marcadors diferents. Aquest estudi va
donar lloc al article científic següent: Rodríguez-Marí et
al., Blood Cell Mol Dis, 27:950-959,2001.
En relació amb la incidència de la mutació N370S en
la població general, s'han analitzat 3.005 mostres de
DNA. El resultat ha estat la identificació de 14 heterozigots
per a aquest al·lel. Això representaria una
freqüència de portadors d'1:214,6 i, per tant, una
freqüència d'aquesta mutació en la població nounada
de Catalunya del 0,465%. En tots els individus
portadors també s'ha fet la recerca de les mutacions
L444P i D409H. Un d'ells va resultar també portador
de la mutació L444P i, per tant, està afectat/ada per
la malaltia de Gaucher. Malgrat que en principi
aquests resultats no justificarien la inclusió de la
malaltia de Gaucher en un programa de cribratge
neonatal, podrien ser rellevants per valorar el nombre
de possibles candidats a la teràpia de substitució
enzimàtica, únic tractament existent actualment.
RECERCA BIOMÈDICA | 109

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
Expressió de distints mutants del gen de la
sulfamidasa
S'ha estudiat els següents al·lels del gen de la sulfamidasa,
responsables de la síndrome de Sanfilippo tipus
A: S66W, R74H, Q85R, R206P, L386R, R433Q,
R433W i 1091delC. També s'ha estudiat el polimorfisme
R456H. El nivell d'activitat enzimàtica detectat en
aquests mutants ha estat sempre molt baix, amb
valors entre 0 i un 20 % de l'activitat de l'al·lel salvatge.
Experiments preliminars per afrontar la teràpia gènica
S'han construït els quimeroplasts correctors de les
mutacions N370S i L444P del gen de la glucocerebrosidasa
responsable de la malaltia de Gaucher, i s'ha
posat a punt la tecnologia necessària per a la
introducció d'aquests quimeroplasts en fibroblasts de
pacients, tot demostrant-se que arriba correctament
al nucli. No obstant això, no s'ha aconseguit la correcció
esperada. Recentment s'han qüestionat seriosament
els resultats originals en què es descriuen
elevats índexs de correcció obtinguts mitjançant
aquesta tècnica (Science 298:2116-2120, 2002).
Actualment s'està elaborant un manuscrit sobre els
nostres resultats negatius per aportar aquesta
informació al debat científic que s'ha originat sobre el
tema.
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
En primer lloc, aquest projecte ha permès la posada a
punt d'una tecnologia d'expressió i caracterització
d'al·lels mutats que és aplicable a altres malalties
genètiques hereditàries. Per exemple, actualment
s'està aplicant a l'estudi de les malalties hereditàries
gangliosidosi GM1 i mucopolisacaridosi VI (síndrome
de Maroteaux-Lamy).
Igualment, la identificació i caracterització d'al·lels
mutats és especialment útil per poder establir
possibles relacions genotip-fenotip amb un valor
pronòstic del desenvolupament de la malaltia.
Un altre aspecte important és aportar eines per a un
diagnòstic molecular rutinari, tant de caràcter prenatal
com presimptomàtic i en portadors sans.
La caracterització d'al·lels Recs, del mecanisme
mutacional que els genera i, sobretot, el descobriment
de l'existència de polimorfismes respecte de l'estructura
genòmica de la regió que inclou el gen GBA,
ajudaran a entendre aquest tipus de mutacions
genòmiques, existents també en altres patologies, i a
millorar el diagnòstic molecular en els pacients que
presentin aquest tipus d'al·lels.
Finalment, el tema de la teràpia gènica mitjançant
quimeroplasts podria haver estat una solució per a
moltes malalties hereditàries, tot superant els inconvenients
de la teràpia gènica convencional. Però els
fracassos obtinguts tant pel nostre grup com per la
majoria de grups que han intentat aquesta aproximació
indiquen que cal una revisió seriosa d'aquesta
estratègia. Com a conseqüència d'aquests resultats
negatius, hem iniciat una nova aproximació a la
teràpia de la malaltia mitjançant la utilització de siRNA.
4. Publicacions
Cormand B, Díaz A, Grinberg D, Chabás A and Vilageliu L. A
new gene-pseudogene fusion allele due to a recombination in
intron 2 of the glucocerebrosidase gene causes Gaucher disease.
Blood Cell Mol Dis, 26:409-416,2000.
Chabás A, Montfort M, Martinez-Campos M, Diaz A, Coll MJ,
Grinberg D and Vilageliu L. Mutation and haplotype analyses in 26
Spanish Sanfilippo Syndrome type A patients: possible single
origin for 1096delC mutation. Am J Med Genet, 100:223-228,
2001.
Rodríguez-Marí A, Díaz-Font A, Chabás A, Pastores GM,
Grinberg D and Vilageliu L. New insights into the origin of the
Gaucher disease causing mutation N370S: extended haplotype
analysis using the 5GC3.2, 5470 G/A and the ITG6.2 polymorphisms.
Blood Cell Mol Dis, 27:950-959,2001.
Díaz-Font A, Cormand B, Chamoles N, Chabás A, Grinberg D
and Vilageliu L. Gene rearrangements in the glucocerebrosidasemetaxin
region giving rise to disease-causing mutations and
polymorphisms. Analysis of 29 RecNciI alleles from Gaucher
disease patients. Hum Genet (en premsa).

Títol del projecte:
Regulació genètica de la mort cel·lular
programada en el múscul estriat en desenvolupament
Investigador principal
Alfons Macaya Ruiz
Institució
Hospital Maternoinfantil Vall d’Hebron
12.420.000 PTA
MEMÒRIA FINAL
1. Resum del projecte original
Objectiu principal
Identificació de gens implicats en la mort cel·lular
programada (MCP) natural i en la induïda per
radiacions, al múscul de rata en desenvolupament.
Objectius secundaris
Estudi de l'expressió de gens de la família Bcl-2 en
ambdós models experimentals. Estudi de l'expressió
de gens de la família Bcl-2 i dels que se sobreexpressin
en els models animals, al múscul de pacients amb
distròfies musculars.
Hipòtesi de treball
Els mecanismes gènics mediadors de l’MCP durant el
desenvolupament normal i en resposta a les
radiacions difereixen totalment o parcialment, malgrat
la similitud morfològica i bioquímica dels fenòmens
d’MCP. Alguns dels gens implicats poden operar en
l’MCP que presumiblement precedeix la degeneració
del múscul humà distròfic.
Mètodes
Anàlisi d’mRNA per RT-PCR, i hibridació in situ en
múscul de rata i humà. Differential display en múscul
de rata per anàlisi d’mRNA durant la màxima apoptosi.
Resultats esperats
Identificació de gens reguladors d’MCP, específics o
no de teixit muscular.
Impacte potencial esperat
Millor comprensió dels mecanismes de degeneració
del múscul i possibilitat de manipulació gènica per
modificar la progressió de les malalties neuromusculars
pediàtriques que cursen amb MCP.
2. Resultats
1) Identificació morfològica i bioquímica d'apoptosi
al múscul estriat en desenvolupament.
S'ha demostrat la presència de mort cel·lular programada
(MCP) al múscul estriat de la rata en desenvolupament
entre els dies E16 i P21, amb un pic entre els
dies P5-P9. El mètode TUNEL i l'electroforesi sobre
gel d'agarosa de l’ADN extret confirmen que hi ha
fragmentació d’ADN i que aquesta és internucleosomal.
Com a paradigma d'augment d'apoptosi es va
RECERCA BIOMÈDICA | 111

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
posar a punt un model d'irradiació en P7, que va
permetre incrementar notablement el nombre de
cèl·lules apoptòtiques. En aquest model, el pic d’MCP
es produeix 6-12 hores després de la irradiació,
mentre el laddering de l’ADN és molt evident.
2) Examen de gens reguladors candidats.
S'ha examinat el possible paper dels gens Bcl-2, Bax i
Bcl-XL. En primer lloc es va aïllar l’mRNA de mostres
de múscul normal i irradiat. En estudis d’RT-PCR
semiquantitativa (L19, gen control), es va comprovar
expressió constitutiva dels tres gens durant el
desenvolupament normal, amb una discreta inducció
de Bax en P9 i de Bcl-2 entre P7 i P9. Per immunocitoquímia,
es va comprovar tinció positiva per a les tres
proteïnes en els sarcoplasmes de les fibres musculars,
més intensa en el cas de Bax. No es va comprovar
col·localització amb fenòmens de degeneració
cel·lular.
En els animals sotmesos a radiació gamma, Bax i Bcl-
XL van patir una clara inducció a partir de les 3 h
postinsult, que a les 12 h seguia sent significatiu
estadísticament (p

Figura 3. Inducció de l’mRNA del gen Bax, analitzada
per RT-PCR, en les hores següents a la radiació (C:
animal control, L19: gen control)
Figura 4. A: expressió diferencial del gen subunitat alfa
de la F0F1-ATPasa mitocondrial en animals radiats
(R7) vs animals control (P7). B: confirmació de la
diferencialitat per RT-PCR.
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
Es tracta del primer estudi que identifica el fenomen
d’MCP i estableix el curs temporal durant el desenvolupament
normal postnatal d'un mamífer (els estudis
anteriors es van efectuar en invertebrats o en
condicions patològiques d'animals vertebrats).
S'ha caracteritzat el tipus i curs de la mort cel·lular en
un model "pur" d’MCP com és la irradiació gamma,
tot comprovant també l'expressió dels gens relacionats
amb l'apoptosi Bcl-XL i Bax.
S'han identificat dues seqüències diferencialment
expressades amb relació a la lesió muscular per
irradiació, les de la subunitat alfa de la F0F1-ATPasa
mitocondrial i la isoforma 2B de la cadena pesada de
la miosina de rata, l'estudi de la qual en altres models
de lesió muscular pot obrir el camí a noves formes de
terapèutica en malalties degeneratives musculars.
Hem aportat proves en un sistema in vivo d'inducció
conjunta del gen de mort cel·lular Bax i d'una proteïna
presumptament implicada en la seva interacció amb el
porus de la membrana mitocondrial, la subunitat alfa
de la F0F1-ATPasa mitocondrial.
No sembla que hi hagi evidència d'augment d'apoptosi
al múscul estriat de pacients afectats per diverses
malalties neuromusculars pediàtriques, almenys en les
fases de la seva patogènia que han estat analitzades.
4. Publicacions
De Torres C, Munell F, Roig M, Reventos J, Macaya A. Naturally
occurring cell death during postnatal development of rat skeletal
muscle. Muscle Nerve 2002;26:777-83.
De Torres C, Munell F, Roig M, Macaya A. The pattern of DNA
fragmentation in pediatric neuromuscular disorders. Rev Neurol
2000;30:901-6.
De Torres C, Munell F, Roig M, Giralt J, Macaya A. Differential
Gene Expression in Rat Developing Skeletal Muscle Following
Radiation-Induced Cell Death. Muscle Nerve (sotmès a revisió).
RECERCA BIOMÈDICA | 113

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
MEMÒRIA FINAL
1. Resum del projecte original
L'objectiu principal d'aquest projecte era demostrar si
l’expansió de les repeticions de trinucleòtids (TRE),
característica de la distròfia miotònica (DM) i altres
malalties genètiques heretables, pot ser induïble per
agents genotòxics i/o per una reparació deficient del
DNA.
També es plantejà com a objectiu secundari veure si
aquesta expansió produïa una inactivació del gen
DMAHP.
Per comprovar aquesta hipòtesi de treball, es va
plantejar utilitzar diversos agents genotòxics amb
formes variades d'actuació i línies cel·lulars distintes
(normals; de DM amb TRE de diferents longituds, i
amb inestabilitat genètica), com també limfòcits
humans de pacients afectats de DM i individus
controls.
Les metodologies previstes eren la hibridació in situ
fluorescent (FISH), el mètode RED (repeat expansión
detection) la PCR i el Southern blotting.
El pla de treball previst suposava tres fases
consecutives:
a) La primera fase consistia en l’estandardització i la
Títol del projecte:
Estudi sobre la induïbilitat de l’expansió de repeticions
de trinucleòtids en la distròfia miotònica
Investigador principal
Ricard Marcos Dauder
Institució
Facultat de Ciències. UAB
Membres de l’equip
Antònia Velazquez, Jordi Surrallés, Laura Fernàndez i Elisabet Piñeiro
8.500.000 PTA
posada a punt de les diverses metodologies per
emprar en els estudis de detecció de les expansions.
b) La segona fase suposava l’establiment de les línies
cel·lulars i la determinació de les dosis eficaces (DL50)
per a cadascun dels mutagens emprats.
c) La tercera fase, que era la mes important, suposava
dur a terme tots els experiments d’induïbilitat
d’expansions pels agents genotòxics emprats, alhora
que es determinava la inestabilitat dels trinucleòtids
estudiats.
2. Resultats
Malgrat que encara hi ha alguns experiments que
poden generar nous resultats, aquests normalment
generaran tan sols resultats de confirmació. Per tant,
de manera resumida els resultats obtinguts en aquest
projecte es poden sintetitzar en aquests quatre punts:
1. La inestabilitat de trinucleòtids és induïble
Utilitzant quatre línies cel·lulars, i establint cultius
clonals, es va estudiar quin era l’efecte del tractament
amb dos mutagens, un que produeix fonamentalment
trencaments al DNA (bleomicina) i l’altre produint
fonamentalment enllaços creuats entre cadenes del
DNA. Per això es van fer servir dues repeticions

diferents de trinucleòtids, la repetició pròpia de la
distròfia miotònica, i la repetició CCG, pròpia de la
síndrome del X-fràgil.
Els resultats concrets d’aquest treball estan recollits
en l’article que s’ha enviat a publicar (vegeu annex), i
es poden resumir en:
- El tractament amb mitomicina C produeix una clara
inestabilització d’ambdós tipus de repeticions de
trinucleòtids.
- El tractament amb bleomicina, malgrat que també
produeix inestabilitat, aquest efecte és molt menor
que l’induït per la mitomicina C.
- Estudis amb les línies deficients per la reparació de
falsos aparellaments (HCT116 i LoVo), i amb les línies
normals (SW480) i la línia HCT116 corregida mitjançant
transferència del cromosoma 3 demostren que la
inestabilitat induïda és independent de l’existència
d’un sistema de reparació de falsos aparellaments
funcional.
- La inestabilitat trobada sembla específica de la línia
SW480.
- La coincidència en el comportament de les repeticions
CTG i CCG suggereix l’existència d’un mecanisme
comú d’inestabilitat de trinucleòtids que actua en
trans.
- Per tot això anterior, aquests resultats mostren que
l’estrès mutagènic és un nou mecanisme que pot
explicar l’aparició de les mutacions dinàmiques en
repeticions de trinucleòtids associades a malalties
humanes.
2. La inestabilitat de trinucleòtids és independent de la
funcionalitat de la ruta de Fanconi. Entre els possibles
defectes genètics que podrien estar lligats a la inestabilitat
de les repeticions de trinucleòtids, s’ha suggerit
que la deficiència en la recombinació homòloga podria
ser un factor important.
Atès que el complex Rad50-Mre11-NBS1 està relacionat
amb la inestabilitat dels trinucleòtids i amb la
reparació per recombinació homòloga i que la seva
constitució requereix l’existència d’una ruta de Fanconi
funcional, es va plantejar la hipòtesi que deficiències en
aquesta ruta podrien ser un factor involucrat en la
inestabilitat de repeticions de trinucleòtids.
Així, es va comprovar aquesta hipòtesi utilitzant una
línia cel·lular deficient en el gen FACD2, la mateixa línia
corregida mitjançant transducció retroviral, i la mateixa
línia amb el vector buit. La metodologia utilitzada va
ser la indicada en el punt anterior, fent tractament
amb cina C, per activar la ruta de Fanconi, i l’anàlisi
mitjançant SP-PCR.
Els resultats obtinguts a pareixen en la taula 1 de
l’annex 1, que indiquen que:
- La freqüència d’al·lels mutants observats és
independent de l’existència d’una ruta funcional del
gen FANCD2; és a dir, en les tres línies utilitzades la
freqüència de nous al·lels és equivalent.
- Els mateixos resultats s’han obtingut quan les línies
cel·lulars han estat sotmeses a concentracions
subtòxiques de mitomicina C. Cal recordar que
aquest compost activa la ruta de l’anèmia de Fanconi.
- Per tant, la conclusió general d’aquest treball és que
el gen FANCD2 i la ruta deficient en pacients de
Fanconi no té cap paper rellevant en l’estabilitat de les
repeticions de trinucleòtids.
3. La inestabilitat de les repeticions de trinucleòtids,
tant espontània com induïda, tendeix a donar al·lels
amb majors longituds
Per tractar de veure quina era l’evolució del nombre
de repeticions del trinucleòtid CTG associat a la
distròfia miotònica, es van planificar experiments per
veure com, en línies limfoblastoides derivades d’individus
amb al·lels amb diferents longituds (CTG)n,
aquestes repeticions variaven en longitud durant les
divisions dels cultius. Així, els experiments realitzats
incloïen:
- Mitjançant transformació cel·lular, obtenir les diverses
línies limfoblastoides.
- Les línies es tractaven amb mitomicina C, o sense
tractament (control).
- Es feia una estimació de quina era ta taxa de divisió
dels cultius tant amb tractament com sense.
- A moments diferents (temps 0, 6 i 12 divisions) es
feia una anàlisi per SP-PCR per valorar les longituds
del trinucleòtid CTG.
Els resultats obtinguts s’expressen en les figures 1 i 2
que s’indiquen en l’annex 2 i que representen l’evolució
del comportament dels al·lels curts i llargs, respectivament.
D’aquestes gràfiques es desprèn que:
- En les línies cel·lulars amb al·lels curts, el tractament
amb mitomicina C indueix l’aparició d’al·lels més llargs
durant el temps (divisions cel·lulars). Això es veu clar
quan es parteix de l’al·lel (CTG)13.
- En les línies cel·lulars amb al·lels llargs, durant les
divisions cel·lulars s’observa una deriva mitòtica vers
longituds més grans, que s’observa en el cas de
l’al·lel (CTG)125. A més, aquest efecte es troba
accelerat pel tractament amb mitomicina C.
4. La inestabilitat d’un al·lel particular és independent
de la longitud de l’altre al·lel
Per tractar d’esbrinar les raons de les inestabilitats
dels al·lels es va voler demostrar si la inestabilitat
d’al·lels de diferents mides depenia de la longitud i/o
inestabilitat de l’altre al·lel dins la mateixa cèl·lula.
En aquest estudi es van utilitzar limfòcits de sang
perifèrica de donants sans i afectats per la malaltia.
Els diferents donants tenien longituds variables, amb
situacions en què un al·lel curt es podia trobar en
homozigosi, o en heterozigosi respecte d’al·lels de
longituds diferents. En aquest experiment, l’estudi
suposà:
- L’extracció de DNA a partir de sang perifèrica del
donants seleccionats.
- L’anàlisi de la inestabilitat dels diferents (CTG)n,
mitjançant SP-PCR.
Els resultats obtinguts s’expressen en la figura 3 i en
la taula 2 que s’indiquen en l’annex 3 i que representen
la variació dels diversos al·lels considerats en
l’estudi. D’aquestes estudi es conclou que:
- La inestabilitat d’un al·lel curt és independent de la
longitud i de la inestabilitat de l’altre al·lel.
- La inestabilitat d’un al·lel curt tendeix a donar al·lels
més llargs. Aquesta tendència a l’expansió confirma la
troballa del punt 3.
- Per tant, la inestabilitat d’un determinat al·lel sembla
dependre de la seva pròpia estructura, tot indicant la
no existència de cap mecanisme que actuï en trans.
- A més, aquests resultats indiquen que la recombinació
mitótica interal·lèlica no té cap paper en la gènesi
d’inestabilitat d’aquestes seqüències.
RECERCA BIOMÈDICA | 115

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
Annexos
Annex 1
Taula 1. Resum dels resultats obtinguts en l’estudi
sobre el paper de la ruta de Fanconi en la inestabilitat
de la repetició (CTG)n. Com es pot veure, la freqüència
total de mutacions no varia significativament per a
la línia PD20 (mutant pel gen FANCD2) en comparació
amb la línia PD20+FD20 (línia corregida amb la còpia
normal del gen FANCD2) i amb la línia PD20+pMMp
(que ha estat transfectada amb el vector buit).
Aquesta absència d’inestabilitat és independent de
l’estrès genotòxic, atès que no hi ha diferències entre
els resultats obtinguts en l’estudi control i els
obtinguts en les línies tractades amb mitomicina C.
Annex 2
Figura 1. Resultats obtinguts amb les línies cel·lulars
amb al·lels curts.
Taula 1.
Annex 3
Figura 2. Resultats obtinguts amb les línies cel·lulars
amb al·lels llargs.

Figura 3. Es mostra que la inestabilitat d’un al·lel és
independent de la de l’altre, alhora que es veu que la
inestabilitat té major tendència a generar expansions.
Taula 2. Els resultats indiquen que la inestabilitat dels
al·lels curts és independent de quin sigui l’al·lel
present en el cromosoma homòleg.
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
La rellevància dels resultats finals obtinguts radica en
el fet que:
1. Per primera vegada s’ha descrit que la inestabilitat
de les repeticions de trinucleòtids causants de la distròfia
miotònica pot ser induïble per l’estrès genotòxic.
2. Aquesta inestabilitat no depèn de dues rutes
importants involucrades en la reparació del DNA, com
és la involucrada en la reparació de falsos aparellaments
i la involucrada en la reparació dels enllaços
encreuats entre cadenes del DNA.
3. Tant la inestabilitat espontània com la induïda per
l’estrès genotòxic tendeix, fonamentalment, a generar
expansions d’aquestes repeticions. Això podria ser
una font d’expansions patològiques dels al·lels no
patogènics.
4. La inestabilitat d’un al·lel és independent de l’estabilitat/inestabilitat
de l’altre al·lel.
Tenint en compte el que s’ha indicat fins ara, la
possible implicació clínica dels nostres resultats
radicaria a conèixer que l’exposició a agents genotòxics
pot actuar com un factor modulador d’una major
inestabilitat de repeticions de trinucleòtids associades
a la distròfia miotònica. Així, igual que passa en altres
malalties relacionades amb el que s’anomena inestabilitat
genòmica, l’exposició respecte d’agents
genotòxics suposa que és un factor de risc.
Recomanacions d’hàbits tendents a reduir exposicions
a agents genotòxics podrien ser útils en
persones amb predisposició a una inestabilitat de la
longitud d’aquestes repeticions de trinucleòtids.
4. Publicacions
X. Bardina, L. Fernàndez, E. Piñeiro, J. Surrallés i A. Velázquez.
Mathematical models to study subtoxic concentrations for some
standard mutagens in three colon cancer cell lines. Publicacions
del Servei d’Estadística, Universitat Autònoma de Barcelona.
01/2000: 1-14 (2000)
L. Fernàndez, E. Piñeiro, R. Marcos, A. Velázquez, J. Surrallés.
Trans-induction of genetic instability at disease-causing trinucleotide
repeat loci (enviat)
RECERCA BIOMÈDICA | 117

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
MEMÒRIA FINAL
Títol del projecte:
Revisió sistemàtica de l’evidència científica sobre
l’administració profilàctica d’antibiòtics i antiinflamatoris
en el tractament precoç de la fibrosi quística
1. Resum del projecte original
Antecedents
La infecció endobronquial recurrent en la fibrosi quística
exigeix tractament amb antibiòtics intravenosos
durant moltes setmanes, tractament que habitualment
s'administra en hospital, la qual cosa repercuteix en
els costos sanitaris i la qualitat de vida de pacients i
les seves famílies. No se sap si els pacients que reben
tractament intravenós a casa presenten resultats
millors o equivalents, si els costos es redueixen o si és
preferible al tractament en hospital. El tractament a
casa necessita instrucció de pacients i assistents i
normalment fan falta uns dies previs en hospital.
Objectius
Determinar si la teràpia d'antibiòtics per via intravenosa
a casa per tractar la fibrosi quística és tan efectiva
com la teràpia d'antibiòtics per via intravenosa en
hospital, i si els pacients i/o les seves famílies la
prefereixen.
Metodologia
Es van obtenir referències de proves a partir del
Investigador principal
Albert Marín Pérez
Institució
Consorci Hospitalari Parc Taulí
Membres de l’equip
Motserrat Bosque
770.000 PTA
registre de proves de fibrosi quística que té la base
editorial del Grup Cochrane de Fibrosi Quística i
Trastorns Genètics. Els autors van revisar els llibres de
resums de totes les conferències espanyoles sobre
fibrosi quística i l'última Conferència Europea
(Estocolm, 2000). Data de la recerca més recent del
registre especialitzat de tractaments de grup: abril de
2002. Proves controlades aleatòries de tractament a
casa per antibiòtics per via intravenosa per a pacients
amb fibrosi quística, es van comparar amb tractament
per antibiòtics per via intravenosa en hospital,
incloent-hi tant nens com adults amb fibrosi quística.
Es van incloure tots els antibiòtics administrats per via
intravenosa. Tres dels autors van seleccionar de forma
independent les proves que calia incloure en la revisió,
van avaluar la qualitat metodòlogica de cada prova i
van extreure dades utilitzant un imprès estàndard. A
causa de nombroses limitacions, en aquest punt es va
adoptar una síntesi explicativa.
Resultats principals
La recerca inicial va identificar 7 estudis. Es va incloure
un estudi que proporcionava els resultats d'un total
de 17 pacients entre 10 i 41 anys d'edat amb una
amb una exacerbació infecciosa per Pseudomones

aeruginosa. Tots els seus ingressos, fins a un total de
31, es van analitzar com a episodis independents. Els
resultats es van estudiar durant 21 dies a partir del
començament del tractament. Als pacients a casa
se'ls van efectuar menys investigacions que als
pacients en hospital (p

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
2, i 1 en va tenir 3; 1 en va tenir 4; i l'últim, 5. Cada
ingrés es va considerar en l'anàlisi com un episodi
diferent. Van haver-hi 18 ingressos en hospital i 13
ingressos a casa. Els pacients, a casa i en hospital
responien a criteris semblants quant a sexe, edat,
ingrés FEV1 i tipus de línia IV. Les edats oscil·laven
entre 10 i 41 anys, amb una mitjana de 22.
Els detalls del resum dels resultats més importants es
poden veure en la taula addicional sobre descripció
de resultats. La durada mitjana dels tractaments va
ser semblant per al braç de tractament a casa i en
hospital (12 respecte d'11 dies, p=0.20; de 10 a 24
respecte de 7 a 26). No es van trobar diferències
entre els dos braços quant al temps entre ingressos,
o quant a les dosis de tobramicina. L'ús d'antibiòtics
de manteniment va ser menor per al tractament a
casa (46% respecte de 71%). Als pacients els van fer
menys investigacions que als pacients en hospital
pacients (p

Títol del projecte:
La síndrome del cromosoma X fràfil (Fraxa i Fraxe). Valoració clínica
i molecular de 250 pacients diagnosticats. Estudis de metilació i
d’expressió transitòria del gen FMR1 en diferents línies cel·lulars
Investigador principal
Montserrat Milà Recasens
Institució
Hospital Clínic i Provincial de Barcelona
Membres de l’equip
Maria Rifé, Ma. Dolors Jiménez, Celia Baderra, Laia Rodríguez-Revenga, Irene Madrigal, Mónica López i
Jessica Lorente
14.982.775 PTA
MEMÒRIA FINAL
1. Resum del projecte original
Objectiu principal: aprofundir els coneixements
clínics i moleculars dels pacients diagnosticats de
síndrome del cromosoma X fràgil (SFX).
Objectius secundaris: definir uns patrons de
comportament que ens puguin orientar cap al
diagnòstic de la síndrome del cromosoma X fràgil.
Modificar el checklist clínic vigent. Valorar l’increment
del triplet CGG en 150 famílies afectades d’SFX en
dues o més generacions. Analitzar la descendència
d’individus amb l’expansió en la zona intermèdia (grey
zone). Establir l’existència o no de relació entre
premutació i menopausa precoç. Determinar l’expressió
del gen FMR1 en pacients diagnosticats com a
mosaics per a l’expansió.
Hipòtesi de treball: en aquests moments disposem
de 300 pacients afectats d’SFX i 300 portadors
asimptomàtics, com també de tècniques per fer els
estudis que ens permetin assolir els objectius plantejats.
La recerca s’encaminarà cap a l’estudi del
promotor, expressió i reactivació del gen a fi de
proporcionar nous coneixements que ajudin a un
tractament de la síndrome.
Mètodes: extracció de DNA, RNA i proteïnes, PCR,
Southern, Western, estudis d’expressió.
Resultats obtinguts: l’estudi de 147 dones amb falla
ovàrica prematura (POF) de població espanyola ha
permès determinar que la incidència de premutacions
en el gen FMR1 entre la població de dones amb FOP
és 11 vegades superior a la població general. Aquest
resultat ha constatat la necessitat d’incloure en els
protocols d’estudi genètics de menopausa precoç
l’estudi del gen FMR1. El cribratge del gen FMR1
d’una sèrie anònima de 5.000 mostres corresponents
a nadons de sexe masculí de la població general de
Catalunya, ha permès determinar la freqüència
d’homes afectats a Catalunya, que segons el nostre
estudi és d’1 en 2.468, i la portadors de la premutació
d’1 de cada 1.234. S’ha caracteritzat la nostra
població per la zona repetitiva CGG del gen FMR2
mitjançant l’estudi de 377 al·lels. S’han revisat 250
nuclis familiars amb un o més membres afectats
d’SFX; de totes s’han pogut avaluar 320 meiosis per
Southern o PCR, de manera que s’ha comptat la
variació del nombre de triplets CGG d’una generació a
RECERCA BIOMÈDICA | 121

