Genética 1 - FBMC

Genética I
Guía de
Problemas
Primer Cuatrimestre de 2013
Profesores:
Beatriz Saidman saidman6@yahoo.com.ar
Esteban Hopp ehopp@fbmc.fcen.uba.ar
María Isabel Remis mariar@ege.fcen.uba.ar
Pablo Cerdán pcerdan@leloir.org.ar
JTP
Andrea Alberti andal@ege.fcen.uba.ar
Arturo Wulff artulf@ege.fcen.uba.ar
Cecilia Bessega cecib@ege.fcen.uba.ar
Daniela Tosto dtosto@cnia.inta.gov.ar
Fabián Norry fnorry@ege.fcen.uba.ar
Laura Kamenetzky lauka@fbmc.fcen.uba.ar
María Eugenia Segretín segretin@dna.uba.ar
Sergio Rodríguez Gil rodrigilcitoevol@ yahoo.com.ar
Flavio de Souza fsouza.ingebi@gmail.com
Carolina Martínez mcmartinez@cnia.inta.gov.ar
Ayudantes de 1ª
Georgina Poggio mgpoggio@ege.fcen.uba.ar
Un típico día de
trabajo en la
vida de un genetista
moderno
(¡minería de
datos!)
Juan Carballeda jcarballeda@cnia.inta.gov.ar
Pablo Rebagliati gchu@ege.fcen.uba.ar
Raquel Defays raqueldefays@ege.fcen.uba.ar
Nicolás Furman nicofurman@gmail.com
Diego Segura dsegura@cnia.inta.gov.ar
Pablo González pablo201083@hotmail.com
Juan Hurtado juan_sauvagei@yahoo.com
Mariana López mglopez@cnia.inta.gov.ar
Ayudantes de 2ª
Cristina V. Alvarez Gonçalvez alvarezgonc@gmail.com
María Belén Vecchione mbelen.vecchione@gmail.com
Jazmín Cassinelli jazmincassinelli@gmail.com
Ayelén Groisman ayelenivana_la15@hotmail.com

1 y 2. LEYES DE MENDEL Y EXTENSIONES DEL ANÁLISIS MENDELIANO I
Bibliografía: Griffiths y col. Cap. 2 y 4
Guía teórica
1) Señale la importancia del concepto de segregación, por
un lado, e independencia, por el otro, de la herencia de
caracteres derivada de las leyes de Mendel y qué papel
juega el azar en ambos. ¿Cuál es la importancia de la diploidía
en todo esto? ¿Sería lo mismo si las arvejas fueran
monoploides en vez de diploides?
R: El concepto de segregación se refiere a la separación de
los alelos de un gen (A,a) que se produce en la meiosis al
formarse las gametas. Cuando esto ocurre cada alelo migra
a un polo distinto y el azar no interviene en este proceso.
(los alumnos suelen decir que los alelos segregan al azar).
El concepto de independencia se refiere a la combinación
al azar de los alelos de genes distintos (A,b) durante la
meiosis I.
La segregación e independencia de la herencia de los
caracteres es, valga la redundancia, independiente de si
los organismos son haploides o diploides y permite la
recombinación, entendida como nuevas combinaciones
de alelos de distintos genes. Como ejercicio, se puede
hipotetizar qué hubiese pasado con las generaciones
paternales, “F1” y “F2” si las arvejas fueran haploides.
Ahora bien, la segregación de alelos se ve enmascarada en los diploides por las interacciones de dominanciarecesividad.
Por eso, antes de Mendel, no se le encontraba lógica a que 2 individuos de fenotipo dominante,
tuvieran descendientes con fenotipo recesivo. Tuvo importancia el análisis numérico-estadístico para establecer
estas leyes que no se había aplicado previamente.
2) ¿Cómo recombinan los genes en la meiosis?
R: Lo hacen mediante dos mecanismos que ocurren durante la meiosis: la combinación de cromosomas no homólogos
y el entrecruzamiento en cromosomas homólogos . Después de Mendel se pudieron incorporar los conceptos
derivados de los avances en citogenética (teoría cromosómica de la herencia) y reformular, en su acepción
moderna que los a l e l o s d e g e n e s situados sobre cromosomas no homólogos recombinan mediante la
migración al azar de dichos cromosomas en la anafase I y los alelos de genes situados en un par de cromosomas
homólogos lo hacen por medio del entrecruzamiento.
3) a) ¿Qué es un monohíbrido? ¿Qué es un híbrido en sentido agronómico o comercial (por ej. un híbrido superrendidor
para Clarín Rural)? b) ¿Qué significa hacer un cruzamiento dihíbrido o trihíbrido?
R:a) Monohíbrido es sinónimo de heterocigota para un único gen. Un híbrido comercial es también un heterocigota
(pero con sobredominancia para el carácter rendimiento). No se lo debe confundir con híbridos interespecíficos
que son resultados de cruzamientos amplios (interespecíficos) y que se verán en la guía de alteraciones.
b) Hacer un cruzamiento dihíbrido o trihíbrido significa analizar la progenie de individuos con varios pares de
alelos simultáneamente, dos (Aa Bb) o 3 (Aa Bb Cc) respectivamente.
4) ¿Qué es retrocruza? ¿Y cruzamiento prueba?
R: La retrocruza es un cruzamiento entre un integrante de la F1 o cualquiera de las siguientes generaciones y
cualquiera de los padres.
Un cruzamiento prueba es un cruzamiento entre un heterocigota y un homoci gota recesivo para las características
en estudio: AA x aa Aa
5) ¿En qué consiste la prueba de complementación?
R: Cruzamiento entre dos mutantes homocigotas con fenotipo similar (por ejemplo albino) para determinar si la
F1 tiene fenotipo salvaje (indicativa de que las mutaciones están localizadas en distintos genes). Es el caso típico
de una vía metabólica de varios pasos. Tanto si hay una mutación para el gen que controla el primer paso de
la vía, como para la segunda, la consecuencia es que no se formará el producto final (por ejemplo antocianas
de color rojo, dando albinismo). Si se cruza una mutante para el gen codificante para la primera enzima de la vía
metabólica con otro para la segunda, la F1 será heterocigota para ambos genes. Como generalmente los alelos
salvajes (enzima normal activa) son dominantes, las enzimas sintetizadas se complementarán para restaurar la
vía metabólica, independientemente de que los alelos salvajes estén en repulsión (en trans). El 100% de la F1
es salvaje. Esta prueba se contrasta con la prueba de recombinación (lo que confunde a los alumnos). En la
prueba de recombinación, puede ocurrir que las mutantes independientes se correspondan al mismo gen pero en
nucleótidos distintos, lo que posibilita que se produzca un entrecruzamiento entre las 2 posiciones mutadas
generando un recombinante salvaje. En este caso, la F1 será de fenotipo mutante en un 100% (los alelos mutados
2

3
del mismo gen no se pueden complementar, salvo algunos casos muy excepcionales llamados de complementación
intragénica). En la F2, en una proporción muy pequeña (por ejemplo 1x10 -4 ) aparecen salvajes por recombinación.
Claramente, no son proporciones mendelianas. Este tipo de experimentos le sirvieron a Benzer para
establecer las “distancias” mínimas o “unidades” de recombinación (“recón”) en sus experimentos con fagos. Hoy
sabemos que esta distancia o unidad es el nucleótido.
6) ¿Qué ventajas tiene el uso de caracteres, genes o marcadores codominantes (respecto a los dominantes) en
un análisis genético de segregación?
R: Se puede distinguir los heterocigotas de los homocigotas, por lo que se dispone de mayor información (estadística)
en una F2, por ejemplo. R etrocruzar F1 con el doble recesivo (cruzamiento prueba), en vez de autofecundar.
7) Explique desde el punto de vista genético las siguientes interacciones alélicas: dominancia, codominancia, sobredominancia
(=heterosis o vigor híbrido) y dominancia incompleta
R: En la dominancia se expresa uno solo de los alelos, en la codominancia se expresan ambos. La sobredominancia
implica que la F1 supera en el carácter estudiado (usualmente rendimiento agronómico) a ambos padres. Dominancia
incompleta: el heterocigota presenta rasgos intermedios entre cada tipo de homocigota, no es igual a
ninguno de ellos (la cantidad de enzima en el heterocigota no alcanza para dar color rojo y la flor queda rosada, por
ejemplo).
8) Normalmente, de un carácter autosómico dominante relacionado con alguna enfermedad
se espera que cada individuo afectado tenga al menos un progenitor también afectado.
Pero, ¿puede suceder que ambos padres no manifiesten la enfermedad?
R: Tiene que ver con la influencia que pueden ejercer otros genes y la influencia ambiental
en la expresión del carácter: penetrancia (incompleta)
aa Aa
9) ¿A qué se denomina “interacciones génicas”?
R: Es la interacción entre dos o más genes de distintos loci en la que uno interfiere o modifica la expresión fenotípica
de otro. Generalmente se denomina hipostático al gen que sólo se manifiesta fenotípicamente cuando otro
locus (epistático) presenta determinado genotipo.
Epístasis = modificaciones de las proporciones fenotípicas debidas a interacción génica. Las variantes de epístasis
son muy numerosas en genética, más de las que aparecen en los textos. Sin embargo, varios tratan con detalle
e incluso dan definiciones de algunos de estos ejemplos. No es de interés para esta materia que los estudiantes
memoricen las variantes y mucho menos las definiciones de cada uno de ellas. Sin embargo, hay problemas que
se refieren a éstos, dado que, experimentalmente, e n una progenie segregante, normalmente no se sabe de
antemano si el comportamiento es de tipo epistático y menos aún a qué variante de epístasis se corresponde. En
este contexto, resulta útil disponer del cuadrito adjunto que muestra algunos ejemplos del tipo de proporciones
fenotípicas posibles.
Tipo de interacción génica 9 3 3 1 Razón
A-B- A-bb aaB- aabb fenotípica
Ninguna (cuatro fenotipos distintos) 9 3 3 1 9:3:3:1
Acción génica complementaria 9 7 9:7
Supresión dominante de A sobre el alelo domi- 12 3 1 13:3
nante Epístasis B recesiva de aa sobre los alelos B y b 9 3 4 9:3:4
Epístasis dominante de A sobre los alelos B y b 12 3 1 12:3:1
Genes duplicados 15 1 15:1
Problemas:
1) Si dispone de las siguientes cepas de Drosophila: i) bw/bw, e/e; ii) salvaje y iii) bwbw/vgvg y desea comprobar
las leyes de Mendel, indique:
a) Todos los cruzamientos que le permitirían hacerlo y la segregación de qué carácter (o caracteres) estudiaría en
cada caso.
b) ¿Equivale el cruzamiento directo al recíproco?
c) ¿Deben usarse hembras vírgenes en todos los casos?
2) Si 2 pares de genes A:a y B:b se transmiten independientemente y se sabe que A es dominante sobre a y B
sobre b, ¿cuál es la probabilidad de obtener:
a) una gameta AB a partir de un individuo AaBb?
b) una gameta Ab a partir de un individuo AA Bb?
c) una cigota AABB a partir de aabb X AABB?
d) un fenotipo AB a partir de AaBb X AaBb?
e) un fenotipo AB a partir de AABB X aabb?
f) un fenotipo aB a partir de AaBb X AaBB?
Aa

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3) Enumere las proporciones genotípicas y fenotípicas que puede formar el trihíbrido AaBbCc cuando es autofecundado
(o cruzado por uno de constitución genotípica similar) suponiendo que A y B son dominantes y C tiene
dominancia incompleta sobre c.
4) Se sabe que existe una serie de 4 alelos en una especie diploide (2n); ¿Cuántos estarían presentes en:
a) ¿Un cromosoma?, b) ¿un par cromosómico?, c) ¿un individuo de la especie?, d) sobre la misma base: ¿cuántas
combinaciones diferentes de alelos se espera que ocurran en la población completa?
5) En el ratón, el gen para el albinismo presenta una serie de alelos múltiples. Cuatro de estos alelos (clasificados
de acuerdo con la disminución de intensidad del color de pelo de los homocigotas) son:
C = color completo (tipo salvaje); c ch = chinchilla; c d = dilución extrema; c = albino
Las relaciones de dominancia son C> c ch > c d > c.
a) Haga un esquema de un cruzamiento entre un ratón salvaje heterocigota para dilución extrema y un ratón
chinchilla heterocigota para el albinismo.
b) Otro gen que afecta el color del pelo tiene su locus en otro cromosoma, y presenta los alelos B para pelo
negro (tipo salvaje) y b para castaño. Ampliar el esquema anterior incluyendo el dato de que los dos ratones
que se cruzan son heterocigotas para ese gen.
6) Un fitopatólogo llamado Flor que trabajaba con dos variedades de lino comprobó que éstas presentaban resistencia
diferencial a dos razas del hongo Melampsora lini. La variedad d e lino 770B era resistente a la raza 24
y susceptible a la raza 22, mientras que el lino Bombay era resistente a la 22 y susceptible a la 24. Al cruzar
770B y Bombay, la F1 era resistente a ambas razas 22 y 24. L a autofecundación de l a F 1 produjo una F2
con las siguientes proporciones fenotípicas:
RAZA 22
RAZA 24 Resistente Susceptible
Resistente 110 43
Susceptible 32 9
e) Pruebe su hipótesis usando X 2
a) ¿Cuántos genes hay involucrados?
b) Defina los genotipos parentales
c) Proponga una hipótesis para explicar la base genética de la resistencia
del lino a estas razas particulares.
d) En base a su hipótesis, ¿qué c a n t idad de cada una de las cuatro
categorías aparece en F2?
7) Si el carácter antenas largas (a) está ligado al sexo (determinación XX-XY) en el mosquito Sinospica rascaremus,
¿qué probabilidad hay de obtener un mosquito macho y con antenas largas en la cruza A/a x A/Y?
8)Averiguar si el modelo de herencia del rasgo definido en el pedigrí,
se corresponde con un tipo de herencia autosómica dominante,
autosómica recesiva, dominante ligada a X, recesiva ligada a
X o ligada a Y. ¿Podría ser válida más de una hipótesis?
Cruza
Progenitores
Madre Padre Hijas
Progenie
Hijos
1 Normal Curva Todas curvas Todos normales
2 Curva Normal
0,5 curvas
0,5 normales
0,5 curvas
0,5 normales
3 Curva Normal Todas curvas Todos curvas
4 Normal Normal Todas normales Todos normales
5 Curva Curva Todas curvas Todos curvas
6 Curva Curva Todas curvas
0,5 curvas
0,5 normales
genitores y de las progenies en cada uno de los cruzamientos?
9) En el ratón hay un alelo mutante que
causa encorvamiento de la cola. A partir
de los resultados de los cruzamientos
que se indican a continuación deduzca
el tipo de herencia de este carácter:
a) ¿Es recesivo o dominante?
b) ¿Es autosómico o ligado al sexo?
c) ¿Cuáles son los genotipos de los pro-
10) En Drosophila se aparearon 2 moscas cuyo fenotipo era "alas curvadas" (Curly) y "setas anormales" (Stubble).
Se analizó un gran número de descendientes adultos y la proporción fue la siguiente: 4 alas curvadas y setas anormales:
2 alas curvadas y setas normales: 2 alas normales y setas anormales: 1 normal para ambos caracteres. Explique
estos resultados.
11) En una especie cultivada se realizó un cruzamiento entre plantas de flores rojas y plantas de flores blancas.
La progenie F1 fue roja. En la F2 los resultados fueron los siguientes: 92 rojas, 30 cremas, 41 blancas. Explique.
12) El color del pelaje en los perros depende de la acción de por lo menos 2 genes. En un locus, un inhibidor
epistático dominante (I) de la pigmentación evita la expresión de los alelos del color que se ubican en otro
locus de segregación independiente y en consecuencia produce pelaje blanco. Cuando se da la condición recesiva
ii, los alelos del locus hipostástico pueden expresarse: iiN_ produce color negro, iinn produce color café. En
un cruzamiento dihíbrido para ambos loci, determine:
¿

5
a) Las proporciones fenotípicas esperadas en la progenie.
b) La probabilidad de hallar, en la progenie de color blanco, un individuo que sea homocigota para ambos loci.
13) Se cruzaron dos cultivares de arveja con flores blancas y se obtuvo una F1 homogénea con flores moradas.
El cruzamiento al azar entre individuos de la F1 produjo 96 plantas hijas, de las cuales 53 presentaron flores
moradas y 43 flores blancas. En este ej:
a) ¿A qué proporción fenotípica se aproxima la F2?
b) ¿Cuál es el tipo de interacción involucrada?
c) ¿Cuáles serían los genotipos probables de las cepas progenitoras?
4) En la rata, dos parejas alélicas A,a y R,r interactúan de la siguiente forma: A_R_: pelaje gris; aaR_: pelaje negro;
A_rr: pelaje amarillo; aarr: pelaje crema. Estos genotipos sólo pueden expresarse en presencia de un alelo
dominante de un tercer gen, D, mientras que su alelo recesivo d causa albinismo. Cuatro líneas albinas homocigotas
diferentes fueron cruzadas con una línea pura de color gris, y estos cruzamientos produjeron las correspondientes
F1 grises. Estas F1 produjeron las siguientes F2:
Líneas
albinas
Cantidad de individuos en las distintas F2
Gris Amarillo Negro Crema Albino
1 174 0 65 0 80
2 48 0 0 0 16
3 104 33 0 0 44
4 292 87 88 32 171
Problemas adicionales
1) En algunas especies vegetales existe variación intraespecífica para la posición (alta o baja) de las anteras; dicha
condición se denomina heterostilia y suele estar determinada genéticamente. En Aminckia spectabilis, una especie
con heterostilia, se efectuaron las siguientes polinizaciones entre plantas con anteras bajas (individuos 1 y 2) y
altas (individuos 3 y 4):
Representando el alelo dominante del gen para la heterostilia por H y
el recesivo por h:
a) Determine los genotipos de las plantas 1, 2, 3 y 4.
b) Indique qué proporción de plantas con anteras altas y bajas se esperarían
en los siguientes cruzamientos: i) 3 X 4; ii) 3 X 2; ii) 4 X 4
2) El gen yellow (y) para el color amarillo del cuerpo de Drosophila es recesivo y ligado al sexo. Si el alelo dominante
y+ determina el color común del cuerpo, qué proporciones fenotípicas se esperan de las cruzas: a) macho
amarillo x hembra amarilla; b) hembra amarilla x macho común; c) hembra común (homocigota) x macho amarillo;
d) hembra común (portadora) x macho amarillo?
3) Las gallinas llamadas "rastreras" presentan patas y alas recortadas y deformes, que dan al ave una apariencia
peculiar debido a una condición genética heterocigótica. Los apareamientos entre "rastreras" produjeron 775 rastreras
y 388 normales.
a) ¿Es aceptable la hipótesis de una proporción 3:1?
b) ¿Se aproximan mejor los datos a una proporción 2:1?
c) ¿Qué fenotipo se produciría con el gen "rastrero" en estado homocigótico?
4) Las gallinas Black Langshan tienen patas con plumas, mientras que las patas de las Buff Rock no son emplumadas.
De su cruzamiento se obtiene una F2 integrada por 15 individuos con patas emplumadas y sólo 1 sin plumas
en las patas. Diagrame los cruzamientos y explique los resultados.
3. DIVISIÓN CELULAR
Bibliografía:
Alberts y col. Cap. 17. Secciones: La estrategia general del ciclo celular,
Cap. 20 Células germinales y fertilización: Beneficios del sexo, Meiosis
Griffiths y col Cap.3: Mitosis y meiosis,
Comportamiento paralelo de genes
autosómicos y cromosomas, Genética
mendeliana y ciclo de vida.
finales.
a) ¿Cuál es el genotipo de cada línea albina?
b) ¿Qué tipo de interacción, si la hay, está implicada
en estos cruzamientos?
Parentales Progenie
bajas (1) X bajas (2) 37 bajas
altas (3) X altas (3) 28 altas
altas (3) X bajas (1) 29 altas
altas (4) X bajas (2) 19 bajas; 16 altas.
1) Enumere al menos 4 diferencias
entre: a) mitosis y meiosis I b) mitosis
y meiosis II c) meiosis I y meiosis II
Considere las diferencias tanto en el mecanismo como en los productos