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
la següent. S’ha posat a punt un nou mètode diagnòstic
per a l’SFX mitjançant l’estudi de la proteïna FMRP
en una extensió de sang o en arrel de cabell.
S’ha posat a punt de la PCR multiplex per al diagnòstic
preimplantacional de la síndrome del cromosoma X
fràgil en blastòmers d’embrions no viables.
Impacte potencial esperat: aquest projecte ha permès
aprofundir en el coneixement de la síndrome del
cromosoma X fràgil tant en el vessant clínic com en la
patologia molecular del gen FMR1.
2. Resultats
L’estudi de 563 pacients afectats d’RM i 208 controls
ha posat de manifest que no hi ha diferències entre
ambdós grups respecte de la incidència d’al·lels
intermedis per l’expansió de la zona repetitiva CGG
del gen FMR1. També s’ha constatat que l’estudi de
la proteïna FMRP en els individus portadors d’al·lels
intermedis pot ser de gran ajuda diagnòstica.
L’estudi de 147 dones de població espanyola i la seva
relació entre la menopausa precoç i l’expansió de la
zona repetitiva CGG del gen FMR1 ha constatat la
necessitat d’incloure en els protocols d’estudi
genètics de menopausa precoç l’estudi del gen
FMR1. La incidència de premutacions en el gen FMR1
entre la població de dones amb FOP és 11 vegades
superior a la població general (4,65%).
S’ha dissenyat un protocol per fer el cribratge per a
l’expansió del gen FMR1 als nounats aprofitant la
mostra que s’obté per al cribratge neonatal de PKU i
Hipoparatiroïdisme que es realitza a Catalunya.
Seguint aquest disseny, s’ha aplicat a 200 nadons i
s’han avaluat els costos (manuscrit en preparació). El
cost directe de la prova és de 2 euros si només es fa
PCR i de 6,2 euros si també s’hi inclou l’estudi de la
proteïna FMRP.
S’han avaluat 229 individus amb retard mental: 153
negatius per la mutació FRAXA i 76 positius. S’ha
dissenyat un cheklist nou adequat a la nostra població.
S’ha comparat amb el cheklist vigent i s’ha vist que el
nou té la mateixa eficàcia, però és més fàcil de passar,
ja que presenta menys ítems i preveu per separat les
avaluacions dels individus pre i postpuberals.
Posada a punt de la PCR multiplex per al diagnòstic
preimplantacional de la síndrome del cromosoma X
fràgil en blastòmers d’embrions no viables i en
corpuscle polar mitjançant els microsatèl·lits: DXS998,
FRAXAC1, FRAXAC2, DXS15 i AMG marcats fluorescents
i analitzats en el seqüenciador automàtic
ABI310.
S’ha realitzat el cribratge del gen FMR1 d’una sèrie
anònima de 5.000 mostres corresponents a nadons
de sexe masculí (any 1998) de la població general de
Catalunya. L’objectiu de l’estudi va ser determinar la
prevalença de la síndrome del cromosoma X fràgil al
nostre àmbit utilitzant una tècnica senzilla i no gaire
cara. La tècnica es basa en la no-amplificació del
fragment de repeticions CGG del locus FRAXA en les
mostres portadores d’al·lels amb un nombre superior
a 53 repeticions. Es van estudiar 4937 al·lels. La
freqüència d’homes afectats segons el nostre estudi
és d’1 en 2.468, i la d’al·lels en el rang de la premutació
és d’1 de cada 1.234. La revisió bibliogràfica
sembla indicar una variabilitat en les freqüències
bastant gran, fet pel qual creiem que els resultats
obtinguts són aptes per a Catalunya i extrapolables a
la població espanyola i, com a molt, a altres
poblacions mediterrànies.
S’han estudiat mitjançant PCR amb primers fluorescents
i anàlisi amb el seqüenciador automàtic ABI310:
343 al·lels per la zona repetitiva CGG del gen FMR2
corresponents a tres poblacions: a) 120 al·lels que
pertanyen a dones amb menopausa precoç sense
cap antecedent de retard mental a la seva família. b)
109 al·lels que corresponen a pacients amb retard
mental inespecífic per als quals s’havien descartat
prèviament anomalies cromosòmiques i expansió per
al gen FMR1, i finalment c) 114 al·lels corresponents a
la població general.
S’ha obtingut la distribució següent: 19 al·lels diferents
en un rang que va des de 9 fins a 32. No s’ha
observat cap al·lel dins del rang patològic. Els al·lels
més comuns són el de 14 i 15 per als grups d’RM i
població control i 15 i 19 per a la població de dones
amb FOP. S’ha realitzat Southern blot amb doble
digestió HindIII/Not I hibridant amb la sonda OxE19 en
els casos de dones homozigots per a un al·lel per tal
de descartar possibles expansions de la zona repetitiva
CGG del gen FMR2.
No s’han observat microdelecions en el gen FMR2 en
pacients amb FOP, tal com s’havia descrit en altres
poblacions.
Dels 57 diagnòstics prenatals corresponents a famílies
SFX, 47 embarassos van ser de dones portadores i
10 de dones amb un 50% de risc en el moment de
l’embaràs i que finalment no van ser portadores. Els
resultats obtinguts en els 47 embarassos de mares
portadores són els següents:
fetus normals, 10 homes i 12 dones
fetus portadors de la premutació 3 homes i 1 dona
fetus amb la mutació complerta 13 homes i 9 dones.
En un dels fetus afectats procedent d’una pacient
portadora d’una premutació de 70 CGG, l’estudi per
Southern blot amb doble digestió EcoRI/EagI i

hibridant amb la sonda StB12.3 mostrà una expansió
de 8,5 a 4,5 Kb i un fragment de 2,5 Kb. Indicant la
presència d’un mosaic per a una deleció i una
expansió. La caracterització d’aquesta deleció es
mostra en la figura següent:
Gen FMR1
Tot i que el fetus va ser diagnosticat amb afectació i
es va fer un IVE, en aquests moments estem
pendents dels estudis d’expressió de la proteïna
FMRP en els teixits fetals.
En un altre fetus procedent d’una mare portadora
d’una premutació, amb un fill anterior afectat per
l’SFX, es va detectar un fetus normal per a l’SFX, però
portador d’una cromosomopatia 46,XY, 18q-. I
finalment en dos altres fetus procedents de mares
portadores també es van detectar altres patologies
concurrents: una distròfia muscular de Duchenne (n’hi
havia antecedents familiars) i una cardiopatia.
Aquests resultats indiquen que malgrat que es faci el
diagnòstic prenatal de l’SFX, no es pot oblidar de fer
l’estudi citogenètic i l’estudi d’altres patologies de les
quals la parella consultant estigui en risc o les ecografies
pertinents.
Avaluació de 320 transmissions de la zona repetitiva
CGG en el gen FMR1. S’han revisat 250 nuclis
familiars amb un o més membres afectats de l’SFX;
de totes s’han pogut avaluar 320 meiosis per
Southern o PCR, de manera que s’ha comptat la
variació del nombre de triplets CGG d’una generació a
la següent. En aquests moments disposem dels
resultats, però estem pendents de l’avaluació i els
càlculs estadístics.
S’ha posat a punt un nou mètode diagnòstic de l’SFX
mitjançant l’estudi de la proteïna FMRP en una
extensió de sang o en arrel de cabell. En aquests
moments s’està fent una avaluació de la viabilitat de la
tècnica en escoles d’educació especial.
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
L’avaluació del checklist clínic de 153 pacients
afectats d’RM i la comparació amb 76 pacients
afectats per la síndrome del cromosoma X fràgil ens
ha portat a poder millorar l’exploració d’aquests
pacients i optimitzar la indicació de l’anàlisi molecular.
L’estudi realitzat en pacients amb menopausa precoç i
en pacients portadores de la premutació en el gen
FMR1, ha significat la inclusió de l’estudi de la regió
repetitiva CGG del gen FMR1 en el protocol d’estudis
genètics per a la menopausa precoç en diversos
hospitals del nostre àmbit.
L’estudi realitzat en pacients amb menopausa precoç
en el gen FMR2 ha significat la no inclusió de l’estudi
del gen FMR2 en els protocols d’estudi genètics per a
la menopausa precoç.
S’ha fet un estudi pilot amb avaluació de costos i
tecnologia per realitzar un cribratge neonatal a
Catalunya. Hem posat de manifest que és possible
sense que impliqui una despesa econòmica gaire gran.
Hem determinat la prevalença de l’SFX a Catalunya,
de manera que la síndrome afecta 1 de cada 2.468
nounats.
El fet de posar a punt l’estudi de la proteïna FMRP, en
extensions de sang o arrel de cabell, ha significat
l’exclusió o confirmació del diagnòstic d’X fràgil en
pacients amb RM i al·lels intermedis per l’FMR1.
També suposa disposar d’un mètode de cribratge per
poblacions.
El fet de posar a punt l’estudi de la proteïna FMRP, en
líquid amniòtic, en vellositats corials i en sang de
cordó, esperem que ens ajudi en alguns casos de
diagnòstic prenatal. En aquests moments s’està
acabant de posar a punt.
Ben aviat esperem poder oferir el diagnòstic preconcepcional
i preimplantacional per a aquesta síndrome.
Figura: Gen FMR1
4. Publicacions
M Rifé, A Nadal, M Milà, R Willemsen. Inmunohistochemical
FMRP studies in full mutated female foetus. Am J Med Genet
(2002) sotmès.
M Rifé,1 C Badenas,1 J Mallolas,1 L Jiménez,1 R Cervera,1 A
Maya,2 G Glover,4 F Rivera,1 M Milà1,3. First Fragil X screening in
5000 consecutive newborn males. Genet Test (2002) acceptat
M Rifé, J Mallolas, C Badenas, B Tazón, M Rodríguez Miguélez,
T Pàmpols, A Sánchez, Milà M. Pilot study for the neonatal
screening of fragile X syndrome. Prenatal Diagnosis (2002) 22:
459-462.
J Mallolas, M Milà. Síndrome del cromosoma X frágil: Aspectos
ginecológicos. Menopausia precoz. Diagnóstico Preimplantatorio.
Revista de Neurología (2001) 33:S20-S24.
J Mallolas, M Duran, A Sánchez, D Jiménez,S Castellví, M Rifé,
M Milà. Implications of the FMR1 gene in menopause: study de
147 Spanish women Menopause 8:106-110.
M Duran, J. Mallolas, M. Rifé, S. Castellví D. Jiménez, A.
Sánchez, M. Milà. Elevada incidencia de premutaciones en el gen
FMR1 en mujeres españolas con fallo ovárico prematuro.
Progresos de Obstetricia y Ginecología (2001) 44:261 -266.
S Castellvi-Bel, M Fernández Burriel, M Rifé, D Jiménez, J
Mallolas, A Sánchez, F Ramos, M Milà. Detection of the Fragile X
Syndrome Protein for the evaluation of FMR1 intermediate alleles.
Hum Genet 2000 107:195-196.
M Milà, S Castellví-Bel, A Sánchez, A Barceló, C Badenas, J
Mallolas, X Estivill. Rare variants in the promoter of the fragile X
syndrome gene (FMR1) Molecular and Cellular Probes (2000) 14:
115-119.
RECERCA BIOMÈDICA | 123

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
MEMÒRIA FINAL
Títol del projecte:
Estudi dels factors genètics determinants de l’evolució
de l’emfisema congènit per dèficit d’alfa-1-antitripsina
1. Resum del projecte original
El dèficit d’alfa-1-antitripsina (AAT) és una malaltia
congènita que es manifesta en forma d’emfisema
pulmonar en l’edat adulta, sobretot en persones
fumadores. L’emfisema en aquestes persones és
d’aparició precoç i especialment greu, però aquesta
gravetat pot ser molt variable i es creu que deu haverhi
altres determinants genètics que modulin l’expressió
del dèficit d’AAT.
L’estudi estava destinat a identificar nous factors
genètics que puguin ser responsables del desenvolupament
del dany pulmonar característic de l’emfisema
congènit en malalts amb dèficit d’AAT. I també a
esbrinar si aquests polimorfismes poden estar relacionats
amb la susceptibilitat individual al fum del tabac
també en persones no deficitàries.
Objectius de l’estudi
1. Estudiar la presència de mutacions en el gen de
l’AAT en pacients amb emfisema pulmonar d’especial
gravetat i caracterització del dèficit molecular.
2. Analitzar el polimorfisme del gen de l’epoxi hidrolasa
microsomal (EHM), de la glutation S transferasa P1
Investigador principal
Marc Miravitlles Fernández
Institució
Hospital General Universitari Vall d’Hebron
9.175.000 PTA
(GSTP1) i de la regió reguladora pròxima a l’extrem 3’
del gen de l’AAT en pacients amb dèficit parcial i amb
dèficit greu d’AAT que presentaven diversos patrons
d’evolució clínica.
3. Estudiar els polimorfismes esmentats anteriorment
en persones fumadores susceptibles i no susceptibles
a l’efecte del tabac, per identificar el seu possible
paper com a reguladors genètics de la susceptibilitat
individual al desenvolupament d’emfisema pulmonar.
Disseny de l’estudi
Es tracta d’un estudi transversal de factors de risc
genètic. S’han estudiat diverses poblacions: malalts
amb dèficit greu d’AAT, fenotip homozigot PiZZ; individus
amb dèficit parcial d’AAT, fenotip heterozigot PiMZ;
fumadors amb emfisema pulmonar, fumadors no
susceptibles al tabac i un grup control d’individus sans.
D’aquest treball, se’n van excloure els malalts amb
d’altres patologies respiratòries diferents de l’MPOC o
l’emfisema que poguessin interferir els resultats de
l’estudi, com són: presència de bronquièctasi,
pneumònies de repetició, alteracions immunològiques
humorals o cel·lulars, anomalies pulmonars congènites,
tuberculosi pulmonar, infecció per VIH o exposició
professional a tòxics respiratoris.

A tots els malalts, se’ls va fer radiografia toràcica en 2
projeccions, tomografia computeritzada toràcica per
descartar bronquièctasi i altres malalties pulmonars
congènites, proves de funció respiratòria completes,
que consten d’espirometria, prova broncodilatadora,
estudi dels volums pulmonars per pletismografia i
difusió del monòxid de carboni. També es va practicar
analítica sanguínia amb determinació d’inmunoglobulines
i subclasses d’IgG.
Els controls sans es van reclutar entre treballadors
sanitaris no emparentats, que acudien a revisió de
salut periòdica i que no presentaven malaltia respiratòria
descartada per radiologia de tòrax i espirometria
normal.
Tots els participants en l’estudi van aportar mostres de
sang per a estudi de polimorfismes dels gens en estudi.
Pla de treball
El pla de treball consistia a identificar les poblacions
d’estudi i posar a punt la tecnologia per a l’extracció
de l’ADN i l’anàlisi dels polimorfismes durant els dos
primers anys. El tercer any va ser destinat a la conclusió
de les determinacions genètiques i la redacció dels
darrers resultats.
2. Resultats
Objectiu 1
Estudiar la presència de mutacions en el gen de l’AAT
en pacients amb emfisema pulmonar d’especial
gravetat i caracterització del dèficit molecular.
S’ha aconseguit estudiar 57 malalts amb dèficit d’alfa-
1-antitripsina (DAAT) en comptes dels 20 malalts
previstos inicialment. Aquest nombre tan elevat de
mostres sanguínies de malalts amb fenotip deficient
PiZZ ha estat possible gràcies a la col·laboració dels
coordinadors del Registre Espanyol del Dèficit d’AAT,
que han enviat mostres dels seus malalts. S’ha
caracteritzat el dèficit molecular a fi de poder etiquetar
la mutació en el gen de l’AAT en malalts en aquells
casos en què els nivells plasmàtics no es corresponien
amb el fenotip que el metge ens expressava en la
seva petició.
En aquests casos discordants, després de fer la
determinació de les concentracions sèriques per
immunonefelometria i determinació del fenotip per
tècnica d’isoelectroenfoc en gradient de pH es va fer
l’estudi molecular del dèficit d’AAT mitjançant amplificació
per la tècnica de la reacció en cadena de la
polimerasa (PCR) del gen de l’AAT i seqüenciació
directa del producte amplificat. D’aquesta forma hem
detectat 2 variants deficitàries noves, que hem
anomenat Mvall d’Hebron i Ybarcelona.
El cas índex portador del fenotip deficient PIYbarcelona
va ser diagnosticat d’MPOC greu i es va fenotipar
inicialment com a PiZZ; en seqüenciar la molècula es
va comprovar que es tractava del fenotip homozigot
deficient PIYbarcelona. S’ha estudiat la resta de la
família del malalt portador d’aquesta mutació i s’ha
pogut obtenir informació de l’evolució de la funció
pulmonar durant sis anys. Aquests resultats estan
acceptats per ser publicats a la revista Chest.
L’altre fenotip deficient que hem diagnosticat recentment,
PIMvall d’Hebron, difereix de l’al·lel normal M1
en un canvi de base en l’exó V.
Objectius 2 i 3
Analitzar els polimorfismes del gen de l’epoxi hidrolasa
microsomal (EHM), de la glutation S transferasa P1
(GSTP1) i de la regió reguladora pròxima a l’extrem 3’
del gen de l’AAT en pacients amb dèficit parcial o
amb dèficit greu d’AAT que presentaven diversos
patrons d’evolució clínica, com també en fumadors
susceptibles a l’efecte del tabac, per identificar el seu
possible paper com a reguladors genètics de la
susceptibilitat individual al desenvolupament d’emfisema
pulmonar.
Aquests polimorfismes s’han estudiat en 4
poblacions: pacients amb MPOC, pacients amb
dèficit greu i amb dèficit parcial d’AAT i controls sans.
Els resultats es presenten de manera conjunta en les
taules següents.
Les característiques de la població de malalts amb
MPOC i amb dèficit d’AAT es mostren en la taula 1.
Taula 1. Característiques clíniques i funcionals de dues
de les poblacions estudiades (MPOC i Pi ZZ)
AAT: Alfa-1-antitripsina, PI: proteinase inhibitor;
MPOC: malaltia pulmonar obstructiva crònica.
Estudi de les mutacions de l’epoxi hidrolasa microsomal
(EHM):
Les mutacions en el gen de la EHM més freqüents
són mutacions esporàdiques en els exons III i IV, que
donen com a resultat 2 substitucions en 2 aminoàcids
que disminueixen l’activitat d’aquest enzim. Hi ha
estudis que descriuen l’associació entre els polimorfismes
en l’exó III i una major susceptibilitat per
desenvolupar MPOC. Fins al moment aquests
polimorfismes s’avaluaven per 2 mètodes convencionals:
RFLP (estudi dels polimorfismes de longitud per
fragments de restricció), per detectar les variants
Tyr113His, i la tècnica d’SSCP (polimorfismes de
conformació de cadena senzilla) per a la detecció de
la variant His139Arg.
En el transcurs d’aquest treball hem desenvolupat 2
mètodes per a la detecció ràpida dels polimorfismes
en els exons III (Tyr113 His) i IV (His139 Arg) del gen
de la EHM amb un mètode nou que es basa a
detectar les diverses temperatures de liqüefacció
derivades de la hibridació dels oligonucleòtids per
tècnica de PCR (reacció en cadena de la polimerasa);
aquest mètode ha estat publicat recentment (Anal
Biochem 2002; 308:120-126).
En les taules 2 i 3 s’observen les distribucions dels
RECERCA BIOMÈDICA | 125

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
Taula 2.
Taula 3.
Taula 4.
Taula 5.
Taula 6.
polimorfismes en l’exó III i en l’exó IV del gen de
l’EHM en malalts amb dèficit greu (PiZ) i parcial (Pi MZ)
d’AAT, juntament amb els resultats en els malalts amb
MPOC i en el grup control.
Taula 2. Distribució dels polimorfismes en l’exó III del gen
de l’EHM en malalts amb MPOC, dèficit d’alfa-1-antitripsina
(PiZZ), dèficit intermedi (MZ) i en voluntaris sans.
Taula 3. Distribució dels polimorfismes en l’exó IV del gen
de l’EHM en malalts amb MPOC, dèficit d’alfa-1-antitripsina
(PiZZ), dèficit intermedi (MZ) i en voluntaris sans.
Els nostres resultats mostren que la proporció d’individus
homozigots mutants per la His113 és significativament
superior en el grup de malalts amb MPOC en
comparació amb el grup de subjectes sans. En canvi,
no vam trobar diferències en la distribució del genotip
dels polimorfismes en l’exó 4 en el grup de malalts amb
MPOC en comparació amb el grup de subjectes sans.
En resum, la freqüència dels fenotips que confereixen
una activitat molt lenta a l’EHM és superior en els
subjectes amb MPOC que en els individus normals
(p

significativa amb la presència d’un dèficit d’AAT (PiZZ)
i també amb una pitjor funció pulmonar en aquests
individus. Estudi dels polimorfismes en la regió reguladora
de l’extrem 3´ del gen de l’alfa-1- antitripsina.
En la taula 6 s’expressen els resultats obtinguts en
analitzar els polimorfismes de la regió reguladora
pròxima a l’extrem 3’ del gen de l’alfa-1-antitripsina.
Taula 6. Distribució dels polimorfismes en la regió
reguladora de l’extrem 3’ del gen de l’AAT en malalts
amb MPOC, dèficit d’alfa-1-antitripsina (PiZZ), dèficit
intermedi (MZ) i en voluntaris sans
S’observa com el genotip heterozigot és significativament
més freqüent en malalts amb MPOC que en
voluntaris sans, la qual cosa indica una possible
susceptibilitat augmentada al fum del tabac en els
portadors d’aquest genotip.
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
1. Els malalts amb emfisema pulmonar greu i joves, a
més del fenotip conegut PiZZ, poden ser portadors
d’altres mutacions, com les noves mutacions detectades
al nostre centre —Ybarcelona, Mvall d’Hebron—,
que confereixen nivells baixos d’aquest enzim en
plasma. Per aquest motiu és important l’estudi genètic
en pacients amb dèficit d’AAT que presenten un
emfisema pulmonar d’especial gravetat.
2. Hem detectat que la mutació homozigota Val105
de la glutation S-transferasa P1 s’associa amb una
pitjor funció pulmonar en portadors de l’al·lel Z, sigui
homozigot o heterozigot.
En canvi, aquesta mutació no sembla tenir efecte en
fumadors sense dèficit d’AAT. Per aquest motiu es pot
afirmar que aquesta mutació s’associa amb una major
susceptibilitat al fum del tabac, però només en
absència d’AAT. La molècula d’AAT té una funció
protectora que és capaç de contrarestar la manca
d’activitat enzimàtica de la GSTP1. Els tractaments
destinats a suplir la funció de la glutation S-transferasa
P1 podrien millorar el pronòstic de malalts amb DAAT
parcial o total.
3. Segons els nostres resultats, les mutacions en l’exó
3 de l’EHM s’associen amb un risc elevat d’MPOC en
subjectes fumadors. Això comporta la possibilitat
d’identificar persones susceptibles a l’efecte tòxic del
tabac i també permet establir la importància d’aquest
enzim en la complexa patogènia de l’MPOC.
4. La tècnica desenvolupada de cribatge i genotip
dels al·lels S i Z en gota de sang seca sobre paper de
filtre mitjançant el nou aparell LightCycler és ràpida,
senzilla, econòmica i sensible en detectar ambdós
al·lels deficients. Gràcies a aquesta tècnica es pot dur
a terme cribatge de poblacions amplies a un cost
raonable per detectar aquesta malaltia genètica. El
cribatge d’aquest dèficit, tal com recomana l’OMS,
s’hauria de fer almenys un cop a la vida en els malalts
amb MPOC.
4. Publicacions
Costa X, Jardí R, Rodríguez F, Miravitlles M, Cotrina M,
González C, Pascual C, Vidal R. Simple method for alpha1antitrypsin
deficiency screening by use of dried blood spot
specimens. Eur Respir J 2000; 15: 1111-1115.
Rodríguez-Frias F, González C, Costa X, Campos F, Cotrina M,
Jardí R, Miravitlles M, Vidal R. Screening for polymorphisms in
exon 5 of the glutathione S-transferase P1 gene. Thorax 2000;
55: 535-536.
Rodríguez F, Jardí R, Costa X, Juan D, Galimany R, Vidal R,
Miravitlles M. Detection of polymorphisms at exons 3 (Tyr113--
>His) and 4 (His139-->Arg) of the microsomal epoxide hydrolase
gene using fluorescence PCR method combined with melting
curves analysis. Anal Biochem 2002; 308:120-126.
Vilà S, Miravitlles M, Campos Añón F, De la Roza C, Segura R,
Morell F, Vidal R. La interleucina 6 como mediador de inflamación
sistémica en enfermos con déficit de alfa-1-antitripsina. Arch
Bronconeumol 2002; 38: 263-266.
Rodríguez F, Jardí R, Costa X, Cotrina M, Galimany R, Vidal R,
Miravitlles M. Rapid screening for alpha1-antitrypsin deficiency in
patients with chronic obstructive pulmonary disease using dried
blood specimens. Am J Respir Crit Care Med 2002;166: 814-817.
De la Roza C, Costa X, Vidal R, Vilà S, Rodríguez-Frías F, Jardí
R, Miravitlles M. Programa de cribado para el déficit de alfa-1antitripsina
en pacientes con EPOC mediante uso de gota de
sangre en papel secante. Arch Bronconeumol 2003; 39: 8-12.
Miravitlles M, Vilà S, Jardí R, de la Roza C, Rodríguez-Frías F,
Vidal R. Emphysema due to alpha-1-antitrypsin deficiency: familial
study of the Ybarcelona variant. Chest 2003 (en premsa).
Rodríguez F, de la Roza C, Jardí R, Galimany R, Vidal R,
Miravitlles M. Glutathione S-transferase P1 (GSTP1) genetic
polymorphisms and alpha-1-antitrypsin deficiency and usual
COPD. Am J Respir Crit Care Med 2003 (en revisió).
Miravitlles M, Jardí R, Vilà S, Rodríguez-Frías F, Hammad I,
Morell F, Vidal R. Anàlisi genètica dels polimorfismes candidats a
conferir una susceptibilitat augmentada al desenvolupament de la
MPOC. XVII Diada Pneumològica. Mataró 9 i 10 d’abril de 1999.
Ann Med (Barc) 1999; 82 (Supl 1): 16s.
Miravitlles M, Jardí R, Vilà S, Rodríguez-Frías F, Morell F, Vidal R.
Estudi dels factors genètics relacionats amb el desenvolupament
de la MPOC. XXXII Congrés Nacional de la SEPAR. Barcelona,
15-18 de maig de 1999. Arch Bronconeumol 1999; 35 (supl 2): 9.
De la Roza C, Miravitlles M, Jardí R, Rodríguez-Frías F, Vilà S,
Costa X, Vidal R. Polimorfisme genètic del gen de la Glutation Stransferasa
P1 (GST P1) i malaltia pulmonar obstructiva crònica.
XXXIII Congrés Nacional SEPAR. Bilbao 10-13 de juny de 2000.
Arch Bronconeumol 2000 (Supl 2); 36: 1.
Vilà S, de la Roza C, Miravitlles M, Jardí R, Rodríguez-Frías F,
Costa X, Vidal R. Polimorfismes genètics del gen de la glutation Stransferasa
P1 (GST P1) i la malaltia pulmonar obstructiva crònica
(MPOC). XVIII Diada Pneumològica. Barcelona, 7-8 d’abril de
2000. Ann Med (Barc) 2000; 83 (Supl 2): s15.
Miravitlles M, Jardí R, González C, Rodríguez-Frías F, Vilà S,
Costa X, De la Roza C, Vidal R. Genetic polymorphism of
glutathione S-transferase P1 gene and chronic obstructive
pulmonary disease. 2000 ALA/ATS International Conference.
Toronto (Canadà), 5-10 de maig de 2000. Am J Respir Crit Care
Med 2000; 161: A208.
De la Roza C, Miravitlles M, Jardí R, Vilà S, Rodríguez-Frías F,
Costa X, Vidal R. Augment en la prevalença de MPOC en els
portadors de variants lentes de l'enzim epoxi hidrolasa microsomal.
XIV Diada Pneumològica. Terrassa, 6-7 Abril de 2001. Ann
Med (Barc) 2001; 84 (Supl 1): s10.
De la Roza C, Miravitlles M, Jardí R, Vilà S, Rodríguez-Frías F,
Costa X, Vidal R. Risc elevat de desenvolupar MPOC en els
portadors de variants lentes de l’Epoxi Hidrolasa Microsomal.
XXXIV Congrés Nacional SEPAR. La Corunya, 9-12 de juny de
2001. Arch Bronconeumol 2001; 37 (Supl 1): 17.
RECERCA BIOMÈDICA | 127

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
MEMÒRIA FINAL
1. Resum del projecte original
Diferents estudis han correlacionat el procés de
regeneració del múscul esquelètic, que es dóna com
a conseqüència d’una alteració muscular congènita o
d’una lesió traumàtica, amb l’activitat proteolítica de
l’enzim uPA. En aquest sentit, s’ha observat un
augment d’uPA en determinades patologies
musculars (distrofinopaties congènites), com la distròfia
muscular de Duchenne (DMD), com també en el
seu model animal, el ratolí mdx.
Malgrat tot, la demostració directa del paper d’uPA en
la regeneració muscular induïda o congènita mai no
ha estat provada. En aquest projecte hem demostrat
un paper clau de l’enzim proteolític uPA en la regeneració
del múscul esquelètic, a partir de l’anàlisi de les
conseqüències de l’absència d’uPA en ratolins uPA-/després
d’una lesió muscular in vivo. De la mateixa
manera, per encreuament de ratolins mdx amb
ratolins uPA-/- hem demostrat que la deficiència
d’uPA potencia la distrofinopatia del ratolí mdx.
L’absència d’uPA en ambdós models de regeneració
muscular va donar com a resultat una deficient
resposta inflamatòria i una acumulació de fibrina
Títol del projecte:
Paper de l’enzim proteolític uPA en la regeneració muscular
de ratolins deficients en uPA (uPA-/-) i de ratolins
mutants musculars MDX i Wobbler in vivo
Investigador principal
Pura Muñoz Cánoves
Institució
Institut de Recerca Oncològica
28.776.450 PTA
extravascular. La desfibrinogenització dels ratolins
deficients per l’expressió d’uPA va restaurar la correcta
regeneració muscular. Aquests estudis han
demostrat per primera vegada la importància de la
fibrinòlisi extravascular en la regeneració del múscul
esquelètic, fet que constitueix una troballa amb
potencial terapèutic per al tractament de lesions
musculars tant traumàtiques com congènites.
2. Resultats
L’activitat fibrinolítica de l’enzim uPA és necessària
per a la regeneració muscular induïda per lesió.
L’activació del zimogen plasminogen (Plg) en la
proteasa activa plasmina està molt regulada i és un
mecanisme molt estès en la generació d’activitat
proteolítica extracel·lular. L’activació del Plg ve donada
per 2 tipus diferents d’activadors, l’activador de tipus
tissular (tPA) i l’activador de tipus urocinasa (uPA). El
sistema d’activació del plasminogen és un factor clau
en la dissolució de matriu de fibrina i és crític en el
manteniment del balanç de l’hemostàsia. A més a
més, està relacionat amb la degradació de matriu
extracel·lular en processos de reestructuració tissular i
migració cel·lular, tant fisiològics com patològics, com
l’ovulació, la invasió trofoblàstica, la involució mamària

postlactacional, la reparació de ferides, l’angiogènesi i
la invasió cel·lular tumoral.
La proteòlisi extracel·lular té lloc tant durant la
formació del múscul esquelètic com durant la seva
regeneració, en què les cèl·lules satèl·lits, precursores
musculars, són de gran importància. En resposta a la
lesió muscular, el teixit lesionat es veu envaït per un
infiltrat compost per fibroblasts, cèl·lules inflamatòries i
macròfags. El teixit necròtic és eliminat i comença la
revascularització i la proliferació de cèl·lules satèl·lits.
Un gran nombre d’enzims proteolítics han estat
proposats per participar durant el procés de regeneració
muscular, tant en la resposta inflamatòria com en
la migració de fibroblasts a través de la làmina basal i
en la seva posterior fusió per la formació de la fibra
muscular. Les metal·loproteases (MMP), com l’MMP-
2, l’MMP-9, la meltrina-α i la catepsina-β sembla que
fan falta per a la formació, in vitro, de miotubs. De la
mateixa manera, l’expressió d’MMP-2 i MMP-9 es
presenta en processos de degeneració-regeneració
de miofibres in vivo. S’ha trobat que en la majoria de
tipus cel·lulars, el mecanisme d’activació de les MMP
necessita una cascada proteolítica iniciada per uPA.
Moltes de les MMP poden ser directament activades
per la plasmina mitjançant un ancoratge d’unió a una
proteïna de baix pes molecular. L’expressió d’uPA i
tPA s’ha demostrat en cultius cel·lulars de pollastre,
ratolí, rata i múscul humà. Recentment, hem
demostrat que la inhibició de l’acció proteolítica d’uPA
amb un anticòs anti uPA bloqueja la migració, fusió i
diferenciació, in vitro, de mioblasts de C2C12.
En aquest estudi, nosaltres descrivim les conseqüències
de la inactivació dels gens del sistema d’activació
del plasminogen durant la regeneració del múscul
esquelètic. Ratolins deficients per l’expressió d’uPA,
però no per tPA, mostren un defecte pronunciat en la
regeneració, després d’haver induït experimentalment
una ferida al múscul, tot suggerint un paper de
protecció d’uPA en el procés de regeneració
muscular. La persistència de la degeneració muscular
en ratolins deficients en uPA és reproduïda en ratolins
deficients en plasminogen. Això indica que de les
dues vies d’activació del plasminogen (mediat per uPA
o tPA), la via induïda per uPA es més gran en el
procés de regeneració muscular. Aquest fet es
refermat per un zimograma, en què extractes proteics
de múscul en regeneració de ratolí wild type, sols
mostren activitat uPA. A més a més, en mioblasts
murins C2C12, també és predominant l’activitat uPA.
Nosaltres vam demostrar una acumulació significativa
de fibrina extravascular en múscul en regeneració, tant
en ratolins uPA-/- com plasminogen-/-. La deposició
de fibrina extravascular és una de les característiques
clau dels processos inflamatoris i de reparació tissular,
incloent-hi l’impediment del guariment de ferides a la
pell, i la glomerulonefritis. En aquestes dues
situacions, hi ha un error en la desaparició de la
fibrina, atribuïble a la reducció de la fibrinòlisi induïda
per uPA o tPA, respectivament.
Quan experimentalent induíem la degeneració
muscular, vam trobar que la deficiència en uPA
portava a un increment del nivells de fibrina muscular,
tot indicant la importància d’uPA en la desaparició de
fibrina extravascular. L’acumulació de fibrina en la
membrana extracel·lular possiblement té un efecte
deleteri, com l’impediment de la nutrició normal del
teixit muscular. La relació entre l’increment del nivell de
fibrina i la prolongació de la degeneració muscular es
va estudiar per desfibrinogenització de ratolins
deficients en uPA; l’administració d’ancrod reduïa els
nivells de fibrinogen en ratolins uPA deficients i
produïa una restauració substancial del procés de
regeneració del múscul normal. Aquests resultats
demostren que una excessiva i persistent acumulació
de fibrina o fibrinogen presenta un paper patogènic,
tot sostenint la degeneració muscular. Nosaltres vam
trobar que la pèrdua d’activació del plasminogen
impedeix la regeneració muscular, la qual cosa ens va
fer plantejar la pregunta de com el sistema uPA-Plg
està involucrat en la reparació tissular.
En conclusió, els nostres resultats demostren que la
deficiència en uPA té un paper beneficiós en la regeneració
muscular després d’una lesió, principalment
mitjançant una activitat fibrinolítica mediada per uPA.
L’absència d’uPA augmenta el grau de distrofinopatia
dels ratolins mdx: paper de la fibrinòlisi en la regeneració
del múscul distròfic.
La distròfia muscular de Duchenne (DMD) és la
malaltia lligada al cromosoma X més freqüent, tot
afectant un de cada 3.500 nens. La DMD és causada
per mutacions en el gen que codifica per la proteïna
distrofina, la qual es localitza en la cara interna del
sarcolema i s’associa amb les proteïnes de membrana
que formen el complex DGC (dystrophin glycoprotein
complex). La distrofina s’uneix als filaments d’actina a
través del seu extrem N-terminal i al complex DGC pel
seu extrem C-terminal, fets que fan que sigui un
component molt important del conjunt de proteïnes
que uneixen la matriu extracel·lular i el citoesquelet, tot
donant estabilitat i integritat a la membrana plasmàtica.
Sense la distrofina unint la matriu extracel·lular
amb el citoesquelet de la cèl·lula muscular, els
músculs es van danyant amb els diversos processos
de contracció i estirament de les fibres musculars que
els componen. La soca de ratolins mdx és el model
murí de la malaltia DMD més utilitzat, ja que no
expressa el gen de la distrofina a causa d’una mutació
en l’exó 23 del gen. Tant els malalts amb DMD com
els ratolins mdx pateixen un progressiu deteriorament
muscular, després de successius cicles de degeneració-regeneració
muscular, i el teixit muscular malmès
és substituït primer per teixit fibròtic i després per teixit
adipós. Però tot i les semblances genètiques, bioquímiques
i histològiques entre els pacients amb DMD i
els ratolins mdx, les manifestacions clíniques dels
ratolins mdx són menys severes que les dels humans,
perquè tenen una mitjana de vida normal i presenten
el pic de major debilitat muscular entre les dues i cinc
setmanes de vida.
En aquesta segona part del projecte, hem analitzat les
conseqüències de la inactivació d’uPA en la regeneració
del músculs distròfics. Els ratolins mdx/uPA-/pateixen
una miopatia més severa que els ratolins
mdx, ja que aquests darrers presenten senyals
recurrents de degeneració i necrosi seguits d’una
correcta regeneració. Les anàlisis histològiques dels
músculs esquelètics dels ratolins mdx/uPA-/- revelen
lesions grans amb miotubs necròtics, gran nombre de
cèl·lules mononuclears i grans infiltrats necròtics, en
comparació amb els músculs mdx. Atès que el
començament de la miopatia en els ratolins mdx/uPA-
/- és a les tres setmanes de vida com en els ratolins
RECERCA BIOMÈDICA | 129

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
mdx, les nostres observacions suggereixen que la
manca de l’activitat proteolítica uPA incrementa la
patologia més que no avançar-ne l’inici. Els nostres
resultats demostren que és l’activitat uPA i no la tPA la
que és augmentada en els músculs distròfics mdx, tot
suggerint un paper beneficiós d’uPA en el procés de
regeneració muscular. Prèviament, al laboratori havíem
demostrat que les activitats uPA i plasmina estaven
augmentades en la regeneració muscular postferida i
que en els ratolins deficients per a l’expressió d’uPA i
Plg la regeneració muscular posttraumàtica era
severament impedida després de la ferida muscular
induïda per injecció de glicerol o cardiotoxina.
La deposició extravascular de fibrina és un fet clau en
patologies caracteritzades per presentar inflamació i
reparació tissular, com són la curació de ferides de la
pell o la glomerulonefritis. En aquestes dues
situacions, l’acumulació de fibrina és atribuïble a la
reduïda fibrinòlisi mediada per uPA o tPA, respectivament.
Amb la generació dels ratolins mdx/uPA-/- hem
pogut demostrar la importància de l’activació del
plasminogen a través d’uPA per degradar la fibrina
acumulada en els músculs distròfics. L’acumulació de
fibrina en la membrana basal extracel·lular podria tenir
efectes deleteris, com l’impediment d’una nutrició
normal del teixit muscular. La hipòtesi que l’augment
dels nivells de fibrina detectats en els ratolins
mdx/uPA-/- podrien contribuir a l’impediment de la
regeneració muscular, va ser estudiada a partir de
l’administració d’una substància anomenada ancrod,
que redueix els nivells de fibrina en plasma. L’anàlisi
histològica de músculs de ratolins mdx/uPA-/- que
van ser tractats amb ancrod durant 18 dies va
demostrar una gairebé restauració total del procés de
regeneració muscular, tot suggerint, doncs, el paper
patològic de l’acumulació de fibrina en la degeneració-regeneració
muscular.
Discussió general dels resultats
El fet d’haver trobat que l’absència d’activitat uPA
impedeix la regeneració muscular, deixa oberta la
pregunta de com l’activitat proteolítica uPA està
implicada en la reparació tissular. La inflamació és un
procés freqüentment associat a la reparació tissular, ja
que el teixit degenerant és envaït per cèl·lules inflamatòries.
Nosaltres i altres laboratoris hem demostrat
que hi ha una acumulació de macròfags i limfòcits T
en el lloc danyat durant els primers dies postlesió i en
els músculs distròfics. En ratolins mdx/uPA-/- de 19
dies de vida (4 dies després que la degeneració hagi
començat) hem observat una reducció en el nombre
de macròfags i limfòcits T en els músculs danyats en
comparació amb ratolins mdx de la mateixa edat, fet
que suggereix que l’absència d’uPA estaria implicada
en aquesta reducció de cèl·lules inflamatòries.
Recentment, el nostre grup també ha demostrat una
disminució del nombre de macròfags i limfòcits T que
arriben al múscul lesionat en ratolins deficients per a
l’expressió d’uPA i Plg. Tot això suggereix que l’activitat
uPA/plasmina podria tenir un profund efecte en
processos inflamatoris i en malalties musculars
associades a processos inflamatoris. Estudis anteriors
duts a terme amb ratolins uPA-/- van demostrar que
uPA era necessari per a la correcta resposta inflamatòria
pulmonar com a resposta a l’agent infecciós
Cryptococcus neoformans, atès que la manca d’acti-
vitat uPA resultava en un reclutament inadequat de
macròfags que acabava comportant una infecció
incontrolada i la mort del ratolí. De la mateixa manera,
el reclutament de macròfags i limfòcits T és significativament
inferior en els ratolins Plg-/- durant el procés
d’inflamació peritoneal induït per tioglicolat.
A més a més, components del sistema d’activació del
plasminogen poden regular l’expressió i/o activar
citocines implicades en processos inflamatoris. Per
exemple, uPA produït endògenament pot amplificar la
síntesi de novo de TNF-α de fagòcits mononuclears,
tot representant un nou mecanisme pel qual les
proteases derivades dels fagòcits contribueixen a
generar senyals proinflamatoris. D’altra banda, s’ha
demostrat que la plasmina allibera la interleucina-1 i
activa el TGF-β produïts pels macròfags. Per tot això,
és temptador especular que uPA/plasmina podrien
tenir un paper similar en els processos inflamatoris
causats per lesions musculars espontànies. La
reduïda presència de macròfags i limfòcits T en els
ratolins mdx/uPA-/- podria tenir com a causa o bé
una reduïda capacitat de migració de les cèl·lules
inflamatòries provocada per la manca d’activitat
plasmina, o bé el reduït potencial d’aquestes cèl·lules
per travessar les matrius de fibrina. A més a més, ha
estat demostrat que els macròfags activats (equivalents
als que s’acumulen en el lloc danyat) produeixen
factors solubles, com FGF i PDGF, els quals són
molècules quimioatraients i mitogèniques per a les
cèl·lules precursores musculars. És a dir, els
macròfags activats que s’acumulen en el lloc danyat
no tan sols fagociten el teixit amb necrosi, sinó que
també faciliten la reparació de les miofibres danyades.
Tots aquests processos queden, doncs, alterats si els
macròfags no s’acumulen en el lloc danyat, la qual
cosa podria explicar la persistent degeneració
muscular observada en els ratolins mdx/uPA-/-.
La hipòtesi que, en general, l’activació del plasminogen
mediada per uPA facilita la penetració cel·lular en
matrius que contenen fibrina concorda amb l’argument
en què es dóna la regeneració muscular
esquelètica, on hi ha conversió local de plasminogen a
plasmina i subsegüent degradació de la fibrina. La
plasmina és probablement un membre d’un grup
altament regulat i especialitzat d’enzims que degraden
la matriu extracel·lular, en el qual s’inclouen les
serines-, metal·lo- i altres classes de proteases, que
conjuntament serveixen per a la reestructuració de la
matriu extracel·lular i la reorganització cel·lular de
camps lesionats. Les nostres dades suggereixen que
la plasmina és particularment necessària en la solubilització
de la fibrina, i que sense ella, la reorganització
cel·lular de matrius riques en fibrina està impedida
severament. Concloem que el sistema de l’uPA/Plg és
necessari per a la regeneració muscular normal i la
resolució correcta del dany muscular en ratolins. La
presència reduïda de macròfags i limfòcits T en el
teixit danyat suggereix que un factor clau en la reparació
més lenta del múscul en ratolins mdx/uPA-/podria
ser la reduïda capacitat dels macròfags i
limfòcits T a digerir proteolíticament el seu camí a
través de la matriu extracel·lular fins al lloc danyat. En
aquest model, un dels components majoritaris que
està present dins de l’àrea danyada i que podria
representar un impediment en la migració de les
cèl·lules inflamatòries en absència d’uPA és precisa-

ment la fibrina. Malgrat tot, no podem excloure que la
reduïda capacitat migratòria de les cèl·lules inflamatòries
sigui una conseqüència directa de la plasmina o
bé d’altres proteases activades per plasmina.
A part del seu efecte clàssic sobre les proteïnes de la
matriu extracel·lular, el uPA/plasmina, pot clivellar la
forma latent del factor de creixement b i del factor de
creixement d’hepatòcits-scatter factor. Ambdós
factors són expressats en el múscul danyat i es creu
que tenen una importància rellevant en la regeneració
muscular, ja que promourien l’activació de les cèl·lules
satèl·lits quiescents in vivo. Per tant, la modulació de
l’activitat proteolítica mediada per uPA podria influenciar
indirectament tant el reclutament cel·lular com el
creixement i la diferenciació dels constituents cel·lulars
en el múscul regenerant, per bé que aquest paper
s’hauria de demostrar tant in vitro com in vivo. En
conclusió, els nostres resultats han demostrat que
uPA té un paper beneficiós en la regeneració muscular
esquelètica, principalment a través de la seva activitat
fibrinolítica. La manca de l’activació del plasminogen
ha revelat, en conjunt, la necessitat de les activitats
uPA-plasmina en la regeneració eficient del múscul
esquelètic.
Figura 1. La regeneració muscular esquelètica induïda
per glicerol està impedida en el ratolí deficient en uPA
però no en el deficient en tPA. (A) Es van tenyir amb
hematoxilina-eosina (H/E) seccions congelades de
músculs de ratolins wild-type, ratolins decifients en
uPA i deficients en tPA els dies 2, 5, 7, 9 i 20 després
de la lesió amb glicerol. Així mateix, també es van
tenyir amb H/E músculs contralaterals com a control
(dia 0 després de la lesió). S’observa una progressiva
regeneració el dia 5 que ja és completa després del
dia 9 tant en el ratolí wild-type com en el deficient per
tPA. En el ratolí deficient per uPA s’observa una
regeneració defectiva el dia 5 que encara és més
notòria els dies 9 i 20. En el ratolí wild-type i en el
deficient per tPA no hi ha signes de lesions prèvies
després del dia 20, excepte per als mionuclis centrals.
La magnitud original és de 400X. (B) Persistència de
miofibres positives per MHC del desenvolupament el
dia 9 després de la lesió en ratolins deficients per
uPA. Crioseccions de ratolins wild-type i deficients per
uPA es van incubar amb un anticòs monoclonal
contra l’MHC del desenvolupament (MHCd) els dies 5
i 9 després de la lesió. Es va observar un gran
nombre de miofibres positives per MHCd en múscul
regenerant del ratolí deficient per uPA els dies 5 i 9
després de la lesió. En el ratolí wild-type només es
van observar fibres positives el dia 5 després de la
lesió però no el dia 9.
Figura 2. La deficiència en uPA augmenta la patologia
del ratolí mdx. Crioseccions de músculs provinents de
ratolins mdx i mdx/uPA-/- es van tenyir amb H/E a les
2, 3 i 4 setmanes d’edat i als 2, 3 i 4 mesos d’edat.
Els músculs mdx de 3 i 4 setmanes, mostren fibres
necròtiques i grans quantitats de cèl·lules mononucleades.
Als temps subsegüents hi ha poca inflamació i
s’incrementa el nombre de fibres amb nuclis centrals.
A punts iguals en el temps, el múscul del ratolí
mdx/uPA-/- mostra una gran zona lesionada amb
miotubs necròtics i poques fibres amb nuclis centrals.
La magnitud original és de 400X.
RECERCA BIOMÈDICA | 131

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
Figura 3. La reducció sistèmica del fibrinogen restaura
la regeneració muscular en el ratolí mdx/uPA-/-. Es va
implantar en el ratolí mdx/uPA-/- de 12 dies d’edat
una bomba miniosmòtica plena d’ancrod (3 unitats/dia
durant 12 dies) o de solució salina. (A) Tal com es
mostra per Western blotting, usant un anticòs antifibrinogen
el tractament amb ancrod redueix els nivells de
fibrinogen en els músculs del ratolí mdx/uPA-/-. Per tal
de confirmar que s’havia carregat la mateixa quantitat
de proteïna en tots els carrils, es va rehibridar la
mateixa membrana amb un anticòs antitubulina. (B)
Es van tenyir amb H/E crioseccions musculars
provinents dels ratolins mdx/uPA-/- tractats amb
ancrod o amb solució salina. Mentre que s’observa
una regeneració progressiva en els ratolins mdx/uPA-
/- tractats amb ancrod, encara és visible el defecte de
la regeneració en els ratolins mdx/uPA-/- tractats amb
solució salina.
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
Els resultats d’aquest projecte demostren que la
deficiència en uPA té un paper beneficiós en la
regeneració muscular, principalment mitjançant una
activitat fibrinolítica mediada per uPA. Alguns fets
apunten que una disminució dels nivells de fibrina en
el múscul, segurament tindria un ús clínic en la teràpia
per a distròfies musculars. Experiments futurs van
dirigits a la definició extensa del benefici de la desfibrinogenització,
anticoagulant, o agents fibrinolítics en
distrofinopaties. La prevenció de l’activació del plasminogen
revela els requeriments d’uPA-plasmina i la
dispensabilitat de tPA en la regeneració del múscul
esquelètic. Experiments amb injeccions de proteases
recombinants o retrovirus mostren que endògenament
es pot suplir l’uPA. En aquest cas, l’uPA pot ser utilitzat
per a un tractament de ferides musculars o distròfies
musculars, particularment si uPA indueix la
resposta preferentment en el múscul. Aquest treball
constitueix la primera demostració del paper d’un
sistema proteolític en la miopatia de l’mdx. Els
resultats descrits suggereixen que augmentar la taxa
de regeneració muscular, tot reduint els nivells de
fibrina en el múscul, podria ser una alternativa
terapèutica a la de substituir la distrofina defectiva o
absent en les distrofinopaties musculars, com la
distròfia muscular de Duchenne.
4. Publicacions
Miralles F, Ibáñez-Tallón I, Parra M, Crippa M, Blasi F, Besser D,
Nagamine Y, Muñoz-Cánoves P. Transcriptional regulation of the
murine urokinase-type plasminogen activator gene in skeletal
myoblasts. Thromb. Haemost. 81:767-74, 1999.
Lluís F, Roma J, Suelves M, Parra M, Aniorte G, Gallardo E, Illa
I, Hughes SM, Carmeliet P, Roig M, Muñoz-Cánoves P. Urokinasetype
plasminogen activator is required for efficient skeletal muscle
regeneration in vivo. Blood 97: 1703-1711, 2001.
Suelves M, López-Alemany R, Lluís F, Aniorte G, Serrano E,
Parra M, Carmeliet P, Muñoz-Cánoves P. Plasmin activity is
required for myogenesis in vitro and skeletal muscle regeneration
in vivo. Blood 99: 2835-2844, 2002.
Roma J, Suelves M, Lluís F, Serrano E, Munell F, Roig M,
Muñoz-Cánoves P. uPA deficiency exacerbates mdx dystrophinopathy.
(manuscrit sotmès al Journal of Cell Biology, abril 2003)

Títol del projecte:
Diagnòstic preconcepcional de la fibrosi quística
Investigador principal
Joaquima Navarro Ferreté
Institució
Facultat de Medicina. UAB
Membres de l’equip
Jordi Benet i Jorge Fernando Sánchez
12.575.250 PTA
MEMÒRIA FINAL
1. Resum del projecte original
Objectius concrets
1. Posar a punt i establir les condicions òptimes del
mètode de la PEP per a 1CP i per a oòcits en MII.
Tenint en compte la dificultat òbvia d’obtenir oòcits
humans, s’iniciarà la posada a punt en cèl·lules
germinals de rosegadors.
2. Posar a punt i establir les condicions òptimes del
mètode de la PEP seguida de PCR fluorescent per a la
detecció del gen de l’FQ en cèl·lules somàtiques.
S’utilitzarà un equip de micromanipulació per recuperar
i aïllar una sola cèl·lula a partir de una dilució cel·lular.
3. Aplicació del mètode de la PEP seguida de PCR
fluorescent per a la detecció de mutacions del gen
CFTR. S’aplicarà en mostres d’homes i dones de
famílies amb risc. Aquest anàlisi servirà per determinar
les mutacions concretes en cada família.
4. Aplicar en oòcits (1CP i MII) descartats de cicles de
FIV i procedents de dones portadores de mutació de
l’FQ, el mètode de la PEP seguida de PCR fluorescent
per a la detecció d’al·lels mutants del gen CFRT. Això
es durà a terme amb la finalitat de confirmar la fiabilitat
del mètode desenvolupat.
5. Aplicació del mètode desenvolupat al diagnòstic
preconcepcional en parelles que, convenientment
informades, ho desitgin. Aquest objectiu implica la
col·laboració amb centres de reproducció assistida
que desenvolupin programes de FIV apropiats.
Breu síntesi del disseny, els procediments i els
mètodes descrits en el projecte original
Amb el present projecte ens proposem diagnosticar el
gen CFRT en cèl·lules aïllades, l’1CP d’oòcits madurs
humans, per determinar la presència de gens normals
o mutats en l’oòcit corresponent.
Obtindrem oòcits madurs per puncions de fol·licles
amb la sol·licitud prèvia de consentiment informat a
les donants. Per la dificultat òbvia d’obtenció d’aquest
tipus de material, processarem inicialment oòcits
d’animals (hàmster i ratolí) cèl·lules aïllades humanes
(limfòcits, espermatozoides...).
Inicialment posarem a punt, en cèl·lules aïllades, el
mètode d’amplificació de DNA mitjançant primers
degenerats. Avaluarem el rendiment d’amplificació del
gen CFTR i adequarem el protocol fins a obtenir un
rendiment del 98% descrit en la bibliografia (Snabes i
col., 1994).
Posteriorment posarem a punt la detecció de les 31
mutacions del gen CFTR més freqüents aplicant el
RECERCA BIOMÈDICA | 133

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
sistema d’anàlisi de Perkin Elmer. Per a la detecció
s’analitzaran les mostres en un separador de
fragments de DNA ABI PRISM 310 de Perkin Elmer.
Les mostres biològiques de pacients portadors o
afectats d’FQ (inicialment mostres de leucòcits,
espermatozoides) s’obtindran gràcies a la col·laboració
establerta amb el centre Hospital de Sant Joan de
Déu. També sol·licitarem a centres de reproducció
assistida, oòcits descartats de cicles de FIV, no
fecundats, de dones normals i posteriorment de
dones portadores de mutacions del gen.
Avaluarem el grau de complementaritat observat entre
ambdues dotacions gèniques d’oòcits humans, la MII
i l’1CP, emprant el mètode desenvolupat abans
d’oferir l’aplicació del diagnòstic preconcepcional
d’FQ a parelles afectades d’FQ.
En col·laboració amb l’equip de metges i genètics de
l’Hospital Sant Joan de Déu oferirem, en el curs de un
cicle de FIV, l’aplicació del diagnòstic preconcepcional
d’FQ a parelles amb elevat risc de descendència
afectada d’FQ.
2. Resultats
Els resultats, es mostren en electroesferogrames en
els quals s’observen 10-11 pics representats en blau,
10-11 pics representats en verd i 9-10 pics en groc
d’una alçada de 250 o més.
Com que en el projecte hem aplicat a diferents quantitats
de mostra de DNA múltiples variacions en el
protocol, els resultats són molt variables, tal com es
pot veure en la memòria que es va presentar. Aquests
mostren variació tant pel que fa a nombre de pics
com a les alçades que aquests presentaven, i establirem
criteris qualitatius als valors quantitatius dels pics:
resultats molt negatius a valors de pics de 0-20,
insuficients de 20-50, positius de 50-250, bons
resultats de 250-1000 i òptims superior a 1000, tot
obtenint un màxim de fins a 6325.
Aquesta classificació dels resultats es representa en
les taules amb diferents colors, que s’indiquen a
continuació.
L’actual versió de la memòria conté els resultats més
rellevant obtinguts i que han aportat una informació
més valuosa i útil per al desenvolupament del protocol
d’anàlisi de 29 al·lels del gen de CFTR en cèl·lules
aïllades.
Recollim en aquesta versió, únicament, els millors
experiments amb electroferogrames amb un mínim 15
pics.
Es tracta d’alguna d’aquests tres tipus de mostres
biològiques analitzades:
1. Mostres de DNA.
2. Cèl·lules d’epiteli bucal.
3. Oòcits descartats de cicles de FIV.
1. Mostres de DNA
Mostrem les 22 mostres amb millors resultats (amb
més de 15 pics obtinguts en mostres de DNA
d’extracte de sang): 7 mostres de 200-300 g, 12
mostres de 200 pg i 2 nostres de 20 pg (equivalent a
tres cèl·lules aïllades) (vegeu Taula 1a-d).
L’intent inicial de precipitar les mostres de DNA
preamplificat va semblar un procediment adequat
(mostres de 200 pg es presenten els millors resultats
obtinguts), independentment del mètode emprat, i
també aquest protocol de precipitat del DNA
preamplificat va donar resultats força esperançadors
en dues mostres de 20 pg de DNA.
També va semblar que fer un tractament de desnaturalització,
homogeneïtzació del DNA emprant el
microones durant 1 min a 75W de potència podia
afavorir l’obtenció d’electroferogrames complets i amb
alçades de pics considerables excel·lents.
2. Mostres d’epiteli bucal
En la Taula 2a-d es mostren els resultats de 37
mostres d’epiteli bucal d’individus controls (eb) i de
familiars o pacients portadors de mutacions del gen
CFTR (ebp), a les quals prèviament es va amplificar el
DNA mitjançant un protocol de PEP adaptat. En la
taula s’indica el nombre de cèl·lules analitzades
simultàniament, siguin 30, 10, 5 o 1 cèl·lules.
En aquest grup d’experiments, pel que fa a l’amplificació
del DNA cel·lulars, observem, sobretot en
cèl·lules úniques aïllades, que el mètode deI PEP amb
40 ug és el més idoni i que en procediments alternatius
assajats (mostres 15, 16, 21 i 29) el resultats són
de menor qualitat, tot mostrant un nombre de pics
menor.
També vam assajar la utilització d’enzim de Taq
polimerasa alternatiu (de forma rutinària l’HT, en
comparació amb la Platinum i l’Ambion), i amb
resultats més satisfactoris amb l’dAmbion.
També el tractament de desnaturalizació i homogeneïtzació
del DNA emprant el microones durant 15
min a 75W de potència, dóna resultats positius, tot
observant electroferogrames més complets i amb
alçades de pics superiors en general.
Hem observat que, en general, els fragments identificats
amb fluorocrom en groc presenten menor alçada
que els que corresponen a fragments identificats amb
fluorocrom en blau i en verd, excepte per a el loci
A455, que sempre sol ser molt elevat. Aquest tipus de
resultat de moment és difícil d’interpretar.
3. Mostres de DNA de cèl·lules descartades de
cicles de FIV
Resultats de l’anàlisi de quatre mostres de DNA de
metafases II aïllades d’oòcits humans madurats in
vitro (MII) preamplificant el genoma total aplicant un
tractament amb microones realitzat després de la
desnaturalizació del DNA (MII-Mw).
Aquest tractament amb microones ha permès
detectar la majoria d’al·lels normals 24 de 29. Excepte
una mostra, les altres semblen més informatives
emprant el microones després de la desnaturalizació
del DNA. Ens sembla interessant aprofundir els tractaments
amb microones en cèl·lules aïllades.
El tractament de microones en l’amplificació d’1CP
humans és força beneficiós, ja que s’han pogut
detectar la majoria d’al·lels normals presents en la
mostra. Només en un cas cap al·lel va poder ser
identificat. En la gràfica superior es mostra l’electroferograma
corresponent a la mostra 4-1CP Mw.

Els resultats en 1CP s’han doblat de 12 a 24 quan
s’aplica el microones. Tot i que el nombre de mostres
analitzades amb microones es baix, pensem que
encara cal continuar treballant per millorar els
resultats.
Resultats en l’anàlisi de mostres de DNA d’1CP i
metafases II d’oòcits humans madurats in vitro.
(Figura 1,2)
Protocol establert per a l’anàlisi de mutacions del
gen CFTR més freqüents a europa del sud en
mostres de dna de cèl·lules aïllades
Obtenció de mostres cel·lulars adequades
Les cèl·lules aïllades, epiteli bucal o d’oòcits madurs
prèviament separada la MII i el corresponent 1CP, es
processen separadament amb molta cura. Les
cèl·lules bucals s’obtenen emprant dues rentades
bucals d’individus. Els oòcits madurats in vitro o no
fecundats durant un cicle de FIV obtinguts mitjançant
consentiment informat en centres de reproducció
assistida.
S’han de prendre mesures severes contra la contaminació
durant tot el procés. És imprescindible treballar
en una zona restringida, tractada amb llum ultraviolada,
en la qual no accedeixin mai mostres de DNA o
productes de PCR. Cal emprar cambra de flux
horitzontal, esterilitzar i exposar a llum ultravilolada els
reactius que ho permetin. Cal portar sempre bata,
màscara i guants i utilitzar pipetes exclusives i puntes
amb filtre. Per a la manipulació cel·lular s'empren
micropipetes de vidre estirades a la flama i esterilitzades
amb llum ultraviolada.
La suspensió de cèl·lules bucals es dilueix en diverses
gotes de PBS amb 0.1% PVA per evitar que les
cèl·lules s’enganxin fins que s’aconsegueix una única
cèl·lula. Es comprova la presència d’un nucli en les
cèl·lules bucals. Les cèl·lules es renten 3 vegades en
PBS/0.1% PVA.
La MII i l’1CP se separen per digestió de la Zona
Pel·lúcida amb 30 mg/ml de tripsina en PBS, pH 7.2
durant 2-3 minuts a 37ºC, o amb Àcid Tyrode’s.
La cèl·lula aïllada es transfereix amb molt de cura a un
tub de PCR de 0.2 ml PCR i sota control esteomicroscòpic
i es comprova la presència de la cèl·lula
Figura 1.
aïllada dintre del tub. És molt útil deixar la cèl·lula prop
del final de la pipeta i controlar el volum de líquid
buidat dins del tub de PCR per poder estar segur que
la cèl·lula ha entrat amb el mínim volum de líquid i
sense fer bombolles.
Lisi cel·lular
Un cop introduïda la cèl·lula al tub de PCR, s’hi
afegeix 1 m l d’SDS (17 m M) (Sigma) i 2 m l de
Proteinasa K PCR grade (125 mg/ml) (Roche)
s’afegeixen i es cobreix amb oli (40 m l). La lisi cel·lular
es realitza per incubació durant 1 hora a 37ºC, seguit
de 15 min a 99ºC per inactivar l’enzim.
Amplificació mitjançant PCR
El DNA total cel·lular contingut en les cèl·lules se
sotmet a l’amplificació del genoma emprant un
mètode de PEP-PCR amb certes modificacions (I-
PEP-PCR).
La reacció té lloc en un volum total de 40 m l amb 5
unitats de SuperTaq Plus Polimerasa AMBION, 4 m l
de 10X SuperTaq Plus buffer, 3.3 m l d’una solució
400 m M d’un encebador de 15 bases completament
degenerat i 2 m l de barreja dels 4 dNTP (2 mM
cadascun). A cada reacció s’inclouen controls
negatius de les solucions d’aïllament i de reactius de
PCR. El programa de PCR es du a terme en un
termociclador Tgradient thermocycler (Biometra).
S’aplica "Hotstart", tot mantenint els tubs en gel i
posant-los al termociclador quan el bloc assoleix la
temperatura de 80 ºC. Un pas de desnaturalització
inicial de 7 minuts a 94 ºC és seguit per 50 cicles de 1
minut a 94 ºC, 2 minuts a 31.5 ºC, una rampa programada
de 0.1 ºC/segon, 55 ºC durant 4 minuts i un
pas de 68 ºC durant 30 segons. Els tubs són
refredats a 4 ºC. Tot el procés es realitza seguit, i si
això no és possible, es mantenen els tubs a -80 ºC.
Cystic Fibrosis Assay
S’utilitza una alíquota de 6 m l dels productes de PEP-
PCR en l’adaptació del "Cystic Fibrosis Assay" (Applied
Biosystems), que, com ja s’ha dit anteriorment, es
tracta d’un kit comercial disponible per fer cribratge de
les 31 mutacions del gen CFTR més freqüents a
l’Europa del Sud. Aquest assaig consisteix en una
RECERCA BIOMÈDICA | 135

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
Figura 2.
incubació en un tampó per purificar el DNA, seguit
d’una multiplex PCR. Quinze parelles d’encebadors
amplifiquen les regions del gen que poden contenir les
mutacions indicades. El tercer pas és un assaig de
lligament d’oligonucleòtids fluorescents
(Oligonucleotide Ligation Assay, OLA) que identifica els
al·lels normals i mutants amb una sonda complementària
per a cada seqüència. Aquesta es lliga, a l’extrem
3’, amb una sonda comuna marcada fluorescentment
amb 6-FAM (blau), TET (verd) o HEX (groc). Els
oligonucleòtids normal i mutant tenen diferent longitud
a causa de la presencia de unes cues de pentaetilen
òxid, de mides diferenciades, la qual cosa té una
conseqüència en la posterior separació electroforètica.
Els 10 m l dels productes de la reacció d’OLA es
precipiten amb etanol durant 1 hora a -80 ºC i són
resuspesos en 1 m l d’aigua lliure de nucleases.
Per a l’anàlisi, els fragments obtinguts es barregen
amb un patró fluorescent de mides estàndard TAMRA
i són separats per electroforesi en gel automatitzada
amb detecció per làser ABI Prism 377 (o 310; Applied
Biosystems). L’anàlisi de les dades es realitza amb els
programes GeneScan i Genotyper (Applied
Biosystems).
Tots els procediments del present estudi han estat
aprovats pels comitès ètics dels centres participants.
Recentment (gener 2002), hem aconseguit un ajut del
FONDO de INVESTIGACIONES SANITARIAS (FIS) en
la convocatòria del 2002 per poder continuar
desenvolupant aquest mètode de Diagnòstic Genètic
Preimplantacional analitzant 1CP (DGP:1CP) principalment
per al que fa a l’aplicació de casos clínic.s
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
S’ha aconseguit desenvolupar un mètode de DGP-
1CP aplicable a 31 mutacions més freqüents a
Europa del Sud.
El DGP-1CP, com explicarem breument, constitueix
un mètode alternatiu al mètode més àmpliament
aplicat que consisteix a analitzar el contingut genètic
d’embrions de 6-8 cèl·lules, mitjançant biòpsia d’un o
dos blastòmers DGP-BL.
El DGP-1CP consisteix a analitzar de manera indirecta
el contingut genètic de gàmetes femenins o òvuls
madurs: constituït d’una cèl·lula que serà penetrada
per l’espermatozoide durant la fecundació i que conté
cromosomes en Metafase II (MII) y d’una altra cèl·lula
que denominem primer corpuscle polar (1CP) que no
té funció reproductiva i que degenera amb el temps.
L’1CP conté una dotació cromosòmica complementària
a la de la MII, i per això pot aportar informació de
la dotació genètica de la MII sense que en condicioni
ni en limiti la capacitat reproductora. Aquest mètode,
l’anomenarem DGP-1CP.
En el cas del DGP-1CP, atès que la biòpsia de l’1CP
es realitza el dia de l’obtenció dels oòcits (dia 0), es
disposa de fins a quatre dies per fer el diagnòstic,
abans del dia de la transferència dels embrions
(Navarro i col., 2001). En el cas de DGP-BL es
disposa de dos dies per fer el diagnòstic, ja que la
biòpsia de blastòmer té lloc el dia 2. En ambdós
protocols la inseminació dels oòcits obtinguts es pot
fer mitjançant injecció intracitoplasmàtica d’un
espermatozoide (ICSI) dues hores després de l’obtenció
dels oòcits.
Al nostre laboratori, gràcies al projecte de la Fundació
La Marató TV3, "Diagnòstic genètic preconcepcional
de la fibrosis quística" hem desenvolupat un mètode
de DGP-1CP que incorpora la utilització de PCR
fluorescent i identificació de fragments de DNA amb
un lector làser i que és capaç de diagnosticar, al
mateix temps, les 31 mutacions del gen CFTR més
freqüents a Europa del Sud, que inclouen les 25 més
freqüents en l’àmbit mundial. Les mutacions analitzades
són les següents: S549N, S549R, R553X,
G551D, V520F, I507, F508, Q493X, 1717-1G-A,
G542X, R560T, R347P, R347H, 3849+4A-G,
3849+10kbCT-, W1282X, R334W, 1078delT ,
R1162X, N1303K, 3659delC, 3905insT, A455E,
R117H, Y122X, 2183AA-G, 2789+5G-A, 1898+1G-A,
621+1G-T, 711+1G-T i G85E.
Aquest mètode de diagnòstic exigeix que la parella
que se sotmet al DGP ha de ser inclosa en un programa
de FIV en una unitat de reproducció assistida, i
per això exigeix el treball en cooperació d’embriòlegs i
genetistes. Breument, els passos que cal seguir son
els següents:

El dia de la punció fol·licular es recuperen els oòcits.
S’insemina, un a un, cada oòcit i immediatament es fa
la biòpsia del corresponent 1CP.
Cada 1CP, un cop lisat, és tractat mitjançant PEP-
PCR (Zhang i col. 1992), per aconseguir augmentar
fins a un mínim de 30 còpies el genoma de l’1CP.
A continuació, amb el DNA amplificat, se segueix un
procés establert que inclou una multiplex PCR i
lligament de sondes, que permet identificar fins a 31
mutacions distintes en el DNA diana, d’acord amb
una classificació de fragments de DNA, segons la
seva longitud i color de fluorocrom marcat.
Les dades de l’anàlisi de cada mostra es recullen en
un programa adequat i són tractades per un programa
informàtic especial. El sistema mostra el resultat
com una representació gràfica de pics o electroforegrama
en què es visualitzen, fàcilment, els al·lels
normals i/o mutants per a cada un dels 29 loci que
s’analitzen. Finalment es fa la transferència exclusiva
d’aquells embrions derivats d’oòcits genèticament
normals.
Els avantatges del DGP-1CP que proposem consisteixen
en el fet que la biòpsia no es realitza en
l’embrió, sinó d’una cèl·lula accessòria, per la qual
cosa no afecta la viabilitat de l’embrió, es tracta d’un
sistema vàlid de diagnòstic par a cèl·lules aïllades i
per a un nombre important de mutacions a la vegada
i es disposa de temps suficient, fins a quatre dies,
per fet una anàlisi genètica completa de les
mutacions esmentades. Per contra, el mètode no
informa del component genètic patern de l’embrió i
se seleccionen exclusivament embrions procedents
d’oòcits genèticament normals. Considerant el
component genètic patern, es poden estar transferint
embrions genèticament normals o portadors.
En ambdós casos de DGP, per al seguiment dels
embarassos, està indicada la realització d’un
diagnòstic prenatal.
4. Publicacions
J Navarro, J Benet, M Durban, JF Sánchez-García, A Pujol, C
Gutiérrez, J Egozcue. Preconceptional Genetic Diagnosis. In:
Carrera JM, Cabero L, Baraibar R (eds). Proceedings of the 5th
World Congress of Perinatal Medicine. Bologna: Monduzzi
Editore, p. 158-166 (2001). CLAVE: CL
JF Sánchez-Garcia, Die-Smulders CEM de , Weber JW, Jetten
AGP, Loneus WH, Hamenrs ajh, Engelen JJM. De novo duplication
(5)(q3q33.3):report of a patient and Characterization of the
duplicated region using microdissection and FISH. Am J Med
Genet (1): 56-61 (2001) CLAVE: A
JF Sánchez-García, J Benet, C Gutierrez-Mateo,E Monrós, JL
Séculi, MC Pons, M Grossmann, JM Calafell, MD Company, C
Márquez, M Carrera, J Egozcue, J Navarro. Diagnóstico genético
preimplantacional mediante análisis del primer corpúsculo polar:
detección de las 31 mutaciones del gen CFTR más frecuentes en
Europa del sur. Revista de la Societat de Fibrosi Quistica Catalana
(en premsa).
RECERCA BIOMÈDICA | 137