2) El gráfico representa la variación del contenido de ADN durante el ciclo vital de una célula:
¿Qué ocurre en el intervalo de tiempo de 2 a 3?
¿Cómo se denomina la fase que transcurre entre 3 y 4?
¿Este gráfico corresponde a un ciclo mitótico o a uno meiótico? ¿Si la cantidad de ADN no se ha modificado al
final del ciclo, ¿qué utilidad tiene este proceso?
3) Si “C” es la cantidad de ADN contenida en un gameto, ¿cuál será la cantidad de ADN (C, 2C, 4C), cromosomas
y cromátidas en los siguientes períodos del ciclo celular en la especie humana? Marque con H ó D si la célula es
haploide o diploide.
valor “C” Nºcromosomas Nº cromátidas H/D
1 premitótica
G2 premitótica
Profase mitótica
Metafase mitótica
Telofase mitótica (en c/núcleo)
Espermatozoide
Profase meiótica I leptoteno
Metafase meiótica I
Anafase meiótica I
Metafase meiótica II
Telofase meiótica II (cada polo)
Interfase premeiótica (antes S)
Interfase premeiótica (después S)
4) Una especie animal tiene 2n cromosomas:¿Qué proporción de las gametas formadas tendrán los centrómeros: i)
de origen paterno únicamente; ii) de origen materno únicamente; iii) de origen materno y paterno simultáneamente?
5) Una cigota posee un 2n = 8; en el primer par de cromosomas homólogos uno de los miembros presenta un abultamiento
("knob") intersticial; en el segundo par uno de los miembros posee un satélite en posición terminal, en el
tercero uno de los cromosomas presenta un segmento heterocromático terminal y el cuarto par es acrocéntrico.
Realice un esquema de las siguientes etapas de la mitosis y meiosis.
a) metafase mitótica; b) metafase de meiosis I; c) metafase de meiosis II; d) anafase de mitosis; e) anafase de
meiosis I (dibuje los ordenamientos posibles en anafase I e indique qué probabilidad tiene cada uno de producirse);
f) anafase de meiosis II
6) Otra cigota posee un complemento de dos pares de cromosomas homólogos A y a, B y b:
a) ¿cuáles de los siguientes complementos cabría esperar en las células somáticas durante el crecimiento: AaBB,
AABb, AABB o aabb?
b) ¿Podría encontrarse más de una combinación? Cuando este individuo llegue a adulto:
c) ¿cuáles de las siguientes combinaciones de cromosomas cabría esperar en las gametas?:
i) Aa, AA, aa, Bb, BB, bb; ii) Aa, Bb; iii) A, a, B, b; iv) AB, Ab, aB, ab; v) Aa, Ab, aB, Bb.
7) Dibuje la configuración de los bivalentes en Paquitene, Diplotene, Diacinesis y Metafase I de una especie con
2n= 4. Considere que uno de los pares es metacéntrico y muestra regularmente durante toda la meiosis un quiasma
intersticial a cada lado del centrómero y el otro par es acrocéntrico con un único quiasma intersticial en el brazo
largo. Use lápices de colores para diferenciar a los dos homólogos.
8) Los conceptos de división reduccional y división ecuacional se refieren a: ¿fenómenos citológicos o genéticos?
¿Hay paralelismo entre dichos aspectos (citológico y genético)?
Si se tiene un par de cromosomas homólogos acrocéntricos donde se ubican
los alelos A/a, como indica la figura.
I
A
A
II
c) ¿En qué estadio efectúa reducción el segmento que contiene el gen A si
ocurre entrecruzamiento en la región I (entre el centómero y el gen)?
a
d) Realice el mismo razonamiento si el entrecruzamiento ocurre en la re-
a
gión II (entre el gen y el telómero).
I II
6

4 y 5. MAPEO CROMOSÓMICO
Bibliografía: Griffiths o cualquier otro libro de genética.
Guía Teórica:
1) ¿Cómo y cuándo se encontró el fenómeno de ligamiento entre genes? ¿Por qué contradice las leyes de Mendel?
R: A principios del siglo XX se encontraron genes que no respondían a la segunda ley de Mendel. En ese momento
no se conocía la base física (teoría cromosómica de la herencia) pero el descubrimiento del ligamiento ayudó
mucho a postular esta hipótesis, luego comprobada. Actualmente se sabe que, en los organismos diploides, hay 2
copias homólogas de cada cromosoma que pueden llevar alelos distintos del mismo gen. Estas copias segregan en
igual proporción que las gametas, de acuerdo a la primera ley de Mendel. Si consideramos 2 genes ubicados en
cromosomas diferentes, éstos segregarán al azar, obteniéndose proporciones similares de gametas parentales y
recombinantes (primera ley de Mendel). Si, en cambio, los 2 genes se ubican en el mismo cromosoma, no segregan
en forma independiente sino que tenderán a segregar juntos. Se dice, entonces, que estos genes se encuentran ligados.
En este caso las gametas serán únicamente parentales, no formándose recombinantes. Es como si los dos genes
fueran en realidad uno sólo. Sin embargo, durante la primera fase de la meiosis, se producen entrecruzamientos
entre cromosomas homólogos que resultan en un intercambio físico como lo demostraron Creighton y Mc Clintock
en 1931 utilizando marcadores citológicos combinados con marcadores genéticos. Estos entrecruzamientos se visualizan
como quiasmas a nivel citológico. Si imaginamos una distribución aleatoria de los entrecruzamientos a lo
largo del cromosoma, la probabilidad de que ocurra un entrecruzamiento es aproximadamente proporcional a la
distancia que separa a los genes en el cromosoma: cuanto más separados se encuentren, más probable es que ocurra
un entrecruzamiento entre ellos. En consecuencia, determinando la frecuencia de recombinantes, podemos obtener
una medida de la distancia entre los genes ligados. Esta es la base para la construcción de mapas genéticos.
El mapeo genético se realiza mediante análisis de cruzamientos planificados, pruebas de progenie y análisis de
pedigrí. Es decir, mediante el análisis comparativo de fenotipos recombinantes. El mapeo físico se realiza mediante
el análisis de clones genómicos (mediante mapeo de contigs de los cuales se conocen, por ejemplo, sus mapas de
restricción), combinado con secuenciación nucleotídica, por hibridación in situ, u otros métodos que no involucran
cruzamientos y análisis de recombinantes. En este caso, las distancias se calculan en nucleótidos o mediante
medición de cromosomas.
2) ¿Cuándo se dice que 2 genes están en acoplamiento o en repulsión? R: Alelos mutantes ubicados en el mismo
cromosoma o separados en los 2 cromosomas homólogos. Acoplamiento: AB/ab; Repulsión: Ab/aB
3) ¿Qué relación existe entre ligamiento y mapeo? R: Establecer el ligamiento y calcular la distancia permite en
base a las distancias relativas de muchos genes establecer un mapa genético.
4) ¿Cuál es la base física del mapeo genético? ¿Qué relación tienen los estudios de mapeo genético con los entrecruzamientos
y quiasmas que se observan en las meiosis? ¿Qué similitutes, relaciones y diferencias existen entre el
mapeo genético y el mapeo físico o genómico? R: Los genes son segmentos de ADN pertenecientes a una larga
molécula que constituye un cromosoma. Los recombinantes para genes pertenecientes al mismo cromosoma surgen
porque en la meiosis hay entrecruzamientos (que se pueden visualizar microscópicamente en la forma de
quiasmas) entre cromosomas homólogos.
El mapeo genético se realiza mediante análisis de cruzamientos planificados, pruebas de progenie y análisis de
pedigrí. Es decir, mediante el análisis comparativo de fenotipos recombinantes. El mapeo físico se realiza mediante
el análisis de clones genómicos con mapeo de contigs (de los cuales se conocen, por ejemplo, sus mapas de restricción),
combinado con secuenciación nucleotídica, por hibridación in situ, u otros métodos que no involucran cruzamientos
y análisis de recombinantes.
Las distancias se calculan en nucleótidos o mediante medición de cromosomas.
El orden físico de los genes en el cromosoma coincide con el orden que surge de su mapeo genético. Existe, además,
una correspondencia proporcional relativa entre distancia genética y distancia calculada en nucleótidos, aunque
la correspondencia no es absoluta y varía en distintas partes del cromosoma. Es decir, una unidad de mapa
significa un número distinto de nucleótidos cerca del centrómero que cerca del telómero, porque las frecuencias de
entrecruzamiento (formación de quiasmas) son distintas. La vecindad de regiones heterocromáticas también afecta
la frecuencia de aparición de quiasmas y la relación absoluta entre distancia genética/distancia física.
5) ¿Qué es y cómo se hace una prueba de 2 puntos? ¿Qué significa la palabra punto en prueba de 2 puntos? ¿Implica
ligamiento? R: Se estudia el ligamiento en cruzamientos de dobles heterocigotas por dobles recesivos (Ver
libro para una explicación más completa)
6) ¿Qué es una unidad de mapa? ¿Es sinónimo de centiMorgan, frecuencia de recombinación o de unidad de recombinación?
¿A cuántos nucleótidos equivale una unidad de mapa? R: Se define como unidad de mapa a la distancia
entre genes (o marcadores) para los cuales se observa un recombinante con una probabilidad de uno en 100
productos de la meiosis. Una unidad de mapa sería, entonces, equivalente a una frecuencia de recombinación del
1%. Es decir, que se calcula mediante la fórmula del % de recombinantes sobre totales y es sinónimo de unidad de
recombinación. Los cM tienen otra fórmula de cálculo que toma en cuenta la posible existencia de dobles entrecruzamientos
y la interferencia. No siempre coinciden. Como se mencionó, la unidad de mapa genético varía (en número
de nucleótidos) según la especie, el cromosoma y localización dentro del mismo cromosoma. Groseramente,
1 cM equivale a 1 megabase (un millón de pares de bases) en humanos.
7) ¿Pueden 2 genes estar ligados a más de 50 u.m.? Por ejemplo, ¿pueden estar a una distancia de 200 u.m.? ¿Qué
es un grupo de ligamiento y a qué se corresponde físicamente?
7

8
R: Primero, hay que ver de dónde sale este límite de 50 u.m. Al momento de la meiosis, cada cromosoma del par
de homólogos se halla conformado por 2 cromátides. Es decir, al momento del apareamiento en el que se produce
el entrecruzamiento tenemos 4 cadenas de ADN vecinas. Sin embargo, sólo 2 de las 4 hebras participa en el entrecruzamiento,
por lo que, como resultado, sólo la mitad de las gametas podrán ser recombinantes. O sea que entre 2
genes ubicados en el mismo cromosoma que están lo suficientemente lejos como para que siempre exista un entrecruzamiento
entre ellos, la máxima proporción de recombinantes será del 50%.
Por lo tanto, 2 genes pueden estar ligados a más de 50 u.m., pero no lo puedo determinar mediante una simple
prueba de 2 puntos entre ambos genes analizados, porque la máxima distancia determinable por este método es de
50 u.m. Necesito un gen “puente” (o varios) para poder integrar a los dos genes en el mismo grupo de ligamiento.
Por lo tanto, un grupo de ligamiento está formado por el conjunto de genes (o marcadores genéticos) que se comportan
como ligados entre sí en forma directa o a través de otros genes “puente”. El grupo de ligamiento se corresponde
a todos los genes o marcadores genéticos localizados en el mismo cromosoma o molécula de ADN. Se llama
desequilibrio de ligamiento al fenómeno que se da entre dos alelos de dos genes distintos que se heredan juntos
con una probabilidad mayor que la dada por el azar. Esto se debe en general a que los genes están ligados.
8) ¿Qué es una prueba de 3 puntos? En una prueba de 2 puntos ¿se puede establecer un orden de los genes? ¿y en
una de 3? ¿hasta qué punto? R: Cuando se estudia el ligamiento simultáneo entre 3 genes (por ej. A, B y C), se
puede establecer un orden ya que (suponiendo que el orden sea ABC), la distancia (prueba de 2 puntos) entre A y
C es aproximadamente igual a la suma de la distancia entre A-B + B-C. En una prueba de 2 ptos. no se puede establecer
un orden, sólo distancias relativas. En la de 3 sí, pero no se sabe si los 2 puntos extremos (A y C) están “a la
derecha” o “a la izquierda”.
9) ¿Porqué no hacer 2 o 3 pruebas de 2 puntos? ¿Dan distintos resultados? ¿Por qué? ¿Qué es interferencia y cómo
se calcula el coeficiente de coincidencia? R: Pueden dar resultados distintos por el fenómeno de subestimación de
dobles entrecruzamientos y/o de interferencia. En el ejemplo de arriba, la distancia entre A y C (medida como
prueba de dos puntos) suele ser menor a la de A-B + B-C. Esto se debe a la presencia de de entrecruzamientos
dobles entre A y C cuyo resultado final es la formación de gametas parentales AC y ac para estos 2 genes que se
computan como No recombinantes, cuando en realidad lo son. Si nosotros no hubiéramos mapeado el gen B nunca
hubiéramos detectado estos dobles entrecruzamientos (ni triples, ni cuádruples). Si extendemos este pensamiento,
en realidad tampoco sabemos si entre A y B hubo entrecruzamientos dobles y si también estamos subestimando la
proporción de recombinantes entre ellos. Cuanto más grande la distancia entre 2 marcadores, más inexacta será la
frecuencia de recombinantes como medida de la distancia entre los genes. Además, está el fenómeno de interferencia
que se relaciona con un impedimento estérico o físico que reduce la probabilidad de que se produzcan quiasmas
muy cercanos entre sí (se “interfieren”) por lo que el número de recombinantes entre genes muy cercanos entre sí
es menor al probabilísticamente esperado. Algunas funciones de mapeo más refinadas, toman en cuenta este fenómeno.
Estas funciones se derivan de la función de Poisson y son, fundamentalmente, dos: la de Haldane (que considera
los dobles entrecruzamientos pero no considera la interferencia) y la de Kosambi (que considera ambas). Por
lo general, todos los mapas que se publican se basan en la función de Kosambi.
10) ¿Por qué, en una prueba de 3 puntos, realizar un cruzamiento prueba facilita el análisis? R: Porque el cruzamiento
con el homocigota recesivo permite concentrarse directamente en las gametas de la F1 permitiendo distinguir
las gametas que portan alelos recesivos de dominantes mediante una sencilla relación de 1 a 1. Esto es particularmente
útil para genes en los que no se puede distinguir el fenotipo heterocigota del homocigota dominante. Toda
la progenie segregante será homocigota recesiva o heterocigota (no habrán homocigotas dominantes)
11) ¿Es sencillo aplicar los sistemas arriba mencionados para mapeo en humanos? ¿Por qué? ¿Es posible utilizar
información de pedigrí para hacer estudios de ligamiento? ¿Existen otros métodos alternativos de mapeo? ¿En qué
consiste el método de mapeo con híbridos somáticos (fusión interespecífica de células)? ¿En qué consiste la hibridación
in situ? R: No se pueden “planificar” cruzamientos en humanos, obtener líneas puras (depresión por endocría)
y las progenies son poco numerosas (estadísticamente problemáticas). El mapeo preciso y fino se realiza
mediante técnicas físicas como la utilización de híbridos somáticos (libro). Lo que se utiliza es la información de
pedigrí con funciones de mapeo basadas en Lod score. El índice Lod score es la medida estadística del ligamiento.
Cuando las familias son numerosas y se encuentran individuos recombinantes en ellas, el análisis es simple. Pero
esto no siempre es así. Las familias con enfermedades interesantes no suelen ser numerosas, y no sirven para realizar
un análisis estadísticamente significativo. Por lo tanto, se deben tomar los datos de varias familias. El lod score,
Z, es el logaritmo de la probabilidad de que dos loci estén ligados respecto de que no lo estén. La probabilidad
general de ligamiento en un grupo de familias, es el producto de las probabilidades de cada familia individual, por
lo que los lods scores al ser logaritmos permiten que se sumen los datos para esas familias.
12) ¿Qué significa índice Lod o Lod score? ¿En qué casos se utiliza?¿Por qué en los últimos años prácticamente
todos los estudios de mapeo genético en todas las especies se realizan con marcadores moleculares?
R: Probabilidad de ligamiento (ver Griffitts). El Lod es el logaritmo en base 10 del cociente entre:
Probabilidad de obtener los datos observados si los loci estuvieran ligados/ Probabilidad de obtener los datos observados
si no estuviesen ligados. Por ej. un Lod = 3 para un par de genes indica que es mil veces más probable
que los genes estén ligados respecto a que no lo estén. Programas como el MapMaker también utiliza Lod Scores
para comparar diferentes órdenes posibles entre varios genes. Al orden más probable le asigna un 0 y a los restantes
le asigna valores negativos.
Porque permiten una cobertura del genoma que no permiten los caracteres morfológicos.
13) ¿Qué similitudes y diferencias existen entre los cálculos de distancias usando las fórmulas vistas arriba y los
algoritmos de programas como el Mapmaker?

9
R: Las fórmulas son un distintas porque los algoritmos del Mapmaker están basados en Lod score (cálculo de probabilidades).
Estos cálculos probabilísticos están basados, sin embargo, en el mismo concepto y la misma lógica
que existe atrás de las funciones de mapeo en pruebas de dos o tres puntos. Sin embargo, son más poderosas, porque
al tratarse de una prueba de “muchos” puntos simultáneamente, permite afinar mucho más el cálculo minimizando
errores debidos a dobles entrecruzamientos e interferencias.
Problemas:
MAPEO CROMOSÓMICO I
1) En el gusano de seda Bombix mori, el gen recesivo l produce color amarillo limón en la larva, mientras que
el d o m i n a n t e L da color blanco. El g e n dominante B, produce bandas negras transversales, mientras que
el recesivo b no las produce. Ambos loci están ligados y su distancia genética es de 30 unidades de
recombinación. Se cruzó una hembra homocigota blanca y con bandas negras con un macho amarillo sin bandas
negras. Los machos de la F1 se utilizaron para fecundar hembras amarillas y sin bandas negras. ¿Qué
segregación fenotípica y genotípica se obtuvo?
2) Los alelos recesivos bw en homocigosis producen ojos marrones en Drosophila, en contraste con el color salvaje
rojo dominante. El análisis del polimorfismo para el largo de fragmentos de restricción (RFLP) para una región
particular de ADN revela dos tipos de fragmentos (I y II). Moscas de ojos marrones con ADN tipo I fueron cruzadas
con moscas salvajes con ADN tipo II. Las moscas de la F1 tienen ojos rojos y exhiben tanto el patrón I como el
II. Se realiza un cruzamiento prueba y la progenie registrada para el color de ojos y el tipo de fragmento fue como
sigue:
Fenotipo frecuencia absoluta
ojos rojos, tipo I + II 184
ojos rojos, tipo I 21
ojos marrones, tipo I 168
a) Indique si ambos genes están ligados.
b) En el caso de que estén ligados indique la distancia genética
entre ambos marcadores.
ojos marrones, tipo I + II 27
total progenie
400
3) a) En Drosophila y para caracteres autosómicos, cuando se quiere realizar un cruce de prueba se utilizan
hembras heterocigotas y machos homocigotas recesivos ¿Por qué no se hace el cruzamiento recíproco? b) En esta
especie se encuentra un gen letal a que produce, en homocigosis, la muerte de la larva, y está ligado con un
40% de entrecruzamiento al locus B/b. El alelo B produce un abdomen deforme y el b un abdomen normal. Indique
la segregación fenotípica y genotípica observable en los adultos de la progenie de un cruzamiento entre un
macho heterocigota en fase de acoplamiento y una hembra heterocigota en fase de repulsión.
4) Una mosca de la fruta con genotipo BR/br es retrocruzada con una de genotipo br/br. En el 84% de las meiosis
no ocurren quiasmas entre los pares de genes ligados; en el 16% ocurre un solo quiasma entre ellos (recuerde que
quiasma y frecuencia de recombinación no son sinónimos). ¿Qué porcentaje de la progenie será Bbrr? a) 50%;
b) 4%; c) 84%; d) 25%; e) 16%. Explique.
5) En la descendencia de un cruzamiento prueba de un triheterocigota se obtuvieron los siguientes resultados:
Fenotipos Frec. obs Fenotipos Frec. obs Se desea saber:
ABD
ABd
AbD
50
32
538
aBd
abD
abd
600
28
62
a) la fase del genotipo parental;
b) el locus central;
c) las distancias genéticas;
d) el valor de la interferencia.
6) En la Tierra Media, es famoso el semielfo Elrond, señor de Rivendel. Su padre era elfo y su madre, una humana.
Los elfos tienen sus orejas puntiagudas (P), ausencia de glándulas adrenales (A) y el corazón del lado derecho
(R). Todos estos alelos son dominantes sobre los alelos humanos. Estos genes son autosómicos y están ligados,
tal como se muestra en el mapa de ligamiento:
P/p A/a R/r
_l___________l____________l__
l__15 um____l___20 um____l
Si Elrond se casa con una humana y no existe interferencia (génica), ¿Qué proporción de sus hijos mostrarán:
a) Apariencia élfica para los tres caracteres?
b) Apariencia humana para los tres caracteres?
c) Orejas y corazón élficos, pero adrenales humanas?
d) Orejas élficas pero corazón y adrenales humanas?
7) En una cierta planta diploide, los loci A, B y D se encuentran ligados de la siguiente manera:

20 um 30 um
A B D
Ud. dispone de una planta (llámela parental) con la siguiente constitución genética: Abd / aBD
a) Asumiendo que no hay interferencia, se desea saber si ocurre autofecundación, ¿qué proporción de la progenie
tendrá el genotipo abd/abd ?
b) Asumiendo que no hay interferencia, si la planta parental es cruzada con una cuyo genotipo es abd/abd ¿cuáles
serán las clases genotípicas encontradas en la progenie? ¿Cuáles serán sus frecuencias en una progenie de 1000
individuos?
8) Un genetista quiere mapear los genes A, B, J, D y E mediante dos cruzamientos de tres puntos. E n a mb
o s u t i l i z a l í n e a s p a r e n t a l e s p u r a s y l u e g o cruza los individuos de la F1 con individuos homocigotas
recesivos. El fenotipo de la progenie se indica en las siguientes tablas.
Por trabajos previos el investigador sabe que los genes D y E tienen segregación independiente entre sí.
a) Determine el genotipo de las líneas parentales utilizadas en ambos cruzamientos.
cruzamiento 1 cruzamiento 2
ABJDE 316 ABJdE 31 ABJDE 243 ABjDe 62
AbJdE 130 AbJDE 17 ABJDe 155 aBJDe 46
abJdE 314 abJDE 39 aBjDe 237 aBJDE 58
aBJDE 140 aBJdE 13 aBjDE 165 ABjDE 34
10
b) Elabore el mapa
correspondiente a estos
5 genes y determine, si
es posible, la distancia
entre ellos.
c) ¿Existe interferencia?
Fenotipo Padres 1 2 3 4 5 6 7 8 9
MAPEO CROMOSÓMICO II
Sonda R S P P R R P R R P R
9) El gen de resistencia al virus del mosaico del tabaco se ha PTG9 --- --- --- --- --- --- --- --- --tratado
de mapear en tomate respecto a marcadores molecu-
--- --- ---
--- --lares
que detectan RFLP. Se supone que existe un alelo que PCD3 --- --- --- --- --confiere
resistencia, dando un fenotipo totalmente resistente --- --- --- --- --- --- --- --- --- --en
homocigosis, y un fenotipo parcialmente resistente en PXY --- --- --- --- --- --heterocigosis.
Existe una variedad de Lycopersicum peruvia-
--- --- --- --- --- --- --num
(especie emparentada al tomate) totalmente resistente al Fenotipo 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
virus pero con otras características agronómicas indeseables; Sonda R P P R S R S R S P R
y otra que es totalmente susceptible al virus pero potencial-
PTG9 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --mente
atractiva agronómicamente. Al cruzar individuos de
--- --- --- --- --- --ambas
variedades se obtuvieron plantas híbridas F1, parcial-
PCD3 --- --- --- --- --- --mente
resistentes. Se presentan los resultados de RFLP, para
--- --- --- --- --- --- --- --tres
marcadores moleculares diferentes (PTG9; PCD3; PXY),
PXY --- --- --- --- --- --- --- --- --de
los individuos parentales y de 20 individuos originados
--- --- --- --- --- --- --por
autofecundación de la F1 (F2), acompañados de los resultados
fenotípicos observados en los ensayos biológicos con el virus: R (totalmente resistente), P (parcialmente
resistente) y S.
a) Calcular el porcentaje de cosegregación del gen de resistencia respecto de cada gen marcador e indicar cuál de
estas 3 sondas (pTG9, pCD3, pXY) utilizaría Ud. como marcador RFLP para seguir la herencia del gen de resistencia
al virus en un proceso de mejoramiento a través de cruzamientos controlados.
b) ¿Qué ventajas tendría usar el marcador elegido para testar resistencia al virus, en lugar de hacer el ensayo biológico
correspondiente?
c) ¿Cuántas generaciones de retrocruza (contra la variedad susceptible) llevaría, en promedio, tener una variedad
resistente al virus pero con un 99% del genoma de la variedad agronómicamente interesante?
d) ¿Qué individuos F2 elegiría para la primera retrocruza, para tratar de acortar el nº de generaciones calculado en
c)?
10) Para ciertas enfermedades no se cuenta aún con una sonda del gen implicado, sin embargo
es posible hacer el diagnóstico por un método indirecto. Siendo requisito contar con
marcadores polimórficos ligados a la enfermedad. Indique el riesgo genético (probabilidad
de estar afectado) para los individuos en gestación (diagnóstico prenatal) en el siguiente
pedigrí, en el que se indican los fenotipos para el Síndrome de Marfan, enfermedad
autosómica dominante, (símbolos sombreados) y un marcador situado a 10 cM del
locus de la enfermedad (A1, A2).
11) Se lleva a cabo el análisis de ADN en una familia numerosa en la que algunos miembros están afectados por
una enfermedad rara autosómica dominante de manifestación tardía (hacia los 40 años). Se extrae el ADN genómico
de todos los miembros de la familia, se digiere con HaeIII y los fragmentos obtenidos se separan por tamaño en

11
un gel de agarosa. Mediante la técnica de Southern se transfieren dichos fragmentos a una menbrana de nylon, se
hibrida con una sonda radiactiva (procedente de un fragmento de ADN humano de secuencia única clonado de un
vector bacteriano) y se obtienen los resultados indicados en la autorradiografía (ver al lado del pedigrí).
I1 I2 II1 II2 II3 II4 II5 II6 II7 II8 II9 II10 II11
4 kpb
3 kpb
1 kpb
Explique la variación obtenida con la sonda dibujando la
región cromosómica correspondiente.
a) ¿Cómo se explica el tercer hijo?
b) ¿Con qué probabilidad aparecerá un individuo enfermo
con el patrón de restricción de la madre sana?
c) ¿Tendrían alguna utilidad estos resultados para aconsejar a las personas de esta familia?
12) Antes que aparecieran los microsatélites, los RFLP se utilizaron, en el pasado, como marcadores genéticos para
la identificación de parentesco. En ciertos casos, p.ej. verificación del vínculo abuelo-nieto en ausencia de los padres,
este tipo de pruebas constituyen la única evidencia válida de que se dispone. El siguiente problema representa
una simplificación de su aplicación a este tipo de cuestiones, que tomaron importancia en la restitución de hijos de
personas desaparecidas por la última dictadura (1976-1983) a
sus legítimas familias. Existen seis niños de los cuales se
sabe con seguridad que sólo tres pertenecen a dos familias
que no guardan ninguna relación entre sí (son de distintas
ciudades). De ambas familias sólo viven los abuelos probables.
Utilizando una sonda para un gen con un alto polimorfismo
para una enzima de restricción (existen 4 alelos en la
población) se revelan los Southern blots de ADN genómico
de los seis niños y de los posibles abuelos, los que se muestran
en el siguiente gráfico:
a) Definir los haplotipos para cada individuo analizado.
b) ¿Cuáles niños pertenecen, con alta probabilidad, a cada
familia?
c) ¿Para cuáles esta experiencia no es suficiente para decidir
a qué familia pertenecen?
d) ¿Cuáles, con seguridad, no pertenecen a ninguna de las
dos?
e) ¿Cree que el hecho de no considerar la existencia de eventos
de recombinación (entre cromosomas homólogos) dentro
del gen marcador en las meiosis de abuelos y padres puede
llevar a conclusiones erróneas?
13) Una pareja afligida llega a Ud. para que le de asesoramiento genético. Su segundo hijo falleció poco después
de nacer debido a una enfermedad genética y la madre esta
nuevamente embarazada. El hijo fallecido ha sido el segundo
en la familia afectado por la enfermedad (el primer
afectado ha sido un hermano de su abuela paterna). Ud.
dispone, a través de estrategias de clonado, de una sonda
de la región cromosomal donde se ubica el gen involucrado
en esta enfermedad autosómica recesiva. Usando esa
sonda, pudo construir un mapa de restricción de dicha
región, y además, obtuvo datos que muestran que, en la
población, existe polimorfismo para sitios reconocidos por
una enzima de restricción E (indicado como +/- en la figura).
Mapa de restriccion del gen que hibrida con la sonda:
Ud. aisló DNA de linfocitos de los abuelos y de los miembros
vivos de la familia y ha obtenido los correspondientes fragmentos de restricción visualizados en el esquema
del Southern. Ud. está ahora en condiciones de hacer un diagnóstico prenatal a partir de células fetales. ¿Qué patrón
de restricción indicaría que el feto heredó la enfermedad (dibújelo)?

14) El mosquito transmisor del dengue (Aedes aegypti) es una plaga endémica de climas tropicales, aunque desde
hace pocos años está extendiendo su distribución hacia Buenos Aires. Se encontró una variante de mosquito que no
transmite el temible virus. El carácter se comportó como dominante mostrando un patrón de herencia mendeliana
simple. Con el objeto de introducir este carácter en la población, comenzaron a realizarse cruzamientos. Como el
carácter es muy difícil de evaluar porque requiere (para su análisis) que el mosquito
hembra pique huéspedes infectados con el virus, se analizaron en cada generación
los patrones de 50 microsatélites con el fin de determinar ligamiento entre alguno de
ellos y el carácter de resistencia. Sólo uno de los marcadores (m25) mostró ligamiento
a este carácter a una distancia de 5 cM. Los patrones microsatélites observados
cuando se utilizó este marcador en los genotipos homocigotas no-transmisor
(NT) y transmisor (T), respectivamente, fueron los que se ven en la figura (ver arri-
ba). Si se cruzan las dos variantes de mosquitos (no-transmisores x transmisores: generación F0) se obtienen individuos
heterocigotas con fenotipo no transmisor (F1).
a) ¿Qué patrones de microsatélites y fenotipos de transmisión y no-transmisión presentarán los descendientes de
una F1 cruzada por la línea parental transmisora?
b) ¿en qué proporciones?
c) Como se explicó más arriba, para la determinación de los fenotipos sólo se pueden utilizar las hembras. ¿Cómo
haría si quiere evaluar a los machos de la retrocruza? ¿Qué cruzamientos haría y qué resultados esperaría?
15) Se desea hallar un marcador molecular asociado al locus que determina resistencia al barrenador del tallo en
maíz (Diatraea saccharalis) para utilizarlo en selección indirecta. Por esta razón se analizó el patrón de bandas
generado por 5 RAPD utilizando una población de 23 líneas recombinantes endocriados provenientes de un cruzamiento
entre un padre resistente por otro sensible al ataque del insecto.
RESISTENTES SENSIBLES
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
A – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – –
B – – – – – – – – – – – –
C – – – – – – – – – – – –
D – – – – – – – – – – –
E – – – – – – – – – – –
16) Se realizó el análisis de ADN de una familia numerosa en la cual ocurrieron casos de una enfermedad autosómica
dominante letal de manifestación tardía (alrededor de los 40 años). El método aplicado fue el del análisis de
segregación de RFLP utilizando la sonda denominada T4. A continuación se muestra un esquema del autorradiograma
de los individuos analiza dos alineado con la genealogía correspondiente. Los individuos afectados se representan
con símbolo lleno.
a) Proponga los genotipos más probables para el síndrome
y el marcador molecular para cada individuo de la genealogía
b) De acuerdo con estos resultados, ¿se podría suponer
ligamiento entre el marcador molecular y la enfermedad?
Justifique su respuesta.
c) Si un investigador demuestra que el “lod score” entre
estos dos caracteres (bandas y enfermedad) es mayor que
3, ¿cómo explicaría la ocurrencia de un enfermo que presentara
sólo la banda de 5kb?
d) Si otro integrante de la familia de 20 años de edad quisiera saber el riesgo de tener la enfermedad ¿qué estudio
le haría y cómo interpretaría los resultados?
sonda T4 y los productos A, B y C.
e) Cuando se analizaron líneas celulares híbridas hombreratón
se obtuvieron los siguientes resultados para la sonda
T4 y tres productos metabólicos A, B y C.
Indique en los casos en que sea posible la ubicación cromosómica
de la secuencia homóloga a la sonda T4 y los productos
A, B y C.
6.- MUTACIONES
Pares de
bases
258 pb
236 pb
Guia de estudio
1) ¿Qué son: - mutación inducida,- mutación espontánea, - clastógeno, - mutación somática, - mutación germinal, -
mutación letal, - mutación condicional, - mutación polar, - reversión?.
3) Describa un proceso selectivo para aislar microorganismos revertantes de auxótrofos. ¿Cómo se puede demostrar
que esas mutaciones revertantes son previas al momento del contacto con el agente selectivo?
4) Defina los siguientes conceptos y dé ejemplos: - transición (los 4 casos posibles) - transversión (los 8 casos posibles)
- mutación silenciosa - mutación neutra - mutación por corrimiento del marco del lectura (o "frame-shift") -
12
T NT
a) ¿Qué marcadores son polimórficos? b) ¿Qué marcadores
están ligados al locus y cuáles no?
c) Calcule la distancia genética.
d) Indique el/los marcadores para los que, con estos datos,
no puede afirmar que están ligados (o no).
Lín Crom. humanos. presentes
cel 2 3 4 5 6 7 8 9
A T4 B C
23 + + + + - - - ? - + - +
34 + + - - + + - ? + - - +
41 + - + - + - + ? + + - +

13
mutación por sustitución "missense" - mutación por sustitución "nonsense" - mutación supresora intragénica - mutación
supresora extragénica
5) Diferencie los siguientes mecanismos de mutación espontánea: - errores en la replicación del ADN. - lesiones
espontáneas
6) Con relación a los errores en la replicación del ADN, ¿con qué base se aparean por puentes de hidrógeno los
siguientes nucleótidos: - la forma imino de C? - la forma enol de T? - la forma imino de A? - la forma enol de G?
7) Indique dos tipos de lesiones espontáneas que, de no ser reparadas, pueden generar mutaciones.
8) Explique la causa por la cual las posiciones de 5-metilcitosina constituyen "hotspots" para transiciones C T G A.
¿Cuál es la función de la uracil-DNA glicosidasa? ¿Cuán específica es la uracil-DNA glicosidasa?
¿Por qué no sería ventajoso para una célula tener uracilo como constituyente normal en su DNA? ¿Qué significado
evolutivo tiene el hecho de que en eucariotas las zonas no codificantes tienen una mayor cantidad de A-T que las
codificantes?
9) Describa un proceso selectivo para aislar microorganismos revertantes de auxótrofos. ¿Cómo se puede demostrar
que esas mutaciones revertantes son previas al momento del contacto con el agente selectivo?
11) Además de permitir el estudio del proceso mismo de mutación, las mutaciones pueden ser útiles en algunos
casos. Dé ejemplos de esos casos.
12) ¿Por qué hay que preocuparse por el agujero de ozono? Explique.
13) ¿Qué procedimiento y sistema selectivo se le ocurren a Ud. para obtener plantas resistentes a una sustancia
tóxica?
14) Explique el modo de acción de los siguientes mutágenos y el tipo de mutación (a nivel molecular) que producen:
- los análogos de bases (ej., el 5-bromouracilo) - los modificadores de bases, como los agentes alquilantes (ej.,
etilmetanosulfato y nitrosoguanidina) - aflatoxina B1 - los agentes intercalantes (ej., proflavina, naranja de acridina,
bromuro de etidio).
15) Mencione los mecanismos biológicos de naturaleza enzimática más importantes en la reparación del ADN
dañado.
16) Explique en qué consiste el “test de Ames”. ¿Por qué se usan varias cepas mutantes de Salmonella?
17) ¿Cuáles son las diferencias entre mutaciones somáticas y germinales?
Problemas:
1) El siguiente segmento de RNAm codifica un segmento intersticial de un polipéptido (los diferentes codones aparecen
subrayados): 5' ......AAU-CUA-UUC-UCU-AUU-AAA-ACC .....3' a) indique una posible mutación en el DNA
que dé lugar a un RNA que no origine ninguna alteración en la proteína codificada.b) indique una posible mutación
en el DNA que dé lugar a un RNA que origine un cambio de un aminoácido por otro en la proteína codificada.c)
indique una posible mutación en el DNA que dé lugar a un RNA que origine un corrimiento del orden de lectura en
la proteína codificada.d) indique una posible mutación en el DNA que dé lugar a un RNA que origine la interrupción
de la síntesis de la cadena proteica. Para cada una de las respuestas utilice el código genético
2) Indica una posible mutación en el ADN que haya podido originar los mutantes 1, 2 y 3 de la secuencia normal
que se detalla a continuación
secuencia normal N------Ile-Ala-Tyr-His-Asn-Lys-Tyr------C
Mutante 1
N-----Ile-Ala-Tyr-Asn-Asn-Lys-Tyr-----C
Mutante 2
N---Ile-Ala-Tyr-Asn-Asn-Lys-Tyr---C
Mutante 3
N---Ile.Ala- COOH
3) Un hombre (H.S.), empleado durante varios años en la planta nuclear de Springfield, se convierte en padre de un
varón hemofílico (B.S.), el primer caso en el árbol genealógico de su familia como en el de su esposa (M.S.). Otro
trabajador de la misma planta, en la que ha estado durante varios años, tiene un hijo enano acondroplásico, también
el primer caso en su familia y en la de su esposa. Los dos compañeros de trabajo demandan a su empleador
(Mr. M.B.).
Como genetista, lo llaman a Ud. a declarar en el juicio. ¿Qué diría Ud. en relación a cada situación? Aclaraciones:
la hemofilia es recesiva ligada al cromosoma X. La acondroplasia es autosómica dominante.
4) El mutágeno etilmetano sulfonato (EMS), que se utiliza mucho en mejoramiento vegetal, induce transiciones G-
C / A-T. La aflatoxina B1, micotoxina que frecuentemente contamina alimentos, induce transversiones G-C / T-A.
Diga si cada mutágeno es capaz de revertir codones ámbar (UAG) y ocre (UAA) tipo salvaje.
5) Una mutante de E. coli defectuosa en el sistema de reparación SOS es resistente a la mutagénesis por luz UV.
Por otro lado, células de piel de un paciente que padece xeroderma pigmentosum (deficiencia de una de las enzimas
reparadoras por escisión) son extremadamente propensas a morir (y desarrollar tumores) por exposición al sol.
Intente explicar la aparente contradicción.
6) Ud. fue nombrado Jefe del Laboratorio de Bromatología (Ministerio de Salud y Acción Social), encargado de
otorgar permisos para la venta de nuevos productos alimenticios que se desean lanzar al mercado, luego de constatar
su inocuidad. Ud. recibe, de manos de una empresa productora de alimentos, una muestra de un nuevo edulcorante
artificial para analizar, junto con un proyecto de una impresionante campaña publicitaria planeada, y además
un inesperado cheque. Para realizar los análisis, dispone de un cepario de Salmonella con 5 auxótrofos que no pueden
sintetizar histidina, que se comportan frente a 3 mutágenos como se indica en la tabla:

14
a) ¿Qué mutantes eligiría para usar en el test de Ames con el objeto de evaluar la potencial mutagenicidad del nuevo
edulcorante?
b) Si la mezcla de las mutantes elegidas + muestra a analizar + extracto hepático produce crecimiento bacteriano
en ausencia de histidina exógena (1 colonia de cada 10.000 bacterias plaqueadas), otorgaría Ud. el permiso para la
venta libre del edulcorante?
7) Una fábrica textil que trabaja con colorantes azoicos decidió evaluar si los efluentes de la producción cumplen
con los requisitos necesarios de pre-tratamiento y depuración antes de ser descargados al río. Para el mencionado
propósito se tomó una muestra río abajo de dicho establecimiento y se utilizó el test de Allium cepa en raicillas de
semillas recién germinadas. Se determinaron 4 grupos experimentales a los cuales se le administró: metil-metano
sulfonato (control positivo: CP); agua (control negativo: CN) y dos concentraciones de la muestra (sin diluir=100% y
diluidas al 10 %).
Los resultados del análisis de la mitosis en los ápices meristemáticos se presentan a continuación:
CN CP 100% 10%
Índice Mitótico (IM) 7.45±1.03 8,92±2,39 13,89±5,91 14,94 ± 5,55
Número de Células con Micronúcleos (NM) 0 6 6 7
Número de Células con Ruptura Cromosómica (NRC) 1 3 4 8
Número de Células con Alteraciones (NTA) 1 9 10 15
Número Total de Células Analizadas (TCA) 2871 2865 2928 3212
a) Dado que el aumento o disminución del IM es buen indicador para monitorear polución ambiental analice los
valores de la tabla y explique los resultados obtenidos
b) Considera que las aguas residuales del establecimiento inducen alteraciones cromosómicas?
c) Indique si los efluentes poseen algún efecto mutagénico o citotóxico.
8)
9)
7. MUTACIONES CROMOSÓMICAS

15
Bibliografía recomendada
Griffiths y col. Capítulos: 17- Chromosome mutation I: Changes in chromosome structure; 18- Chromosome mutation II:
Changes in chromosome number
Lacadena, J.R. Genética General. Conceptos fundamentales. (1999) Editorial Síntesis S.A., Madrid. 13- Variaciones cromosómicas
estructurales 14- Variaciones cromosómicas numéricas
Guía de estudio
1) ¿Por qué las hemoglobinas humanas constituyen un ejemplo acerca del papel evolutivo de las duplicaciones?
2) Cuando se dice que las inversiones son supresoras o reductoras de la recombinación. Nos referimos:
a) ¿Al mecanismo citológico o a su consecuencia genética? b) ¿A homocigotas o a heterocigotas estructurales? c)
¿A la zona invertida o al cromosoma completo? d) ¿A las inversiones paracéntricas o a las pericéntricas?
3) Enumere las dos características que considere más importantes en las inversiones paracéntricas y en las translocaciones
recíprocas.
4) En un heterocigoto estructural para translocación recíproca, podría originarse algún gameto viable a partir de los
productos meióticos originados en una meiosis con orientación adyacente?
5) Los grupos de ligamiento se mantienen constantes en cada especie?
6) El número diploide de un organismo es 2n= 12. ¿Cuántos cromosomas tendrá: a) un monosómico. b) un disómico.c)
un tetrasómico d) un doble trisómico. e) un nulisómico.f) un haploide. g) un triploide.h) un autotetraploide.
7) ¿Cuál es la diferencia fundamental entre la aneuploidía y la euploidía?
8) Indique las diferencias entre auto y alopoliploides.
9) Debido al pequeño tamaño del cromosoma IV de Drosophila melanogaster, las moscas pueden ser monosómicas
o trisómicas para este cromosoma y continuar siendo viables.
a) Si una mosca disómica para el cromosoma 4 y homocigota para el gen recesivo eyeless de dicho cromosoma se
aparea con una mosca monosómica para este cromosoma pero normal, ¿cuál será el aspecto de la F1? b) ¿Cuáles
serían las proporciones fenotípicas que se obtendrían al cruzar los distintos fenotipos de la F1?
Problemas
1) En una sección de cromosomas salivales de Drosophila las bandas tienen una secuencia 123.45678. El homólogo
con el que este cromosoma debe aparearse tiene una secuencia: a)123.45876; b)123.445678; c)123.478;
d)14.325678; e) 1234.45678; f) 124.35678. ¿Qué clase de cambios cromosómicos han ocurrido en cada caso?
2) En el cromosoma X de D. melanogaster se observa la región 7B constituída por 12 bandas. El carácter “quetas
chamuscadas” se debe a la mutación recesiva sn situada en
el cromosoma X, efectiva en hemicigosis. Cruzando machos
de quetas chamuscadas con hembras de fenotipo
normal, pero heterocigóticas estructurales para diferentes
deleciones que abarcan varios segmentos de la zona 7B
del cromosoma X, se obtuvieron los resultados que figuran
en la tabla:
Teniendo en cuenta que todas las deleciones estudiadas
son letales en homocigosis y hemicigosis, y que las hem-
Hembra Deleción Fenotipo de las hembras de
la descendencia
1 7B1-7B8 50% con quetas chamuscadas
y 50% normales
2 7B2-7B5 Todas con quetas normales
3 7B7-7B12 Todas con quetas normales
4 7B5-7B10 50% con quetas chamuscadas
y 50% normales
bras utilizadas en los cruzamientos eran hijas de machos de fenotipo normal, deduzca cuál es la posición del locus
sn en el mapa de cromosomas politénicos.
3) En la descendencia de un cruzamiento entre una hembra normal de Drosophila y un macho white (w)-Bar (B),
Bridges observó que una hembra no había heredado el carácter Bar del padre, pero era heterocigota para el carácter
white. A esta hembra se la retrocruzó con un macho w B, y las proporciones que se obtuvieron en la descendencia
fueron dos hembras a un macho. a) ¿Cuál es la explicación más simple de estas proporciones anormales? b) ¿Cuál
es el fenotipo de la descendencia? Se cruzaron las hembras heterocigotas estructurales de la descendencia con distintos
machos que eran hemicigotas para los mutantes rudimentary (r), forked (f) o fused (fu), que están cercanos a
Bar (como lo muestra el siguiente mapa):
En los cruzamientos con machos forked se observaron en F1
hembras forked; sin embargo, de los cruzamientos con machos r
o fu no se obtuvieron hembras r ni fu, respectivamente.
c) ¿Cómo explicaría estos resultados?
4) En un cromosoma de Drosophila persimilis se han reconocido citológicamente 8 regiones denominadas
a,b,c,d,e,f,g,h. Dentro de estas especies 4 razas diferentes tienen el siguiente orden cromosómico: a) a h b d c f e
g. b) a e d c f b h g. c) a h b d g e f c d) a e f c d b h g.
Suponiendo que cada raza evolucionó por una inversión simple a partir de otra raza, muestre cómo pudo haberse
originado cada una.
5) En un heterocigota estructural para una inversión paracéntrica, un cromosoma tiene una ordenación 12.3456789
y su homólogo 12.3765489. a) En un meiocito se produce un entrecruzamiento en la región 4-5, durante paquitene
¿qué se observaría en anafase I? b) ¿Cómo se observaría la anafase I de otro meiocito en el que se produce un en-

16
trecruzamiento en la región 6-7? c) ¿En cuál de los dos meiocitos será mayor el tamaño del fragmento formado en
Anafase I?
6) Una especie de arañas con un x = 4, presenta un conjunto de poblaciones, donde cada una de ellas posee características
citogenéticas que le son propias.
La población del centro de la provincia de Bs. As. (BA), presenta en su meiosis 4 II con todos cromosomas acrocéntricos.
Otro grupo de arañas provenientes de una zona árida de La Pampa (LP) mostró también la presencia de
bivalentes pero en menor número que los de BA.
Cuando se estudia la meiosis de la F1, producto del cruzamiento de BA x LP, se encuentra un III involucrando a un
cromosoma metacéntrico y 2 II de tipo acrocéntrico.
Por último, se estudian varios ejemplares provenientes de la vera de un río donde, una importante pastera de Misiones
(M) descarga contaminantes. Los ejemplares de este grupo tienen una meiosis con II (en menor número que
en BA). Al analizar la meiosis de la F1 del cruzamiento de LP x M se encuentran un bivalente con un “rulo” que
involucra un brazo completo y un cuadrivalente.
Ahora, tome varios colores, relea el problema lentamente, piense y responda:
a) Esquematice qué se vería en la meiosis de la F1 del cruzamiento de M x BA. ¿Qué estadio esquematizó?
b) Complete el siguiente cuadro, (nx: indica
posibles variantes de las gametas). ¿Alguna es
inviable?, justifique la respuesta en no más de
tres renglones.
c) En la meiosis de la F1 de M x LP y de M x
BA se encuentran ligados genes que se compor-
tan como no ligados en el resto de los cruzamientos ¿a qué se debe este ligamiento? A partir de la respuesta anterior
indique dónde se pueden encontrar los genes ligados.
7) En cierta especie de Drosophila, que tiene los cromosomas telocéntricos, se conocen los loci A,a, que está muy
próximo al centrómero, B,b situado a 30 cM del anterior y C,c a 15 cM de B,b y a 45 cM de Aa. Un macho de
fenotipo normal capturado en el campo se cruzó con una hembra, perteneciente a una población de laboratorio, que
es normal en todos los aspectos, salvo recesiva para los tres caracteres antedichos. Toda la descendencia del cruzamiento
fue de fenotipo dominante. Cuando las hembras de este cruzamiento se sometieron a un cruzamiento de
prueba con machos de la población de laboratorio se obtuvo la siguiente descendencia:
Fenotipo Nº de individuos
ABC 4250
Abc 490
aBC 510
abc 4480
2n
n1
n2
n3
8) En hembras de D. melanogaster heterocigotas para las siguientes 3 mutaciones: Bristle (Bl), mutación dominante
ubicada en el cromosoma 2; Dichaete (D), mutación dominante ubicada en el cromosoma 3, y eyeless (ey), mutación
recesiva ubicada en el cromosoma 4, fueron cruzados individualmente con machos homocigotas para ey. La
mayoría de los cruzamientos producen las 8 clases fenotípicas esperadas: Bl D ey+; Bl D ey; Bl D+ ey+; Bl D+ ey;
Bl+ D ey+; Bl+ D+ ey+; Bl+ D+ ey; Bl+ D ey.
Seis hembras produjeron un número limitado de fenotipos que es el siguiente:
a) Bl D ey+; Bl D ey; Bl+ D+ ey+; Bl+ D+ ey. b) Bl D ey; Bl D+ ey+; Bl+ D ey; Bl+ D+ ey+
c) Bl D ey; Bl D+ ey; Bl+ D ey+; Bl+ D+ ey+. d) Bl D+ ey+; Bl D+ ey; Bl+ D ey+; Bl+ D ey.
e) Bl D ey+; Bl D+ ey; Bl+ D ey+; Bl+ D+ ey. f) Bl D ey+; Bl D+ ey+; Bl+ D ey; Bl+ D+ ey.
Para cada una de estas hembras dé la explicación más simple de la causa que pudo restringir el número de fenotipos
de la descendencia (considere que los quiasmas son terminales).
9) Una planta de centeno homocigota recesiva bb con ordenación cromosómica
“normal” se cruza por otra que es homocigótica BB y además homocigótica
para una “translocación recíproca” entre los cromosomas 3 y 6. La F1 de este
cruzamiento fue semiestéril y fenotipo B. Cuando una planta de la F1 se cruza
por otra homocigótica recesiva bb y de constitución cromosómica normal se
obtiene la descendencia indicada en la tabla.
BA LP M F1 BAxLP F1 BAxM F1 LPxM
a) Explique por qué aparecen sólo cuatro fenotipos.
b) De los datos de la tabla se deduce que la fracción de recombinación
entre A,a y B,b es 0,1. ¿Cómo se puede explicar esta discrepancia con los
datos del enunciado?
Fenotipo Fenotipo Nº indiv.
B semiestéril 385
b semiestéril 33
B fértil 39
b fértil 395
Calcule la distancia a la que se encuentra el locus B/b del punto de translocación? ¿Qué tipo de configuración
meiótica (monovalente, bivalente, trivalente, cuadrivalente, hexavalente) se observará en la metafase-I de las plantas
semiestériles y fértiles? Esquematice
10) Suponga que está estudiando la citogenética de cinco especies íntimamente relacionadas de Drosophila. La
figura de abajo muestra el orden de los genes (las letras indican genes que son idénticos en las cinco especies) y los
grupos de cromosomas que se encuentran en cada especie.

11) En
cierta especievegetal
con un número diploide de 2n=10 cromosomas, disponemos
de la seria monosómica completa. Para localizar
el locus A,a (A>a) se cruzan plantas disómicas homocigóticas
AA por cada uno de los diferentes monosómicos
de fenotipo recesivo. Las cinco F1 obtenidas fueron
de fenotipo dominante existiendo en todos los casos
17
a) Explique de qué modo, probablemente, estas especies evolucionaron
una a partir de otra, esquematizando los cambios
ocurridos en cada paso. (Nota: asegúrese de que comparar el
orden de los genes con cuidado).
b) Esquematice una celula en paquitene y otra anafase I de una
hembra híbrida obtenida a partir del cruzamiento de un macho
de la especie a por una hembra de la especie c. (Considere
solamente los dos pares mayores, y la formación de un solo
quiasma en cada bivalente).
plantas con 10 y con 9 cromosomas. Las plantas de la F1 que tenían 9 cromosomas (monosómicas) se cruzaron por
plantas disómicas de genotipo recesivo aa, obteniéndose los siguientes resultados:
Los numeros 1 al 5 representan los cromosomas que están en condición monosómica en el primer cruzamiento.
¿En qué cromosoma se encuentra situado el locus A,a?
12) La zarzamora europea (Rubus idaeus) tiene 14 cromosomas. Otro tipo de mora (Rubus caesius) es tetraploide
con 28. Los híbridos entre estas especies son individuos F1 estériles. Algunas gametas que no han reducido sus
cromosomas en la F1 son funcionales en las cruzas retrógradas. Determine el número de cromosomas y el nivel de
ploidía para cada uno de los siguientes casos: a) F1; b) Retrocruza con ambos padres.
13) Las especies de algodón del Nuevo Mundo
Gossypium hirsutum tienen 2n=52. Las especies del
Viejo Mundo: G. thurberi y G.herbaceum tiene cada
una 2n=26. Los híbridos entre estas especies muestran
los siguientes arreglos cromosómicos durante la meiosis:
Nota: II bivalentes, I univalentes
a) ¿Cómo podría interpretar estos resultados desde un punto de vista filogenético? b) ¿Cómo podría probar que su
interpretación es correcta?
Especie o híbrido F1 Crom. II I
14) Existen seis especies principales del género Brassica al que B. carinata 34 17 0
pertenece la colza (y la canola): B. carinata, B. campestris, B. nigra,
B. oleracea, B. juncea, B. napus. Las relaciones entre las especies
pueden deducirse a partir de la tabla (Nota: crom.= cromosomas,
II=bivalentes, I=univalentes)
a) Deduzca el número de cromosomas de B. campestris, B. nigra y
B. oleracea.
b) ¿Algunas de las especies mencionadas son poliploides? ¿Cuáles?
c) En caso afirmativo señale las especies progenitoras de cada una
de las especies poliploides.
B. napus
B. juncea
B. juncea x B. nigra
B.napus xB.campestris
B.carinataxB.oleracea
B. juncea x B.oleracea
BcarinataxB.campestris
B. napus x B. nigra
38
36
26
29
26
27
27
27
19
18
8
10
9
0
0
0
0
0
10
9
8
27
27
27
d) Explique mediante cruzamientos como se originaron las especies poliploides.
15) Se dispone de cuatro cultivares diferentes de trigo
(V1, V2, V3 y V4) que son homocigóticos estructurales.
El cultivar V1 posee la ordenación cromosómica
normal, el V2 presenta
una translocación recíproca entre los cromosomas 1 y
2, el V3 tiene una translocación recíproca entre los
cromosomas 2 y 3 y el V4 tiene una translocación recíproca entre los cromosomas 2 y 4.
Otro cultivar V5, homocigótico estructural para otra translocación recíproca diferente, se cruza por los anteriores,
dando los siguientes resultados al observar la meiosis de los correspondientes híbridos:
Cuáles son los cromosomas implicados en la translocación de la variedad V5?
8. GENÉTICA DE POBLACIONES
Guía de Estudio:
Descendencias de las cinco F1 analizadas
Disómicos Monosómicos
Fenotipo A Fenotipo a Fenotipo A Fenotipo a
1 140 140 139 141
2 97 103 93 107
3 193 0 0 196
4 58 53 57 52
5 158 149 145 150
HIBRIDO
Configuración meiótica en
metafase I
G. hirsutum x G. thurberi 13 II pequeños + 13 I grandes
G.hirsutum x G.herbaceum 13 II grandes + 13 I pequeños
G.thurberi x G.herbaceum 13 I grandes + 13 I pequeños
Cruzamiento Configuración en metafase I del híbrido
V1 X V5 Una asociación de 4 cromosomas (1 IV )
V2 X V5 Una asociación de 6 cromosomas (1 VI )
V3 X V5 Dos asociaciones de 4 cromosomas (2 IV )
V4 X V5 Una asociación de 6 cromosomas (1 VI )