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
MEMÒRIA FINAL
1. Resum del projecte original
La cistinúria és una aminoacidúria causada per un
transport de cistina i aminoàcids bàsics defectiu al
ronyó i intestí. Fenotípicament hi ha diferents tipus de
cistinúria (tipus I/I i no I/I). Hem identificat el gen (rBAT)
responsable de la cistinúria de tipus I/I, però no del
tipus no I/I. Recentment, hem definit una zona en el
cromosoma 19 on es localitza el gen responsable de
la cistinúria de tipus no I/I. A més a més, hem
demostrat que el transportador d'aminoàcids bo,+ -
like està constituït per dues subunitats: rBAT (gen de
cistinúria de tipus I/I) o "subunitat pesant", i una altra
"subunitat lleugera". La subunitat lleugera encara no
ha estat identificada. La hipòtesi d'aquest projecte és:
un gen en posició 19q és responsable de la cistinúria
tipus no I/I, i aquest nou gen podria ser el que codifica
per a la "subunitat lleugera" d’rBAT.
Els objectius concrets del projecte són:
1. Identificar el gen responsable de la cistinúria tipus
no I/I per genètica reversa.
En l'actualitat hem definit, gràcies a l'estudi de famílies
recombinants, una regió de ~1 megabase en la qual es
Títol del projecte:
Identificació d’un nou gen de cistinúria:
base molecular de la cistinúria tipus NO I/I
Investigador principal
Virginia Nunes Martínez · Manuel Palacín Prieto · Pedro Barceló Reverté
Institució
Institut de Recerca Oncològica · Facultat de Biologia. UB · Fundació Puigvert
Membres de l’equip
Sandra Mañas, Mariona Font, Virginia Nunes, Sergio Palomo i Lídia Feliubadaló
48.012.775 PTA
localitza el gen responsable de la cistinúria tipus no I/I.
2. Estudiar gens candidats a ser la subunitat lleugera
d’rBAT.
Vam partir d'una família de proteïnes semblants a
permeases de llevat, que són potencials candidates a
ser subunitats funcionals de la proteïna rBAT.
3. Després de la identificació del nou gen, establir el
primer estudi de correlació fenotip-genotip per als
gens responsables de cistinúria coneguts.
Breu síntesi del disseny, procediments i mètodes
Grup 1
Vam partir inicialment d'una regió ja delimitada amb
els estudis de famílies tipus no I/I recombinants. La
zona abasta 1,5 megabases en 19q12-13.1 (entre els
marcadors D19S430 i D19S874). Possiblement i
gràcies a l'establiment del consorci amb el Dr. Pras,
podrem delimitar-la fins a gairebé 0,5 Mb, un cop
comprovat un recombinant històric que s'ha detectat
en la població juevolibia.
Material de què disposem: 1) YAC de la regió
procedents d'una genoteca obtinguda de CEPH, que
una vegada comprovat el seu no quimerisme mitjançant
FISH podran ser utilitzats per facilitar la recerca
del gen. 2) Tota una bateria de microsatèl·lits i STS

obtinguts de les bases de dades i de seqüència
pròpia, de la zona que anem mapant en els diferents
YAC. Els microsatèl·lits han estat emprats per anar
delimitant la zona d'interès en les famílies recombinants
i per comprovar els "contigs" de la regió; per a
l'última tasca també s'han usat STS no polimòrfics. 3)
Bateria de còsmids, entre els quals un "contig" de la
regió generat en el Laurence Livermore National
Laboratory (LLNL), que comprèn una zona de 450 kb
en la qual s'inclou una bona part de la nostra regió
candidata.
Mètodes: 3.1.- Anàlisi dels YAC. 3.2.- Cribratge del
YAC amb els microsatèl·lits adequats. 3.3.- Anàlisi dels
còsmids. 3.4.- Identificació de gens en el locus de
cistinúria de tipus no I/I: 3.4.1.- Identificació de gens
candidats. 3.4.2.- selecció de cDNA. 3.4.3.- Alu-splice
PCR i/o 3.4.4) exon-trapping. 3.5.- Anàlisi mutacional
de gens candidats. 3.6.- Anàlisi de l'estructura
genòmica del gen responsable de la cistinúria de tipus
no I/I. 3.7.- Correlació genotip-fenotip.
Grup 2
La hipòtesi de treball és que un membre (conegut o
no) de la família humana de transportadors putatius
d’aminoàcids composta per E16, permease-like, b2c2
i permease-like-4 (P4) és la subunitat funcional
(“cadena lleugera”) del transportador rBAT/sistema
bo,+, i per això mateix un ferm candidat com a gen de
cistinúria de tipus no I/I. La recerca de clusters d’EST
humans homòlegs als cDNA d’E16 humana, TA1 de
rata, IU12 i ASUR4 de X. laevis, SMPR1 de
Schistosoma mansoni, human permease-like i la
banda d’RT-PCR b2c2 de cèl·lules OK ens ha permès
identificar 2 clusters d’EST que proposen l’existència
de 2 nous membres de cDNA humans en aquesta
família: b2c2 i la permease-like-4 (P4). Actualment la
funció de la permease-like, b2c2 i P4 és desconeguda.
Mètodes:
3.1. Seqüenciació dels cDNA de b2c2 i de la permease-like-4
(P4) i expressió tissular de b2c2, P4 i
permease-like.
3.2. Localització cromosòmica dels gens d’aquesta
família de transportadors putatius d’aminoàcids.
3.3. Recerca de nous membres de la família de
transportadors putatius d’aminoàcids al locus de
cistinúria de tipus no I/I.
3.4. Coexpressió en oòcits de Xenopus dels cRNA
permease-like, b2c2 i P4 amb els de 4F2hc i/o rBAT.
3.5. Identificació estructural de la permease-like, b2c2
i P4 com a subunitats “lleugeres” de 4F2hc i/o rBAT.
3.6. Expressió funcional d’holotransportadors en
cèl·lules en cultiu.
3.7. Expressió funcional de mutants cistinúria-específics
de la “subunitat lleugera” d’rBAT.
Grup 3
1. Captació de nous pacients.
2. Recollida de dades per establir la relació fenotipgenotip.
3. Estudi cristal·logràfic del càlcul i experimentació in
vitro amb substàncies litolítiques.
4. Posada a punt de determinació d’aminoàcids en
plasma.
2. Resultats
Grups (1 i 2):
1. Vam identificar tres membres de la família de
subunitats lleugeres de transportadors heteromèrics
d'aminoàcids (HAT): bo,+AT (publicació 2), y+LAT-1 i
y+LAT-2 (D. Torrents i col. J. Biol. Chem. 273, 32437-
32445 (1998) treball previ a la concessió del projecte).
2. bo,+AT i rBAT formen el transportador d'aminoàcids
de membrana plàsmica bo,+ en cèl·lules
transfectadas (publicació 2) i en ronyó (publicació 15).
Aquest transportador fa de mediador en l'influx de
cistina i aminoàcids dibàsics i el subsegüent eflux
d'aminoàcids neutres (publicació 2). L'heterodímer
rBAT- bo,+AT s'expressa a la membrana apical de les
cèl·lules epitelials del túbul proximal (E. Fernández i
col. Am. J. Physiol. 283:F540-F548, 2002; treball no
finançat per La Marató). Experiments de reconstitució
en proteolisosoma van demostrar que bo,+AT és
completament funcional en absència d’rBAT (publicació
18). A més a més, bo,+AT estabilitza rBAT
(publicació 18) i l'ajuda en la seva ruta cap a la
membrana plàsmica (2).
3. Vam demostrar que mutacions en SLC7A9
(bo,+AT) causaven cistinúria de tipus no I (publicacions
2 i 7) i fins i tot causaven alguns casos de
cistinúria de tipus I (publicació 17). Vam identificar el
80% dels al·lels responsables en més del 90% dels
224 pacients amb cistinúria estudiats (publicacions
2,4, 5 i 7).
4. A partir de les dades clíniques i amb algunes
mutacions específiques d’SLC7A9 es va establir la
primera correlació fenotip-genotip en cistinúria
(publicació 7).
5. Les dades clíniques, bioquímiques i genètiques de
pacients amb cistinúria es van recollir en una base de
dades (publicació 17). L'anàlisi d'aquesta informació
va demostrar que mutacions en SLC3A1 produeixen
sempre cistinúria de tipus I, mentre que mutacions en
SLC7A9 causen principalment cistinúria de tipus no I i
alguns casos de cistinúria de tipus I. Això va fer que
proposéssim una nova classificació per a la cistinúria:
tipus A, a causa de mutacions en SLC3A1, i tipus B,
a causa de mutacions en SLC7A9 (publicació 17).
6. Hem generat un ratolí knock out per a SLC7A9 (del
qual no podem donar més informació perquè està
sotmès a una patent).
7. Hem construït un vector amb braços d'homologia
de 6 i 2,3 kb en el qual s'han substituït 257 pb de la
zona promotora i l'exó 1 del gen SLC7A8 (LAT-2) pel
gen PGKNeobpA, amb la qual cosa molt probablement
no es produirà la transcripció dels restants
exons del gen, i en el cas que es produís, la primera
metionina en pauta està a 202 aminoàcids, amb la
qual cosa es produiria una proteïna 202 aminoàcids
més curta en l’N, d'un total de 531 aminoàcids; seria
una proteïna de 319 aminoàcids.
Grup (3):
1. Vam considerar tancada a desembre de 2001
l'entrada de dades clíniques i bioquímiques per a
l'estudi clínic iniciat a mitjan 2000 sobre el ritme
circadià d'excreció de cistina i aminoàcids bàsics en
pacients cistinúrics i en un grup de pacients no
cistinúrics (vegeu annex 1). A hores d'ara estem fent
el tractament estadístic de les dades i posteriorment
es redactarà l'article i serà enviat per ser publicat.
RECERCA BIOMÈDICA | 139

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
Quan hagi estat acceptat se’n remetrà a la Fundació
La Marató de TV3 una còpia.
2. Disposem, a hores d'ara, d'una estructura sòlida i
consolidada de laboratori per a l'estudi i el tipatge del
càlcul urinari. L'aportació de La Marató de TV3 ha
estat crucial per muntar-ne l'estructura bàsica. Com ja
vam informar l’any passat, es va incorporar un nou
membre al Laboratori de Cristal·lografia (a càrrec de la
institució), per optimar el treball diari; es va creure
convenient l'adquisició, gràcies a l'aportació de La
Marató de TV3, d'un nou equip informàtic semblant a
l'adquirit el 1999, amb el programari adequat per
compatibilitzar-lo amb el primer; això ens ha permès
doblar el treball assistencial i clínic.
3. Col·laboració sòlida i establerta des de 1993 amb
el grup d'investigació del Dr. Manuel Palacín
(Universitat de Barcelona) i el grup de la Dra. Virginia
Nunes (Institut de Recerca Oncològica. Hospital Duran
i Reynals) per a l'estudi de pacients cistinúrics, des
d'un punt de vista clínic, genètic i biològic.
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
Els resultats obtinguts en el desenvolupament
d’aquest projecte tenen una rellevància indiscutible.
Han contribuït a establir les bases moleculars d'una
malaltia hereditària, la cistinúria, que si bé es va
descobrir fa més de cent anys, només en els últims
deu s’ha pogut estudiar molecularment. Sens dubte
els grups integrants del present projecte som pioners
en la descripció de les bases moleculars de la cistinúria.
Hem estat responsables de la creació d'un
Consorci Internacional per a l'Estudi de la Cistinúria.
Consorci que ha possibilitat unir esforços dels
diferents grups que treballem en aquest àmbit.
Els descobriments més rellevants són:
1) Identificar rBAT i 4F2hc com a proteïnes relacionades
amb el transport d'aminoàcids. 2) Identificació
d’SLC3A1 (rBAT) com el gen responsable de cistinúria
de tipus I. 3) Identificació de les subunitats lleugeres
dels HATs y+LAT-1, y+LAT-2, LAT-2 , bo,+ DREC i
xCT. 4) Identificació d’SLC7A9 (bo,+AT) i d’SLC7A7
(y+LAT-1) com a gens responsables de cistinúria de
tipus I i LPI, respectivament. 5) Establiment d'una
nova classificació de cistinúria basada en el genotip.
6) L'heterodímer rBAT/bo,+AT és el principal, si no
l'únic responsable de la reabsorció renal de cistina, i el
transportador 4F2hc/LAT-2 és responsable del flux
transepitelial de cistina. 7) La subunitat lleugera bo,+
DREC és plenament funcional en absència d’rBAT. Del
punt 3 al 7, es tracta de descobriments realitzats
durant el temps de finançament d’aquest projecte per
La Marató de TV3 i els articles apareguts estan
referenciats en l'apartat de publicacions.
Resultats de rellevància clínica
Els resultats que es presenten tot seguit tenen
rellevància clínica:
1. Hem caracteritzat dos nous gens responsables de
dues malalties hereditàries: cistinúria i lisinúria amb
intolerància a proteïnes (LPI). Això ha estat bàsic per
poder oferir diagnòstic genètic a les famílies amb
aquestes malalties, ja que coneixem l'espectre de
mutacions en ambdós gens.
2. Hem pogut establir una correlació genotip-fenotip
en el cas de la cistinúria de tipus no I.
3. Hem establert una nova classificació de cistinúria
basada en els genotips. Ara parlem de cistinúria A, a
causa de mutacions en SLC3A1, i de tipus B, a causa
de mutacions en SLC7A9.
4. Actualment estem establint les bases per poder fer
estudis de fàrmacs, ja que hem generat un model knock
out per a la cistinúria de tipus no I (B). Evidentment tots
aquests descobriments contribueixen de manera definitiva
a poder estudiar els pacients molecularment, oferirlos
consell genètic i una futura teràpia farmacològica
millor que l'ús de la D-penicilamina.
4. Publicacions
D. Torrents, J. Mykkänen, M. Pineda, L. Feliubadaló, R. Estévez,
R. de Cid, P. Sanjurjo, A. Zorzano, V. Nunes, K Huoponen, A.
Reinikainene, O. Simell, MJ. Savontaous, P. Aula, M. Palacín.
Identification of the amino acid transporter y + LAT-1 as a lysinuric
protein intolerance gene. Natur. Genet. 21:293-297. (1999)
L. Feliubadaló and The International Cystinuria Consortium.
Non-type I cystinuria caused by mutations in SLC7A9, encoding a
subunit (b o,+ AT) of rBAT. Natur. Genet. 23: 52-57. (1999).
L. Feliubadaló, l. Bisceglia, M. Font, L. Dello Strologo, E. Beccia,
M. Arslan-Kirchner, B. Steinmann, L. Zelante, X. Estivill, A.
Zorzano, M. Palacín, P. Gasparini, V. Nunes. Recombinant families
locate the gene for Non-Type I cystinuria between markers C13
and D19S587 on chromosome 19q13.1. Genomics 60: 362-365
(1999).
J. Purroy, L. Bisceglia, J. Jaeken J, P. Gasparini, M. Palacín, V.
Nunes. Detection of two novel large deletions in SLC3A1 by semiquantitative
fluorescent multiplex PCR. Hum. Mut. 15: 373-379
(2000).
L. Bisceglia, J. Purroy, M. Jimenez-Vidal, A. D’Adamo, F.
Roussaud, E. Beccia, R.Penza, GF. Rizzoni, M. Galluci, M. Palacin,
P. Gasparini, V. Nunes, L. Zelante. Cystinuria type I: identification
of seven new mutations in SLC3A1. Kidney International 59:
1250-1256 (2001).
Palacín, M., Bertran, J. and Zorzano, A. Heteromeric amino acid
transporters explain inherited aminoacidurias. Curr. Opin. Nephrol.
Hypertens. 9: 547-533 (2000).
M. Font and The International Cystinuria Consortium. Functional
analysis of mutations in SLC7A9 and genotype/phenotype
correlation in non-Type I cystinuria. Hum. Mol. Genet. 10:305-316
(2001).
F. Rousaud, S. Gracia, M. Palacín, V. Nunes, F. Millán, A. Oliver,
A. Rousaud. Cistinuria y litiasis renal de cistina. Estudio y enfoque
terapéutico. Arch. Esp. de Urol. 54: 989-996, (2001).
F. Rousaud, S. Gracia, F. Millán, A. Oliver, A. Rousaud.
Terapéutica médica en la enfermedad litiásica . Act. Fund.
Puigvert, 20: 88-92, ( 2001).
F. Rousaud, S. Gracia, F. Millán, A. Rousaud. Litogénesis de los
cálculos de cistina. Act. Fund. Puigvert, 20: 192-200, (2001).
F. Rousaud, F. Millán, F. Izquierdo, F. Rousaud, H. López, J. Martí,
P.Torre. Análisis y evolución de la litiasis residual tras la aplicación
renal de ondas de choque. Arch. Esp. de Urol, 54: 1009-1016
(2001).
M. Palacín, P. Goodyer, V. Nunes, P. Gasparini. Cystinuria in
Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS and Valle D (ed.). Metabolic and
Molecular bases of Inherited Disease. McGraw —Hill.pg. 4909-
4932 (2001). También hi ha una nova versió en línia:
http://genetics./serverjava/Arknoid/amed7mmbid/co_chapters/ch
191/ch191_p01.html. (2002).
M. Palacín, G. Borsani, G. Sebastio. The molecular bases of
cystinuria and lysinuric protein intolerance. Current Opinion in
Genetics & Development 11: 328-335 (2001).
M. Palacín, E. Fernández, J. Chillarón, A. Zorzano. The amino
acid transport system b o,+ and cystinuria. Molecular Membrane
Biology, 18: 21-26 (2001).

J. Chillarón, R. Roca, A. Valencia, A. Zorzano, M. Palacín.
Heteromeric amino acid transporters:biochemistry, genetics and
physiology. Am. J. Physiol Renal Physiol 281: F995-F1018 (2001)
F. Rousaud. Consideraciones acerca de la cistinuria y litiasis renal
de cistina. Act. Fund. Puigvert, 21: 18-19 (2002).
L. Dello Strologo, E. Pras, C. Pontesilli, E. Beccia, F. Ricci-
Barbini, L. De Sanctis, A. Ponzone, M. Gallucci, L. Bisceglia, L.
Zelante, M. Jimenez, M. Font, A. Zorzano, F. Rousaud, V. Nunes,
P. Gasparini, M. Palacín, G. Rizzoni. Comparison between
SLC3A1 and SLC7A9 cystinuria patients and carriers: a need for
a new classification. J. Am. Soc. Nephrol. . 13: 2547-2553 (2002).
N. Reig J.Chillarón, P. Bartocioni, E. Fernández, A. Bendahan, A.
Zorzano, B. Kanner, M. Palacín, J. Bertrán. The ligth subunit of
system b0,+ is fully functinal in the absence of the heavy subunit.
EMBO J. 21:4906-4914 (2002).
L. Feliubadaló and the Cystinuria International consortium.
Identification of the gene responsible for non-type I cystinuria,
SLC7A9. Am. J. Hum. Genet 65. Abstracts 1651, p. A294 (1999).
J. Purroy, L. Bisceglia, L. Feliubadaló, F. Rousaud, L. Zelante, A.
Zorzano, X. Estivill, M. Palacin, V. Nunes. Cystinuria type I:
Identification of nine new mutations by RNA SSCP and two large
deletions by multiplex QF-PCR in SlC3A1. Am J Hum. Genet 65.
Abstracts 2427, p. A428 (1999).
L. Feliubadaló, L. Bisceglia, M. Font, L. Zelante, X. Estivill, A.
Zorzano, M. Palacin, P. Gasparini, V. Nunes. Familias recombinantes
situan el gen de la cistinuria tipo no I en una región de 2,4 Mb.
en el cromosoma 19q13.1. Prog. Diag. Pre. 11. Abstracts O-009
p. 229 (1999).
J. Purroy, L. Bisceglia, L. Feliubadaló, F. Rousaud, L. Zelante, A.
Zorzano, X. Estivill, M. Palacín, P. Gasparini, V. Nunes. Nuevas
mutaciones en rBAT, el gen responsable de la cistinuria de tipo I.
Prog. Diag. Pre. 11. Abstracts P-074 p. 247 (1999).
M. Font and The Cystinuria International Consortium. SLC7A9 is
the main non-TypeI Cystinuria gene. Am. J. Hum. Genet. Abstract
2149, p. 383 (2000)
M. Jiménez, M. Palacín, V. Nunes. Identificación de 14 nuevas
mutaciones en el gen causante de la cistinuria de tipo I SLC3A.1.
Prog. Diag. Pre. 6 vol 13 . Abstracts P-063 p. 39 (2001).
M. Font Llitjós, V. Nunes. Detección de grandes deleciones e
inserciones en el gen SLC7A9 en pacientes con cistinuria de tipo
no-I mediante PCR multiplex semicuantitativa. Prog. Diag. Pre. 6
vol 13. Abstracts P-064 p. 39 (2001).
L. Feliubadaló, M.L. Arbonés, M. Palacín V. Nunes. Generación
de un modoelo Knock out para la cistinuria de tipo no I. Prog.
Diag. Pre. 6 vol 13. Abstracts P-065 p. 40 (2001).
M. Font Llitjós, M. Palacín, V. Nunes. Detection of two novel large
mutations iin SLC7A9 by semi-quantitattive fluorescent multiplex
PCR. European Journal of Human Genetics. vol 10 -Supplement
1-, Abstract P0628, p. 206 (2002).
L. Feliubadaló, M. Arbonés, M. Palacín, V. Nunes. Generation of
a knock out model for non type I cystinuria. European Journal of
Human Genetics. vol 10 —Supplement 1—, Abstract P0641, p.
209 (2002).
RECERCA BIOMÈDICA | 141

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
MEMÒRIA FINAL
1. Resum del projecte original
Objectius del projecte original
1. Determinació de la relació cost-eficàcia del
cribratge genètic molecular (anàlisi del gen HFE)
poblacional i de familiars de primer grau d’afectats
en relació amb el cribratge bioquímic (ferritina sèrica
500m g/ml i/o IST 55%) poblacional o de familiars
de primer grau d’afectats.
1.1. Selecció de la mostra: inclusió d'una mostra de
5.000 controls poblacionals. Inclusió de familiars de
primer grau d’afectats.
1.2. Screening bioquímic (ferritina sèrica 500m g/ml
i/o IST 55%) a tots els participants.
1.3. Anàlisi genètica (anàlisi del gen HFE a la recerca
de les mutacions C282Y i H63D) a tots els participants.
1.4. Convocatòria de tots els participants amb ferritina
sérica 500m g/ml i/o IST 55%, o/i homozigots
C282Y o/i heterozigots C282Y amb la finalitat de
realitzar: una avaluació clínica completa, arbre
genealògic, interrogar antecedents familiars, hàbits
tòxics i practicar una nova anàlisi de sang (determinació
de GOT, GPT, FA, bilirubina, albúmina, hemograma,
virus C i B, temps de protrombina).
Títol del projecte:
Avaluació de la relació cost-eficàcia de l’anàlisi genètica
molecular en el diagnòstic precoç de l’hemocromatosi
hereditària i perspectives de prevenció i de tractament
Investigador principal
Rafael Oliva Virgili
Institució
Hospital Clínic i Provincial de Barcelona
8.679.550 PTA
1.5. Biòpsia hepàtica en dos supòsits:
a) Si persisteixen les alteracions del metabolisme del
ferro practicada tres mesos després i en absència de
qualsevol altra causa d’hemocromatosi secundària.
b) En persones homozigots o heterozigots només si hi
ha manifestacions clíniques o bioquímiques de la
malaltia.
1.6. Avaluació de l’eficàcia (com a anys de vida
guanyats) del cribratge genètic molecular (anàlisi del
gen HFE) poblacional i de familiars de primer grau
d’afectats en relació amb el cribratge bioquímic (ferritina
sèrica 500m g/ml i/o IST 55%) poblacional o de
familiars de primer grau d’afectes.
1.7. Avaluació del cost del cribratge genètic molecular
(anàlisi del gen HFE) poblacional i de familiars de
primer grau d’afectats en relació amb el cribratge
bioquímic (ferritina sèrica 500m g/ml i/o IST 55%)
poblacional o de familiars de primer grau d’afectats
seguit en alguns casos de biòpsia hepàtica.
1.8. Determinació de la relació cost-eficàcia.
2. Determinació de la relació cost-eficàcia de l’anàlisi
genètica molecular (anàlisi del gen HFE) en relació
amb els estudis habituals en malalts amb hemocromatosi.
2.1. Selecció dels malalts: malalts amb sospita d’HH

que acudeixin espontàniament al Servei d’Hepatología
de l’HCP.
2.2. Estudis habituals.
2.3. Anàlisi genètica (anàlisi del gen HFE a la recerca
de les mutacions C282Y i H63D).
2.4. Avaluació de l’eficàcia (en anys de vida guanyats)
del cribratge poblacional genètic molecular (anàlisi del
gen HFE) en relació amb l’eficàcia del cribratge
poblacional bioquímic (ferritina sèrica 500m g/ml i/o
IST 55%).
2.5. Avaluació del cost de l’estudi genètic molecular
(anàlisi del gen HFE) en relació amb els estudis
convencionals (ferritina, saturació de la transferrina,
ferro en biòpsia hepàtica).
2.6. Determinació de la relació cost/eficàcia.
3. Identificació de factors reguladors de l’expressió
del gen HFE com a base del desenvolupament de
fàrmacs o teràpies alternatives.
3.1. Identificació de proteïnes reguladores i elements
reguladors de l’expressió del gen HFE.
3.1.1. Identificació d’elements conservats en l’evolució:
seqüenciació de la regió promotora del promotor
del gen HFE en diverses espècies model.
3.1.2. Seqüenciació de la regió promotora del gen
HFE en malalts HH sense mutacions C282Y.
3.1.3. Estudis de band-shift i de footprinting.
3.2. Generació d’un model de transcripció in vitro.
Síntesi del disseny experimental:
1. Determinació de la relació cost-eficàcia del cribratge
genètic molecular (anàlisi del gen HFE) poblacional
i de familiars de primer grau d'afectats en relació amb
el cribratge bioquímic (ferritina sèrica 500m g/ml i/o
IST 55%) poblacional o de familiars de primer grau
d'afectats.
1.1. Selecció de la mostra: 5.000 donants de sang
consecutius. Malalts amb hemocromatosi. Familiars
de primer grau d’afectats.
1.2. Screening bioquímic.
1.3. Anàlisi genètica (anàlisi del gen HFE a la recerca
de les mutacions C282Y i His63Asp).
1.4. Convocatòria d’homozigots C282Y o/i heterozigots
C282Y i determinació de paràmetres bioquímics.
1.5. Biòpsia hepàtica, si cal.
1.6. Avaluació de l’eficàcia (en anys de vida guanyats)
del cribratge genètic molecular.
1.7. Avaluació del cost del cribratge genètic molecular.
1.8. Determinació de la relació cost-eficàcia: ptes/any
de vida.
2. Determinació de la relació cost-eficàcia de l'anàlisi
genètica molecular (anàlisi del gen HFE) en relació
amb els estudis habituals davant de malalts amb
hemocromatosi.
2.1. Selecció dels malalts: malalts que espontàniament
arribin al Servei d'Hepatología de l’HCP.
2.2. Estudis habituals.
2.3. Anàlisi genètica (anàlisi del gen HFE a la recerca
de la mutació C282Y): igual que en 1.3.
2.4. Avaluació de l’eficàcia (en anys de vida guanyats)
del cribratge genètic molecular (anàlisi del gen HFE)
en relació amb l’eficàcia del cribratge bioquímic (ferritina
sèrica 500m g/ml i/o IST 55%) i per biòpsia
hepàtica (índex de ferro hepàtic >1,9).
2.5. Avaluació del cost de l’estudi genètic molecular
(anàlisi del gen HFE) en relació amb els estudis
convencionals.
2.6. Determinació de la relació cost-eficàcia en cada cas.
3. Identificació de factors reguladors de l’expressió del
gen HFE com a base del desenvolupament de
fàrmacs o teràpies alternatives.
3.1. Identificació de proteïnes reguladores i elements
reguladors de l’expressió del gen HFE.
3.1.1. Identificació d’elements conservats en l’evolució.
3.1.2. Seqüenciació de la regió promotora del gen
HFE en malalts HH sense mutacions C282Y o H63D.
3.1.3. Estudis de band-shift i de footprinting.
3.2. Generació d’un model de transcripció in vitro
amb el qual poder demostrar en un nivell funcional
l'efecte dels elements i factors reguladors identificats.
A més, la disponibilitat d'aquest model permetria en el
cas de descobrir alguna alteració de la regió promotora,
l’estudi del mecanisme patogènic exacte.
Síntesi del pla de treball
Primer any de desenvolupament del projecte:
Selecció dels participants en l’estudi. Extracció de les
mostres de sang i signatura del full de consentiment
informat pels familiars que participin en l’estudi.
Recerca de les mutacions Cys282Tyr i His63Asp del
gen HFE en la majoria de les mostres. Inici de la
seqüenciació de la regió promotora del gen HFE en
diverses espècies model.
Segon any de desenvolupament del projecte:
Inclusió de malalts i familiars addicionals en l’estudi.
Inici de la seqüenciació de la totalitat del gen HFE a la
recerca de mutacions noves no descrites en aquells
malalts amb hemocromatosi familiar en què s'hagin
descartat les mutacions Cys282Tyr i His63Asp.
Identificació de possibles regions reguladores de
l’expressió del gen HFE per mitjà d’assaigs in vitro.
Tercer any de desenvolupament del projecte:
Determinació de la relació cost-eficàcia. Seguiment
dels afectats. Inici de l’estudi retrospectiu-prospectiu
de l'evolució dels malalts en relació amb el tipus de
mutació detectada. Conclusió dels estudis funcionals
de la regió promotora. Anàlisi i elaboració dels
resultats i redacció d’articles.
2. Resultats
Hem determinat que les mutacions del gen HFE són
responsables del 85,1% dels casos d’hemocromatosi
al nostre país (Sánchez et al., 2000). Quant al cribratge
genètic molecular (anàlisi del gen HFE) poblacional,
s’hi han inclòs 5.370 controls poblacionals, a més
dels 512 controls prèviament estudiats en un treball
pilot (Sanchez et al., 1998). Per tant, s’han superat les
previsions inicials en haver aconseguit incloure 5.882
controls (5.370 donants + 512 de l’estudi pilot). S’ha
analitzat la presència de possibles mutacions C282Y i
H63D a tots els participants i els nivells de ferro, ferritina
i transferrina. Això ha permès trobar 8 (5 homes i 3
dones) donants que són homozigots C282Y (0,15%) i
74 heterozigots compostos C282Y/H63D (1,38%), a
part de determinar acuradament la freqüència
poblacional dels al·lels mutants en la nostra població
(3,16%±0,46% per a la mutació C282Y i
20,80%±1,09% per a la mutació H63D; Sánchez et
al., 2003). Hi havia 4 dels 8 homozigots C282Y, tot
homes, que presentaven nivells de ferritina i de saturació
de transferrina elevats. En canvi, no s’ha detectat
cap dona amb un increment en aquests paràmetres.
Només 1 dels 74 heterozigots compostos
C282Y/H63D presentava nivells de ferritina i de
saturació de transferrina elevats (penetració de
RECERCA BIOMÈDICA | 143