18
1) a) En una población en equilibrio de Hardy Weinberg:
¿Cuál es la frecuencia de heterocigotas que puede haber? ¿Cuál es la de homocigotas dominantes? ¿Cuál es la de
homocigotas recesivas?
b) La invariabilidad de las frecuencias génicas de una generación a otra, implica que esté en equilibrio (de Hardy
Weinberg) la población parental?
c) La estructura genética de una población, ¿viene dada por sus frecuencias génicas o por las genotípicas?
d) El conocimiento de las frecuencias génicas de una población, ¿implica conocimiento de su estructura genotípica?
¿Y si la población está en equilibrio H-W? R: a) Frecuencias heterocigotas H=2.p.q ≤ 0.50 (si hay dos alelos),
H = 1 – Σpi 2 (si hay más de dos alelos). Frecuencia homocigotas dominantes D = p 2 Frecuencia de homocigotas
recesivos R = q 2
b) La invariabilidad de las frecuencias génicas de una generación a otra no implica que la población parental esté
en equilibrio. La generación parental puede tener D, H, R ≠ p 2 , 2pq, q 2 , pero llega al equilibrio en una generación
de panmixia. Para que hablemos de equilibrio deben mantenerse constantes las frecuencias génicas y genotípicas
p 2 , 2pq, q 2 .
c) La estructura genética de una población viene dada por sus frecuencias génicas y genotípicas. Si (D, H, R) ≠ (p 2 ,
2pq, q 2 ) puede deberse a que no hay panmixia, o que hay selección, deriva, mutación, etc., que afectan la estructura
genética.
d) El conocimiento de las frecuencias génicas de una población no implica el conocimiento de su estructura genotípica,
a menos que la población esté en equilibrio de Hardy-Weinberg.
2) En el caso de loci ligados a cromosomas sexuales, ¿cuándo se considera que una población se encuentra en
equilibrio?
R:En estos casos, el sexo heterogamético presenta solo dos genotipos, y el homogamético tres. Por lo tanto podemos
describir sus frecuencias genotípicas poblacionales de la siguiente manera:
AA Aa aa A a
P H Q R S
pf = frec. del alelo A en la población femenina
qf = frec. del alelo a en la población femenina
pm = frec. del alelo A en la población masculina
qm = frec. del alelo a en la población masculina
En este caso, 2/3 de los alelos totales de la población son transportados por el sexo homogamético y 1/3 por el sexo
heterogamético. Las frecuencias génicas en cada uno de los sexos serán diferentes si la población no está en equilibrio.
Siguiendo la nomenclatura asignada para cada uno de los genotipos, la frecuencia del alelo A en las hembras será
igual a: pf = P + ½ H y en los machos pm = R
En la población total será igual a: p = 2/3 pf + 1/3 pm
Si las frecuencias en ambos sexos no son iguales en un comienzo, y se produce apareamiento aleatorio, las frecuencias
irán oscilando en los dos sexos hasta alcanzar el equilibrio cuando:
pf = pm = p
Los machos obtienen sus genes ligados al sexo de la madre, por lo tanto:
pm = pf de la generación anterior (identificada con el apóstrofe).
Las hembras obtienen sus genes en igual proporción de los progenitores, por lo tanto,
pf = ½ (pm + pf ) de la generación anterior
En cada generación se reduce a la mitad la diferencia de las frecuencias génicas entre los dos sexos, lo que se desprende
de la siguiente ecuación:
pf - pm=½p’m+½p’f - p’f=½p’m - ½ p’f= - ½(p’m+p’f)
Por lo tanto, el equilibrio no se alcanza en una sola generación de apareamiento aleatorio, sino en varias. Las frecuencias
se van acercando asintóticamente al valor medio poblacional, momento en el cual se alcanza el equilibrio.
3) ¿Por qué, en teoría, la consanguinidad no favorece un incremento en la frecuencia de alelos recesivos en una
población sino que solamente afectaría la distribución de alelos entre genotipos?
R:La falta de panmixia no modifica las frecuencias génicas sino las genotípicas. Entonces, por la consanguinidad p
y q no cambian. El apareamiento entre parientes no afecta las frecuencias génicas conjuntas, sino que aumenta la
frecuencia de homocigotas. La consanguinidad hará que los genes recesivos raros se presenten en homocigosis con
una mayor frecuencia que si existiese apareamiento aleatorio en poblaciones de tamaño grande.
Problemas:
1) Una condición anémica en el hombre llamada talasemia es determinada por un par de alelos codominantes. El
genotipo homocigótico dominante TmTm produce una anemia grave (talasemia mayor) y el genotipo heterocigótico
TmTn produce una anemia benigna (talasemia menor). Los individuos normales son homocigóticos TnTn. Se
encontró que la distribución de esta enfermedad en una muestra de una población italiana era de 4 con talasemia
mayor, 400 con talasemia menor y 9596 normales. Indique si esta muestra está de acuerdo con los valores esperados
según el equilibrio de HardyWeinberg dentro de límites estadísticos aceptables.
2) Cierta planta presenta flores azules, celestes y blancas y se sabe que esos tres colores están determinados por un
locus bialélico de dominancia incompleta. Un ecólogo vegetal encuentra una población de esta planta y considera
que pueden reconocerse dos subpoblaciones. Desea entonces averiguar si cada una de ellas se encuentra en equili-

Azul Celeste Blanco Total
Subpoblación I 164 32 4 200
Subpoblación II 20 80 100 200
Total 184 112 104 400
19
brio de HardyWeinberg y qué sucede con la población
total. Si partió de los siguientes datos ¿A qué conclusión
llegó?
3) Los grupos sanguíneos humanos (AB0) están determinados por un sistema de alelos múltiples en el que existen
relaciones de codominancia y dominancia (según la interacción). La jerarquía de dominancia de estos tres alelos
es: IA = IB > i. En una muestra de una población humana se encontraron 23 individuos del grupo AB, 441 del grupo
“0”, 371 del grupo B y 65 del grupo A. a) Calcule las frecuencias alélicas de IA, IB e i. b) Calcule el porcentaje de
la población que se espera que sea de los grupos A, B, AB y 0 si las frecuencias génicas fueran: IA = 0,36, IB = 0,20
e i= 0,44.
4) Al analizar, en una población de mamíferos, un carácter monogénico con ligamiento total al cromosoma X, se
encontró que la frecuencia del gen dominante en las hembras es 0,8, mientras que el 30 % de los machos son recesivos.
¿Qué frecuencias génicas aparecerán en cada sexo en la 3ra generación a partir de la citada? ¿Hacia qué valor
tienden dichas frecuencias al cabo de un gran número de generaciones?
5) 5) La enzima 6-glicerol fosfato deshidrogenasa (6-Gpd) presenta, en algunos lepidópetros (mariposas), distintas
formas diferenciables en una corrida electroforética, donde cada banda
depende de la presencia de un alelo diferente para el locus autosómico 6-
Gpd. Los alelos más comunes son el F (fast) y el S (slow), (llamados así
porque el F se aleja más del punto de siembra y el S menos).
En un laboratorio se estudian las frecuencias genotípicas de 4 poblaciones
experimentales respecto de este locus. En la tabla se muestra el número
de individuos de cada genotipo para cada sexo y en cada población.
a) ¿Qué poblaciones están en equilibrio de Hardy-Weinberg?
b) ¿Cuáles no están en dicho equilibrio y por qué?
c) ¿Cuáles son las frecuencias génicas y genotípicas de equilibrio y cuántas generaciones tardarán en alcanzarlo las
poblaciones que no estaban en equilibrio?
6) Un señor muy enfermo que estaba redactando su testamento, deseaba saber si él era verdaderamente el padre
biológico del segundo hijo de su anterior esposa que, a pesar de su duda, llevaba su apellido. Sus abogados le recomendaron
que realizara las pruebas genéticas de filiación. En un prestigioso laboratorio se tomaron entonces las
muestras de sangre del hijo y de ambos padres. Se extrajo ADN genómico. Mediante PCR y a partir de primers
adecuados se amplificaron 8 regiones de microsatélites altamente variables del ADN (loci), con el fin de determinar
el índice de paternidad. A continuación se muestran los esquemas
de los patrones electroforéticos obtenidos al correr en geles de poliacrilamida
los productos de amplificación para cada locus. P= padre,
H= hijo y M= madre. A los costados se indican los alelos que difieren
en el tamaño del fragmento. En la tabla se indican las frecuencias
poblacionales de estos alelos.
Frecuencias alélicas:
Locus 2: 117= 0.18; 113= 0.16; 111= 0.1
Locus 3: 149= 0.01; 153= 0.32; 155= 0.1; 157=0.16
Locus 4: 179= 0.16; 193= 0.09; 195= 0.01
Locus 5: 156= 0.65; 166= 0.05
Locus 6: 185= 0.025; 195= 0.05; 199= 0.25; 205=0.13
Locus 7: 88= 0.58; 104= 0.28
Locus 8: 109= 0.3; 115= 0.16
Locus 9: 182= 0.13; 184= 0.29; 214= 0.01; 232= 0.01.
A partir de estos datos calcule el índice de paternidad para cada locus
(razón de verosimilitud hijo/ no hijo) y el valor acumulado para todos
los loci.
9. GENETICA CUANTITATIVA
Guía de Estudio:
1) ¿Qué características particulares permiten diferenciar los caracteres de herencia cuantitativa y aquellos de herencia
cualitativa? R: ver tabla
Caracteres Cuantitativos Caracteres Cualitativos
Diferencias de grado Diferencias de clase
Variación continua:
Clases fenotípicas que forman un espectro métrico continuo
Machos Hembras
FF FS SS FF FS SS
POBLACION 1 48 84 18 18 84 98
POBLACION 2 24 24 72 24 24 72
POBLACION 3 9 42 49 9 42 49
POBLACION 4 20 20 60 9 42 49
Variación discontinua:
Clases fenotípicas discretas

Muchos genes involucrados en determinación del carácter Pocos genes
Efectos individuales de los genes no discernibles, por ser pequeños y
afectados por el ambiente
El análisis genético se realiza mediante estimaciones estadísticas de los
parámetros de la población, como media y varianza
20
Efectos individuales de los genes discernibles
El análisis genético se realiza por conteo y proporciones
2) ¿Qué es la “heredabilidad” de un carácter? R: Se refiere a la proporción de la variabilidad fenotípica total de un
carácter que es genéticamente heredable en una población (h2 (en sentido estricto) = VA/VP, VA = varianza genética
aditiva, Vp = varianza fenotípica; en otras palabras h2 es la proporción de la varianza fenotípica que se debe a la
varianza genética aditiva).
3) Una heredabilidad h2 de 0,4, significa que para un determinado carácter, un individuo presenta el 40% de su
fenotipo determinado genéticamente, y un 60% determinado por el medio ambiente? R: No!!!!, es un parámetro
poblacional, por lo tanto significa que en una población, sólo el 40% de la variabilidad fenotípica total observada
para ese carácter está determinada genéticamente.
4) ¿Por qué es importante conocer el valor de este parámetro en el marco de programas de mejoramiento? R: Porque
permite que el mejorador tenga un indicio de cual es la respuesta potencial a la selección que se esté aplicando
sobre el carácter. De esta manera se diseñan los cruzamientos adecuados para obtener la mejor respuesta (mejora
del carácter) evitando la depresión endogámica y la disminución drástica del tamaño poblacional.
5) a) ¿Por qué el mejoramiento de los toros es más rápido que el de las vacas? ¿Por qué es más fácil mejorar cerdos
que ovinos o bovinos?¿Por qué en teoría la consanguinidad no favorece un incremento en la frecuencia de
alelos recesivos en una población sino que solamente afectaría la distribución de alelos entre genotipos?
b) ¿Cuál es la razón por la que no se obtienen líneas puras en animales?¿Qué son las "razas" en términos de mejoramiento
animal?,
c) ¿Por qué la selección individual se llama fenotípica y la familiar genotípica?
R: El mejoramiento en toros es conveniente pues producen mayor descendencia que las vacas. Los machos son
siempre más convenientes pues se pueden evaluar más descendientes sin alargar el intervalo generacional (edad
media de los padres cuando nacen los hijos). Además se pueden seleccionar pocos animales con el caracter deseado
sin afectar el tamaño poblacional del rodeo.
- Es más fácil mejorar cerdos, por ser multíparos.
- Consanguinidad: p y q no se modifican. El apareamiento entre parientes no afecta las frecuencias génicas conjuntas,
sino que aumenta la frecuencia de homocigotas. La consanguinidad hará que alelos recesivos raros se presenten
en homocigosis con una mayor frecuencia que si existiese apareamiento aleatorio. - Líneas puras en animales
no existen pues no hay autofecunfación. Las razas en términos de mejoramiento son poblaciones altamente endocriadas.
- En la selección individual se elige al individuo progenitor para realizar mejoramiento por su FENOTIPO.
La selección familiar es GENOTÍPICA pues se elige por el pedigree del individuo, por ejemplo, el carácter producción
de leche en toros se elige por su tía, madre o abuela.
6) ¿A qué se denominan QTL? R: El término se aplica a los “loci” que afectan caracteres cuantitativos. Es decir
que se refiere a la ubicación de genes que afectan caracteres que pueden ser medidos en una escala lineal o cuantitativa.
El mapeo de QTL es una técnica de mapeo por recombinación y requiere de:
1) uso de grupos de individuos que difieran marcadamente en el carácter que se quiere mapear;
2) identificación de aquellos marcadores moleculares polimórficos que difieran entre ambas líneas; 3) análisis de la
F2 segregante entre ambos grupos (o de la retrocruza o de RIL!!!!), tanto en cuanto a los marcadores moleculares
como en cuanto a los valores para el carácter cuantitativo en estudio, 4) análisis estadístico de los datos (ANOVA
simple o de regresión como primer paso crudo - el análisis real requiere mapeo del intervalo compuesto con estadística
de máxima probabilidad para estimar valores LOD a lo largo del cromosoma).
7) ¿Qué son las líneas recombinantes endocriadas o RIL (recombinant imbred lines)? ¿y las líneas haploides duplicadas?
R: Las RIL son líneas endocriadas con 9 o más generaciones (14 en Drosophila) de autofecundación o
endocría (cruzamiento entre hermanos) y son, por lo tanto, prácticamente homocigotas. Suelen ser derivadas de un
cruzamiento entre dos parentales altamente divergentes (contrastantes) para uno o más rasgos cualitativos o cuantitativos
representando diferentes combinaciones aleatorias de alelos que estaban fijados en las líneas parentales. Se
parte de una F2 (o retrocruza de F1 por un parental). Es una alternativa al cruzamiento prueba dado que todos los
segregantes serán homocigotas dominantes o recesivos. Otra ventaja es que la autofecundación (o endocría) de las
líneas mantiene el genotipo (no hay segregaciones), lo que permite su mantenimiento (inmortalización) y distribución
entre distintos grupos que compatibilizan mapas genéticos. Los haploides duplicados tienen las mismas características,
pero se obtienen por un mecanismo distinto. En muchas plantas es posible cultivar anteras (gametas) in
vitro de forma de generar plantas haploides. Partiendo de una F1 se obtienen, entonces, gametas haploides que
generan plantas que combinan genes de distintos loci de las dos líneas paternas. Cuando se las trata con colchicina,
se pueden duplicar los cromosomas dando individuos diploides que son homocigotas porque los cromosomas
“homólogos” representan copias idénticas del mismo cromosoma del haploide original.
Problemas:

21
1) Suponga que dos pares de genes con dos alelos cada uno Aa y Bb, determinan en una población la altura de las
plantas en forma aditiva. El homocigota aabb tiene una altura de 30 cm y el AABB de 50 cm.
a) ¿Cuál es la altura de la F1 de un cruzamiento entre estas dos cepas homocigotas?
b) Después de un cruzamiento F1xF1, ¿qué genotipos de la F2 presentarán una altura de 40 cm?
c) ¿Cuál será la frecuencia de estas plantas en la F2?
d) Si se seleccionaran los individuos de 45 cm o más de altura para obtener la siguiente generación, ¿cuál sería la
altura media de ésta?
2) Se cruzaron dos razas diferentes de maíz, cada una con una altura media de 1,72 m y se obtuvo una F1 con una
altura media también de 1,72 m. En la F2 había una considerable variación que iba de 0,91 m a 2,5 m. De las 1942
plantas consideradas, 8 alcanzaban una altura de 2,5 m y 7 una de 0,91 m. La altura del maíz, ¿sería para Ud. un
carácter cualitativo o cuantitativo? ¿Por qué? ¿Cuántas parejas de genes están implicadas en la determinación del
carácter segregaron en la F2? Explique estos resultados en términos génicos asumiendo que el ambiente fue mantenido
constante en todos los casos.
3) Johannsen midió el peso de las semillas de porotos de la variedad Princesa. Los porotos son autógamos (autofertilizados)
y por lo tanto esta variedad es una línea pura. Los pesos en centigramos de una muestra pequeña pero
representativa se enumeran a continuación: 19 31 18 24 27 28 25 30 29 22 29 26 23 20 24 21 25 29
a) Calcule el peso promedio y la desviación estándar de las alubias en esta muestra.
b) Calcule la varianza ambiental. c) Calcule la heredabilidad del peso de las alubias en esta variedad. d) Si el peso
promedio de las alubias seleccionadas para ser progenitores es 30 cg, prediga el peso promedio de las alubias de la
siguiente generación.
4) Al medir el contenido en proteínas por mg de materia seca de las plantas de una población se obtuvieron los
siguientes resultados:
Proteínas (unidades arbitrarias): 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Nº de individuos 1 3 6 10 18 13 6 2 1
Al seleccionar como progenitores para formar la generación siguiente los individuos con contenido proteico superior
a 7 unidades se obtuvieron los siguientes resultados:
Proteínas (unidades arbitrarias): 3 4 5 6 7 8 9 10 11
N º de individuos 0 3 4 10 18 9 6 2 0
A la vista de estos resultados, se desea saber: a) El valor de la heredabilidad del carácter "contenido de proteína"
b) De acuerdo con dicho valor de la heredabilidad, ¿qué consecuencia se puede sacar respecto al componente genético
del carácter analizado? c) ¿Podría darse esta interacción en una alógama?
5) Si 3 genes que segregan independientemente, con dos alelos cada uno, determinan la altura de una determinada
planta, por ej.: Aa, Bb y Cc, de modo que la presencia del alelo representado por la mayúscula añada 2 cm a la
altura base (que es de 2 cm).
a) Indique la altura que esperaría en la F1 de un cruzamiento entre las cepas homocigotas AABBCC (14 cm) X
aabbcc (2 cm).
b) Indique la distribución de las alturas (fenotipos y frecuencias) que se espera en un cruzamiento F1 X F1.
c) ¿Qué proporción de esta F2 tendría la misma altura que las cepas paternas? d) Si los alelos representados por
mayúsculas actuasen como dominantes, por ej.:
A_B_C = 8 cm, ¿cuáles serían las respuestas a los epígrafes a), b) y c)?
e) Si los alelos representados por mayúsculas actuasen multiplicando la altura existente, por ej.: Aabbcc= 4 cm,
AAbbcc= 8 cm, AABbcc= 16 cm, etc., ¿cuáles serían las respuestas a los puntos a), b) y c)?
6) Tiempo atrás salió en los diarios el “descubrimiento”
del “gen” del temor (o cobardía) en ratas de laboratorio
basado en diferencias observadas en el patrón de comportamiento
de ratas frente a la aplicación de shocks eléctricos
poco después de hacer sonar un sonido peculiar en un
lugar de sus laberintos. Las ratas “temerosas” desarrollaron
un reflejo condicionado de cobardía por el que huían
rápidamente al escuchar el sonido o cuando eran colocadas
en ese lugar del laberinto, sin necesidad de aplicar el
shock eléctrico. El grado de “cobardía” se estableció cronometrando
el tiempo que tardaban las ratas en huir después
de emitirse el sonido característico y al ser colocadas
en el lugar prefijado. Se analizó la influencia del cromosoma
1 en este comportamiento mediante cruzamientos
controlados. Se estudiaron distintas RIL para dicho cromosoma
obtenidas a partir de un cruzamiento entre líneas
Esquema 1
Sondas RFLP
Valor promedio
y
desvío
Xabg XKn XCen Xpsr
601 a1 t1 121
Padre valiente 10 ± 2,8
Padre temeroso 0,9 ± 0,3
Clase 1 1 ± 0,5
Clase 2 9 ± 2,5
Clase 3 10 ± 2,6
Clase 4 9,5 ± 2,4
Clase 5 0,8 ± 0,4
Clase 6 1 ± 0,6
Clase 7 8,5 ± 2,3
Clase 8 0,9 ± 0,6
Clase 9 1,3 ± 0,7

“temerosas” y “valientes”.
a) Haga un esquema de los cruzamientos con los que se obtuvieron las RIL ejemplificando con el caso de este problema.
En el esquema 1 se representa una región del cromosoma 1 en las distintas familias recombinantes (negro perteneciente
al padre temeroso, blanco perteneciente al padre valiente). De cada clase recombinante esquematizada se
obtuvieron al menos 50 ratas que fueron ensayadas biológicamente mediante un diseño estadístico apropiado. Para
cada clase recombinante se obtuvo un promedio y un desvío estándar. Indique cómo se hizo para ordenar los distintos
marcadores en el cromosoma 1
b) ¿Por qué se utilizaron 50 ratas de cada una de las líneas recombinantes y no solamente una?
c) ¿Qué conclusiones puede sacar acerca de la localización genética del temor? ¿Está este QTL ubicado en el cro-
mosoma 1? ¿Podría Ud localizar más de un QTL en el esquema 1?
¿Supone que puede estar ubicada en otras partes del genoma? ¿Por
qué?
d) ¿Podría haber utilizado otro método alternativo para llegar a las
mismas conclusiones?
e) ¿Reflejan los datos la ocurrencia de segregación transgresiva?
¿Por qué?
f) En el esquema siguiente se representa uno de los RFLPs obtenidos
para los padres temeroso y valiente, respectivamente, utilizando la
sonda Xabg601 y la enzima Eco RI. Complete el patrón obtenido para cada una de las clases recombinantes endocriadas.
7) El enanismo es un carácter muy buscado en trigo porque está asociado a una menor susceptibilidad al vuelco y a
un mayor rendimiento. Para estudiar este carácter se construyeron líneas de sustitución cromosómica entre las variedades
Mara y Cappelle-Desprez. Es decir, se obtuvieron distintas líneas de la variedad Cappelle-Desprez las
cuales tienen alguno de sus cromosomas reemplazados por los de la variedad Mara. Mara es como 12 cm más baja
que C-D (cuyo promedio de altura es de 103 cm de alto, ver ordenadas del gráfico). Observando el gráfico adjunto:
a) ¿Qué clase de carácter es la altura?
b) ¿Qué podría decir acerca de la cantidad y de la localización
de los genes de altura de Mara?
c) ¿Puede existir algún otro gen relacionado con altura
que no esté siendo detectado por este análisis?
d) ¿Podría sospechar algún efecto epistático para el
carácter altura a partir de este análisis?
e) ¿Considera que a partir del cruzamiento se podrían
obtener líneas más bajas (o más altas) que estas variedades
parentales (por segregación transgresiva)?
f) ¿Serviría este método de utilización de líneas de sustitución
para asignar una localización cromosómica a
marcadores moleculares?
10. HERENCIA DE ORGANELAS
Guía de Estudio:
1) ¿Qué es la HERENCIA materna (también llamada uniparental,
citoplasmática o extranuclear) y cómo se diferencia
de la influencia materna? ¿Cuál es su base genómica?
¿Mediante qué mecanismos se multiplican las organelas?
2) Explique la organización genómica de mitocondrias y
cloroplastos, tomando como base mitocondrias de humanos,
levaduras y cloroplastos de plantas superiores. ¿Diría
Ud. que su evolución fue lenta o rápida comparada al
genoma nuclear? Si dependiera del caso, ejemplifique.
3) ¿Qué origen evolutivo tienen estas organelas? ¿El mismo
es monofilético o polifilético? Explique la teoría de
Margulis.
4) Hace unos 10 años una noticia “sacudió los titulares”
Eva (sí, la de Adán y Eva) fue negra y vivió hace 200.000
años. ¿En qué se basó el periodista? ¿Por qué ignoró
olímpicamente al pobre Adán? ¿Era feminista?
Tamaño delgenoma
22
Padres Clases Recombinantes
T V 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Plantas Hongos Animales
Extremadamente
variable (300kb a
2400kb en una
misma familia)
Estructura Variable, circular o
lineal
Información rRNA, tRNA, proteínas
ribosomales,
proteínas involucradas
en respiración
Presencia de
intrones
Modo de herencia
Tasa de divergencia
de
secuencia
comparada con
nuclear
No, pero abundantes
regiones no codificantes
Variable, principalmente
materna
Muy variable Pequeñas y poco
(26,7kb a 115kb en variables ≈ 16kb
as- comycertes
filamentosos)
circular circular
rRNA, tRNA,
proteínas ribosomales,
proteínas
invo- lucradas en
respiración
rRNA, tRNA,
pro- teínas
involucradas en
respiración
Si No, pocas regiones
no codificantes
Cualquiera de los
dos parentales
materna
lenta media rápida

Problemas
1) Una enfermedad humana que produce cardiomiopatías muestra el siguiente pedigrí:
a) ¿Cómo explica el patrón de herencia de esta enfermedad?
b) Si el individuo III-5 tiene hijos con una mujer sana. ¿Cómo espera que sean sus hijos varones? ¿Y sus hijas mujeres?
c) ¿Puede el individuo III-10 tener una hija sana? ¿Y un hijo sano? Justifique.
d) La pareja formada por los individuos II-3 y II-4 tuvo un cuarto hijo sano. ¿Como lo explicaría? ¿Puede deducir
si ese hijo es varón o mujer? Justifique.
2) La polilla de la harina Ephestia kuehniella posee ojos negros y cuerpo pigmentado debido a un precursor del
pigmento (la proteína kynurenina) cuyo control de expresión está dado por el gen dominante A. Cuando el genotipo
de la polilla es aa el fenotipo es ojos rojos y cuerpo sin pigmentar.
Si se realiza el cruzamiento de un macho heterocigota por una hembra recesiva el resultado es 1/2 de polillas pigmentadas
con ojos negros y 1/2 de polillas no pigmentadas con ojos rojos. Si se realiza el cruzamiento recíproco
todas las larvas nacen pigmentadas. Sin embargo, al emerger los adultos presentan las proporciones fenotípicas
esperadas: 1/2 de polillas pigmentadas con ojos negros y 1/2 de polillas no pigmentadas con ojos rojos.
a) Explique los fenotipos observados en ambos cruzamientos. ¿De que tipo de herencia se trata?
b) ¿Qué explicación molecular tiene este tipo de herencia?
3) Una estrategia comercial en la producción de maíz es la generación de híbridos con esterilidad del polen. De
esta manera el productor debe comprar semillas para cada siembra, además de evitar la autofecundación y la consecuente
pérdida de valor comercial (por disminución del vigor híbrido).
Los determinantes genéticos de esterilidad del polen están localizados en las mitocondrias (en maíz se conocen por
lo menos 20). Para evitar la expresión de estos determinantes de esterilidad, en las plantas que actúan como parentales
para generar híbridos, se utiliza un gen nuclear dominante Rf (restaurador de la fertilidad). Rf restaura la fertilidad
en plantas genotípicamente androestériles.
Si usted tiene una semilla de maíz cualquiera de origen desconocido ¿cómo haría para saber su genotipo en cuanto
al carácter Rf?
4) El enrollamiento de la caparazón de los moluscos está determinado genéticamente por un locus bialélico, en el
que el alelo D determina el enrollamiento dextrógiro. En el cigoto de los moluscos y otros invertebrados tiene lugar
un proceso de segmentación espiral. El huso mitótico está inclinado respecto al eje del óvulo. Si dicha inclinación
es en una dirección el caracol estará enrollado levógiramente; si está inclinado en la otra dirección se enrollará
dextrógiramente.
Un caracol dextrógiro A resultante de un cruzamiento se autofecunda y produce exclusivamente descendencia
levógira. ¿Cuál es el probable genotipo de A y de sus progenitores?
11 GENÉTICA DEL SEXO
Guía de Estudio
1. ¿Qué se entiende por determinación sexual y diferenciación
sexual? R: Determinación sexual: sistemas biológicos que determinan
el desarrollo de las características sexuales de un organismo
(determinación cromosómica, génica, por nivel de ploidía o
ambiental) Diferenciación sexual: procesos necesarios para alcanzar
las características sexuales previamente “determinadas”.
2. ¿Qué son los cromosomas sexuales y en qué grupos taxonómicos
se los encuentra? R: Son los cromosomas que determinan
genéticamente el sexo. Se encuentran muy distribuidos en insectos,
mamíferos, aves y plantas dioicas.
3. ¿Qué se entiende por región pseudoautosómica (PAR)? R:
región de homología y apareamiento entre los cromosomas sexuales.
4. Los genes relacionados con la diferenciación sexual ¿están ubicados exclusivamente en los cromosomas sexuales?
Explique.
R: Nooo!! Sólo es necesario que se localicen allí los genes regulatorios codificantes para los factores de transcripción
maestros que disparan el proceso que se describe en los libros. Existen muchos genes importantes para el sexo
(incluso los que codifican para cosas tan importantes como son las hormonas sexuales) que se localizan en los
autosomas y pueden verse influidos por los cromosomas sexuales.
23

24
5. A la inversa, ¿pueden existir genes que no tienen nada que ver con el sexo localizados en los cromosomas sexuales?
Explique.
R: Sí, el gen que determina la presencia de pelos en el borde de la oreja, se encuentra en la región diferencial del
cromosoma Y.
6. ¿Cómo se comportan, en relación con las leyes de Mendel, los genes que se encuentran en los cromosomas sexuales?
R: Su herencia difiere de la de los genes ubicados en los autosomas, ya que los alelos se heredan asociados
con el sexo de la descendencia. La misma está influida, a su vez por hemicigosis (genes del cromosoma Y),
heterocromatinización (genes del cromosoma X), etc.
7. ¿Qué diferencia existe entre genes LIGADOS, caracteres LIMITADOS a un sexo e INFLUIDOS por el sexo?
R: Los genes ligados al sexo, son aquellos que se encuentran en la región diferencial de los cromosomas sexuales
(ligados al X o Y). Los caracteres limitados a un sexo, son aquellos que se expresan solamente en un sexo aunque
los genes que los determinan estén presentes en ambos (ej. distribución facial del vello en hombres). Los caracteres
influidos por el sexo, se expresan en ambos sexos pero con diferente relación de dominancia (ej. el alelo que determina
la calvicie humana, es dominante en hombres y recesivo en mujeres).
8. ¿En qué consiste la determinación del sexo por equilibrio génico? R: En Drosophila melanogaster, el sexo está
determinado por la relación: cromosoma X/conjunto de autosomas. Siendo 1 la relación que determina hembras y
0,5 la que determina machos.
9. ¿Cuál es el mecanismo de determinación sexual en humanos? R: En humanos el sexo se determina cromosómicamente,
siendo el cromosoma Y el determinante masculino (portador del gen SRY, factor determinante del desarrollo
de los testículos).
10. ¿Qué es la compensación de dosis génica en mamíferos? ¿Qué establece la hipótesis de Lyon? Dé una evidencia
citológica y una genética de la compensación de la dosis. R: La compensación de la dosis es el mecanismo
mediante el cual se iguala, en ambos sexos, la actividad de los genes que se encuentran en el cromosoma X. Hipótesis
de Lyon: en mamíferos, la compensación de la dosis ocurre por inactivación, al azar, de uno de los cromosomas
X de las hembras (heterocromatinización). El corpúsculo de Barr es la evidencia citológica de esta inactivación.
Una evidencia genética puede obtenerse analizando la expresión de Glu6P-deshidrogenasa en hembras heterocigotas.
11. ¿Cuál es el mecanismo de compensación de dosis génica en Drosophila? R: La compensación de la dosis
ocurre por hiperactivación del cromosoma X de los machos.
12. ¿En qué consiste el mecanismo de determinación del sexo por haplodiploidía? ¿En qué grupos taxonómicos se
encuentra? R: En este sistema, la determinación del sexo depende de la dotación cromosómica de los individuos,
siendo las hembras diploides y los machos haploides. Se encuentra en los himenópteros (abejas, hormigas, termitas)
13. ¿Qué mecanismos de reproducción permiten perpetuar un genotipo más allá de la existencia del individuo?
¿Conoce alguno que implique la producción de semillas? R: Apomixis
Problemas
1) En los embriones de los mamíferos, la presencia del cromosoma Y determina el desarrollo de testículos y genitales
externos masculinos. En 1990 se clonó un fragmento de 14 kpb del cromosoma Y que contiene todo el gen
determinante del sexo, al cual se lo llamó Sry (Sex Reversal Y, es decir, revierte el sexo). Como era previsible para
un gen regulatorio, Sry codifica para una proteína (SRY) que contiene un dominio de unión al ADN, la misma
actúa en el conducto genital precursor de los testículos y el comienzo de la expresión es alrededor de 10 a 12 días
post-coito o post-reimplantación.
Con la intención de obtener ratones transgénicos, se inyectaron óvulos fecundados con una solución acuosa conteniendo
el gen Sry clonado. Las cigotas fueron reimplantadas en madres adoptivas seudopreñadas. Se obtuvo una
camada de 93 crías nacidas (machos y hembras). Para determinar rápidamente qué ratones de la camada eran
transgénicos, se obtuvo ADN genómico de trozos de cola de toda la camada, y se realizó un Southern-blot con 2
sondas radioactivas. Sonda A = fragmento del gen Sry clonado, revela una sola banda de 3,5 kpb. Sonda B = fragmento
del gen Zfy, revela dos bandas de 11 kpb y 5 kpb. El gen Zfy es un gen del cromosoma Y, localizado lejos
de Sry y por fuera del fragmento de 14 kpb.
a) Dibujar las bandas que se observarían en un Southern hecho con ADN genómico de las crías e hibridado simultáneamente
con las sondas A y B. Considere todos los resultados posibles.
b) Gracias a estudios previos con cepas de ratones con anomalías cromosómicas, se sabe que la presencia de más
de un cromosoma X en el ratón macho, siempre da por resultado esterilidad. ¿Cuáles de las crías obtenidas serían
fértiles y cuáles estériles?
c) Proponga otras metodologías para la detección de los ratones transgénicos.
2) En un laboratorio de genética de Drosophila melanogaster, se obtuvo por irradiación una población A con alteraciones
en la gametogénesis tanto de hembras como de machos, la misma consistía en fallas meióticas durante
anafase II. Como resultado de estas anormalidades se observó, por un lado, no disyunción de todo el complemento
cromosómico, con la consecuente producción de gametas completamente no reducidas y, por el otro, no reducción
de cromosomas sexuales, produciéndose gametas parcialmente no reducidas. Este tipo de gametas se encontraba en
una frecuencia elevada, pero también aparecieron gametas normales.
Con el objetivo de estudiar la viabilidad y capacidad de fecundación de estas gametas, se realizaron cruzamientos
entre hembras y machos de la población A, y se analizaron todos los descendientes obtenidos.