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
l’1,35% per a aquest genotip). Els resultats d’aquest
treball s’han acceptat com a publicació científica
(Sánchez M, Villa M, Ingelmo M, Sanz C, Bruguera C
and Oliva R 2003. Population screening for hemochromatosis:
a study in 5370 Spanish blood donors.
Journal of Hepatology, en premsa).
El nostre estudi també prediu, segons la llei de Hardy-
Weinberg, que la freqüència del genotip
C282Y/C282Y a Espanya és d’1 en 1.004 i que la
freqüència dels heterozigots compostos
(C282Y/H63D) és d’1 en 72. De rellevància, l’expressió
bioquímica de la malaltia en la nostra població és
aproximadament del 80% dels homes (4 de 5)
detectats amb el genotip C282Y/C282Y. Per tant,
podem concloure que a Espanya hi ha aproximadament
unes 40.684 persones C282Y homozigot
(40.847.371 (cens 2001) x 1 / 1004 = 40.684) i
563.693 persones heterozigot compostes
(C282Y/H63D) que no saben que tenen risc de
desenvolupar hemocromatosi. D’aquestes, aproximadament
uns 23.882 homes i unes 8.136 dones
expressen o expressaran bioquímicament la malaltia si
no s’hi du a terme cap mena de prevenció.
Els resultats de l’avaluació de l’eficàcia (en anys de
vida guanyats) del cribratge genètic molecular (anàlisi
del gen HFE) poblacional i de familiars de primer grau
d’afectats en relació amb el cribratge bioquímic (ferritina
sèrica 500m g/ml i/o IST 55%) indica que l’estratègia
de cribrar tota la població de 35-40 anys és
dominant respecte de l’estratègia de no fer res,
sempre que el cost de l’anàlisi genètica no superi els
10 euros. Aquests resultats s’han presentat com a
comunicació als congressos de l’European Iron Club i
Bioiron 2001 (Oliva R, Sánchez M, Ingelmo M, Sanz
C, Pereira A, Rodés J, Bruguera M. Evaluation of the
cost-effectiveness ratio of the genetic and biochemical
screening for hemochromatosis in Spain), i l’article
científic corresponent està ara en fase d’elaboració.
Quant a la identificació de proteïnes reguladores i
d’elements reguladors de l’expressió del gen HFE,
s’han seqüenciat les regions promotores corresponents
del gen humà, de ratolí i de la rata, i la regió
promotora del gen HFE en malalts HH sense
mutacions C282Y. Els resultats han estat publicats a
Genetic Testing (Sánchez M, Bruguera M, Quintero E,
Barrio Y, Mazzara R, Rodés J and Oliva R, 2000,
Hereditary Hemochromatosis in Spain. Genetic
Testing, 4, 171-176), tot aportant una valuosa
informació bàsica referent als mecanismes d’expressió
del gen HFE.
Quant a la caracterització dels extrems 3’ i 5’ del gen
HFE s’han seqüenciat diversos clons (EST) identificats
a les bases de dades amb la finalitat de caracteritzar
molt millor l’inici de transcripció del gen. A més, per
RT-PCR i RACE s’ha aconseguit estendre la regió 3’
del gen i identificar noves variants d’splicing (Sánchez
M, Bruguera M, Rodés J and Oliva R, 2001, Complete
characterization of the 3' region of the human and
mouse hereditary hemochromatosis HFE gene and
detection of novel splicing forms. Blood Cells,
Molecules, and Diseases 27, 35-43).
Tots aquests resultats descrits en les seccions prèvies
també han donat lloc a una tesi doctoral (Sánchez M,
2002, La hemocromatosis hereditaria: estudio del gen
HFE y de sus mutaciones en la población española,
Universitat de Barcelona) dirigida per l’investigador
principal del projecte. La part de l’estudi de costefectivitat
també ha servit de base per a l’elaboració
de la tesina del Màster de Gestió Sanitària (1998-
2000; Asenjo MA, Grau J, Universitat de Barcelona)
presentada per l’investigador principal del projecte
(Oliva R, Avaluació de la relació cost-efectivitat de
l’anàlisi genètic molecular en el diagnòstic precoç de
l’hemocromatosi hereditària).
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
En primer lloc, el cribratge de 5.370 donants de sang
per a les mutacions C282Y i H63D del gen de l’hemocromatosi
ha permès determinar acuradament la
freqüència poblacional dels al·lels mutants en la nostra
població (3.16%±0.46% per a la mutació C282Y i
20.80%±1.09% per a la mutació H63D; Sánchez et
al., 2003). També és rellevant haver determinat que les
mutacions del gen HFE són responsables del 85,1%
dels casos d’hemocromatosi al nostre país (Sánchez
et al., 2000). Aquestes dades poden resultar molt útils
en la planificació de les necessitats sanitàries sobre
hemocromatosi, atès que permeten predir que a
Espanya hi ha aproximadament 40.684 persones
C282Y homozigots i 563.693 persones heterozigots
compostes (C282Y/H63D) que no saben que tenen
risc de desenvolupar hemocromatosi.
Si a aquestes dades, hi afegim els resultats assolits
sobre l’expressió bioquímica de la malaltia en la nostra
població (un 80% dels homes detectats amb el
genotip C282Y/C282Y i un 1,35% dels C282Y/H63D;
Sánchez et al., 2003), també podem predir que uns
23.882 homes i unes 8.136 dones expressen o
expressaran bioquímicament la malaltia al nostre país
si no es fa res per prevenir-ho. Aquestes dades són
molt rellevants, perquè un excés crònic de ferro a
l’organisme com el que es dóna en l’hemocromatosi
condueix a cirrosi hepàtica i risc incrementat de
càncer de fetge. També comporta un risc incrementat
de diabetis mellitus i de cardiomiopatia, entre altres
alteracions. Totes aquestes alteracions es poden
prevenir si el risc de desenvolupar hemocromatosi es
detecta de manera precoç (per exemple mitjançant el
cribratge genètic) i, en cas d’augment dels nivells de
ferro, s’inicia una prevenció. En aquest cas, la prevenció
consisteix a iniciar un tractament per mitjà de
donacions de sang periòdiques per reduir, i
subsegüentment mantenir, els nivells de ferro dins de
la normalitat.
Els resultats de l’estudi de la relació cost (expressat en
euros)-eficàcia (expressat en anys de vida guanyats)
de l’anàlisi genètica molecular indica que l’estratègia
de cribrar tota la població de 35-40 anys i de salvar
vides és dominant respecte de l’estrategia de no fer
res, sempre que el cost de l’anàlisi genètica no superi
els 10 euros. És a dir, que el nostre país estalviaria
diners fent l’anàlisi genètica a tota la població de 35-
40 anys i subsegüentment fent un tractament preventiu
a las persones detectades amb risc de patir
hemocromatosi. Tots aquests resultats haurien de
servir per ajudar els nostres polítics i responsables del
sistema sanitari a considerar la implementació
d’aquest tipus d’estratègies preventives basades en el
cribratge poblacional.
A part de tots aquests resultats potencialment aplicables
a curt termini, en el projecte també hem contri-

uït substancialment en l’avenç dels aspectes de
recerca bàsica. Així, hem completat la seqüència del
gen HFE humà i hem descobert i descrit diverses
noves variants d’splicing (Sánchez et al., 2001).
Aquestos avenços poden tenir aplicacions a mitjà i
llarg termini gràcies a estimular el desenvolupament
de tractaments més eficaços per a les alteracions del
metabolisme del ferro.
4. Publicacions
Sánchez M, Bruguera M, Quintero E, Barrio Y, Mazzara R,
Rodés J and Oliva R (2000). Hereditary Hemochromatosis in
Spain. Genetic Testing, 4, 171-176.
Sánchez M, Bruguera M, Rodés J and Oliva R (2001). Complete
characterization of the 3' region of the human and mouse hereditary
hemochromatosis HFE gene and detection of novel splicing
forms. Blood Cells, Molecules, and Diseases 27, 35-43
Sánchez M, Villa M, Ingelmo M, Sanz C, Bruguera C and Oliva
R (2003). Population screening for hemochromatosis: a study in
5370 Spanish blood donors. Journal of Hepatology (en premsa).
Oliva R, Sánchez M, Sanz C, Pereira A, Rodés J, Bruguera M
(2003). Cost-effectiveness analysis for population screening for
hemochromatosis in Spain (article en preparació).
RECERCA BIOMÈDICA | 145

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
S'han generat tres memòries:
MEMÒRIA 1
1. Resum del projecte original
Objectius
Estudiar el paper dels metabòlits en l'àcid araquidònic
i dels enzims de la via de la ciclooxigenasa (COX) en
la patogènia de la inflamació en la fibrosi quística (FQ),
i també l’ús potencial dels inhibidors selectius de la
COX-2 en el seu tractament.
Disseny
L’estudi ha consistit a obtenir mostres de mucosa
nasal de pacients amb fibrosi quística i de malalts amb
patologies similars inflamatòries de les vies aèries i de
subjectes sans. Totes les mostres han estat extretes a
causa d’una indicació terapèutica amb finalitat
pal·liativa (polipectomies, cirurgia correctora del nas) i
en cap cas motivat per l’estudi.
En aquestes mostres s’han estudiat les característiques
del procés inflamatori de les vies respiratòries en
els malalts amb FQ comparades amb altres processos
inflamatoris diferents de l’FQ i amb mucosa nasal sana.
En primer lloc, i d’acord amb l’objectiu principal de
Títol del projecte:
Paper de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) en la inflamació
de la fibrosi quística. Estudi de l’eficàcia clínica
dels inhibidors selectius de la COX-2
Investigador principal
César Picado Vallés · Emili Gelpí Monteys · Antonio Moreno Galdó
Institució
Hospital Clínic i Provincial de Barcelona · Institut d’Investigacions
Biomèdiques de Barcelona (CSIC) · Hospital Maternoinfantil Vall d’Hebron
Membres de l’equip
Equip Emili Gelpí: Joan Roselló-Catafau, Oriol Bulbena i Emili Gelpí
Equip Antonio Moreno: Nicolás Cobos, Santos Liñán, Silvia Gartner i Antonio Moreno
38.965.000 PTA
l’estudi, s’ha analitzat l'expressió i regulació de la
ciclooxigenasa-1 (COX-1) i la ciclooxigenasa-2 (COX-
2) en la mucosa nasal mitjançant tècniques de
transcripció reversa i PCR i Western blot.
En segon lloc, s’han analitzat les relacions entre la
regulació de les dues COX i les característiques del
procés inflamatori tot estudiant: a) les característiques
histològiques de l’infiltrat inflamatori, b) l'expressió de
citocines reguladores de la inflamació (IL-5, IL-6, GM-
CSF, IL-8) mitjançant tècniques d'immunohistoquímica,
i c) el possible paper en la regulació de la inflamació
i de la regulació de la COX-2 en la mucosa nasal
de la FQ, de respostes IgE mediades davant de
superantígens de bacteris habitualment presents en la
mucosa respiratòria dels malalts amb FQ, com ara
l'estafilococ, els quals han estat implicats en el
desenvolupament d’altres tipus de rinosinusitis
cròniques.
Pla de treball
L’obtenció de les mostres nasals de pacients amb FQ,
pacients controls amb altres patologies inflamatòries i
mucoses nasals sanes s’han obtingut tot al llarg d’uns
32 mesos. Les mostres s’han rebut de 4 centres
hospitalaris (Vall d’Hebron, Clínic, Sant Joan de Déu,

Santa Creu i Sant Pau). En total s’han utilitzat 62
mostres nasals. Durant els 32 mesos s’han fet els
estudis histològics, immunohistoquímics, ELISA i de
biologia molecular (RT-PCR i Western blot). L’únic
estudi que resta per finalitzar és la valoració mitjançant
immunohistoquímica de l'expressió d’algunes citocines
proinflamatòries, que està en fase de quantificació.
Els darrers mesos s’han emprat per escriure els
articles amb els resultats obtinguts i la preparació de
les primeres presentacions dels resultats en congressos
dedicats a l’FQ.
2. Resultats
1. Estudi de la regulació del metabolisme de l’àcid
araquidònic en la mucosa nasal de pacients amb FQ.
Els dos enzims de la via de la ciclooxigenasa
anomenades COX-1 i COX-2 no han mostrat cap
diferència significativa en llur regulació en comparació
amb la mucosa nasal sana i la mucosa inflamada de
pacients amb processos rinosinusítics crònics similars
a l’FQ però d’etiologia diferent. Aquestes troballes
s’han fet tant respecte d’ARN missatger com de la
proteïna. Aquests resultats lliguen amb els obtinguts
per un dels grups integrants del projecte, que han
trobat uns nivells baixos de prostaglandines en les
secrecions nasals. Tot plegat aquests resultats
mostren que, contràriament a allò esperat i establert
en la nostra hipòtesi de treball, la via de la ciclooxigenasa
no està activada en les vies aèries en l’FQ.
2. Estudi de les característiques de la resposta
inflamatòria a les vies aèries de l’FQ i llur relació amb
el metabolisme de l’àcid araquidònic.
En el nostre estudi hem trobat que la resposta
inflamatòria de les vies aèries superiors a l’FQ es
caracteritza pel fet de ser predominantment neutrofílica.
Les citocines proinflamatòries més expressades en
les vies aèries d’aquests pacients són les relacionades
amb la presència de neutròfils (IL-8).
3. Estudi de les relacions entre inflamació, infecció,
resposta a superantígens i metabòlits de l’àcid
araquidònic.
L’origen de la formació de pòlips nasals com a part de
la resposta inflamatòria crònica de les vies aèries en
algunes malalties com l’FQ és desconegut. En alguns
casos de rinosinusitis crònica similar a l’observada en
l’FQ s’ha detectat la presència d’anticossos de tipus
IgE dirigits contra superantígens procedents de
bacteris que habitualment colonitzen les vies aèries,
com ara l’estafilococ. En el nostre estudi hem
comprovat que aquest tipus de resposta s’observa en
la rinosinusitis crònica que acompanya altres processos,
però no en la FQ, la qual cosa descarta que
reaccions d’aquesta mena estiguin involucrades en
l’etiologia de la malaltia.
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
D’acord amb estudis previs, l’ús d’antiinflamatoris no
esteroïdals (AINE) podria tenir efectes beneficiosos en
l’FQ. Aquests AINE tenen efectes secundaris atribuïts
a la seva capacitat d’inhibir tant la COX-1 com la
COX-2. A la inhibició de la primera (COX-1), se li
atribueixen els efectes secundaris, mentre que a la
inhibició de la segona (COX-2) se li assignen les
accions antiinflamatòries beneficioses. L’aparició de
nous fàrmacs amb activitat selectiva sobre la COX-2
obria noves perspectives en el tractament de l’FQ
amb AINES. Atès que s’accepta que en els processos
inflamatoris es produeix una regulació a l’alça de la
COX-2, que és la responsable almenys en part de la
resposta inflamatòria, la idea del nostre projecte era
molt simple: amb aquests fàrmacs inhibidors selectius
de la COX-2, podrem obtenir beneficis sense haver de
pagar els inconvenients dels efectes adversos dels
AINE clàssics (hemorràgia digestiva, fonamentalment).
Aquest projecte tenia dos vessants, un dels quals era
de recerca bàsica i pretenia posar les bases per a una
ulterior actuació terapèutica en l’FQ.
L’estudi de recerca bàsica mostrà que en contra d’allò
hipotetitzat, la COX-2 no està activada a les vies
aèries de malalts amb FQ. A més, i d’acord amb
aquesta troballa, la producció de metabòlits generats
per la via de la COX no està augmentada.
Amb aquests resultats no va semblar ètic passar a la
segona fase de l’estudi, que consistia a provar la
hipòtesi en la vida real tractant els malalts amb un
inhibidor selectiu de la COX-2.
A banda dels estudis en la via de la ciclooxigenasa, el
nostre estudi també va demostrar que l’altra via
metabòlica de l’àcid araquidònic, coneguda com la via
dels cisteinil leucotriens, tampoc no està activada.
Malauradament, el nostre estudi no pot aportar dades
positives amb repercussió clínica. En tot cas, aporta
observacions que fan pensar que dos nous tipus de
fàrmacs dirigits a tractar les malalties inflamatòries: els
inhibidors selectius de la COX-2 i els anticisteinil
leucotriens (montelukast, zafirlukast) molt probablement
no tenen cap paper rellevant en el tractament de l’FQ.
MEMÒRIA 2
1. Resum del projecte original
Objectius
Estudiar el paper de la ciclooxigenasa-2 i dels seus
inhibidors selectius en la patogènia de la inflamació en
la fibrosi quística (FQ), com també el seu tractament.
Hipòtesi
En l’FQ es produeix un fenomen inflamatori, responsable
en part de l’obstrucció bronquial. Aquest fenomen
inflamatori es produeix com a conseqüència d’una
producció excessiva de mediadors inflamatoris, en
particular de prostaglandina E2 (PGE2). La síntesi de
PGE2 en condicions fisiològiques és gràcies a la ciclooxigenasa-1
(COX-1), però l’excés de PGE2, és secundària
a la inducció de la ciclooxigenasa-2 (COX-2).
L’ús d’inhibidors de les ciclooxigenases (ibuprofè) ha
demostrat ser útil en el tractament de l’FQ. Aquests
inhibidors tenen l’inconvenient d’inhibir tant la COX-1,
com la COX-2. La inhibició de la primera causa
efectes secundaris (hemorràgia digestiva, insuficiència
renal). Els inhibidors selectius de la COX-2 no tenen
aquests inconvenients, per la qual cosa podrien ser
molt útils en el tractament prolongat de l’FQ.
Mètodes
L’estudi constarà de dues parts:
a) Recerca Bàsica: hom obtindrà les cèl·lules epitelials
i les secrecions nasals mitjançant raspallat i rentat
nasal. Les cèl·lules epitelials seran cultivades in vitro,
tot estudiant la regulació de la COX-2 mitjançant la
RECERCA BIOMÈDICA | 147

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
quantificació de l’ARNm per RT-PCR semiquantitativa i
de la seva proteïna per Western blot. En les
secrecions nasals, hom mesurarà els nivells de prostanooids
mitjançant cromatografia d’alta eficàcia (HPLC)
i ELISA.
b) Recerca clínica: assaig doble cec aleatori i paral·lel,
d’un any de durada, de dos grups de 50 pacients
cadascun: l’un serà tractat amb placebo i l’altre amb
un inhibidor selectiu de la COX-2 (nimesulida). Hom
analitzarà el resultat valorant els efectes secundaris
(reaccions adverses), simptomatologia clínica (episodis
infecciosos, hospitalitzacions, dies lliures de símptomes),
evolució de la capacitat ventilatòria (espirometria
forçada) i qualitat de vida.
Resultats esperats
Impacte potencial esperat. Hom demostrarà que en
l’FQ hi ha un augment en la síntesi de la PGE2, a
causa de la regulació a l’alça de la COX-2 en les
cèl·lules epitelials respiratòries. La inhibició selectiva
de la COX-2 minvarà la inflamació de les vies aèries,
disminuirà les complicacions infeccioses i millorarà
l’obstrucció bronquial i la qualitat de vida sense
ocasionar efectes secundaris.
2. Resultats
1. Desenvolupament i posada a punt d’un mètode
per a la valoració de prostaglandines i leucotriens
en secrecions nasals.
S’ha estandarditzat una metodologia d’utilització en la
clínica per al mesurament directe de prostaglandines i
pèptids leucotriens en mostres de secrecions nasals
humanes per tècniques enzimoimmunoenzimàtiques
(EIA). En el cas de la determinació conjunta de prostaglandines
i pèptids leucotriens, aquest mètode estalvia
l’extracció mitjançant minicolumnes fase reversa C18
(específica per a prostaglandines i pèptids leucotriens,
respectivament), la qual cosa comporta l’evaporació
d’extractes orgànics que en el cas dels leucotriens
peptídics suposen pèrdues del 50%.
L’alta especificitat dels anticossos emprats fa que
tampoc calgui, doncs, una purificació posterior dels
extractes per HPLC. En aquest sentit, cal dir que els
estudis per immunocromatrografia dels extractes de
rentats nasals mostren que la major part de la reactivitat
enzimàtica correspon als temps d’elució de la
PGE2, PGF2 i dels leucotriens peptídics.
En mostres més complexes que el rentat nasal, com
és el cas de l’orina i el plasma, és aconsellable una
extracció prèvia abans de l’EIA, molt especialment per
al cas de les metabòlits ciclooxigenàsics de l’àcid
araquidònic.
2. Estudi de la regulació del metabolisme de l’àcid
araquidònic en la mucosa nasal de pacients amb
fibrosi quística.
S’han estudiat les alteracions dels nivells de prostaglandines
i pèptids leucotriens en secrecions nasals
de pacients amb fibrosi quística, que s’han comparat
amb els nivells d’aquests metabòlits de l’àcid araquidònic
determinats en subjectes sans. Cal dir que els
nivells de metabòlits ciclooxigenàsics (prostaglandines
E2 i F2) determinats en els pacients amb fibrosi quística
mostren un disminució respecte dels individus
sans. Aquestes diferències són significatives per al
cas dels leucotriens peptídics. Aquests resultats són
concordants amb els obtinguts per un dels grups
integrants del projecte coordinat, que han trobat que
no hi ha cap augment de l’activitat enzimàtica COX-2
(tant pel que fa a ARN missatger, com de proteïna).
A la vista, doncs, dels resultats obtinguts, hem de
concloure que pel que fa a la regulació del metabolisme
de l’àcid araquidònic en la mucosa nasal de
pacients amb fibrosi quística, tant la via de la ciclooxigenasa,
com de la lipoxigenasa no estan activades en
les vies aèries dels pacients amb fibrosi quística.
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
Atesos els treballs recentment publicats en la literatura,
antiinflamatoris no esteroïdals (AINE) podrien tenir
efectes beneficiosos en el tractament de la fibrosi
quística. Els AINE tenen efectes secundaris associats
amb la inhibició de l’activitat ciclooxigenasa. Mentre
que la inhibició de l’activitat ciclooxigenasa constitutiva
(COX-1) té efectes secundaris, tot fa suposar que la
inhibició específica de la ciclooxigenasa induïble (COX-
2) té efectes beneficiosos en aturar la reacció inflamatòria.
En aquest sentit, l’aparició de nous AINE
selectius per a la COX-2 ens va fer pensar en les
possibilitats d’aquest tipus de fàrmacs per al tractament
dels processos inflamatoris associats a la fibrosi
quística, ja que en actuar sols sobre la COX-2 podrien
estalviar els efectes nocius que, com l’hemorràgia
digestiva, ocorren en el tractament sostingut dels
AINE tradicionals.
Fruit de les investigacions realitzades en aquest
projecte, s’ha pogut establir que en les vies aèries
dels malalts afectats de fibrosi quística —i en contra
del que es podia esperar—, no hi ha activació de la
COX-2, ni el corresponent augment de prostaglandines,
ni leucotriens peptídics en el procés inflamatori
de la mucosa nasal amb pacients amb fibrosi quística.
Totes aquestes observacions fan pensar que la utilització
d’AINE que siguin inhibidors selectius de la
COX-2 per combatre les malalties de base inflamatòria,
no siguin d’interès rellevant en el tractament de la
fibrosi quística.
MEMÒRIA 3
1. Resum del projecte original
Objectius
Estudiar el paper dels metabòlits de l'àcid araquidònic
i dels enzims de la via de la ciclooxigenasa (COX) en
la patogènia de la inflamació en la fibrosi quística (FQ),
com també l'ús potencial dels inhibidors selectius de
la COX-2 com a tractament.
Disseny
L'estudi ha consistit:
1) En la selecció de pacients amb FQ que complien
els criteris d'inclusió en l'estudi: major de 8 anys, en
fase estable de la seva malaltia i que es controlaven
amb regularitat a la Unitat de Fibrosi Quística del Vall
d’Hebron.
2) En l'obtenció de secrecions nasals de pacients
amb FQ i de subjectes sans com a grup control.
3) En l'obtenció de cèl·lules nasals de pacients amb
FQ i d'altres malalts amb patologia inflamatòria de les
vies aèries de característiques semblants.
En aquestes mostres s'han estudiat les característiques

dels processos inflamatoris de les vies aèries dels malalts
amb FQ comparades amb altres processos inflamatoris
diferents de l’FQ i amb mucosa nasal normal.
D’acord amb l’objectiu principal de l'estudi, s'ha
analitzat l'expressió i regulació de la ciclooxigenasa-1
(COX-1) i de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) en la
mucosa nasal mitjançant les tècniques de transcripció
reversa, PCR i Western blot.
En segon lloc, s'han analitzat les característiques del
procés inflamatori, l'expressió de citocines reguladores
de la inflamació (IL-5, IL-6, GM-CSF i IL-8) mitjançant
tècniques d'immunohistoquímica i de la resposta IgE
mediada per superantigen de bacteris habitualment
presents en les secrecions mucoses dels pacients
amb FQ amb l’Staphiloccocus aureus, els quals estan
implicats en altres processos inflamatoris rinosinusals
crònics.
A més a més, al grup estudiat de pacients amb FQ se
li ha fet exploració funcional respiratòria, determinació
d'IgE, proves cutànies, determinació d'òxid nítric
nasal, tomografia axial computeritzada (TAC) de sins
maxil·lars i paranasals i endoscòpia nasal.
Pla de treball
Durant el període inicial es van seleccionar 60
pacients amb FQ que complien els criteris d'inclusió i
30 subjectes sans com a grup control. Es va
protocol·litzar la tècnica d'obtenció de mostres de
secrecions nasals per a ambdós grups. A tots els
pacients d’FQ se'ls va fer un TAC i endoscòpia nasal
per buscar pòlips nasals. Durant una segona etapa
tots els pacients amb FQ es van controlar clínicament
i es va decidir conjuntament amb el Servei
d'Otorinolaringologia (ORL) de l'Hospital Infantil Vall
d’Hebron el moment de la intervenció quirúrgica dels
pòlips nasals. Amb el material de la mucosa nasal i de
les secrecions nasals es van fer les determinacions de
la COX-1 i la COX-2. Amb els resultats obtinguts, no
es va poder fer l'última part del projecte d'investigació
clínica amb un inhibidor selectiu de la COX-2. Es va
decidir dirigir la investigació d'aquesta fase cap a
l'anàlisi d'altres mediadors de la inflamació, com els
leucotriens i les citocines i de la seva relació amb la
patologia broncopulmonar, patologia rinosinusal i
relació genotip-fenotip. A més, es va ampliar l'obtenció
de mostres de mucosa nasal a altres processos
rinosinusals crònics per fer una anàlisi comparativa
amb les mostres de pacients amb FQ.
2. Resultats
Subjectes d'estudi: s'han inclòs 60 pacients amb FQ
en fase estable d’edats compreses entre 7 i 40 anys.
El 56% eren de 7 a 18 anys inclusivament: 33 homes i
27 dones.
Grup control: s'ha inclòs 30 pacients de població
sana d’edats compreses entre 7 i 50 anys.
A tots se'ls va fer una rentada nasal i es van obtenir
mostres de secrecions nasals. Dels 4 ml de sèrum
instil·lats en cada pacient se’n va recuperar una
mitjana d’1,8 ml.
1. Es va fer l'estudi de la regulació dels enzims COX-1
i COX-2 i dels nivells de prostaglandines en les
secrecions i en les mucoses nasals. Es van comparar
els resultats entre ambdós grups.
Els dos enzims COX-1 i COX-2 no han mostrat
diferència significativa en la regulació de la mucosa
nasal sana i la mucosa inflamada dels pacients amb
FQ. Aquestes troballes van ser contràries a la nostra
hipòtesi inicial.
Tampoc no es van trobar diferències significatives en
els nivells de prostaglandines entre els pacients amb
FQ i els del grup control.
2. Es van correlacionar els resultats de les prostaglandines
i dels cisteïnil leucotriens amb els diferents
paràmetres clínics, de laboratori i amb la presència de
pòlips nasals.
En el grup de pacients amb FQ van ser diagnosticats
de pòlips per endoscòpia 9/60 i per TAC de sins
14/35. D’acord amb aquests resultats es van establir
dos grups i es van comparar les diferents característiques
de la població estudiada.
No vam observar diferències significatives entre els
pacients amb FQ i pòlips nasals i sense pòlips amb
relació als nivells de prostaglandines (105,8 pg/ml vs
227,7 pg/ml, p= 0,207) ni en relació amb els nivells de
cisteïnil leucotriens (104,04 pg/ml vs 138,8 pg/ml, p=
0,79).
Tampoc no es va trobar correlació significativa entre
els pacients amb valors d'IgE elevats respecte dels
nivells de prostaglandines ni dels nivells de cisteïnil
leucotriens.
El mateix es va esdevenir amb els pacients amb tests
cutanis positius i els nivells de prostaglandines i cisteïnil
leucotriens.
3. Estudi de les citocines i la seva correlació entre els
diversos paràmetres clínics, de laboratori i la presència
de pòlips nasals.
Aquesta fase de l'estudi està pendent dels resultats
de les citocines i, per tant, no s’ha acabat.
4. Correlació entre els diversos paràmetres clínics, de
laboratori i la presència de pòlips diagnosticats per
endoscòpia i per TAC de sins.
Els resultats es mostren en la taula 1. Es van observar
diferències significatives entre els pacients amb FQ
amb pòlips diagnosticats per endoscòpia nasal en
relació amb la IgE elevada, amb la presència de
símptomes nasals i amb nivells d'ONN molt baixos.
Es van observar diferències significatives entre els
pacients amb FQ i pòlips diagnosticats exclusivament
per TAC amb relació a l'edat i als valors d'IgE.
No es van observar diferències significatives amb la
resta dels paràmetres estudiats.
Taula 1. Relació entre els pacients FQ amb pòlips
diagnosticats per endoscòpia nasal o per TAC de sins
i els diferents paràmetres estudiats.
RECERCA BIOMÈDICA | 149

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
La tècnica utilitzada per a l'obtenció de mostres de
secrecions nasals s'ha posat a punt i s’hi va recollir
mostra representativa suficient per a la determinació
de les prostaglandines, de cisteïnil leucotriens i de
citocines.
Aquesta tècnica es podrà emprar en altres estudis per
analitzar diferents substàncies en les secrecions
nasals.
L'obtenció de teixits nasals va ser representativa i es
va poder determinar l'expressió i regulació dels
enzims COX-1 i COX-2.
Aquest material també es podrà utilitzar en altres
estudis de regulació i d'expressió de diferents enzims.
Sorprenentment, els valors de prostaglandines en les
mostres analitzades no van confirmar la hipòtesi inicial
que aquests mediadors tenien un paper en el
mecanisme de la inflamació en l’FQ, ja que els valors
determinats no difereixen dels valors en els subjectes
controls.
Davant d'aquestes troballes, no vam trobar justificació
de cap mena per tractar els nostres pacients amb un
inhibidor selectiu de la COX-2.
Arran d'aquests resultats es va fer una segona modificació
del projecte inicial i es van determinar els cisteïnil
leucotriens, que tampoc no difereixen dels valors
en els subjectes normals.
Aquesta troballa podria posar en qüestió de manera
rellevant el paper dels anticisteïnil leucotriens com a
tractament antiinflamatori en aquests pacients i en
aquest moment són motiu d'assajos clínics.
Si bé no s'ha pogut corroborar la hipòtesi inicial, els
resultats no deixen de ser encoratjadors en no poder
implicar la via dels eosinòfils en els possibles mecanismes
i mediadors implicats en la patogènia de la
inflamació en l’FQ ni dels pòlips, com succeeix en
altres malalties inflamatòries rinosinusals i bronquials.
Encara s’ha d’enllestir els resultats de la citocina IL-8,
segregada principalment pels neutròfils, i que sí que
sembla determinant en la patogènia de la inflamació.
D'acord amb els nostres resultats, la presència de
pòlips en l’FQ no està relacionada amb la presència
de nivells elevats de prostaglandines ni de cisteïnil
leucotriens. Segons els nostres resultats la presència
de pòlips nasals diagnosticats per endoscòpia sí que
sembla que tenen una relació significativa amb la
presència d'atòpia, de símptomes nasals i de nivells
molt baixos d'ONN. El diagnòstic de pòlips nasals per
TAC sol ser més precoç i en pacients de menor edat
amb escassa presència de símptomes nasals.

Títol del projecte:
Estudi de l’expressió de proteïnes estructurals
de membrana en el curs evolutiu de la malaltia del ratolí mdx
Investigador principal
Manuel Roig Quilis
Institució
Hospital Maternoinfantil Vall d’Hebron
Membres de l’equip
Francisca Munell, Alfons Macaya, Carmen De Torres, Bru Cormand, Manuel Roig i Josep Roma
17.054.250 PTA
MEMÒRIA FINAL
1. Resum del projecte original
Objectiu general
Identificar diferències en l’expressió de proteïnes
estructurals de membrana, en diferents moments de
l’evolució de la malaltia del ratolí mdx.
Objectius específics
a) Analitzar, en diferents moments de l’evolució de la
malaltia del ratolí mdx, si alguna isoforma de la distrofina
augmenta la seva expressió en comparació amb
els controls respectius.
b) Identificar, en diferents moments de l’evolució de la
malaltia del ratolí mdx, si existeixen diferències en
l’expressió de proteïnes, estructuralment relacionades
amb la distrofina (espectrina, DRP1, DRP2, distonina i
distrobrevina).
c) Identificar altres proteïnes no relacionades fins al
moment amb la distrofina, l’augment de les quals
pogués explicar el comportament més benigne de la
malaltia del ratolí mdx comparada amb la dels
pacients amb distrofia muscular de Duchenne.
d) Demostrar diferències en l’expressió de proteïnes
estructurals de membrana en el ratolí mdx en
comparació amb els seus controls o l’existència
d’altres proteïnes candidates a variar el comportament
de la malaltia, comprovar si aquestes també es
produeixen en humans afectats de distròfia muscular
lligada al cromosoma X.
Disseny
a) Animals utilitzats: soca mdx i la seva soca control
C57BL10/ScSn per fer els emparellaments pertinents.
b) Identificació de ratolins: demostració de l'absència
de distrofina per mitjans inmunocitoquímics.
c) Recollida de mostres: s'utilitzaran tres parelles
compostes per un ratolí mascle mdx i un ratolí mascle
sa de la mateixa llorigada. En cadascun del temps
següents: 10 dies, 1, 2, 3, 5 i 8 mesos de vida se
sacrificaran tres parelles de ratolins. Es diseccionarà el
grup muscular gastrocnemi (GMG).
d) Processament de mostres: un dels GMG dels
animals sacrificats serà immediatament congelat en
nitrogen líquid i es conservarà en el congelador a -
80ºC tot esperant fins al seu posterior ús per a extracció
d’RNA. El paquet muscular contralateral serà
congelat en isopentà refredat amb nitrogen líquid i
serà guardat a -80ºC per a estudis histològics,
immunohistoquímics i hibridació in situ.
RECERCA BIOMÈDICA | 151

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
e) Detecció de l’expressió d’isoformes de distrofina:
l’expressió de les diverses formes de distrofina s’estudiaran,
quant a RNA mitjançant les tècniques d’RT-
PCR, Northern blot i hibridació in situ i, quant a proteïna
mitjançant Western blot en cadascun dels temps
abans esmentats.
f) Detecció de l’expressió de proteïnes alternatives
amb dominis funcionals comuns amb la distrofina: la
comparació de la seqüència de la distrofina amb totes
les seqüències de proteïnes contingudes en els bancs
de seqüències ens indiquen que la utrofina, DRP2,
distonina, distrobrevina, beta-espectrina i sintrofina
són proteïnes candidates a suplir la funció de la distrofina
a causa de la seva alta homologia estructural i la
seva localització. Amb la finalitat de demostrar alguna
variació de la seva expressió en algun moment de
l’evolució de la malaltia dels ratolins mdx i la diferencialitat
de la mateixa respecte els ratolins control de la
mateixa edat, s’estudiaran diversos transcrits mitjançant
RT-PCR i Northern blot. Així mateix, en el cas
que algun d’aquests transcrits augmenti la seva
expressió en els ratolins mdx, s’estudiarà la seva
proteïna mitjançant Western blot i immunohistoquímica
en el cas que hi hagi anticòs comercial.
g) Anàlisi de l’expressió d’altres proteïnes, candidates
a variar el comportament de la malaltia: amb la finalitat
de detectar noves seqüències, no relacionades fins al
moment amb la distrofina o fins i tot desconegudes en
l’actualitat, es compararan dues poblacions d’mRNA
d’animals afectats, en diferents moments de la
malaltia. S’ha escollit com a primer punt temporal els
10 dies de vida, ja que fins als 15 dies el ratolí mdx no
presenta els primers símptomes de necrosi muscular.
Com a segon punt, s’ha escollit el tercer mes de vida,
moment en el qual la necrosi ja s’ha estat produint
durant més de dos mesos i, suposadament, el ratolí ja
ha posat en marxa algun mecanisme per aconseguir
contrarestar els efectes de la manca de distrofina i,
d’aquesta forma, modificar el curs natural de la seva
malaltia. Els mRNA extrets de les dues poblacions
escollides es retrotranscriuran i els cDNA obtinguts
s’amplificaran utilitzant primers degenerats representant
seqüències consens de les proteïnes que exerceixen
una funció similar a la distrofina. Els productes de
l’amplificació serviran per generar dues llibreries de
cDNA, les quals s’hibridaran, per duplicat, usant una
sonda composta amb la totalitat dels mRNA extrets
de cada població, marcats isotòpicament. Les
colònies que hibridin positivament amb una sonda i no
amb l’altra seran considerades com a diferencials i els
seus DNA seran seqüenciats. La comparació de les
seqüències obtingudes amb les bases de dades de
seqüències gèniques (BLAST, EST) ens permetrà
identificar-les o evidenciar que tenim davant una
seqüència no descrita fins al moment. Una vegada
obtingudes les seqüències, s’estudiarà la seva expressió
en el curs evolutiu de la malaltia del ratolí mdx,
mitjançant RT-PCR, Northern blot, hibridació in situ,
Western blot i immunohistoquímica.
Pla de treball
La identificació genètica dels animals es realitzarà
mentre es vagin produint les llorigades. Els primers
parells identificats, es deixarà que arribin a l’edat
mínima proposada en l’estudi (8 mesos). Els últims
parells de ratolins mdx(?) a sacrificar seran els corres-
ponents a 10 dies de vida. D’aquesta manera
esperem obtenir totes les edats a estudiar en el
termini de temps al més breu possible.
L’estudi de l’expressió de les isoformes de distrofina i
de les proteïnes relacionades amb aquesta mitjançant
RT-PCR s’iniciarà durant el primer any. Per això, des
del començament del projecte, es dissenyaran primers
específics per a cadascuna de les seqüències a analitzar
i cal preveure que, a partir dels 6 mesos, disposarem
de mostres suficients com per començar ja a
extreure RNA i estudiar l’expressió de les proteïnes
esmentades per RT-PCR. Calculem que l’optimització
de la tècnica per a cada seqüència específica i la seva
realització en totes les mostres ocuparà la segona
meitat del primer any i bona part del segon any.
Durant el segon any es farà l’estudi del mida dels
transcrits per Northern blot, de la proteïna (Western
blot) i de la seva localització cel·lular (hibridació in situ i
immunohistoquímica) de les seqüències que hagin
demostrat expressió diferencial per RT-PCR. És
possible que l’expressió d’isoformes de la distrofina
sigui nul·la o d’algun transcrit aïllat, malgrat que es pot
esperar que alguna de les proteïnes relacionades amb
la distrofina augmenti la seva expressió en el ratolí
mdx. L’estudi d’aquestes serà el que ens ocuparà la
major part del segon any.
Durant aquest segon any i una part del tercer estudiarem
altres possibles seqüències no relacionades fins
al moment amb la distrofina, mitjançant l’amplificació
amb primers que reconeguin seqüències consens, la
construcció de llibreries de cDNA dels productes
amplificats i la clonació i la seqüenciació dels clons
diferencials. Probablement, caldrà dissenyar més
d’una parella de primers i provar diverses condicions
d’amplificació per obtenir un producte d’amplificació
correcte. Un cop obtingut, s’identificarà per comparació
amb el banc de seqüències i se n’estudiarà
l’expressió en totes les mostres extretes durant el
primer any.
** Modificacions / Diversificació del pla de treball inicial
en el decurs de la recerca
En el decurs de l’execució d'aquest treball va sorgir la
possibilitat d'estudiar in vivo els efectes i les
conseqüencies de l’absència de l’activador del
plasminogen uPA en el procés de regeneració
muscular. En comprovar que la regeneració del ratoli
KO (uPA-/-) restava molt retardada, vam decidir verificar
per altres mitjans la nostra hipòtesi que proposa
que el ratolí mdx és capaç de disminuir la intensitat de
la necrosi muscular secundària al dèficit de distrofina a
partir del tercer mes de vida. La producció d'una soca
de ratolins doble mutants (mdx-uPA-/-) ens va
permetre analitzar els efectes d'una regeneració
ineficient al damunt de la malaltia mdx. El màxim
impacte del dèficit d’uPA es va posar de manifest en
el decurs dels tres primers mesos de vida del ratolí
doble mutant, tot coincidint amb el període de
màxima necrosi muscular.
2. Resultats
I) La utrofina com a substitut de la distrofina en el
múscul del ratolí mdx.
Els nivells d’utrofina van ser analitzats per Western
blot en diferents edats del ratolí mdx i els seus
controls respectius. Els resultats obtinguts ens

permeten dividir en fases diferents el comportament
de la utrofina en aquests ratolins. En una primera fase,
que inclou el període que va del naixement fins als 14
dies de vida postnatal, els nivells d'utrofina dels
ratolins mdx i dels controls segueixen un comportament
similar, tot mantenint uns nivells més o menys
estables, amb ràtios (utrofina/miosina) sempre per
sobre d’1,0. Al voltant del dia 15 comença una
segona fase, en la qual tant els ratolins mdx com els
controls pateixen una dràstica reducció dels nivells
d’utrofina, i presenten ràtios per sota de 0,2 fins als
25 dies després del naixement. Després d’aquest
moment comença una tercera fase, en què l’evolució
dels nivells d’utrofina segueix un curs diferent quan
comparem mdx i controls. Així, mentre que en els
controls els nivells d’utrofina es mantenen en nivells
moderadament baixos (ràtios per sota de 0,8), en els
mdx els nivells arriben a ratios molt més altes (entre
1,5 i 4,5).
Figura 1.
L’anàlisi de l’expressió del β-distroglicà en el ratolí
mdx ens mostra una evolució paral·lela a la de la
utrofina. Així, es pot distingir un període (fins als 15
dies) durant el qual els seus nivells són bastant
constants i molt similars entre els mdx i els controls
(amb ràtios β-distroglicà/ miosina al voltant d’1,5). A
partir del dia 15 postnatal els nivells de distroglicà
pateixen una reducció dràstica (que arriba a ràtios de
0,03) i s’allarga fins als 25 dies en ratolins mdx, però
no en els ratolins control (ràtios entre 0,7 i 1,3). Des
dels 25 dies després del naixement en endavant els
nivells de β-distroglicà es veuen parcialment restaurats,
però mantenint-se sempre en nivells més baixos
que els controls de la mateixa edat.
Western utrofina i β-distroglicà. Arran de la seva
rellevància, els resultats per la utrofina entre 1 i 25 dies
es mostren per duplicat (I i II, mostres corresponents a
ratolins diferents). La desaparició de la utrofina al
voltant dels 15 dies de vida es dóna paral·lelament en
els mdx i en els controls. Els resultats es van normalitzar
amb la banda de miosina tenyida amb Coomassie.
n: ratolí normal (control), d: ratolí distròfic
Densitometria utrofina.
A: Resultats de l'anàlisi densitomètrica del Western
blot de la utrofina en ratolins mdx (línia i quadres
negres) i en controls (línia i triangles grisos). Unitats a
l'eix Y esquerre. En segon terme, les barres puntejades
ens mostren l'evolució dels grups necròtics amb
afecció de més de 5 fibres (eix Y dret).
B: Resultats de l'anàlisi densitomètrica del β-distroglicà
en ratolins mdx (línia i quadres negres) i en controls
(línia i triangles grisos).
La correlació entre els nivells d'utrofina i β-distroglicà
en el ratolí mdx a partir del moment en què la utrofina
és reexpressada després de la fase postnatal (és a dir,
en ratolins de 15, 20 i 25 dies i 1, 2, 3, 6 i 9 mesos
d’edat) és elevada (R2 = 0.87). La tendència lineal de
la correlació talla la intersecció dels eixos X i Y, tot
suggerint la total dependència entre la presència
d'utrofina i la de -distroglicà. Aquesta dependència
lineal no és observable en els ratolins control de les
mateixes edats.
Figura 2.
Gràfiques de correlació entre l'expressió d'utrofina i la
de β-distroglicà. Es van analitzar ratolins controls (A) i
mdx (B) de 15, 20 i 25 dies, 1, 2, 3, 6 i 9 mesos. La
recta de regressió es va calcular gràcies al paquet
estadístic del programa Excel de Microsoft. La fórmula
de les rectes de regressió i els valors dels factors R2
es troben inserits dins de cada gràfica.
Densitometria utrofina.
A: Resultats de l'anàlisi densitomètrica del Western
blot de la utrofina en ratolins mdx (línia i quadres
negres) i en controls (línia i triangles grisos). Unitats en
l'eix Y esquerre. En segon terme, les barres puntejades
ens mostren l'evolució dels grups necròtics que
afecten més de 5 fibres (eix Y dret).
B: Resultats de l'anàlisi densitomètrica del β-distroglicà
en ratolins mdx (línia i quadres negres) i en controls
(línia i triangles grisos).
La correlació entre els nivells d'utrofina i β-distroglicà
en el ratolí mdx a partir del moment en què la utrofina
és reexpressada després de la fase postnatal (és a dir,
en ratolins de 15, 20 i 25 dies i 1, 2, 3, 6 i 9 mesos
d’edat) és elevada (R2 = 0.87). La tendència lineal de
la correlació talla la intersecció dels eixos X i Y, tot
suggerint la total dependència entre la presència
d'utrofina i la de β-distroglicà. Aquesta dependència
lineal no és observable en els ratolins control de les
mateixes edats.
RECERCA BIOMÈDICA | 153

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
Figura 3.
Gràfiques de correlació entre l'expressió d'utrofina i la
de β-distroglicà. Es van analitzar ratolins controls (A) i
mdx (B) de 15, 20 i 25 dies, 1, 2, 3, 6 i 9 mesos. La
recta de regressió es va calcular gràcies al paquet
estadístic del programa Excel de Microsoft. La
fórmula de les rectes de regressió i els valors dels
factors R2 estan inserits dins de cada gràfica.
II) Evolució dels nivells d’mRNA de proteïnes estructuralment
relacionades amb la distrofina en els ratolins
mdx i controls adults:
L’increment de la utrofina quant a proteïna detectat en
els ratolins mdx adults no es correlaciona amb els
nivells dels seus transcrits, ja que aquests es
mantenen constants entre el primer i novè mes. Els
nivells d’mRNA d’altres proteïnes estructuralment
relacionades amb la distrofina, com DRP-2 i
-β espectrina, mostren un comportament similar, tot
mantenint-se també el seus nivells d’mRNA estables
en totes les edats analitzades (1, 3 i 9 mesos).
Figura 4.
RT-PCR semiquantitatives comparant els nivells dels
mRNA de la utrofina, la proteïna relacionada amb la
distrofina 2 (DRP2), la -espectrina i la GAPDH en
ratolins mdx versus els controls de les mateixes edats.
III) El doble mutant mdx-uPA-/-:
Atesa la importància de la uPA en la regeneració
muscular, es va decidir obtenir un ratolí doble mutant,
mancat de distrofina i d’uPA (soca mdx-uPA-/-). El
primer fet destacable va ser l'elevada mortalitat que va
dificultar enormement l'obtenció de la soca de forma
estable. A partir de la generació en què s’obtenien els
dobles mutants purs es va decidir portar un control
setmanal de la mortalitat per tal d'establir exactament
quina era i quan es produïa la mort d'aquests ratolins.
Es va utilitzar la soca mdx com a control. Els resultats
van posar de manifest que la mortalitat del ratolí doble
mutant mdx-uPA-/- estava al voltant del 80%, mentre
que en el ratolí mdx era de l'ordre del 5% fins a la
setmana 25 de vida. A més, en el doble mutant la
mortalitat es concentra entre la cinquena i la novena
setmanes de vida, tot coincidint temporalment amb
l'inici del període de màxima necrosi del ratolí mdx.
També es va detectar un cert decrement en la seva
grandària, perceptible per la simple observació i
objectivable mesurant el seu pes.
Figura 5.
Elevada mortalitat del doble mutant mdx-uPA-/-.
Mentre que en el ratolí mdx la mortalitat fins a la
setmana 25 és de l'ordre del 5% (línia i triangles gris
clar), en el doble mutant mdx-uPA-/- (línies i quadrats
gris fosc) aquesta arriba al 80% i es concentra
totalment entre la cinquena i la novena setmanes de
vida, coincidint temporalment amb l'inici del període
de màxima necrosi del ratolí mdx.
IV) Expressió diferencial de gens en el múscul
esquelètic del ratolí mdx:
Mitjançant la tècnica de RAP-PCR (random arbitrarily
primed-PCR) vam poder detectar l’expressió diferencial
de gens comparant el ratolí mdx amb la seva
soca control. Totes les bandes, seleccionades per la
seva diferencialitat, presentaven una expressió
superior en ratolins mdx que en controls. Com que els
mRNA que van ser identificats com a diferencials
corresponen a proteïnes d’estructura i funció molt
diversa, les agrupem en diferents apartats per a una
major claredat dels resultats.
Seqüències amb homologia amb enzims:
Detall dels films autoradiogràfics corresponents als
gels del differential dysplay dels quals s’ha obtingut la
banda 1 (A) i la banda 8 (B). Mdx: Soca de ratolí mdx.
WT: Soca de ratolí control. Les bandes seleccionades
com a diferencials s’indiquen amb fletxes negres.

Figura 6.
Banda 1: aquesta banda, de 363 parells de bases
presenta un alineament del 100% amb el clon de ratolí
748005, que és un clon del qual l’únic que es coneix
és que presenta homologia amb un enzim d’E.Coli
anomenat 2-hidroxihepta-2,4-diè-1,7-dioat isomerasa,
enzim que catalitza un pas en la via catabòlica de
l’àcid homoprotocatecuic (HPC) (Roper DI 1993).
Banda 8: aquesta banda de 514 parells de bases
presenta un alineament del 100% amb la S-adenosilmetionina
descarboxilasa de ratolí
(AF052604.1|AF052604) (EC 4.1.1.50) Aquest enzim
participa en la síntesi de poliamines, les quals s'ha
demostrat que són indispensables per a la proliferació
de les cèl·lules de mamífer (Shantz LM 1999).
Seqüències amb homologia amb interleucines:
Banda 5: banda de només 150 parells de bases que
presenta un alineament del 100% amb la petita
citoquina induïble A6 (Scya6 o C10) de ratolí (NM
009139.1). Sobre la seva funcionalitat se sap que es
produeix activament durant processos d’inflamació
crònica, on actua com a quimioatraient de macròfags.
Fins al moment no se n'ha descrit l’expressió en
múscul, però l'elevada expressió que hem detectat en
el ratolí mdx suggereix que podria tenir alguna funció
important en aquest teixit.
Figura 7.
Detall del film autoradiogràfic corresponent al gel del
differential dysplay del qual s’ha obtingut la banda 5.
Mdx: Soca de ratolí mdx. WT: Soca de ratolí control.
Les banda seleccionada com a diferencial és la que
s’indica amb la fletxa negre.
Seqüències amb homologia amb proteïnes
transmembrana:
Banda 3: banda de 377 parells de bases, que presenta
un alineament del 100% amb la proteïna de ratolí
de la família de les tetraspanines anomenada CD63
(NM 007653.1). És una proteïna amb quatre dominis
transmembrana i un gran loop extracel·lular que
s’associa a la integrina b1. S'ha demostrat que està
implicada en processos d’adhesió a matriu
extracel·lular i diferenciació de cèl·lules epitelials
intestinals (Halldén G 1999). No se li ha demostrat fins
al moment cap funció en el teixit muscular.
Banda 9: banda de 197 parells de bases, que presenta
un 96% d’homologia amb un clon que segons s’ha
predit codificaria per una putativa glicoproteïna
transmembrana (NMB), de funció totalment desconeguda
(AI429397).
Seqüències amb homologia amb clons:
Dues de les seqüències obtingudes presentaven
homologia amb clons dels quals es coneix només la
seqüència.. Es tracta de les bandes anomenades 7 i 10.
Figura 8.
Detall dels films autoradiogràfics corresponents als
gels del differential dysplay dels quals s´ha obtingut la
banda 7 (A) i la banda 10 (B). Mdx: Soca de ratolí
mdx. WT: Soca de ratolí control. Les bandes
seleccionades com a diferencials s'indiquen amb
fletxes negres.
Seqüències sense identitat inicial significativa amb
cap seqüència coneguda:
Finalment, es van trobar també dues bandes sense
identitat significativa amb cap de les seqüències
introduïdes fins al moment (setembre de 2000) en les
bases de dades. Corresponen a les que hem
anomenat banda 2 (de 234 parells de bases) i banda
4 (de 254 parells de bases).
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
Hem clarificat com la utrofina, proteïna homòloga a la
distrofina, contribueix a millorar la malaltia del ratolí
distròfic mdx.
Hem obtingut i caracteritzat un ratolí doble mutant
mancat de distrofina i de la proteasa uPA, la qual hem
contribuït a caracteritzar com a proteïna clau en la
regeneració muscular. Aquesta soca doble mutant pot
RECERCA BIOMÈDICA | 155

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
esdevenir una eina molt important per a la caracterització
del paper de la proteasa uPA en la regeneració
muscular.
Hem identificat 14 gens expressats diferencialment en
el ratolí distròfic mdx. La funció d'alguns d'aquests
gens podria ser crucial per a la regeneració muscular.
Actualment estem en vies de caracteritzar-los.
4. Publicacions
Torres C de, Munell F, Roig M, Macaya M. Análisis del patrón de
fragmentación del ADN en enfermedades neuromusculares
pediátricas. Rev. Neurol. 2000; 30 (10); 901-906.
Fargas A, Roma J, Roig M. Regeneración muscular: efecto de la
lámina basal, el tamaño de la lesión y la respuesta inflamatoria en
el ratón C57BL10/ScSn. Rev. Neurol. 2002;16-28;34(4):328-38.
Lluís F, Roma J, Suelves M. et al. Urokinase-dependent plasminogen
activation is required for efficient skeletal muscle regeneration
in vivo. Blood 2001 15;97(6):1703-11.
Torres C de, Munell F, Roig M, Reventós J, Macaya A. Naturallyoccurring
cell death during postnatal development of rat skeletal
muscle. Muscle Nerve 2002;
Fargas A, Roma J, Gratacos M, Roig M. Distribution and effects
of a single intramuscular injection of India Ink in mice. Ann Anat.
2003; 185:1-5
Roig M, Munell F, Fargas A, Roma J. Longitudinal pathologic
study of the gastrocnemius muscle group in the mdx-mice. Acta
Neuropathologica (sotmès a publicació).
Roig M, Roma J, Munell F, Fargas A. Muscle regeneration
following glicerol injection mimics mdx mice degenerative-regenerative
groups. Acta neuropatologica (sotmès a publicació).
Roma J, Munell F, Fargas a, Roig M. Pathological changes in
the gastrocnemius muscle of the mdx-mice correlate wih utrophin
and beta-dystroglycan expression. Muscle and Nerve (sotmès a
publicació).
Roma J, Muñoz P, Roig M, et al. Upa deficiency promotes
muscular dystrophy in mdx mice. Journal of Cell Biology (sotmès
a publicació).

Títol del projecte:
Alliberament d’ATP a través del regulador
transmembrana de la fibrosi quística
Investigador principal
Carles Solsona Sancho
Institució
Facultat de Medicina. CSUB
Membres de l’equip
Àlex Soler, Xènia Grandes, Joan Blasi, Laia Bahima, Artur Escaleda, Laura Texidó, Marc Elias, Carles Solsona,
Mireia Martín-Satué, Adriana Raptis, Benjamin Torrejón i Inmaculada Gómez.
22.775.000 PTA
MEMÒRIA FINAL
1. Resum del projecte original
Els darrers anys s’ha vist que la permeabilitat a ions
de la membrana apical de l’epiteli bronquial està
activat per nucleòtids extracel·lulars com l’ATP i l’UTP,
mitjançant receptors específics purinèrgics del
subtipus P2Y. La presència dels nucleòtids
extracel·lulars, en condicions normals podrien ser per
la suposada permeabilitat de la CFTR (Cystic Fibrosis
Transmembrane Regulator) a l’ATP. Els objectius
inicials del nostre treball foren investigar si la proteïna
CFTR era permeable a l’ATP, o bé hi havia una altra o
altres proteïnes de membrana permeables a l’ATP. Per
tant, els dos objectius inicials van ser mesurar l’alliberament
d’ATP a través de les membranes de cèl·lules
que expressaven CFTR i cèl·lules que no expressaven
CFTR. El tercer objectiu era investigar el paper de la
CFTR en el procés de secreció d’ATP, mitjançant
exocitosi.
El model experimental inicial va ser l’ovòcit de
Xenopus laevis, en el qual mitjançant un giny elaborat
al nostre laboratori podíem mesurar alhora l’alliberament
d’ATP i els canvis en la permeabilitat iònica
monitoritzats amb la tècnica de la fixació de voltatge
(voltage-clamp). A més, els ovòcits de Xenopus ens
han permès expressar la CFTR en la seva membrana
plasmàtica i mesurar-ne la permeabilitat a l’ATP.
També havíem proposat que l’alliberament d’ATP
podia ser modulat per l’acció de les toxines clostridials
—toxina botulínica i toxina tetànica— i que la CFTR
pogués modificar la secreció d’ATP a través d’algunes
de les proteïnes SNARE implicades en la maquinària
cel·lular de l’exocitosi.
El pla de treball era identificar primerament els processos
endògens d’alliberament de l’ATP en els ovòcits
de Xenopus, després mesurar l’alliberament d’ATP
durant l’activació de la CFTR, i finalment, el darrer any
del projecte, estudiar l’efecte de les toxines clostridials.
2. Resultats
L’ATP és una molècula molt hidrofílica, amb tres grups
fosfat, que, per tant, difícilment pot travessar una
membrana lipídica. No obstant això, l’ATP és un
senyal de comunicació intercel·lular que actua a través
de receptors específics coneguts com receptors
purinèrgics. Les cèl·lules dels epitelis respiratoris tenen
receptors purinèrgics. El nostre treball ha estat
adreçat a investigar la base cel·lular i molecular que
guia l’alliberament d’ATP, i de manera molt especial
RECERCA BIOMÈDICA | 157

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
investigar el paper de la CFTR.
Com hem comentat anteriorment, per investigar el
paper de la CFTR sobre l’alliberament cel·lular d’ATP
hem fet servir models cel·lulars simples: els ovòcits de
Xenopus laevis i les vesícules sinàptiques.
1) Caracterització de l’alliberament electrogènic d’ATP
a través de la membrana cel·lular.
En ovòcits sotmesos a hiperpolaritzacions intenses, es
produeix l’activació d’un corrent d’entrada. Hem
caracteritzat aquest corrent d’entrada, causat
essencialment pel pas de l’ATP a través de la
membrana plasmàtica. Hi ha una bona correlació
entre l’amplitud del corrent enregistrat i la quantitat
d’ATP alliberada. Més encara, esgotant la concentració
intracel·lular d’ATP amb el tractament amb cianur,
disminueix l’amplitud del corrent i la quantitat d’ATP
alliberat. Tant el corrent com la quantitat d’ATP alliberats
són sensibles a diferents agents farmacològics
com: DIDS, SITS, suramina, i gadolini. En canvi, altres
agents amb activitat inhibidora sobre les proteïnes
ABP no modifiquen ni l’alliberament d’ATP ni el
corrent iònic. Els agents indicats com a inhibidors, ho
són de l’activitat apirasa descrita a la proteïna CD39,
la qual fou descrita en primer lloc com un antigen de
superfície dels limfòcits. CD39 és una proteïna amb
dos segments transmembrana i una nansa
extracel·lular molt llarga. A més, la nansa extracel·lular
presenta una petita regió hidrofòbica semblant a la
que presenten alguns canals iònics. La sobreexpressió
de la proteïna CD39 augmenta el corrent generat pels
pols hiperpolaritzants i quan l’activitat de la proteïna
CD39 endògena està inhibida també hi ha una inhibició
de l’alliberament d’ATP. Hem proposat que un dels
mecanismes cel·lulars d’alliberament d’ATP és que la
proteïna CD39 pot formar en determinades condicions
un porus permeable a l’ATP.
Aquests resultats han estat publicats al Journal of
Biological Chemistry,
2) Paper de la CFTR en l’alliberament electrogènic
d’ATP.
La CFTR s’ha implicat en processos de control de
volum cel·lular. Els ovòcits de Xenopus no tenen
molècules reguladores de volum. En ser sotmesos a
condicions hipotòniques augmenten el seu volum,
però no es genera cap corrent. En canvi quan se
sotmeten a condicions hipertòniques, es genera un
corrent iònic d’entrada a causa del pas de ions clorur i
també ATP. També hi ha una part de l’ATP alliberat
que correspon a exocitosi d’ATP, ja que s’inhibeix per
l’acció de la toxina tetànica, que és un potent inhibidor
de l’exocitosi. Per tant, hem conclòs que les
condicions hipertòniques produeixen un alliberament
d’ATP dependent de dos mecanismes cel·lulars, l’un
relacionat amb l’exocitosi i l’altre electrogènic a través
de la membrana cel·lular. Quantitativament, el segon
és el més important. Els ovòcits injectats amb mRNA
antisentit contra CD39 mostren un corrent més petit i
un menor alliberament d’ATP, tot indicant novament
que aquesta molècula és una de les implicades en
l’alliberament d’ATP. Hem investigat el paper de la
CFTR en aquest processos. Els ovòcits que expressaven
CFTR, després de ser injectats amb l’mRNA que
codifica aquesta proteïna, presentaven una inhibició
en l’alliberament d’ATP mediat per exocitosi, mentre
que l’ATP alliberat per mecanismes electrogènics no
es veu modificat. Aquests resultats han estat publicats
al Journal of Physiology,
3) És ben conegut que la CFTR es pot comportar
com un canal permeable a ions clorur. Hem explorat si
durant l’activació de la CFTR es produeix un alliberament
d’ATP. En cap cas hem pogut detectar alliberament
d’ATP durant el temps en què està obert aquest
corrent. El corrent de sortida de clorurs s’obre un
temps relativament curt, d’uns 10-15 minuts, i es va
tancant espontàniament, en un període que dura
entre 45-90 minuts. Tanmateix, hem observat que
aquest corrent es tanca més ràpidament quant
l’ovòcit està sotmès a un xoc hiposmòtic. Això
suggereix que la CFTR, entre molts altres papers que
pot desenvolupar, està implicada en els processos de
regulació de volum cel·lular.
4) Caracterització dels mecanismes cel·lulars que
controlen l’emmagatzemament d’ATP.
Els resultats que vam obtenir suggerien que la CFTR
estava implicada en el control de l’alliberament d’ATP
per mecanismes exocitòtics. Un del problemes que
se'ns plantejava era com està emmagatzemat l’ATP
en els grànuls de secreció. Per la nostra experiència
en l’àmbit de les neurociències, vam escollir explorar
aquest problema en les vesícules sinàptiques, on
coneixem les proteïnes implicades en la fusió de les
membranes que es coneixen com proteïnes SNARE, i
de les quals més endavant farem esment. Però el que
ens preocupava era conèixer en quin estat està l’ATP
a l’interior dels grans de secreció. Se sabia que l’ATP
està a l’interior dels grans de secreció i de les vesícules
sinàptiques acompanyant productes de secreció
i/o neurotransmissors. Hem descobert que malgrat la
seva aparença buida, a l’interior de les vesícules
sinàptiques hi ha una matriu capaç d’adsorbir ATP per
càrregues electrostàtiques. Amb el microscopi de
força atòmica hem mesurat els canvis de volum
d’aquesta matriu quan està sotmesa a un increment
de força iònica. D’acord amb la naturalesa química
dels elements que constitueixen la matriu, hem
proposat que els ions calci tenen un paper clau en
l’adsorció de l’ATP. A més, per indicació dels consultors
de la revista on hem publicat els resultats, hem
estudiat el paper d’aquesta matriu en l’adsorbció dels
neurotransmissors clàssics. Els resultats han estat
publicats als Proceedings of the National Academy of
Sciences - USA.
5) Altres mecanisme electrogènics d’alliberament
d’ATP. El paper dels hemicanals.
En els ovòcits de Xenopus hem explorat si altres
corrents d’entrada suporten l’alliberament d’ATP.
L’exclusió de ions divalents en el medi de perfusió
produeix un corrent d’entrada que correspon a l’activació
d’hemicanals. Els hemicanals corresponen a la
meitat simètrica d’un connexó. Els connexons estan
formats per connexines i són canals que acoblen
elèctricament dues cèl·lules veïnes. S’especula sobre
quin paper poden tenir aquests hemicanals en la
fisiologia cel·lular. Hem trobat que durant l’obertura
d’aquest corrents, es produeix l’alliberament d’ATP.
Aquest alliberament no es produeix quan els ovòcits
estan injectats amb mRNA antisentit contra la
connexina endògena Cx38, o bé quan s’utilitzen
alguns bloquejants farmacològics dels connexons
com l’octanol o l’àcid niflúmic.
Les proteïnes SNARE, com hem comentat anteriorment,
estan implicades en la fusió de les membranes.

Però la sintaxina, a més, pot modular l’activació
d’alguns corrents, com la CFTR. Hem investigat el
paper de la sintaxina en l’activació dels hemicanals i
l’alliberament d’ATP. La sobreexpressió de sintaxina
inhibeix l’activació dels hemicanals i l’alliberament
d’ATP. Pel contrari, la inhibició de l’expressió de
sintaxina, o la seva hidròlisi per l’acció de la toxina
botulínica de tipus C1, augmenta el corrent mediat
pels hemicanals.
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
L’equilibri iònic, i en concret els fluxos de clorur, estan
modificats en les cèl·lules epitelials dels malalts de
fibrosi quística. Les mutacions de la proteïna CFTR no
deixen que s’incorpori a la membrana plasmàtica, i
per tant que la seva funció sigui absent. Com ja hem
assenyalat, una de les seves funcions és comportarse
com un canal iònic permeable a clorur. La manca
d’activitat CFTR en la membrana plasmàtica apical
provoca una manca de ions clorur que produeix, al
seu torn, una manca d’aigua en el medi bronquial que
es tradueix en la seva baixa fluïdesa. La baixa fluïdesa
del medi disminueix la mobilitat de la llum bronquial i
augmenta el risc de processos infecciosos. Els darrers
anys s’han fet esforços per poder activar altres proteïnes
de membrana que permetin el pas de clorurs, i
que serien una via alternativa a la CFTR per a l’alliberament
de clorurs. El reequilibri de clorurs a la llum
bronquial hauria de disminuir el risc d’infecció dels
malalts de fibrosi quística.
L’activació de canals de clorur sensibles a la concentració
intracel·lular de calci s’ha descrit en diferents
cèl·lules, incloent-hi les de l’epiteli bronquial. Una de
les vies d’augment del calci intracel·lular es pot fer per
l’activació de receptors purinèrgics del tipus P2Y, els
quals estan acoblats a proteïnes G. Els darrers anys
s’han descrit fins a 6 tipus diferents de receptors P2Y.
Entre els quals els receptors P2Y2, P2Y4 i P2Y6
s’activen no tan sols pel nucleòtid adenílic com l’ATP,
sinó, i amb més afinitat, pel nucleòtid pirimidínic UTP.
En la membrana apical de les cèl·lules de l’epiteli
bronquial hi ha els receptors P2Y2 i P2Y6. S’han fet
algunes proves d’aplicació amb aerosol dels nucleòtids
UTP i ATP, com també alguns derivats, com
l’INS37217 [P(1)-(uridine 5')-P(4)- (2'deoxycytidine5')tetraphosphate.
El principal problema
per a aquesta terapèutica és la degradació dels
nucleòtids a mans d’enzims amb activitat nucleotidasa.
Una de les vies per augmentar l’efectivitat
d’aquest tractament hauria de ser inhibir aquest enzim
amb activitat extracel·lular. Per això entenem que els
nostres resultats tot mesurant l’activitat apirasa, com
també la seva inhibició per diversos agents, pot ajudar
a dissenyar inhibidors cada cop més específics per a
aquesta activitat. L’addició d’aquests inhibidors a
l’ATP o UTP nebulizats, hauria d’allargar la mitjana de
vida d’aquests nucleòtids en la llum del bronqui.
Una altra estratègia per activar les receptors P2Y és
augmentar la secreció d’ATP a través de la membrana
plasmàtica. En el nostre treball assenyalem, d’una
banda, que la proteïna CD39 es pot comportar com
un canal permeable a ATP o com una nucleotidasa.
Els estímuls que fins ara hem fet servir al nostre
laboratori per estimular l’alliberament d’ATP són
hiperpolaritzacions molt severes o l’augment de la
pressió osmòtica i, per tant, no són fisiològics. Però
aquests resultats resulten molt útils per poder buscar
agents farmacològics que indueixin l’alliberament
d’ATP a través d’aquesta proteïna CD39.
Pel que fa als hemicanals, tampoc és fisiològica l’activació
que hem fet servir, que ha estat baixar la
concentració extracel·lular de calci. En condicions de
baix calci extracel·lular, es produeix l’alliberament
d’ATP. S’ha descrit la presència d’hemicanals
(connexina Cx26) en les cèl·lules respiratòries
epitelials, que en condicions d’estrès osmòtic alliberen
ATP, sent sensibles a agents farmacològics que
inhibeixen l’activació dels hemicanals, com l’àcid
flufenàmic. Novament caldrà buscar altres vies d’activació
dels hemicanals de les cèl·lules de l’epiteli
respiratori. El model que hem fet servir ha de resultar
una eina molt útil per buscar nous activadors
farmacològics d’hemicanals.
Per últim, les característiques de la matriu que hem
trobat a l’interior dels grànuls de secreció indica les
estratègies moleculars per poder augmentar la
concentració de nucleòtids i pot constituir, en si
mateixa, un suport per a administrar-los.
4. Publicacions
Reigada D, Diez-Perez I, Gorostiza P, Verdaguer A, Gomez de
Aranda I, Pineda O, Vilarrasa J, Marsal J, Blasi J, Aleu J, Solsona
C. Control of neurotransmitter release by an internal gel matrix in
synaptic vesicles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Mar
18;100(6):3485-90.
Aleu J, Martin-Satue M, Navarro P, Lara IP, Bahima L, Marsal J,
Solsona C. Release of ATP induced by hypertonic solutions in
Xenopus oocytes. J Physiol. 2003 Feb 15;547(Pt 1):209-19.
Escalada A, Aleu J, Bodas E, Martin-Satué M, Felipe A, Marsal
J, Gómez de Aranda I, Pujol G, Solsona C. ATP release from the
electric organ of Torpedo and from Xenopus oocytes. Drug Dev
Res. 2001; 52:34-43.
Bodas E, Aleu J, Pujol G, Martin-Satue M, Marsal J, Solsona C.
ATP crossing the cell plasma membrane generates an ionic
current in Xenopus oocytes. J Biol Chem. 2000 Jul
7;275(27):20268-73.
Publicacions relacionades indirectament amb el projecte
Aleu J, Blasi J, Solsona C, Marsal J. Calcium-dependent acetylcholine
release from Xenopus oocytes: simultaneous ionic
currents and acetylcholine release recordings. Eur J Neurosci.
2002 Oct;16(8):1442-8.
RECERCA BIOMÈDICA | 159