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Considerando que las gametas pueden fecundarse totalmente al azar, prediga el complemento cromosómico de
toda la descendencia posible y su fenotipo sexual.
3) En humanos, el gen Sry (localizado en el segmento diferencial del cromosoma Y) determina masculinidad. Qué
fenotipo sexual, y cuántos corpúsculos de Barr presentarán los siguientes individuos: a) 46, XY b) 47, XXY c)
45, X
4) Supongamos que una determinada enzima dimérica A, cuyo locus se encuentra en el
segmento diferencial del cromosoma X, interviene tanto en el metabolismo de Drosophila
como en el del ratón, y que en ambos casos dos variantes moleculares de dicha enzima están
codificadas por los alelos A1 y A2. El genotipo de los individuos es distinguible por
electroforesis según el siguiente esquema:
Se hace el siguiente experimento, tanto en Drosophila como en ratón. A partir de un tejido adecuado de una hembra
heterocigota A1A2 se obtiene un cultivo celular primario y de este 10 subcultivos unicelulares. ¿Qué patrones
electroforéticos se obtendrán en los siguientes casos? a) Cultivo primario de Drosophila. b) Subcultivos de Drosophila.
c) Cultivo primario de ratona. d) Subcultivos de ratona.
5) En el ratón existen dos sistemas enzimáticos cuyos productos son
detectables en los glóbulos rojos. Los mismos están determinados por
las parejas alélicas A,a y B,b, cuyos loci respectivos están situados en
el segmento diferencial del cromosoma X. Unas hembras diheterocigotas
(hijas de machos que presentaban las enzimas A y b) se cruzaron
con machos AB, obteniéndose la siguiente descendencia masculina:
AB:34; ab:26; Ab:67; aB:73. Teniendo en cuenta la hipótesis de
Lyon, de los ocho tipos de hembras que se señalan en la tabla, ¿Cuáles
serán las hermanas de los machos antes indicados? ¿Con qué frecuencia
aparecerá cada una?
Tipo de
Hembra
A1A1 A2A2
6) Ni el Zar Nicolas II ni su esposa la Emperatriz Alexandra tenían la
enfermedad conocida como hemofilia, caracterizada por estar ligada al sexo. Su hija, la princesa Anastasia, tampoco
la tenía, pero el Zarevich Alexius, su hermano, sí. ¿Podria Anastasia haber sido portadora de la hemofilia? Si se
hubiese casado con su primo Henry, que era hemofílico, alguno de sus hijos o hija ¿habrían sido hemofílicos?
7) Es de conocimiento popular que todo gato de 3 colores es gata (hembra). A este tipo de gatos se los llama calico.
Se sabe que el pelaje blanco presente en sectores o mosaicos proviene de un gen independiente del que produce
pelaje naranja o negro.
Se realizaron dos cruzamientos:
1) Macho blanco y negro x Hembra blanca y naranja → 50% machos blancos y
naranjas, 50% hembras tricolores
2) Macho blanco y naranja x Hembra blanca y negra → 50% machos blancos y
negros, 50% hembras tricolores
a) ¿Cuál es el indicador más evidente de la ausencia de herencia mendeliana? b)
¿Por qué gatos machos no tienen nunca 3 colores? c) Explique la base genética
de este comportamiento. d) ¿Cómo sería el resultado de cruzar una hembra tricolor
por un macho blanco y negro?
8) ¿Es posible que, en los humanos, un gen mutante recesivo esté localizado en el cromosoma X, si una mujer que
presenta el rasgo recesivo y un hombre normal tienen un hijo varón normal? Explique.
9) En la especie humana la presencia de cierto mechón de pelo blanco es un caracter influido por el sexo, dominante
en el hombre y recesivo en la mujer. La protanopia (tipo especial de ceguera al color rojo) está determinada por
el alelo recesivo de un gen situado en el segmento diferencial del cromosoma X. Un hombre con mechón blanco y
visión normal, cuyo padre carecía de dicho mechón, tiene descendencia con una mujer sin mechón y con visión
normal, cuyo padre carecía del mechón y tenía protanopia, y cuya madre tenía el mechón.
a) Qué proporción de los descendientes serán hembras con mechón blanco y visión normal?
b) Qué proporción de la descendencia serán machos con mechón blanco y protanopia?
10) En la mariposa trébol todos los machos son amarillos, en cambio las hembras pueden ser amarillas si tienen el
genotipo homocigota AA, o blancas si poseen el alelo (A'_). Sin tomar en consideración el sexo, qué proporciones
fenotípicas pueden esperarse en F1 de la cruza AA' x AA'?
+
-
Porcentaje de Glóbulos Rojos
con las Enzimas que se indican
A y B A y b a y B a y b
1 100
2 25 25 25 25
3 100
4 50 50
5 50 50
6 50 50
7 50 50
8 50 50

12.- MARCADORES MOLECULARES Y GENOTIPIFICACIÓN
Bibliografía: Biotecnología II: Levitus y col.
¡Odio ser ADN!
¡Hay tanta información
para
recordar!
Guía teórica:
1) ¿Qué son, de dónde se obtienen y para qué sirven las enzimas (mejor llamadas endonucleasas) de restricción?
¿Cómo hacen las bacterias que producen ER para evitar que su genoma se vea afectado por las mismas?
¿Qué tipos de especificidad presentan? ¿Qué tipos de extremos pueden generar en el ADN sustrato? R: Las
endonucleasas de restricción son producidas por bacterias como mecanismo de defensa contra los fagos. El
genoma se encuentra protegido por metilación específica del sitio de restricción mediante una metilasa con
igual especificidad que la endonucleasa. Cortan el ADN en sitios específicos (secuencias definidas de ADN de 4
ó 6 bases, generalmente). Algunos dejan extremos cohesivos, otros dejan extremos romos. El sitio blanco (de
reconocimiento) suele ser (aunque no siempre) un palíndrome, aunque el sitio de corte puede no coincidir con el
sitio de reconocimiento. Los fragmentos generados se pueden separar fácilmente mediante electroforesis en
geles de agarosa o poliacrilamida. La velocidad de los fragmentos depende de su longitud: los más pequeños
migran más rápido.
2) ¿En qué consiste la PCR de punto final? ¿Es una técnica cualitativa o cuantitativa?¿Qué diferencias existen
entre PCR de punto final y PCR de tiempo real? ¿Es posible hacer una PCR a partir de RNA? ¿Cómo puede
utilizarse para diagnóstico (la detección de HIV, por ejemplo)? ¿Qué ventajas o desventajas tendría respecto a
otras técnicas como el ELISA?
R: PCR: polymerase chain reaction (esquema del Recombinant DNA de Watson et al.)
- Utiliza la Taq polimerasa: Thermus aquaticus
- Permite amplificar segmentos específicos de ADN.
- No requiere digestión del ADN.
- No requiere clonar el segmento
- Se requiere poca cantidad de ADN.
Es una técnica fundamentalmente cualitativa, debido a que llega a una meseta de amplificación por limitantes que
no suelen ser la concentración del templado. La PCR en tiempo real va siguiendo la cinética de ampli- ficación
permitiendo comparar las fases logarítmicas de amplificación entre sí y así cuantificar con precisión los templados
frente a una referencia o estándar. Para realizar una PCR a partir de RNA se debe hacer RT-PCR (se llama
igual que la otra –una por Retro- Transcriptasa y la otra por Real Time). Se realiza la primera reacción
con retrotranscriptasa y después se continua con Taq pol.
Es posible utilizar PCR para diagnóstico y tiene como ventaja que se trata de un método directo (detecta al virus
y no los anticuerpos con los que reacciona el paciente). Por eso sirve para la detección en recién nacidos o
personal médico de alto riesgo que trabaja con pacientes, antes de los 6 meses que tarda en detectarse una respuesta
inmunológica. No da falsos positi- vos (salvo por contaminación de amplicones: un pro- blema general de
las PCRs). Desventajas: más complejo, caro y menos automatizable que un ELISA. Hay que purificar RNA e
implica mayor exposición al virus por parte del personal que hace el diagnóstico.
3) ¿En qué consiste un Southern blot? ¿y el northern? ¿y el western? ¿Para qué se usan y qué tipo de molé- culas
se detectan en cada caso? ¿Qué relación tiene el Southern con los RFLPs? Mencione 4 aplicaciones de los
RFLPs. Compare la utilización de Southern vs. PCR, northern vs. RT-PCR y western vs. ELISA.
R: Southern blotting:- Se parte de ADN (genómico de alto peso molecular en el caso de los RFLP) y se lo digiere
con enzimas de restricción.
- Los fragmentos de ADN se separan por electrofore- sis en gel de agarosa.
- Se transfiere a un filtro de nylon o nitrocelulosa y se desnaturaliza el ADN.
- Se incuba con una sonda marcada específica de la secuencia en estudio.
- Lavado y exposición del filtro.
- Detección autoradiográfica o fluorográfica. Esta técnica permite determinar:
a) Presencia y N° de sitios de corte con una determinada enzima de restricción en un fragmento de ADN dado
y establecer la existencia de polimorfismos para fines diagnósticos o estudio genético (RFLP).
b) Número de copias (aproximado) del gen en el genoma, por ejemplo, cuando se hacen transgénicos.
Los RFLP surgen de comparar los patrones de restricción de Southern blot entre distintos individuos, especies,
etc. observando diferencias (polimorfismos) en sitios de corte.
Aplicaciones de los RFLP:
- mapeo genético - diagnóstico prenatal
- diferenciación de individuos (fingerprinting)
- estudios evolutivos
Northern blotting:
- El ARN celular total o mRNA se separa por tamaño utilizando electroforesis en gel de agarosa (en presencia
26

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de un agente desnaturalizante como el for- maldeído para evitar la formación de estructuras secundarias en el
ARN durante la corrida).
- Se transfiere a un filtro de nitrocelulosa.
- Hibridación con una sonda apropiada marcada seguida por autoradiografía. Se revelan bandas que in- dican el
número y tamaño de los tipos de ARN complementarios a la sonda.
Permite cuantificar aproximadamente y evaluar nive- les de expresión de genes (para mejor precisión se usa RT-
PCR en tiempo real). También es útil, entre otras cosas, como auxiliar del clonado de cDNA porque el tamaño
de un mRNA específico puede compararse con el tamaño de los cDNA copiados de ese mRNA, y revela si este
cDNA está completo.
En el Western blotting se transfieren proteínas corri- das en un gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa
o PVDF y luego se las visualiza por su reacción con anticuerpos específicos.
La PCR ha desplazado, paulatinamente, al Southern para varias de sus aplicaciones (por ser menos complejo,
tener menos requerimientos de cantidad de templado, y porque puede automatizarse mejor) pero no en todos los
casos (por ej., comparaciones evolutivas). Pero aún en este último caso, hoy en día empiezan a ser reemplazados
por los SNPs o por comparación directa de la secuencia nucleotídica de genes diagnósticos. En algunos casos, se
puede tener una sonda pero no conocer la secuencia nucleotídica para diseñar los iniciadores, por lo que se puede
hacer un Southern si no se tiene la información como para hacer PCR. Northern y RT-PCR, ídem que con Southern.
La PCR “común” (punto final) no es cuantitativa, para ello se debe hacer PCR de tiempo real (qRT-PCR).
El western es más específico que el ELISA (se identifica la banda). No da falsos positivos. Es más complejo y
caro. Se utiliza para confirmación del HIV, por ej.
4) ¿Cómo clasificaría de acuerdo a la metodología a las distintas técnicas conducentes a obtener marcadores genéticos
moleculares (RFLP, AFLP, RAPD, SSR, SNP).¿Cuál es el origen de la variación genómica (mutaciones)
detectada por cada una de ellas y cuál es su magnitud? Haga una comparación entre ellas.
R: Los RFLP fueron los primeros marcadores de ADN en ser utilizados. Surgen de comparar los patrones de restricción
de Southern blot entre distintos individuos, especies, etc. observando diferencias (polimorfismos) en sitios
de corte. Debido a que se basan en la hibridación molecular lo que permite el reconocimiento entre secuencias que
no son totalmente homólogas, se los considera marcadores relativamente conservados que permiten comparaciones
evolutivas entre especies, géneros y familias relacionados (dependiendo de la secuencia, se puede progresar en la
escala taxonómica hasta más arriba). Se continúan usando en estudios de sintenia (mapeo comparativo). Como
restricción PCR hibridción dominantes codomnan.
RFLP + - + - +
AFLP + + - + -
RAPD - + - + -
SSR - + - - +
SNP +/- + - - +
contrapartida, resulta más complicado encontrar variabilidad
(polimorfismos informativos) intraespecíficos para
hacer, por ejemplo, genotipificación (identificación a nivel
de individuo o fingerprinting).
Hoy en día, los RFLPs han sido desplazados en gran medida
por los SNPs (polimorfismo de nucleótido simple –
único-, se pronuncia SNiP). Los SNP no tienen una única
metodología como los RFLP sino varias, aunque todas ellas requieren de PCR en alguno de sus pasos. Cualquier
técnica que permite visualizar un cambio en un nucleótido se clasifica como SNP. Como ejemplo ya se mencionó a
los que implican la amplificación y posterior digestión del producto de PCR con una enzima de restricción (aquel
que fuera responsable del polimorfismo en el RFLP). Hoy en día, los polimorfismos a detectar son identificados a
partir de estudios previos de secuenciaciones genómi- cas más que de RFLP. No todos los SNPs requieren restricción.
Otra técnica clásica clasificada como SNP es la SSCP que consiste en desnaturalizar el ADN y diferenciar
electroforéticamente las diferen- cias de migración de los plegamientos secundarios intracatenarios derivados del
cambio nucleotídico. Estos marcadores ofrecen varias ventajas respecto de los RFLP: a) existe mayor número de
alelos en la población (en humanos se estima que hay un SNP cada 1000 pb) y b) el grado de heterocigosis es alto,
con lo que resultan ser más informativos. Comparten con los RFLP la ventaja de no ser anónimos (se conoce su
identidad –secuencia, pertenencia a un gen, por ej.-) y su codominancia (posibilidad de diferenciar heterocigotas de
homocigotas).
Los otros marcadores de mayor utilización (junto con los SNPs) son los microsatélites o SSR (single sequence
repeats) están constituidos por un motivo (secuencia corta de ADN) de repetición en tándem de di-, tri y tetranucleótidos.
La repetición más común es la del dinucleótido CA en animales y TA en vegetales. Aquí lo que varía no
es un único nucleótido, sino el número de veces en que se repite el motivo de repetición, lo que es detectado como
productos de amplificación que poseen tamaños que varían según la cantidad de repeticiones. Son los marcadores
más utilizados para genotipificación (también llamado genotipado o fingerprinting).
Los RAPDs (randomly amplified polymorphic DNA, se pronuncia RAPiD) son marcadores moleculares que surgen
luego de utilizar un único oligonucleótido iniciador (primer) en la reacción de PCR. Son polimorfismos para
fragmentos de ADN amplificados al azar del genoma, obteniéndose una serie de bandas de distintos tamaños según
donde se haya pegado ese primer. Este conjunto de bandas sirve como una huella de ADN que puede emplearse
para caracterizar a un individuo. Se dice que es al azar pues se utilizan primers que no se sabe en qué lugar del
genoma
hibri- dan. Por eso se dice que son anónimos porque se desconoce la secuencia y (salvo mapeo específico) su localización
cromosómica. Como son oligonucleótidos de 10 bases, en general “pegan” en varias regiones del genoma,
por lo que al correr el producto de la PCR en geles de agarosa, generalmente se observan varios fragmentos, que
miden hasta 2 kpb. Otra desventaja es que son marcadores dominantes (no se puede diferenciar al heterocigota del
homocigota) y problemas de reproducibilidad. Su mayores ventajas son los bajos costos y la posibilidad de usarlos

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con cualquier genoma de cualquier especie aunque se desconozca absolutamente todo de su secuencia genómica.
Al igual que los RFLPs, se los puede mejorar secuenciando y convirtiendo en marcadores de PCR específica (en
este caso se llaman SCARs). Los AFLP representan una sofisticación más reproducible que combina restricción
con endonucleasas y amplificación selectiva por PCR. Si bien
comparte desventajas y ventajas con los RAPD (son dominantes
y anónimos, no requieren de información genómica previa),
son más costosos pero su mayor costo se ve compensado
por la generación de muchas más bandas polimórficas por
corrida (data points) y mayor reproducibilidad.
Aclaraciones: sustituciones: cambio de nucleótidos, INDELs:
INserciones o DELeciones, Hiper: hipervariables (altísima tasa de mutación/evolución, máximo polimorfismo),
Alta: variación, Conservado (particu- larmente cuando son secuencias codificantes)
5) Suponiendo que en un genoma dado las 4 bases posibles se encuentran representadas en forma similar y totalmente
al azar (contenido de GC = 50% unifor- memente distribuido a lo largo del genoma):
a) ¿Cuál es la distancia promedio esperable entre sitios de restricción para enzimas que reconocen especificidades
de secuencia de 6 pares de bases, como EcoRI? ¿y para una de 4 o de 8 pb?
b) ¿Cuántos sitios de restricción y, por lo tanto, bandas de DNA en un gel, se generarían en un genoma humano
(109 pb), bacteriano (106 pb), o mitocondrial humano (104 pb) se generarían con EcoRI?
c) ¿Cuántas bandas generarían los RAPD que se hacen con decámeros y se detectan por PCR?
R: a) Un sitio de restricción de 6 bases aparecerá, como promedio, una vez cada 4 6 bases, es decir 4.096 pb. Una de
4 será cada 44 pb = 256 pb, uno de 8 pb será de una cada 65.536 pb.
b) 10 9 dividido por 4x103 = 250.000 bandas o sitios para el genoma humano; 250 para una bacteria y entre 2 y 3
para el genoma mitocondrial.
c) Por un lado debemos considerar que los sitios complementarios a los primers tienen que ser “perfectos” (los 10
nucleótidos tienen que ser
perfectamente complementarios, lo que no es necesariamente cierto). Por lo tanto la distancia se podría calcular
como para los sitios de restricción 4 10 = 1.048.576. En un genoma humano habría 1000 sitios, en uno bacteriano,
uno sólo. De todos modos, para que haya bandas se requieren 2 condiciones adicionales: que las orientaciones
estén invertidas y “apuntando” hacia adentro entre primers vecinos (se reduce a un cuarto = 250 y la distancia media
aumenta a 4 millones) y que la distancia sea menor a los 4000 pb porque la Taq polimerasa deja de funcionar
eficientemente más allá de este tamaño. La probabilidad de que 2 sitios distintos estén en una posición arbitraria es
de uno en 4 10 x 4 10 = 4 2x10 = 1.099.511.627.776 ~ 10 12 . Sabiendo que las distancias para una amplificación detectable
varían entre un poco menos de 100 y aproximadamente 2500-2600 pb, la probabilidad de encontrar 2 secuencias
en alguno de esos nucleótidos es 44-2x10 x 2500 = 10 -12 x 2,5.10 3 = 2,5 x 10 -9 sustitución INDEL Hiper Alta Conservado
RFLP - + - - +
AFLP + - - + -
RAPD - + - + -
SSR - + + - -
SNP + - - + -
, lo que significa que espero encontrar
entre 2 y 3 bandas por genoma de organismo superior por primer, es decir que de las 250 bandas potenciales, sólo
el 1% está a la distancia necesaria para dar bandas amplificables. Sin embargo, el número de bandas observadas es
mayor, debido a que no es requerida una complementaridad de bases perfecta en las condiciones de anillado de los
primers.
Problemas:
1) Un fragmento de ADN clonado, con extremos cohesivos generados por
EcoRI, lleva el gen que codifica para un polipéptido de la cápside de un
virus que infecta a humanos, pero que enferma sólo a personas que tienen
las defensas inmunológicas disminuidas. Ese fragmento de ADN, que tiene
8 kpb de longitud, se inserta en el plásmido bacteriano pBR322 en su
único sitio para EcoRI. El plásmido recombinante es cortado por dos endonucleasas
de restricción (por se parado o juntas) y luego es sometido a
Southern Southern Northern Northern Western Western
1 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 4 55 5 1 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 4 55 5 1 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 4 55
5
A) A) EcoRI EcoRI B) B) BamHI BamHI C) C) E E + + BB
8 8 8 kpb kpb kpb
6 6 6 kpb kpb kpb 5,5 5,5 5,5 kpb kpb kpb
4,5 4,5 4,5 kpb kpb kpb
4 4 4 kpb kpb kpb
electroforesis en un gel de agarosa y teñido con bromuro de etidio. En la figura se muestra el patrón de bandas
(visualizadas por medio de luz UV) originado por cada uno de los tratamientos:
Al realizar Southern blots de los geles "B" y "C", ¿qué fragmentos hibridarán
con una sonda del gen de la cápside del virus?
2) Un investigador está estudiando un polimorfismo en el largo de los
fragmentos de restricción (RFLP) ubicado en el cromosoma 7, que presenta
dos alelos. El sitio de corte para EcoRI indicado con la flecha
está presente en uno de los alelos (A1) y ausente en el otro (A2).
a) ¿Cuál será el patrón de
bandas del RFLP para
Sonda Sonda 11
Sonda Sonda 22
EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI
4 4 4 kpb kpb kpb 2 2 2 kpb kpb kpb
4 4 4 kpb kpb kpb
3,5 3,5 3,5 kpb kpb kpb
3 3 3 kpb kpb kpb
2,5 2,5 2,5 kpb kpb kpb
1 1 1 kpb kpb kpb
un individuo A1A1 utilizando la sonda 1? ¿Y para uno
A2A2? ¿Y para el heterocigota? b) ¿Y con la sonda 2?
3) El interferón está codificado por un gen que no contiene
intrones. Por corte con BamHI, se genera un único fragmento de
restricción conteniendo al gen completo, que puede ser identifi