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
MEMÒRIA FINAL
1. Resum de projecte original
Introducció
L'atròfia muscular espinal (AME) és una malaltia
hereditària caracteritzada per l'afectació de les
cèl·lules de l'asta anterior de la medul·la espinal, amb
debilitat proximal i simètrica i atròfia progressiva dels
grups musculars. Es classifica en tres grups segons
la gravetat dels símptomes, l'edat d'aparició i l’evolució
que presenta. La forma aguda tipus I o malaltia
de Werdnig-Hoffmann es manifesta en el període
neonatal o en els primers mesos de vida. Els afectats
mai no aconsegueixen la capacitat d'asseure's i
moren abans dels dos anys de vida. La forma
intermèdia tipus II i la forma crònica tipus III o malaltia
de Kugelberg-Welander són clínicament més heterogènies.
En la primera, els símptomes apareixen abans
dels 18 mesos, els pacients no arriben a deambular i
la mort es produeix després dels 2 anys. En la tipus
III els símptomes es noten a partir dels 18 mesos,
arriben a deambular i en general aconsegueixen
l'edat adulta. La incidència de la forma greu tipus I és
d'aproximadament 1 de cada 6.000, tot constituint
un dels trastorns autosòmics recessius letals més
Títol del projecte:
La funció del gen SMN (Survival Motor Neuron) en la patogènesi de
l’atròfia muscular espinal: la seva expressió ontogènica en humans, en
cèl·lules transfectades de pacients i en el model animal de la malaltia
Investigador principal
Eduardo Fidel Tizzano
Institució
Hospital de la Santa Creu i Sant Pau
25.548.000 PTA
freqüent en la infància. La incidència de les formes
cròniques és aproximadament d’1 per 10.000, que el
converteix en el segon trastorn neuromuscular més
freqüent de l'edat pediàtrica. La freqüència de
portadors en la població general és aproximadament
d’1 per 40-50 i es calcula que hi ha més de 1.000
famílies afectades amb aquesta malaltia en la
població espanyola.
El clonatge i identificació del gen determinant de
l'AME, survival motor neuron (SMN), va indicar que
aquest gen està duplicat, i existeix una versió telomèrica
(SMN1) i una altra de centromèrica (SMN2).
El gen SMN1 està delecionat o interromput en més
del 90% dels pacients, sigui quina sigui la forma
clínica. No obstant això, el gen SMN2 sempre està
present en els afectats i encara que la seva funció no
està clara, s'ha demostrat que pot modificar les
manifestacions clíniques de la malaltia.
En aquells pacients sense deleció homozigota del
gen SMN1, s'ha detectat una mutació recurrent
exclusiva de la població espanyola, present en el 3%
dels afectats, que és una deleció de quatre parells de
bases (DelAGAG) en l'exó 3 (Bussaglia i col., Nat
Genet 11:335, 1995). Aquesta mutació s’esdevé en
els codons 133-134 i resulta en una alteració del

motlle de lectura, tot produint un codó stop 45
nucleòtids cap a l'extrem 3’.
Objectius generals i específics
Anàlisi de la patologia molecular i del patró d'expressió
del gen i la proteïna SMN (determinants de l'atròfia
muscular espinal) en teixits humans durant el
desenvolupament humà. Detecció i identificació
d'òrgans i cèl·lules diana on s'expressa i funciona el
gen. Estudi del gen SMN i altres gens modificadors
en cèl·lules de pacients SMN a fi de corregir el
defecte molecular.
1. Creació d'un banc de teixits humans (fetals i
postnatals) tant d'individus afectats com de subjectes
sans per fer estudis d'expressió del gen SMN per
hibridació in situ i la seva proteïna per Western blot i
immunohistoquímica.
2. L'anàlisi conjunta i comparativa d'ambdós patrons
d'expressió es proposa:
-Determinar el patró d'expressió temporal-espacial
durant el desenvolupament humà.
-Definir l'expressió i localització específica en les
cèl·lules i teixits a fi de comprendre quina és la funció
in vivo del gen i la proteïna SMN.
-Establir la relació entre els nivells, localització i regulació
de gen i proteïna SMN amb l'aparició de la
degeneració de la motoneurona anterior i la patologia
descrita en els pacients amb AME. Establir si s’esdevenen
fenòmens apoptòtics com a conseqüència de
la pèrdua de funció del gen SMN.
3.Transferir a cèl·lules de pacients (limfoblasts i
fibroblasts) la versió normal del gen per determinar la
possible correcció del defecte molecular, tot estudiant
l'expressió i observant el fenotip cel·lular corresponent.
Síntesi del disseny
Els sistemes experimentals d'estudi, com la detecció
d’RNAm per hibridació in situ i de proteïna per
immunohistoquímica per definir el patró d'expressió
temporal-espacial durant el desenvolupament humà,
poden contribuir significativament a determinar les
possibles funcions del gen SMN i la seva proteïna,
com també la patogènia AME. És important determinar
si la mort i degeneració neuronal descrita en
l'AME són la conseqüència de fenòmens apoptòtics i
si pot haver-hi involucrats altres mecanismes que
porten a la degeneració de la motoneurona en el
desenvolupament humà.
La transferència del gen normal en cèl·lules de
pacients amb un fenotip observable (per exemple el
nombre de "gems") i la introducció de diferents tipus
de vectors d'expressió amb versions distintes del gen
i d'altres possibles gens modificadors permetrà
avaluar els efectes de les diverses proteïnes truncades,
i així contribuir a donar claus per a la correcció
del defecte molecular.
Síntesi del pla de treball original
Primer any:
-Recol·lecció de teixits humans (aquesta acció es durà
a terme tot al llarg del projecte, atès que depèn de la
disponibilitat que se’n tinguin).
-Posada a punt de la metodologia d'hibridació in situ,
com l'anàlisi de la proteïna per immunohistoquímica.
-Estudi dels pacients a fi de determinar-ne la patologia
molecular i establir línies cel·lulars en pacients amb els
tres tipus d'AME i amb els tres tipus més freqüents de
mutació: delecions i conversions gèniques de l'exó 7 i
8 del gen SMN i la deleció de 4 parells de bases de
l'exó 3, característica de la població espanyola.
Segon i tercer anys:
- Experiments i resultats dels estudis d'expressió en
els diversos teixits.
- Construcció dels vectors d'expressió i experiments
de transfecció per corregir el defecte molecular en les
distintes línies cel·lulars dels pacients. Interpretació
dels resultats.
2. Resultats
1. A partir de la creació del banc de teixits humans i
els estudis efectuats, s'han obtingut els resultats
següents:
Per estudi de la medul·la espinal durant el desenvolupament,
s'ha determinat que en els afectats amb la
forma tipus I, hi ha un augment significatiu de la mort
neuronal programada. Tanmateix, aquest augment no
es veu reflectit en la morfologia de neuroblasts i
motoneurones del període fetal. Els canvis típics de la
malaltia descrits originàriament només s'han detectat
després del naixement. D'aquestes troballes es
determina que el mecanisme patogènetic de l'AME
tipus I és la conseqüència, almenys, de dos processos:
a) un augment de la sensibilitat de les neurones
de l'asta anterior a la mort neuronal programada, a
causa de l'absència d’SMN1. Això fa que el nombre
de motoneurones estigui disminuït fins gairebé el 60%,
comparat amb els controls durant el desenvolupament,
i b) canvis degeneratius en la motoneurona que
apareixen en etapes posteriors i que no estan
associats inicialment amb la mort neuronal programada.
Aquests resultats es descriuen en Soler i col.
Brain, 2002 125:1624-1634.
S'ha determinat el patró d'expressió del gen SMN en
el teixit nerviós. Quant a l'ARN missatger i per hibridació
in situ, es va observar que el gen s'expressa en
motoneurones de l'asta anterior, neurones sensitives
del gangli raquidi i de l'asta posterior, neurones de
l'oliva bulbar, els nuclis del nervi hipoglòs i espinal,
neurones del tàlem, cèl·lules de Purkinje al cerebel i
cèl·lules piramidals en l'escorça cerebral. Aquests
resultats s'han corroborat al nivell de proteïna per
estudis d'immunohistoquímica. La conclusió és que hi
ha una correlació incompleta al nivell de l'expressió
del gen SMN, l'anatomia patològica i les manifestacions
clíniques de la malaltia. A partir d'aquests
resultats es va plantejar un interrogant per resoldre:
per què malgrat que el gen s'expressa en tants grups
neuronals, només la patologia i les manifestacions
clíniques de la malaltia tenen lloc en les motoneurones
de l'asta anterior? El pas següent va ser la comparació
de l'expressió amb cèl·lules i teixits AME, on està
absent el gen SMN1 i present el gen SMN2. Aquests
experiments indiquen que hi ha una expressió
disminuïda d’SMN2 a la medul·la espinal i el múscul i
que en altres teixits no afectats per l'AME, el gen
SMN2 expressa nivells semblants de proteïna als
controls (que tenen el gen SMN1). (Soler, Cuscó,
López, Baiget i Tizzano, en preparació).
Igualment, s'ha estudiat l'expressió de dues proteïnes
RECERCA BIOMÈDICA | 161

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
relacionades amb l'apoptosi: Bcl-2 i Bcl-X. La primera
presentava un interès particular, atès que s'havia
comunicat prèviament una interacció entre Bcl-2 i
SMN (Iwahashi et al. Nature 1997). Els resultats
indiquen que l'expressió de Bcl-2 està disminuïda en
la medul·la espinal dels fetus amb AME, i la de Bcl-X,
que normalment substitueix aquell en el desenvolupament,
és irregular i retardada. Aquests resultats es
descriuen en Soler i col. J Neuropathol Exp Neurol,
2002 (en premsa vol. 62 núm. 4).
Finalment, per completar el panorama de l'AME
durant el desenvolupament fetal, es va estudiar
l'enzim acetilcolintransferasa (ChAT), que participa en
la síntesi del neurotransmissor acetilcolina i és un
marcador de funció de motoneurona. Es van trobar
diferències en l'expressió de ChAT en ambdós tipus
de medul·la espinal (control i AME) per a RNAm i
proteïna. La diferència en la quantitat de ChAT seria
pel nombre disminuït de motoneurones, atès que
aquelles motoneurones romanents a la medul·la AME
expressen ChAT d’una manera semblant als controls.
Seria possible, doncs, actuar sobre aquestes
motoneurones romanents com a possibilitat terapèutica.
Aquests resultats es descriuen en Soler i col.,
2003 (sotmès).
2. A partir de l'anàlisi de la patologia molecular del
gen per caracteritzar les cèl·lules de pacients amb
genotips diferents, s'han obtingut els resultats
següents:
De l'anàlisi molecular de l’ADN a gairebé 400 pacients
no emparentats amb AME, s'han detectat 19 (gairebé
5%) amb gens híbrids SMN1-SMN2 i en 10 casos
(2,5%) es va observar la deleció de 4 parells de bases
en l'exó 3 (430del4) característica de la població
espanyola. Inicialment es va desenvolupar un mètode
quantitatiu d'anàlisi de pacients (anàlisi d'heterozigots
deleció/mutació puntual), familiars (portadors d'una
deleció i una còpia normal) i individus de la població
general (portadors possibles amb una probabilitat de
ser portadors d'1/50). Es va realitzar una PCR quantitativa
de l'exó 7 del gen SMN amb un dels primers
marcatges amb fluoresceïna amb un control genòmic
(gen del retinoblastoma) i dos estàndards interns del
gen SMN i de l’RB. El senyal es va llegir en un
seqüenciador ABIPRIS 310. Com a controls de
sensibilitat i especificitat del mètode es van estudiar
110 individus (70 pares portadors demostrats amb
més d'un fill afectat i 40 familiars no portadors per
estudi de marcadors d’ADN). El mètode va ser utilitzat
per a l'estudi de pacients amb gens híbrids, i es
publica en (Cuscó i col., Human Genetics (2001)108:
222-229). Així mateix s'ha aplicat per a l’estudi de les
famílies amb la mutació espanyola, a fi de caracteritzar
les línies cel·lulars que s'analitzaven.
Aprofitant els avantatges de la PCR en temps real en
l'aparell Light Cycler, amb aquest protocol s'ha
estudiat el gen SMN1, SMN2 i les seves respectives
còpies d’RNA en les cèl·lules i teixits analitzats.
Aquests resultats es descriuen en: Tizzano i col.
(2002) Fèrtil Steril 77:409-411; Cuscó i col. (2002) Brit
J Obst Gynecol 109:1244-1249 i Hum Mutation
(2002) 20:452-459.
S'han construït 4 vectors diferents per transfectar les
cèl·lules de pacients: SMN, NAIP, SERF1, i Htra2beta1.
Aquest últim és un factor d’splicing que pot
modificar l'expressió del gen SMN2 (amb un transcrit
que no té l'exó 7) tot produint un transcrit com el gen
SMN1 (complet) (Hofmann i col., 2000; PNAS, 97:
9618-9623). Els resultats d’RNA missatger i diverses
proteïnes en fibroblasts i limfoblasts dels pacients amb
mutacions diferents estan en preparació (López,
Cuscó, Soler, Baiget i Tizzano).
Malgrat que la mutació prediu una proteïna truncada i
no funcionant, aquesta mateixa s'ha observat fins ara
en 10 famílies i amb els 3 tipus d'AME. A més a més,
els casos de tipus II-III amb més d'1 afectat mostren
variabilitat extrema en el fenotip, com s'havia observat
prèviament en els casos amb deleció (Bussaglia i col.,
Neurology 48:1443-1445, 1997). L'estudi de les línies
cel·lulars d'aquests pacients no va ser capaç de
detectar diferències quantitatives en la quantitat de
proteïna i RNAm complet o full length. L'estudi del
nombre de còpies del gen SMN2 també va ser
semblant. La conclusió fonamental d'aquests resultats
és la confirmació d'altres gens modificadors fora del
locus AME (en trans) que serien capaços de modificar
el fenotip dels pacients amb la forma crònica de la
malaltia (Cuscó i col., sotmès 2003).
Finalment i com a part de la investigació de la funció
del gen SMN, s'han fet estudis del gen SMN2 en
dues síndromes motores: la neuropatia motora
multifocal o MMN (Rojas i col., Neurology (2002)
59:1112-1113) i l'esclerosi lateral amiotròfica o ALS
(Gámez i col. Neurology (2002) 59:1456-1460).
Ambdós treballs contribueixen a l'estudi de quina seria
la funció del gen SMN2 en la motoneurona.
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
Aquest projecte ha estat pioner en l'estudi de l'atròfia
muscular espinal durant el desenvolupament humà.
Durant molts anys, només es coneixien resultats post
mortem d'autòpsies que mostraven un nombre reduït
de motoneurones i la majoria d'aquelles que estaven
presents tenien signes de degeneració. La finalitat
primordial va ser caracteritzar l'atròfia muscular
espinal no en una fase terminal sinó durant el seu
desenvolupament per poder identificar els mecanismes
de malaltia.
Les conclusions fonamentals són:
1.Les motoneurones de la medul·la espinal fetal
afectada d'AME són més sensibles a la mort cel·lular
programada. Això fa que el nombre de motoneurones
sigui inferior en l'AME ja a partir del desenvolupament
fetal. En l’esmentada hipersensibilitat podria estar
involucrada la proteïna Bcl2, que desapareix abans
d'allò que s'ha previst, i la proteïna BclX, que apareix
una mica més tard. Les motoneurones romanents no
semblen tenir disfunció d'acord amb el que observa
en l'expressió de ChAT. La degeneració de motoneurones
són troballes posteriors i postnatals. És possible
que hi hagi un mecanisme agregat que ocasiona
aquesta alteració i en això podrien tenir participació
elements de la placa neuromuscular i el múscul
pròpiament dit, la denervació prematura del qual per
disminució de les motoneurones podria afectar les
motoneurones restants.
2.Hi ha diversos nivells d'expressió del gen SMN1 i
SMN2, ja sigui en les diverses línies cel·lulars de
pacients com en els teixits humans en desenvolupament.
Tenint en compte que el gen SMN2 està
present en tots els afectats, l'expressió augmentada

d’aquest gen podria ajudar a l'augment dels nivells
complets d’SMN.
En aquest estudi s'ha constatat que l'expressió
d’SMN2 està present durant el desenvolupament
primerenc de les motoneurones, encara que no pot
compensar l'absència d’SMN1, com passaria en
altres teixits no afectats en l'AME. És possible que
l'efecte de l'absència del gen SMN1 es pugui revertir
si es fa una intervenció primerenca (molt possiblement
durant el desenvolupament fetal) per prevenir o aturar
la mort neuronal i la degeneració que es detecta
posteriorment. S'obren línies de treball per continuar
l'estudi de possibles estratègies terapèutiques per a
aquesta malaltia.
4. Publicacions
XX Congreso Nacional de Genética Humana. Valencia, 17-19 de
junio de 1999. E. Tizzano, C. Soler, MJ Barceló, I Cuscó, Del Río
E, JM Alvarez, M. Baiget. "Patología molecular y expresión del gen
SMN y de posibles genes modificadores de la atrofia muscular
espinal". Progresos en Diagnóstico Prenatal 11: 227 (1999)
E. Tizzano, Y. Martín, MJ. Barceló, I. Cuscó, M. Cornet, E.
Bussaglia, A. Valero, C. Hernández-Chico, C. Soler, M. Baiget.
"Molecular pathology of the SMN and H4F5 genes in Spanish
SMA patients". Am J Hum Genet 65: A113 (1999)
I. Cuscó , MJ. Barceló, E. Bussaglia, M. Baiget, E. Tizzano.
"Characterization of SMN hybrid genes in Spanish SMA patients
evidence of de novo and compound heterozygous cases". Am J
Hum Genet 65: A291 (1999).
Cuscó, MJ. Barceló, E. Bussaglia, M. Baiget, E. Tizzano.
"Estudio de conversión génica del gen SMN en pacientes con
atrofia espinal". Neurología 14: 475 (1999)
E. Tizzano, R.Rojas, A Lleó, MJ. Barceló, I. Cuscó, M. Armán, I.
Illa, M. Baiget. "Estudio de la asociación de la neuropatía motora
multifocal (NMM) y la enfermedad de 2da motoneurona (LMND)
con la deleción homocigota del gen SMN centromérico".
Neurología 14: 511 (1999)
European Human Genetics Conference 2000 I. Cuscó, MJ.
Barceló, Y. Martín, C. Hernández-Chico, E. Bussaglia, M. Baiget,
E. Tizzano. "Study of hybrid SMN genes in Spanish SMA
patients". European J Hum Genet 8 supp.1:144 (2000).
LII reunión Anual de la Sociedad Española de Neurología.
Barcelona, 13-16 de diciembre de 2000. EF. Tizzano, I. Cuscó,
MJ. Barceló, M. Baiget. Diagnóstico de AME sin deleción homocigota
del gen SMN1: utilidad del estudio cuantitativo. Neurología
(2000), 15:442.
103rd International European Neuromuscular Centre (ENMC)
Workshop: Designing rational therapy of SMA based on the
understanding of its pathophysiology. Naarden, 18-20 enero de
2002. E. Tizzano, "Fetal development and SMA: spinal cord
findings". Neuromuscular Disorders (en premsa)
E. Tizzano, M. Baiget. "Bases moleculares de la atrofia muscular
espinal: el gen SMN". Neurología, 15:393-400, (2000)
E. Tizzano, M. Baiget. "Molecular Bases of spinal muscular
atrophy: the survival motor neuron gene". Contributions to
Science, 2:35-42 (2001)
I. Cuscó, M.J. Barceló, E. Del Río, Y. Martín, C. Hernández-Chico,
M. Baiget, E. F. Tizzano. "Characterization of SMN hybrid genes in
Spanish SMA patients: de novo, homozygous and compound
heterozygous cases". Human Genetics 108:222-229 (2001)
K. Zerres, S. Rudnik-Schöneborn, M. de Visser, E. Tizzano, Y.
Poortman. "Spinal Muscular Atrophy: Wanda Workshop". Acta
Myologica XX: 61-68 (2001)
E. Tizzano, I. Cuscó, MJ. Barceló, J. Parra, M. Baiget. "Should
gamete donors be tested for spinal muscular atrophy?". Fertility
and Sterility 77:409-411, (2002)
C. Soler, I. Ferrer, I. Gich, M. Baiget, E. F. Tizzano. "Neuronal
death is enhanced and begins during fetal development in type I
spinal muscular atrophy spinal cord". Brain 125 (7) 125:1-11
(2002)
R. Rojas, E. Tizzano, I. Cuscó, E. Gallardo, M. J. Barceló, I. de
Andrés, P. Larrodé, J.F. Martí-Massó, J.A. Martínez-Matos, M.
Povedano, B. Rallo, S. Serrano, M. Baiget, and I. Illa. "The
absence of the SMN2 gene may play a role in multifocal motor
neuropathy". Neurology 59:1112-1113 (2002).
I. Cuscó, M.J. Barceló, C. Soler, J. Parra, M. Baiget, E. Tizzano.
"Carrier and prenatal diagnoses in relatives of spinal muscular
atrophy patients". (sometido 2002) British Journal of Obstetrics
and Gynecology 109: 1244-1249 (2002)
Ivon Cuscó, María J. Barceló, Montserrat Baiget and Eduardo F.
Tizzano. "Implementation of SMA carrier testing in genetic labs:
comparison of two methods for quantifying the SMN1 gene".
Human Mutation 20:452-459 (2002).
J. Gámez, M.J. Barceló, X. Muñoz, F. Carmona, I. Cuscó, M.
Baiget, C. Cervera, E. Tizzano. "Survival and respiratory decline
are not related to homozygous SMN2 deletions in ALS patients".
Neurology, 59:1456-1460 (2002).
C. Soler, I. Ferrer, J.L. Álvarez, M. Baiget, E.F. Tizzano. "Downregulation
of Bcl2 proteins in type I SMA motor neurons during
fetal development". Journal of Neuropathology and Experimental
Neurology (en premsa 62 (4), 2003).
C. Soler, I. Cuscó, E. López, I. Ferrer, A. Clúa, M. Baiget, E. F.
Tizzano. "Choline Acetyl Transferase expression in fetal SMA
spinal cord" (sotmès 2003).
I. Cuscó, E. López, C. Soler, M. Baiget, E. Tizzano. "A genetic
and phenotypic analysis in Spanish spinal muscular atrophy
patients with 430del4, the most frequently found subtle mutation
in the SMN1 gene" (sotmès 2003).
RECERCA BIOMÈDICA | 163

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
MEMÒRIA FINAL
1. Resum del projecte original
Objectius concrets
a) Caracterització i clonatge de gens
1. Estudiar genealogies amb atàxia dominant d’aparició
tardana (ADCA) per mostrar i caracteritzar molecularment
les mutacions expansives dinàmiques descrites.
2. Anàlisi de lligament genètic: assignar loci responsables
en els casos de no detección de mutació
expansiva. Excloure loci amb lligament demostrat en
altres famílies.
3. Identificar altres mutacions expansives encara no
descrites.
b) Estudis patogenètics
Investigar la relació entre el genotip i el fenotip en
aquestes malalties neurodegenerativas, i estudiar
particularment els fenòmens de penetrància, expressivitat,
pleiotropia i anticipació dels gens implicats.
c) Estudis d’epidemiologia genètica
Incidència de les mutacions expansives CAG en
casos d’atàxia, tot observant-ne la distribució en
l’àmbit nacional espanyol, amb especial esment de
Cantàbria i Girona, en ser les casuístiques nacionals
més grans i més ben estudiades. Determinació de les
Títol del projecte:
Anàlisi genètica d’heredoatàxies dominants.
Identificació i caracterització de mutacions dinàmiques
Investigador principal
Víctor Volpini Bertran
Institució
Institut de Recerca Oncològica
Membres de l’equip
Jordi Corral, Isabel Banchs i Victor Volpini
6.623.433 PTA
freqüències al·lèliques dels polimorfismes CAG.
d) Genètica de poblacions
Estudi d’haplotips de loci marcadors associats als
fenotips atàxics. Estudi de possibles efectors
fundadors i de deriva genètica en general. Origen
evolutiu de les mutacions dinàmiques: aptitud biològica
i taxes de mutació.
Disseny
1. Anamnesi i exploració física dels individus en
estudi. Estudis de laboratori, electrofisiologia i estudis
de radioimatge. Estudis anatomopatològics quan
corresponguin.
2. Extracció del DNA i conservació a 4º i congelat a -
80º de tots els individus en estudi (familiars sans i
malalts).
3. Detecció de les reportades mutacions expansives
dinàmiques SCA1, SCA2, SCA3, SCA6 i SCA7.
4. Identificació i clonatge d’altres gens responsables
en els casos que no presentin les mutacions dinàmiques
descrites, per mitjà de les tècniques RED o
DIRECT.
5. Confecció de genotips de loci marcadors polimòrfics.
Verificació de lligament respecte d’SCA4 i SCA5.
Recerca d’altres loci lligats.

Pla de treball
1. Classifidació dels subjectes en estudi com a "casos
aïllats" o "casos familiars". Procedència geogràfica de
les genealogies. Extracció del DNA de tots els individus
en estudi.
2. Detecció en els afectats d’aquestes malalties neurodegeneratives
de les mutacions SCA ja reportades.
3. En casos de detecció: seqüències interruptores.
Correlació genotip-fenotip. Procedència paterna o
materna de l’al·lel deleteri i influència del sexe i de
l’al·lel salvatge en l’expressivitat del fenotip. Influència
dels genotips (seqüències CAG) dels altres loci SCA
en la modulació i consecució del fenotip final.
4. En els casos de no detecció:
a) Ús de la tecnologia RED o DIRECT.
b) Anàlisi de lligament genètic.
c) Alu-PCR o bases de dades.
5. Anàlisi de desequilibri de lligament.
2. Resultats
a) Caracterització i clonatge de gens
- Hem investigat 129 casos índex familiars i 291 casos
esporàdics. En els casos familiars hem trobat
mutacions expansives dinàmiques en 56 casos
(43.4%, e=8.1%). Queden 73 casos (56.6%, e=8.2%)
en què l’atàxia correspon a un gen per identificar.
Entre els 291 casos esporàdics, no s’han detectat
mutacions expansives dinàmiques.
Taula 1. Casos índex amb història familiar d’atàxia o
casos esporàdics respecte de la identificació o no de
mutacions CAG. Els valors totals (N) permeten
establir els intervals corresponents de confiança en
les proporcions estimades (entre parèntesis). Les
mutacions dinàmiques tipus CAG estan absolutament
associades als casos amb història familiar: 2 =
145.8; P< 0.001.
Hem estudiat els increment de variació de les repeticions
CAG corresponents a la transmissió en una
generació. Els valors indicats tot seguit corresponen a
la mitjana d’aquests increments, a la desviació típica i
al coeficient de variació de Pearson. Per a SCA1:
+0.7, 0.95, 136%; per a SCA3: +1.9, 2, 105%; per a
SCA7: +11.2, 18.22, 163%. L’increment més gran
correspon al locus SCA7, com reporten igualment
altres casuístiques.
Taula 2. Distribucions dels increments de variació ( n)
de les seqüències (CAG)n en les transmissions corresponents
a una generació. SCA1 i SCA3 corresponen
a transmissions maternes. SCA2 i SCA3 corresponen
a transmissions paternes. SCA7 correspon a la suma
d’ambdues.
N=nombre de casos. S=desviació típica. V=coeficient
de variació de Pearson.
-La transmissió hereditària de les mutacions CAG
segueix unes proporcions mendelianes en tots els loci
SCA estudiats, en desacord amb estudis previs que
suggereixen desviacions significatives, especialment
per a SCA3.
Taula 3. Anàlisi de segregació de les mutacions
expansives dinàmiques CAG. En cap cas la segregació
s’aparta significativament del model mendelià, que
prediu unes proporcions 1:1 en l’F1 per als genotips
(+/E) I (+/+). XX=només dones; XY=només homes;
total=ambdós sexes. E=mutació expansiva. +=al·lel
salvatge.
- Hem identificat una família amb atàxia sense les
mutacions SCA descrites ni lligament genètic als altres
loci SCA reportats fins al moment. Segons una
simulació d’anàlisi de lligament, resulta un lod score
esperat de Z=1.72, per a una freqüència de recombinació
"veritable" de r=0.05. En una anàlisi global del
genoma, resulta una probabilitat d’obtenir un lligament
significatiu d’un 49%. Resultats preliminars indiquen
un lligament constatable per a SCA8 (Z=2.66, a q =
0.00); però sense la reportada expansió del gen.
Taula 4. Genealogia "D": poder o Prob.(Zmàx( )> k) i
lod score esperat o E[ Z( = r)] .
Es mostren els resultats obtinguts per a tres valors de
recombinació genètica "veritables" després d’una
anàlisi de simulació amb 1.000 rèpliques de l’esmentada
genealogia.
b) Etiopatogènia
- Els signes i símptomes derivats de l’afectació de les
motoneurones poden ser una primera manifestació
d’atàxia-plus en casos d’SCA2 (Berciano et al.,
Movement disorders 2000) V15, P 1098) (Berciano et
al., J Neurol 2000, 247 [Suppl 3]: III/1-III/229, P826).
- No associació generalitzada dels casos esporàdics i
idiopàtics d’atàxia amb la malaltia celíaca (Combarros
et al., Neurology 2000, 54: 2346).
c) Estudis d’epidemiologia genètica:
Distribució nacional espanyola dels casos SCA familiars
amb mutació: 7 SCA1 (12.5%), 16 SCA2 (28.6%), 27
SCA3 (48.20%), 3 SCA6 (5.4%) i 3 SCA7 (5.4%).
Taula 5. Casos índex en què s’ha identificat una
mutació dinàmica tipus CAG en el locus SCA corresponent.
- Rang del nombre de repeticions dels loci SCA
(mitjana, desviació típica, coeficient de variació de
Pearson): SCA1: 47, 4.2, 8.8%; SCA2: 39.5, 4.42,
11.2%; SCA3: 70.5, 3.36, 4.8%; SCA6: 23.3, 1.53,
6.6%; SCA7: 47.9, 17.52, 36.6%.
Taula 6. Distribucions de les mutacions CAG dels
diversos loci SCA. N=nombre de casos. S=desviació
típica. V=coeficient de variació de Pearson.
d) Genètica de poblacions
La mutació SCA10 està circumscrita a la població
mexicana. S’hipotetitza un efecte fundador per
migració ancestral o per deriva genètica (coll d’ampolla)
de la mateixa població nadiua.
"Spinocerebellar ataxia type 10 is rare in populations
other than Mexicans. (2002) Neurology. 58:983-984)".
Distribució mundial i procedencia de les mutacions
SCA3: "Ancestral Origins of the Machado-Joseph
Disease Mutation: A Worldwide Haplotype Study.
(2001) American Journal of Human Genet 68(2):523-
528".
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
La detecció d’una mutació genètica significa un
diagnòstic molecular etiològic i identifica una malaltia
neurodegenerativa hereditària, tot classificant-la pel
tipus molecular de mutació detectada i permetent un
diagnòstic diferencial amb processos neurodegenera
RECERCA BIOMÈDICA | 165

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
Taula 1.
Taula 2.
Taula 3.
Taula 4.
Taula 5.
Taula 6.
tius afins. A més, en aquests casos és possible fer
diagnòstics prenatals i de portadors no penetrants
(presimptomàtics), quan se sol·liciten i valoren
adequadament, en l’àmbit d’un assessorament
genètic escaient.
Hem de tenir en compte que els estudis sobre l’etiologia
i la subsegüent patogènia d’aquestes malalties
són una etapa essencial per a futures teràpies que
raonablement han de sorgir els propers anys.
Cal assenyalar que els resultats de les recerques
sobre aquestes malalties no solament beneficien els
mateixos pacients i familiars, sinó que afavoreixen
coneixements sobre el funcionament íntim del sistema
nerviós central, i en particular de l’encèfal, assumpte
d’un rellevant interès científic general.
4. Publicacions
Pujana MA, Corral J, Gratacòs M, Combarros O, Berciano J,
Genís D, Banchs I, Volpini V. Spinocerebellar ataxias in Spanish
patients: genetic analysis of familial and sporadic cases. (1999)
Human Genetics 104: 516-522.
O. Combarros, MD; J. Infante, MD; M. López-Hoyos, MD; M. J.
Bartolomé, MD; J. Berciano, MD; J. Corral, TS; and V. Volpini,
MD. Celiac disease and idiopathic cerebellar ataxia. (2000)
Neurology 54: 2346.
Gaspar C, Lopes-Cendes I, Hayes S, Goto J, Arvidsson K, Dias
A, Silveira I, Maciel P, Coutinho P, Lima M, Zhou YX, Soong BW,
Watanabe M, Giunti P, Stevanin G, Riess O, Sasaki H, Hsieh M,
Nicholson GA, Brunt E, Higgins JJ, Lauritzen M, Tranebjaerg L,
Volpini V, Wood N, Ranum L, Tsuji S, Brice A, Sequeiros J,
Rouleau GA. Ancestral Origins of the Machado-Joseph Disease
Mutation: A Worldwide Haplotype Study. (2001) American Journal
of Human Genet 68(2):523-528.
T.Matsuura, MD, LPW Ranum, PhD, VVolpini, MD, PhD, M
Pandolfo, MD, H Sasaki, K Tashiro, K Watase, MD, PhD, HY
Zoghbi, MD, T Ashizawa, MD. Spinocerebellar ataxia type 10 is
rare in populations other than Mexicans. (2002) Neurology.
58:983-984.

Títol del projecte:
Regulació de l’expressió muscular del gen de la distròfia miotònica.
Investigació de vies terapèutiques per a la distròfia miotònica
Investigador principal
Antonio Zorzano Olarte
Institució
Facultat de Biologia. UB
Membres de l’equip
Antonio Zorzano, Xavier Testar, Marta Camps, Luc Marti, Anna Gumá, Perla Kaliman,
Manuela Sanchez Feutrié, Hans Burghardt, Carles Cantó, Jordi Duran, Silvia García,
Meritxell González, Marc Liesa, Déborah Naón, Meritxell Orpinell, Sara Pich, Francesc X. Soriano
25.793.000 PTA
MEMÒRIA FINAL
1. Resum del projecte original
La distròfia miotònica és la forma més estesa de
malaltia neuromuscular hereditària i la seva incidència
a Europa és d'1 en 7.000-8.000 naixements. La
distròfia miotònica és una malaltia autosòmica
dominant i es caracteritza principalment per miotonia,
debilitat muscular progressiva, pèrdua de massa
muscular i resistència a la insulina. El defecte genètic
de la distròfia miotònica consisteix en l'amplificació
d'un triplet CFG localitzat a la regió 3’ no traduïda del
gen de la miotonina proteïna cinasa (DM-PK), la qual
cosa condueix a una marcada reducció en els nivells
musculars de la DM-PK en pacients afectats de
distròfia miotònica.
L'objectiu del projecte consisteix a avaluar la regulació
de l'expressió del gen de la distròfia miotònica en
cultius primaris de cèl·lules musculars humanes i en
cèl·lules musculars procedents de rosegadores per
factors que es coneixen que exerceixen un paper
central en la cèl·lula muscular, com són els factors de
creixement de tipus insulina (IGF), factors miogènics
de la família MyoD, factors neuronals amb potent
acció sobre la fibra muscular, com l'agrina o l'hereguli-
na o les tiazolidinadiones —potents activadors dels
factors de transcripció PPAR i potenciadors insulínics.
Aquests estudis ens permetran determinar si la DM-
PK es regula en cèl·lules musculars, la qual cosa
podria tenir un potencial terapèutic en el tractament
de pacients amb distròfia miotònica.
A més a més, en aquest projecte es pretén determinar
si el producte del gen de la distròfia miotònica
exerceix un efecte regulador sobre la capacitat de
resposta de la cèl·lula muscular en factors hormonals,
com els factors de creixement IGF o la insulina. Això
ens permetria entendre la base molecular de l'aparició
de resistència a la insulina, característica del múscul
de pacients de distròfia miotònica, i també establir
noves teràpies per tractar-la.
D’acord amb la nostra hipòtesi de treball, els
objectius concrets del projecte són:
1. Regulació de l'expressió del gen de la distròfia
miotònica en cèl·lules musculars. L'avaluació de la
regulació de l'expressió del gen de la distròfia miotònica
es durà a terme en cultius primaris de cèl·lules
musculars humanes i en cèl·lules musculars
procedents de rosegadors. En aquest sentit, s'estudiarà
el possible paper regulador de factors que
RECERCA BIOMÈDICA | 167

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
exerceixen un important paper en la diferenciació
miogènica, com els factors de creixement de tipus
insulina (IGF), factors miogènics de la família MyoD,
factors neuronals amb potent acció sobre la fibra
muscular com l'agrina o l'heregulina o compostos
tiazolidinadiones que estimulen l'activitat dels factors
de transcripció PPAR.
2. Avaluació de la possible funció com a promotor de la
regió de DNA situada entre el gen DMR-N9 i l'adjudicable
inici de transcripció del gen de la distròfia miotònica.
En el cas que els estudis anteriors revelin alguna llum
sobre els factors que regulen l'expressió del gen de la
distròfia miotònica, avaluarem si la regió de DNA
situada entre el gen DMR-N9 i l'adjudicable inici de
transcripció del gen de la distròfia miotònica funciona
com a promotor, i si és així, regula l'activitat transcripcional
del gen de la distròfia miotònica en resposta als
factors analitzats.
3. Avaluació de l'efecte del producte del gen de la
distròfia miotònica sobre la resposta de la cèl·lula
muscular a la insulina i/o factors de creixement de
tipus IGF.
En aquest projecte també es pretén determinar si el
producte del gen de la distròfia miotònica exerceix un
efecte regulador sobre la capacitat de resposta de la
cèl·lula muscular en factors hormonals com els factors
de creixement IGF o la insulina. Això ens permetria
entendre la base molecular de l'aparició de la resistència
a la insulina característica dels pacients afectats de
la distròfia miotònica.
2. Resultats
Els resultats més destacables obtinguts al llarg del
projecte són els que s'especifiquen a continuació. En
aquest sentit, de moment aquest projecte ha permès
publicar dos articles científics que s'enumeren més
endavant i els resultats no publicats encara pensem
publicar-los l'any vinent. També hem d'esmentar que
aquests estudis tindran continuïtat en el futur gràcies
a la consecució d'un projecte d'investigació (Pla
Nacional del Ministeri de Ciència i Tecnologia) per un
dels membres del nostre equip (Dra. Perla Kaliman).
1. Inducció de l'expressió de DMPK durant la diferenciació
de les cèl·lules musculars
Durant la diferenciació de mioblasts d’L6E9, l'addició
d'IGF-II exògena causa la inducció de proteïnes
marcadores de múscul esquelètic, com és el transportador
de glucosa sensible a la insulina GLUT-4, la
isoforma 3 de caveolina, que és un component del
complex de distrofina, i la cadena pesant de la miosina.
L'expressió d'aquestes proteïnes augmenta amb el
temps d'exposició a IGF-II, i és màxima el dia 4, quan
la diferenciació morfològica està completada (28).
Durant la miogènesi, el nivell de proteïna DMPK va
augmentar com a resposta a IGF-II (20 nM; figura 1A).
Comparat amb els mioblasts no diferenciats (dia 0),
l'IGF-II va induir un augment de 6,8 ± 0,5 vegades (n
= 3) en l'expressió de proteïna DMPK el dia 4 de
diferenciació. Com a control vam examinar el nivell
d'expressió de ß1-integrina, una proteïna de membrana
plàsmica no específica de múscul, que va
romandre inalterada durant la diferenciació induïda per
IGF-II. La proteïna DMPK induïda per IGF-II es localitza
principalment en la fracció citosòlica en miotubs,
mentre que no es va detectar proteïna DMPK en
fraccions de membrana de cèl·lules diferenciades
(figura 1B). Els IGF indueixen l'expressió de DMPK
d'una manera dependent de dosi, i l'anàleg d'IGF-I,
des(1,3)IGF-I va ser 15 vegades més potent que IGF-II
(figura 1C i 1D), tot indicant que ambdós pèptids
indueixen l'expressió de DMPK a través de l'activació
del receptor d'IGF-I, tal com s'ha descrit per a altres
marcadors miogènics (22, 25).
Figura 1. Expressió de DMPK durant la diferenciació
de mioblasts L6E9. A) L'expressió de DMPK es va
determinar per "immunoblot" usant l'anticòs monoclonal
MANDM1 en extractes totals de mioblasts L6E9
diferenciats en presència de 20 nM IGF-II durant 2 o 4
dies, o bé mioblasts no diferenciats (d 0). El contingut
de ß1-integrina es va analitzar com a control de
quantitats relatives de proteïnes en cada mostra. B)
Es van analitzar fraccions de membranes (M) o citosòliques
(C) procedents de mioblasts L6E9 (Mb) o
miotubs (Mt) per "immunoblot" usant l'anticòs
MANDM1. Mioblasts confluents L6E9 (d 0) van ser
diferenciats per depleció de sèrum durant 2 dies en
absència o presència de diferents concentracions
d'IGF-II (0—5 nM; C) o des(1,3)IGF-I (0—0.3 nM; D).
El contingut de DMPK ( ) es va analitzar per immunoblotting
a partir de 30 µg de proteïnes solubilitzades.
ß-actina ( ) es va utilitzar com a control de les quantitats
relatives de proteïnes en cada mostra. Es va
considerar com a expressió basal el contingut de
proteïna després de 2 dies al medi deplecionat de
sèrum, i les dades s'expressen com a vegades
d'augment sobre el basal. Les dades mostrades són
representatives de tres experiments independents.
Hem comprovat que la proteïna de 80-kDa induïda
per IGF-II durant la miogènesi i identificada amb l'anticòs
monoclonal MANDM1 correspon a DMPK, ja que
es va detectar específicament en miotubs, mentre que
en cèl·lules no musculars, com cèl·lules HeLa,
adipòcits 3T3-L1 i adipòcits aïllats de rata només es
detectava una banda de 72-kDa, banda que ha estat
anteriorment descrita com una proteïna amb què hi ha
reacció encreuada (CRP; figura 2A) (39). A més a
més, la mobilitat electroforètica de la proteïna DMPK
de rata detectada amb MANDM1 coincideix amb la
mobilitat de DMPK de múscul esquelètic humà
detectat tant amb l'anticòs MANDM1 com amb l'anticòs
monoclonal específic humà MANDM5 (figura 2B).
Els nivells d’mRNA de DMPK també es van induir
amb la diferenciació el dia 4 iniciada tant per IGF-II (20
nM) o per deprivació de sèrum (2% FBS; figura 2C).

Figura 2. Expressió de proteïna i mRNA de DMPK en
cèl·lules de múscul esquelètic. A) Es van analitzar
extractes totals de mioblasts i miotubs L6E9, cèl·lules
HeLA, adipòcits aïllats de rata, i adipòcits 3T3-L1 per
immunoblot usant l'anticòs monoclonal MANDM1. B)
Es va comparar la mobilitat electroforètica de DMPK
en extractes de cèl·lules de mioblasts i miotubs de
L6E9 procedents de rata (obtinguts després de 4 dies
en IGF-II en el medi de diferenciació) i de múscul
humà. L'anticòs MANDM1 reconeix tant la proteïna
DMPK humana i de rata, i l'anticòs MANDM5 reconeix
específicament la proteïna DMPK humana. C) Es van
diferenciar cèl·lules mioblàstiques L6E9 (Mb) durant 4
dies en presència d'IGF-II (20 nM) o de 2% FBS. Es
va obtenir RNA total dels grups experimentals
diferents, i 30 µg d’RNA es va aplicar en gels.
Després de transferència, l’mRNA de DMPK va ser
revelat mitjançant quimioluminiscència posterior a
hibridació amb una sonda procedent del cDNA
complet de ratolí de DMPK.
La integritat i quantitats relatives d’RNA en cada
mostra van ser comprovades per tinció amb bromur
d'etidi (28S rRNA). D) Es va determinar l'activitat
catalítica de DMPK després d'immunoprecipitar amb
l'anticòs MANDM1 a partir d'extractes procedents de
mioblasts (Mb) o miotubs (Mt) L6E9 obtinguts després
de 4 dies de diferenciació al medi que contenia IGF-II.
En les reaccions d'activitat proteïna cinasa es va usar
MBP com a substrat in vitro (panell superior). Es va
analitzar l'expressió de proteïna DMPK en mostres
immunoprecipitades mitjançant assajos de Western
blot usant MANDM1 (panell inferior). Les dades
mostrades corresponen a experiments representatius.
En cèl·lules diferenciades amb IGF-II, la inducció de
l'expressió de proteïna DMPK va correlacionar amb
nivells augmentats d'activitat Ser/Thr cinasa de DMPK
respecte de la proteïna bàsica de mielina (MBP), que
és un substrat ben caracteritzat de la proteïna
recombinant (40) (figura 2D). En mioblasts no diferenciats,
la fosforilació d’MBP era molt baixa en immunoprecipitats
de DMPK. En cèl·lules diferenciades, l'activitat
DMPK cinasa s'induïa fortament (panell superior),
i aquests resultats correlacionaven amb nivells més
alts d'expressió de DMPK en les mostres immunoprecipitades
(panell inferior).
2. Vies de senyalització intracel·lular que regulen
l'expressió de DMPK en cèl·lules de múscul esquelètic
A continuació vam analitzar els elements intracel·lulars
implicats en la inducció de l'expressió de DMPK
durant la diferenciació del múscul esquelètic. Hem
demostrat anteriorment que les proteïnes PI 3-cinasa,
NF-kB, i NOS defineixen una via miogènica que ve
iniciada per IGF-II (28). A més a més, hi ha evidència
que indica que les vies dependents de p38 MAPK i
PI-3 cinasa actuen en paral·lel tot senyalitzant la
diferenciació miogènica induïda pro IGF-II (33).
Aquí analitzarem l'expressió de proteïna i mRNA de
DMPK proteïna en mioblasts L6E9 induïts a diferenciar
per IGF-II o per deprivació de sèrum, en absència o
en presència d'inhibidors específics d'aquestes vies
en cèl·lules de múscul esquelètic (28, 33). Hem utilitzat
LY294002 per inhibir selectivament l'activitat PI 3cinasa,
N-nitro-L--arginina (NNA) per inhibir l'activitat
NOS, salicilat sòdic (NaSal) per inhibir NF-kB activació,
i SB202190 per inhibir l'activitat p38 MAPK. El dia
4 de diferenciació, l'expressió de DMPK augmentava
en paral·lel a la inducció de proteïnes específiques de
múscul, com la cadena pesant de miosina i caveolina-
3 (figura 3A), i això va correlacionar amb el desenvolupament
d'un fenotip completament diferenciat
mesurat com la formació de miotubs multinucleats
(dades no mostrades). L'expressió de proteïna DMPK
s'inhibia quan les cèl·lules eren diferenciades en
presència d’LY294002, SB202190, NaSal, o NNA, tot
indicant el requeriment de les activitats PI 3-cinasa,
p38 MAPK, NF-kB, i NOS per a l'expressió de DMPK.
Com a control, vam analitzar en cada experiment el
contingut cel·lular d'una proteïna que no es regula per
diferenciació (la proteïna ß-actina). Vam observar que
en presència de drogues que inhibien la miogènesi,
l'expressió de DMPK, cadena pesant de la miosina, i
caveolina-3 era inhibida, mentre que el contingut de -
actina no es modificava. Aquests resultats van indicar
que el decrement en l'expressió de DMPK era a
causa de la inhibició de la miogènesi i no a deterioració
cel·lular induït per les drogues antimiogèniques. A
més a més, no es va observar evidència de mort
cel·lular induïda per les drogues utilitzades (dades no
mostrades).
RECERCA BIOMÈDICA | 169

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
Figura 3. Vies de senyalització intracel·lular miogènica
que regulen l'expressió de DMPK en cèl·lules L6E9.
Mioblasts confluents L6E9 (Mb) van ser diferenciats
durant 4 dies en presència de 20 nM IGF-II o en 2%
FBS amb inhibidors o sense de PI 3-cinasa
(LY294002, 20 M), NF-kB (NaSal, 10 mM), p38
MAPK (SB202190, 10 µM), o NOS (NNA, 10 mM). A)
Els continguts de DMPK i dels marcadors de múscul
esquelètic cadena pesant de miosina (MHC) i caveolina-3
es van analitzar mitjançant Western blot en lisats
cel·lulars totals. Es van determinar les quantitats relatives
de proteïnes en cada mostra mitjançant anàlisi de
l'abundància de la proteïna no específica de múscul,
-actina. B) Es va obtenir RNA total dels distints grups
experimentals, i 30 g d’RNA es va carregar en gels
per analitzar l'expressió d’mRNA de DMPK. La integritat
i quantitats relatives d’RNA en cada mostra es van
comprovar per tinció de bromur d'etidi (28S rRNA). Les
dades mostrades corresponen a experiments
representatius.
La regulació de l'expressió de la proteïna DMPK va
correlacionar amb les dades obtingudes per anàlisi de
Northern blot. No es va detectar DMPK mRNA en
mioblasts no diferenciats, es va induir després de 4
dies de diferenciació iniciada tant per IGF-II o per
depleció de sèrum, i era bloquejat totalment quan PI
3-cinasa, NF-kB, NOS, i p38 MAPK eren inhibits
(figura 3B). El retard entre l'inici del tractament d'IGF-II
i la detecció de la proteïna DMPK i l’mRNA, i el fet
que resultats idèntics s'obtenien quan les cèl·lules es
diferenciaven amb sèrum baix o amb IGF-II, suggerien
una acció indirecta d'IGF-II sobre l'expressió de
DMPK, probablement a través de l'activació
d'elements addicionals implicats en el programa de
diferenciació.
El nostre laboratori i altres han mostrat anteriorment
les especificitats dels inhibidors utilitzats en aquest
estudi en cèl·lules musculars (24, 28, 29, 33).
Nosaltres vam comprovar aquí que l'expressió de
DMPK induïda per IGF-II va ser bloquejada per
LY294002, SB202190, NaSal, o NNA de manera
dependent de concentració i també vam mostrar que
els inhibidors presentaven una dosi inhibidora 50 de
l'expressió de la proteïna DMPK que correlacionava
amb allò que s'ha descrit per a la inhibició específica
de les vies de senyalització analitzades (LY294002, 1
M; SB202190, 25 nM; NNA, 1 mM; NaSal, 2 mM;
figura 4 A—D) (41, 42, 43).

Figura 4. Inhibició dependent de dosi de l'expressió
de DMPK per LY294002, NNA, NaSal, i SB202190.
Mioblasts confluents (Mb) van ser diferenciats en
sèrum durant 4 dies en presència de 20 nM IGF-II i en
concentracions creixents d’LY294002 (0—5 M; A),
NNA (0—2 mM; B), NaSal (0—5 mM; C), o SB202190
(0—0.1 M; D). Es va analitzar el contingut cel·lular de
DMPK ( ), caveolina-3 ( ), cadena pesant de la miosina
(MHC; ( ) i -actina ( ) per immunoblotting de 30 g de
proteïnes solubilitzades dels diversos grups experimentals.
La quantificació de l'expressió de les proteïnes
es va fer per densitometria. En tots els casos, el
contingut de la proteïna present després de 4 dies en
presència d'IGF-II es va considerar com a valor 100, i
les dades es van expressar com a percentatge del
valor 100 de referència. Les dades mostrades corresponen
a un experiment representatiu.
A més, el nostre laboratori ha confirmat els resultats
obtinguts en mioblasts de rata L6E9 en un model
diferent de cèl·lules de múscul esquelètic, els mioblasts
de ratolí C2C12. Com havíem observat en cèl·lules
L6E9, l'expressió de la proteïna DMPK es va induir en
mioblasts C2C12 després de 4 dies de diferenciació o
bé per IGF-II o per 2% HS (figura 5A). La incubació de
cèl·lules C2C12 amb LY294002, SB202190, NaSal, o
NNA durant diferenciació va revelar que en mioblasts
de ratolí, la inducció de l'expressió de DMPK per
sèrum baix o per IGF-II també és dependent de l'activitat
de les vies de senyalització miogèniques anteriorment
caracteritzades.
Figura 5. Vies de senyalització intracel·lular miogèniques
que regulen l'expressió de DMPK en cèl·lules
C2C12. A) Mioblasts confluents C2C12 (Mb) van ser
diferenciats durant 4 dies en absència (DMEM) o en
presència de 20 nM IGF-II o de 2% HS amb inhibidors
o sense de PI 3-cinasa (LY294002, 20 M), NF-kB
(NaSal, 10 mM), p38 MAPK (SB202190, 10 M), o
NOS (NNA, 10 mM). Els continguts de DMPK i del
marcador de múscul esquelètic caveolina-3 es van
analitzar per Western blot en lisats cel·lulars. Les
quantitats relatives de proteïnes en cada mostra es
van comprovar per expressió de la proteïna -actina.
Les dades mostrades corresponen a un experiment
representatiu.
3. Expressió de DMPK en cèl·lules 10T1/2 que
sobreexpressen MyoD
Els fibroblasts 10T1/2 transfectats de manera estable
amb MyoD expressen proteïnes de múscul esquelètic i
fusionen generant miotubs quan se'ls incuba en
presència d'IGF-II o en un medi amb 5% HS (figura 6A
i 6C). Després de 4 dies de diferenciació en aquestes
condicions, les cèl·lules 10T1/2-MyoD també expressen
proteïna i mRNA de DMPK (figura 6A i 6B). En
cèl·lules 10T1/2-MyoD, l'expressió de DMPK i de
caveolina-3 era regulada per una via miogènica inhibida
per LY294002, NaSal, o NNA, indicant la implicació
de PI 3-cinasa, NF-kB, i NOS, respectivament (figura
6A). No obstant això, quan l'activitat p38 MAPK era
bloquejada per SB202190, caveolina-3 i fusió cel·lular
s'inhibien (figura 6A i 6C), mentre que la proteïna i
l’mRNA de DMPK s'expressaven com en cèl·lules no
tractades (5% HS o IGF-II; figura 6A i 6B). Aquestes
dades mostren que en cèl·lules que sobreexpressen
MyoD, DMPK no requereix p38 MAPK per ser induïda i
demostren una dissociació entre l'expressió de DMPK i
el desenvolupament d'un fenotip muscular completament
diferenciat.
Figura 6. Vies de senyalització intracel·lular miogèniques
que regulen l'expressió de DMPK en cèl·lules
10T1/2- MyoD. A) Cèl·lules confluents 10T1/2-MyoD
(Mb) van ser diferenciades durant 4 dies en absència
(DMEM) o en presència de 20 nM IGF-II o de 5% HS
amb inhibidors o sense de PI 3-cinasa (LY294002, 20
µM), NF-kB (NaSal, 10 mM), p38 MAPK (SB202190,
10 µM), o NOS (NNA, 10 mM). Els continguts
cel·lulars de DMPK i de caveolina-3 van ser analitzats
per Western blot en lisats totals.
Les quantitats relatives de proteïnes en cada mostra
van ser comprovades mitjançant anàlisi de la proteïna
no muscular -actina. B) Cèl·lules confluents 10T1/2-
MyoD (Mb) van ser diferenciades durant 4 dies en
absència (DMEM) o en presència de 20 nM IGF II o
5% HS amb o sense l'inhibidor de p38 MAPK
(SB202190, 10 µM). Es va obtenir RNA total, i 30 µg
RNA van ser carregats en gels per analitzar l'expressió
d’mRNA de DMPK.
La integritat i quantitats relatives d’RNA en cada
RECERCA BIOMÈDICA | 171

FUNDACIÓ LA MARATÓ DE TV3
mostra es van comprovar per bromur d'etidi (28S
rRNA). C) Cèl·lules confluents 10T1/2-MyoD (Mb) van
ser diferenciades durant 4 dies en absència (DMEM) o
en presència de 20 nM IGF II amb o sense l'inhibidor
de la p38 MAPK (SB; SB202190, 10 M). La diferenciació
morfològica va ser avaluada per la formació de
miotubs. Les imatges mostrades són representatives
de 30 camps microscòpics agafats a l'atzar en 3
experiments independents. Barres d'escala, 30 µm;
l'escala és la mateixa per a tots panells.
4. Efecte de la proteïna DMPK sobre la resposta de la
cèl·lula muscular a la insulina i/o factors de creixement
de tipus IGF.
4.1. Obtenció de formes mutants de la DMPK
humana.
En primer lloc i a fi d'obtenir una forma mutant cinasa
deficient de la DMPK, vam generar mutants de la
DMPK humana en què el lloc hipotètic d'unió a ATP
(K110) va ser substituït per una alanina (K110ADMPK)
o una arginina (K110RDMPK). Aquests mutants
podrien exercir una acció dominant negativa sobre la
DMPK endògena un cop sobreexpressades en
cèl·lules a causa de la seva incapacitat d'unir ATP. En
les bases de dades, per homologia de seqüències,
està definit que els residus importants per a l'activitat
catalítica de DMPK són:
DMPK humana (Q9013)
- domini proteïna-cinasa: residus 81-349
- residu d'unió a metalls (per a la unió d'ATP):
residus 87-95
- lloc d'unió a ATP: 110 (K)
- lloc actiu (residu catalític): 205 (D)
A partir del cDNA de la DMPK humana clonat en el
vector d'expressió procariota pRSET (cedit pel Dr. L T.
Timchenko, Baylor College of Medicine, Houston,
Texas), vam generar les mutacions K110A i K110R
mitjançant la tècnica de la mutagènesi dirigida
emprant el kit QuickchangeTM Site-Directed
Mutagenesis (Stratagene). Aquest sistema permet
introduir mutacions en plàsmids de doble cadena
(dsDNA). Es va partir d'un vector de dsDNA superenrotllat
amb el cDNA de la DMPK humana i 2 oligonucleòtids,
complementaris a cadenes oposades del vector,
que contenien la mutació desitjada. Aquests dos
oligonucleòtids es van estendre mitjançant la Pfu
polimerasa durant diversos cicles de temperatura. A
continuació dels cicles de temperatura, el producte es
va tractar amb l'endonucleasa DpnI per digerir el motlle
de DNA parental i per seleccionar el DNA sintetitzat de
nou amb la mutació. A continuació, es van transformar
bacteris E. coli supercompetents per reparar els nicks
que pogués presentar el plàsmid mutat.
Aquestes formes mutants de DMPK es van obtenir en
el vector d'expressió procariota pRSET i es van
seqüenciar per comprovar que durant la PCR no
s'havien introduït mutacions addicionals.
Se sap que la deleció de l'extrem C-terminal de la
DMPK la converteix en una cinasa constitutivament
activa (Bush et al., Biochemistry 2000 8480-90). A fi
d'obtenir una forma constitutivament activa de la DMPK
i partint del cDNA de la DMPK salvatge en el vector
d'expressió procariota pRSET, vam generar per PCR
una forma mutant de la DMPK amb una deleció en el
seu extrem C-terminal ( C) a partir del nucleòtid 1591.
4.2. Expressió en bacteris de DMPK salvatge, K110A-
DMPK, K110R-DMPK i C-DMPK
L'expressió de les proteïnes recombinants en bacteris
es va dur a terme segons el mètode The
QIAexpressionist (QIAGEN). Segons aquest protocol, el
plàsmid contenint el cDNA recombinant s'introdueix en
les cèl·lules hoste (bacteris E.coli), es deixen créixer els
bacteris fins a una densitat òptica determinada
(OD600=0.5-0.7), s'indueix l'expressió, i s’acaba lisant
els bacteris i analitzant l'expressió de la proteïna per
SDS-PAGE. Atès que el vector utilitzat (pRSET) té un
epítop de 6 histidines, vam poder purificar les proteïnes
a partir del lisat bacterià per cromatografia d'afinitat a
través de columnes de níquel (Ni-NTA, QIAGEN). Les
proteïnes unides al níquel a través de l'epítop d’histidines
es van eluir en una solució d'imidazol 100 mM.
A tall d'exemple, la figura 7 mostra la purificació de la
DMPK salvatge:
Figura 7. Purificació de la DMPK salvatge per
columnes de níquel. C+, control positiu; FT, flow
through; W, rentada; E, eluïts en 4 volums successius
de 200 l d'una solució d'imidazol 100 mM. 10 ug de
cada fracció es van analitzar per SDS-PAGE i
Western blot emprant un anticòs monoclonal contra
la DMPK humana.
Resultats semblants es van obtenir en expressar i
purificar les formes de DMPK K110A, K110R i C. En
tots els casos, les proteïnes es van eluir pures en les
fraccions 1 i 2. La puresa es va analitzar tenyint els
gels amb nitrat d'argent.
4.3. Anàlisi de l'activitat cinasa de les proteïnes purificades
La DMPK posseeix una activitat serina/treonina cinasa
i és capaç de fosforilar in vitro la MBP (myelin basic
proteuet) (Carrasco et al., Endocrinology 2002 3017-
25). Vam analitzar la capacitat de fosforilar MBP de
cadascuna de les formes de DMPK purificades
segons que s’ha detallat en l'apartat anterior. Vam fer
la fosforilació in vitro emprant 32P-ATP com s'ha
descrit anteriorment (Carrasco et al., 2002).
Els resultats obtinguts ens van indicar que la mutació
K110A genera, com esperàvem, una forma cinasa
deficient de la DMPK. Al contrari, la mutació K110R
no afecta l'activitat cinasa de la proteïna. Finalment la
forma truncada en l'extrem C-terminal no va mostrar
més activitat que la forma salvatge, per la qual cosa
generarem en un futur pròxim una deleció més
extensa de l'extrem C-terminal.
En la figura 8 es mostra l'activitat cinasa de la forma
salvatge i la mutant K100A:
Figura 8. Fosforilació in vitro de MBP en presència de
DMPK salvatge (WT) o K110A-DMPK (K110A) i -
32PATP. La reacció es va sotmetre a SDS-PAGE i es
va revelar per autoradiografia. El senyal correspon a
MBP fosforilada (32P-MBP).
4.4. Generació d'adenovirus recombinants que
expressin les formes de DMPK
Vam partir dels cDNA de la DMPK salvatge i la forma
constitutivament activa marcats amb l'epítop c-myc el

5' i clonats en el vector d'expressió eucariota pCIneo
(cedits pel Dr. B. Perryman, University of Colorado).
Vam generar, a partir d'aquests, dos adenovirus
recombinants mitjançant recombinació homòloga
(Graham i Prevec, 1991 Chapter 11, Methods ‘in’
Molecular Biology vol. 7, De. EJ Murray). Els cDNA
van ser clonats en un plàsmid d'enllaç (shuttle
plasmid) pAdl1/RSV i cotransfectats amb el plàsmid
pJM17 en cèl·lules 293 per aconseguir una recombinació
homòloga. Es van aïllar calbes individuals i els
adenovirus recombinants van ser amplificats en
cèl·lules 293, purificats per centrifugació en un gradient
de clorur de cesi, dializats amb una solució 1 mM de
MgCl2, 10 mM deTris pH 7.4, 10% de glicerol i van
ser, finalment, emmagatzemats a -80ºC. Els virus van
ser titulats mitjançant infecció de cèl·lules 293 amb
dilucions seriades de la preparació i observant l'efecte
citopàtic (CPE) en les cèl·lules després de 48 h d'infecció.
Es va donar un títol infecciós assumint que cal una
multiplicitat d'infecció (MOI) de 10 per causar un CPE
complet a 48 h. A més, es va mesurar la densitat
òptica a 260 nm (OD260) per calcular el títol de
partícules (1 unitat d'OD260 = 1012 partícules / ml).
Es va estudiar l'expressió de les proteïnes recombinants
per infecció de cèl·lules 293 (figura 9).
Figura 9. Expressió en cèl·lules 293 de DMPK salvatge
(wt) i constitutivament activa ( ). C+, control positiu;
adv, extractes de cèl·lules 293 després de 24 h
d'infecció amb adenovirus recombinants per a la
DMPK salvatge o constitutivament activa. Els extractes
es van analitzar per SDS-Page i Western blot
emprant un anticòs monoclonal contra la DMPK
humana.
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques
dels resultats finals obtinguts
Durant la primera fase del projecte vam determinar els
mecanismes específics pels quals es regula l'expressió
gènica de DMPK en múscul esquelètic. Aquests
estudis són rellevants amb l'objecte de permetre
futures possibles estratègies terapèutiques que
permetin la sobreexpressió de DMPK.
Durant la segona fase del projecte, hem generat les
eines essencials per fer estudis funcionals de la
DMPK.
1. A partir d'estudis d'homologia seqüencial amb
altres proteïnes serina/treonina cinases, vam identificar
una mutació —K110A— que genera una forma proteïna
cinasa deficient de la DMPK humana.
Aquesta forma mutant constitueix un element valuós
per dur a terme estudis funcionals en models cel·lulars
de múscul esquelètic. La sobreexpressió d’aquesta
ens permetrà exercir un efecte dominant negatiu
sobre la DMPK muscular endògena i d'aquesta
manera analitzar els paràmetres metabòlics, de
diferenciació i de regeneració que es vegin alterats per
la manca d'activitat DMPK.
2. Hem posat a punt una producció eficient de DMPK
en bacteris i la seva purificació per cromatografia
d'afinitat. El fet de disposar de la proteïna purificada
ens permetrà en un futur pròxim encarar un abordatge
proteòmic per identificar els elements intracel·lulars de
múscul esquelètic que específicament interaccionen
amb la DMPK, ja siguin reguladors de la seva activitat
o substrats.
3. Hem generat adenovirus recombinants que expressen
la DMPK salvatge i la DMPK constitutivament
activa. La infecció de cèl·lules per adenovirus és un
mètode altament eficient d'expressió de proteïnes tant
en sistemes cel·lulars en cultiu com in vivo. Els adenovirus
generats ens permetran fer estudis metabòlics i de
diferenciació en cèl·lules en cultiu i estudis de regeneració
per infecció en animals intactes.
Aquestes eines podrien ser d'utilitat en el futur en la
posada a punt d'estratègies de teràpia gènica en el
tractament de la distròfia miotònica.
4. Publicacions
M. Carrasco, J. Canicio, M. Palacín, A. Zorzano, P. Kaliman.
Identification of Intracellular Signaling Pathways that Induce
Myotonic Dystrophy Protein Kinase Expression during
Myogenesis. Endocrinology 143, 3017-3025, 2002.
A. Zorzano, P. Kaliman, A. Gumà, M. Palacín. Intracellular
signals involved in the effects of insulin-like growth factors and
neuregulins on myofiber formation. Cellular Signalling 2003 (en
premsa).
RECERCA BIOMÈDICA | 173

Divulgació
La Fundació va editar durant aquest exercici
dos números de la revista, de publicació
semestral, distribució gratuïta i finançada
amb fons provinents de patrocinadors:
l’edició núm. 10, el novembre de 2003
(50.000 exemplars) i la núm. 11, el maig de
2004 (51.819 exemplars). Aquesta darrera
edició va introduir un nou disseny gràfic
i la incorporació d’una nova capçalera,
Món Marató, denominació amb què se
sintetitzen els continguts que s’hi publiquen.
La Fundació vol implicar més directament el
sector dels artistes plàstics. Per això destinarà
la portada de les edicions de maig de
Món Marató a reproduir un quadre donat
per un pintor. En aquest número 11 va ser
el pintor Joan Pere Viladecans.
També es va publicar la Memòria 2002.
Exercici juliol 2002-juny 2003, de la
Fundació La Marató de TV3, amb la qual es
va fer un ampli repàs del conjunt d’activitats
i dels resultats econòmics de la Fundació
obtinguts durant aquell exercici comptable.
El lloc web www.fundaciomaratotv3.org té
un important paper difusor de la Fundació,
ja que a més d’informar sobre l’organització,
les activitats i les notícies relacionades amb
La Marató de TV3, dóna a conèixer les
convocatòries del concurs d’ajuts, la destinació
individualitzada per projecte dels recursos
obtinguts amb La Marató i les publicacions
científiques generades per cada projecte
premiat durant el temps del seu desenvolupament.
Finalment, la Fundació va posar en marxa,
el juny de 2003, un espai monogràfic,
Diagnòstic La Marató de TV3, a Catalunya
Informació. Aquest programa va servir per
informar dels avenços en la investigació
científica aconseguits mitjançant els projectes
que es van finançar. L’espai tenia una durada
de 5 minuts, i s’emetia el primer divendres
i dissabte de cada mes, amb una repetició
de 5 cops els divendres i 3 els dissabtes.
Amb aquest programa, la Fundació va
ampliar els seus canals de comunicació
per poder retre comptes a la societat civil de
la destinació final dels recursos econòmics
aconseguits amb els seus donatius.
DIVULGACIÓ | 175