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cado en un Southern blot con una sonda de cDNA marcada radioactivamente. Para determinar la posible causa de
una inmunodeficiencia, muestras de sangre de pacientes y de personas no afectadas fueron utilizadas para estudiar
el gen del interferón y la expresión del mismo. Se muestran a continuación autorradiografías de Southern y northern
de dichos experimentos, así como también un western-blot representativo utilizando anticuerpos antiinterferón
. Los individuos 1 y 2 no son afectados (sanos). En base a los resultados con Southern, Northern y
Western:
a) ¿Cuál sería la posible causa de la inmunodeficiencia en los pacientes 3, 4, y 5?
b) ¿Qué característica particular tiene el individuo 2 para el gen del interferón ?
c) ¿Importa a partir de qué tejido se realizó el Southern? ¿Y el northern y el western?
4) El famoso detective ochentoso Sherlock Molecularis se encuentró investigando un asesinato
en una disco. La pista determinante del caso es una mancha de semen encontrado en
la ropa de la víctima, del que pudo extraerse DNA, el cual se sometió a corte por una enzima
de restricción apropiada y posterior electroforesis, cuyo Southern blot se analizó por
minisatélites (VNTR): hibridación con el fago M13 (sonda de Jeffreys, Nature
314[1985]:67-72). En un carril paralelo se corrió, en idénticas condiciones, una muestra de
DNA de linfocitos del sospechoso Jack Destripadorius. En la figura se muestra el resultado
de la correspondiente autorradiografía:
I.- Si fuera Watson (no James), ¿cuál de las siguientes afirmaciones creería correcta para
asesorar a Sherlock?:
a) Jack es presumiblemente culpable porque la sonda hibrida tanto con el DNA de la mancha
como con el de Jack. La diferencia en el patrón de bandas se debe a que el semen contiene
gametas y estas reflejan la mitad de las secuencias (constitución haploide). Para confirmar
la culpabilidad habría que repetir el análisis con una muestra de semen de Jack y no de sangre.
b) Jack no es culpable porque los patrones son diferentes a pesar de que ambos DNAs hibridan con la sonda y
comparten buena parte del patrón de bandas.
c) El presunto culpable pasó a ser el hermano prófugo de Jack (con antecedentes policiales) porque el patrón de
bandas de Jack no coincide, pero las bandas comunes (aproximadamente la mitad de todas las bandas) hacen sospechar
de él. Se requiere, sin embargo, un análisis del DNA del joven escurridizo para confirmar esta hipótesis.
II.- Dado que estas secuencias son tan hipervariables (muy polimórficas), se supone que la tasa de mutación (creación
de nuevos alelos por el mecanismo de recombinación desigual o por deslizamiento de la DNA polimerasa) en
gametas es considerable (se calcula un µ = 0,001). ¿Cree Ud. que se puede usar este tipo de análisis para tests de
paternidad o de hermandad?
III.- ¿Qué % de bandas coincidentes se esperaría encontrar, comparando los patrones de bandas de personas relacionadas
por los siguientes parentezcos?:- madre e hijo, - abuelo y nieto, - tío y sobrino
5) Pasó sin llamar mucho la atención una película de hace unos años llamada GAT-
TACA (que no debe su nombre a una gata muy agresiva sino a una secuencia nucleotídica
y a la vez nombre de un centro de viajes al espacio del futuro cercano). Se
trata de un thriller con ambiente de ciencia-ficción que se plantea un escenario futuro
muy inquietante. Gracias al conocimiento del genoma humano, se podrá predecir
con bastante precisión las probabilidades de morir, por ejemplo, de un ataque cardíaco
antes de los 30 años. La película avanza en otro aspecto que es la posibilidad de
planificar la composición genética (alelos) de los hijos de una pareja. No lo hace
en un sentido tan declaradamente fascista (que todos sean arios, rubios y de ojos
azules estilo “Los niños de Brasil”), sino tratando de evitar los alelos de la llamada
carga genética (alelos que predisponen a enfermedades coronarias, cáncer, neurológicas,
etc.). No se trata de “clonar” un Hitler o un premio Nóbel, sino elegir entre
los futuros hijos posibles disponibles, “los mejores alelos” del padre y la madre del
futuro hijo/a, sin despreciar los clásicos color de ojos, coeficiente intelectual o
altura.
a) ¿Le parece que esto sea factible en la ciencia real? Si Ud. fuera un científico
convencido de las bondades de liberar a la especie humana de su carga genética, basándose en las técnicas que
aprendió sobre clona- ción e ingeniería genética en animales (que no es este caso) ¿Cómo diseñaría un sistema
de análisis de este tipo?
b) Si bien en una parte de la película, en menos de 5 minutos pueden generar un largo diploma con la secuencia
nucleotídica de una muestra sacada de un pelo, aún en el mejor escenario futuro (en el sentido científico),
no se podrán secuenciar los 30.000 genes humanos para una aplicación masiva como la mencionada por menos
de unos miles de dólares y tiempos más largos ¿Qué tipo de marcadores moleculares tendría que utilizar para esta
detección? ¿Podrá detectar todas las mutaciones posibles?
Para “premiar” la “planificación genética familiar”, la sociedad de GATTACA se divide en 2 clases bien diferenciadas.
Aquellos que fueron “planificados” tienen acceso a los mejores empleos, mientras que aquellos que
son “hijos del azar” son considerados “inválidos” o “de-gen-erados” y sólo pueden ser barrenderos o tener

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profesiones mal pagas. En la película, una familia tiene 2 hermanos (uno de cada “clase”). El hermano no planificado
“genéticamente inferior” logra engañar al sistema y acceder a un buen empleo aprovechando la complicidad
de una persona “genéticamente calificada” que le da muestras de tejido (de su DNA, bah). Todo va bien
hasta que se produce un asesinato y.... no le vamos a contar la parte sustanciosa de la película. El tema es
que hay una “chica linda” (ni más ni menos que Umma Thurman) que se enamora del muchacho degenerado
(Ethan Hawke) que, si bien será genéticamente inferior, es también ¡tan bueno y lindo! Bueno, la chica lleva
pelos a una empresa que, por pocos dólares, le analiza (por computadora) la huella digital genética de identidad
del muchachito (obviamente tiene sus dudas y no es cuestión de juntar sus alelos con un desconocido).
c) ¿Es esto posible? ¿Qué técnicas utilizaría para poder hacer una cosa así? (no estamos hablando de predisposición
a enfermedades, sino de identidad).
6) La (kappa) -caseína es una proteína presente en la leche bovina y juega un papel importante en el proceso de
elaboración de quesos. Un alelo del gen de la -caseína, llamado “A”, produce un tipo de caseína que da un queso
de calidad superior a la que da otro alelo, llamado “a”. La única diferencia entre ellos radica en una base que abarca
el sitio de restricción para la endonucleasa Hind III, lo cual hace que el sitio esté presente en “A” y ausente en “a”
Gtgctggag(t/c)aggtatcctag
Sitio Hind III +/-
región 3’ no codificante
región codificante
DNA amplificado (874 pb) ggtcacaacaa cgtg agatg
Al hacer PCR con iniciadores ("primers") específicos (indicados en la fig.) sobre muestras de sangre de cinco toros
y posterior tratamiento con Hind III, se obtuvieron los siguientes resultados (Animal Genetics 22, 11 [1991]):
a) ¿Qué clase de marcador estamos analizando: dominante o codominante?
b) ¿Cuál es el genotipo de los toros testados?
1 2 3 4 5 pb
c) Si Ud. fuera un rico y poderoso productor agropecuario que abastece leche
a una importante fábrica de muzzarella,
- ¿cuáles bovinos elegiría para realizar apareamientos dirigidos?
874
- ¿seleccionaría además basándose en otras características fenotípicas?
- ¿financiaría un proyecto de investigación a realizar por un Licenciado en
521
Biología para optimizar (por ejemplo automatizar) la tipificación genotípica?
d) ¿Qué ventajas tiene este método sobre el clásico de RFLP?
e) ¿De qué otros tejidos se podría extraer DNA de los toros?
353
f) ¿Se podría determinar el genotipo de vacas, haciendo PAGE no desnaturalizante de proteínas en muestras de leche?
13. GENÉTICA BACTERIANA
Bibliografía Microbial Genetics, D. Freifelder, Jones and Bartlett Publishers, Inc. Modern Microbial Genetics.
Streps UN y Yasbin RE (1991) J Wiley Sons.
Guía de Estudio:
1) ¿Cómo es la estructura de una célula bacteriana? ¿Como está organizado su genoma?
R: La célula bacteriana (gram-) contiene dos membranas externas que encierran el espacio periplásmico y una
pared celular, generalmente de péptidoglucano, que le otorga rigidez y protege de los “shocks” osmóticos. La
membrana interna encierra al citoplama, separándolo del periplasma. En el citoplasma encontramos toda la maquinaria
necesaria para la síntesis de ácidos nucleicos y proteínas. La membrana interna es compuesta por una bicapa
lipídica mayormente de fosfolípidos, mientras que la externa contiene una hemimembrana interna similar y una
capa externa de lipopolisacárico. Las bacterias gram+ no tienen membrana externa y la pared de peptidoglicano es
más gruesa que la de las gram-.
Si bien no existe un núcleo, como en las células eucariotas, el ADN se encuentra organizado en el nucleoide, que
es una masa de ADN y proteínas (80% ADN), que puede ser observado por microscopía. El nucleoide contiene
dominios cuyo grado de superenrrollamiento no es afectado por los dominios vecinos. Este grado de independencia
sugiere que los dominos están asociados a una matriz que impide que se transfieran las tensiones entre ellos. El
cromosoma bacteriano no está tan empaquetado como el de los eucariotas, pero se encuentra asociado a una serie
de proteínas que cumplen funciones análogas a las de las histonas, como ser HU, HN-S, Fis e IHF. En la mayoría
de los casos conocidos, las bacterias poseen un único cromosoma circular que se replica en forma bidireccional.
Pueden contener plásmidos grandes (el factor F o el plásmido Ti, por ejemplo, pueden llegar a tener 200 kpb y
pueden servir como vectores para ingeniería genética: BAC).
2) ¿Cómo se multiplican las bacterias?

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R: Se reproducen asexualmente por división binaria (aunque no es la única forma). Es asexual y en los libros viejos
se la llama fisión). Incluso las bacterias que esporulan (Bacillus y Clostridium) lo hacen asexualmente y son un
ejemplo del fenómeno de diferenciación celular.
3) ¿Qué es un cultivo líquido? ¿Y uno sólido? ¿Para qué se utiliza cada uno?
R: Medio de cultivo líquido: es un medio que no tiene soporte sólido, donde los microorganismos crecen en suspensión
y los nutrientes difunden libremente, por lo que existe competencia por ellos entre los microorganismos.
El medio líquido se puede realizar en tubos de ensayo (pocos ml), Erlenmeyers (decenas o cientos de ml) o en fermentadores
de varias escalas. Medio de cultivo sólido: difiere del líquido en el agregado de una matriz inerte que
sirve de “sostén” para el crecimiento bacteriano. Esta “matriz” es por lo general de ágar, un polímero extraído de
algas, de consistencia similar a una gelatina. El crecimiento bacteriano ocurre sobre la superficie del ágar, de forma
que los microorganismos no pueden moverse libremente y forman colonias aisladas. Los componentes solubles del
medio difunden lentamente, por lo que disminuye considerablemente la competencia entre los microorganismos
que comparten el medio de cultivo. El medio sólido se suele realizar en cajas de Petri (de varios tamaños y formas),
o en frascos chatos (de Roux, utilizados para células tipo fibroblastos). Cada microorganismo origina una
colonia, que en muchos casos, por sus características, permite la identificación del microorganismo que la generó.
Los medios de enriquecimiento permiten aumentar la proporción de un microorganismo determinado en una población
heterogénea. Para ello debe haber competencia entre las distintas cepas microbianas, de forma tal que aumente
la proporción de aquellas para las cuales el medio de cultivo es adecuado. Es por ello que los medios de
enriquecimiento son líquidos, de forma de facilitar la difusión de nutrientes y/o de inhibidores que se utilicen. El
medio sólido sirve para aislar colonias (clones) individuales (purificar). El medio líquido sirve para obtener masa
(gran cantidad) de células, por ejemplo, para obtener plásmidos en forma preparativa.
4) ¿Qué diferencia un medio selectivo de medio diferencial.
R: Un medio selectivo es aquél donde sólo crecerán determinadas cepas o especies. Es un caso extremo de medio
de enriquecimiento, pero dado que la competencia entre microorganismos no es necesaria, se utilizan medios sólidos.
Un ejemplo de medio selectivo es el que utiliza un antibiótico que sólo permite el crecimiento de las cepas
resistentes. Un medio diferencial es aquel que permite diferenciar al menos una de las distintas cepas/especies de
una muestra. Los medios diferenciales son sólidos, para permitir el crecimiento aislado de las distintas colonias, de
forma tal que puedan distinguirse. El medio diferencial no impide el crecimiento, simplemente permite diferenciar.
(ej. bacterias lac+ vs lac- en presencia de X-gal).
5) Diferencie entre un medio completo y uno definido ¿Para qué los utilizaría?
R: Medio completo es el que contiene todos los nutrientes incluyendo fuentes de carbono y nitrógeno necesarias
para el crecimiento pero no están bien definidos en su composición que puede variar levemente de partida a partida.
Por ej. la triptona del medio LB es un hidrolizado de caseína con tripsina, el extracto de levadura es un extracto
soluble de levaduras hidrolizadas. El medio definido, en cambio, contiene componentes y concentraciones de aminoácidos
individuales y vitaminas (por ejemplo biotina para E. coli) perfectamente establecidos y constantes.
6) ¿Qué es la técnica de plaqueo en réplica (replica plating)? ¿Para qué sirve?
R: Cuando obtenemos sobre la superficie del agar de una caja de petri un número de colonias, cada una de las cuales
proviene de un solo microorganismo y debemos analizar su comportamiento en distintos medios de cultivo,
existe la posibilidad de “replicar” dicha placa de petri. Esto implica obtener otra placa con la misma distribución de
colonias, cada una de las cuales debe ser genéticamente idéntica a la de la placa madre. Para ello se usa un trozo de
terciopelo estéril, que cubre un lado de un cilindro del diámetro de la caja de petri. El cilindro se coloca suavemente
sobre la caja de petri a replicar, contactando el terciopelo con las colonias. Algunos microorganismos de cada
colonia quedarán adheridos al terciopelo, y este se usa a la manera de un “sello” en una caja de petri vacía. En esta
última, crecerán colonias idénticas a las originales, en la misma posición. Podríamos evaluar, por ejemplo cuales
son resistentes a un antibiótico determinado, con lo que bastaría con preparar una placa con dicho antibiótico y
hacer la réplica a dos placas, una con y otra sin antibiótico.
7) ¿Qué es una placa (playa o calva) de lisis?
R: La difusión limitada que se observa en los medios sólidos también puede ser utilizada para estudiar fagos (virus)
bacterianos. Si distribuimos sobre una placa de petri un cultivo denso de bacterias, ellas crecerán cubriendo
toda la superficie, lo que llamamos “césped”. Si antes de sembrar la placa, mezclamos las bacterias con una suspensión
diluída de fagos, éstos infectarán y lisarán las bacterias y en la superficie del ágar se observará un halo
translúcido por cada fago infectivo como consecuencia de la lisis localizada de bacterias. Es decir, las bacterias son
el “medio de cultivo” de los fagos. Esto no sólo permite titular (contar) suspensiones de fagos, también permite
trabajar con ellos en forma análoga a lo que hacemos con otros microorganismos. Existe un método análogo para
estudiar virus animales, aunque eso se hace sobre monocapas de células en cultivo. Para obtener un número bajo y
cuantificable de placas se requiere mezclar un exceso de bacterias con una cantidad mucho menor de viriones (a
esto se le llama baja multiplicidad) de manera que la probabilidad de que 2 partículas virales distintas penetren en
la misma célula sea insignificante. Después se plaquean las células sobre la caja de Petri.
8) ¿Qué se entiende por "sexo" en organismos procarióticos (¡NO en eucarióticos!)?
R: A los bizarras formas de transferencia parcial de ADN entre bacterias de la misma o de distinta especie: transformación,
a través: bacterias muertas que actúan como “machos” (donantes); transducción, a través de sus virus;
conjugación: a través de plásmidos y estructuras de secreción que conforman puentes celulares.
9) Describa brevemente el mecanismo de conjugación. ¿Siempre se observa transferencia de información genética
cromosómica?

32
R: Se produce entre una bacteria conteniendo un plásmido conjugativo (históricamente denominado Factor F o
episoma) llamada F+ y una que no lo contiene. La conjugación es el mecanismo por el cual una bacteria transfiere
a otra una hebra simple de ADN. El mecanismo es similar al de replicación por círculo rodante (rolling circle).
Primero se genera un corte (nick) en una de las cadenas, más precisamente en la región conocida como oriT, por
origen de transferencia. En el sitio de corte, una helicasa comienza a separar ambas cadenas, a partir de ese punto
comienza la transferencia de una de ellas. La transferencia termina cuando se transfiere la secuencia completa
(plásmido, por ejemplo) o cuando se interrumpe el contacto entre la bacteria aceptora y la dadora (transferencia
cromosómica). En el caso de los plásmidos, cuando finaliza la transferencia se recircularizan utilizando el oriT y la
cadena complementaria se sintetiza de novo tanto en la bacteria dadora como en la aceptora. Además del oriT, los
plásmidos transmisibles contienen una serie de genes que son necesarios para la transferencia, los genes tra. Estos
genes codifican para el “pilus” que es una estructura que protruye de la bacteria dadora y hace contacto con la bacteria
receptora y facilita la formación de complejos de secreción tipo III. Además del pilus, otros genes tra codifican
para proteínas que no tienen un rol estructural, como ser la endonucleasa que realiza el corte inicial y la helicasa
.Otro tipo de plásmidos que no son transmisibles, pero si son movilizables se encuentran en la naturaleza. Dichos
plásmidos no contienen el juego completo de genes tra, pero sí contienen la región mob, que permite que los
genes tra de un plásmido transmisible puedan actuar en trans para transferir a los plásmidos movilizables. La región
mob contiene un origen de transferencia y algunas de las enzimas necesarias para la transferencia, como ser la
endonucleasa y la helicasa. En el caso más común, sólo se transfiere una copia (en general completa) del plásmido
(ej. factor F) por lo que la célula receptor (F-) se convierte en F+. NO hay tranferencia de genes cromosómicos ni,
por lo tanto, aparición de recombinantes para genes crosomales; a menos que estos se encuentren transpuestos en
el Factor F (sexducción), lo que no es muy común. Esta forma de “apareamiento” permite transferir horizontalmente
(es decir, incluso entre especies distintas como E. coli y Salmonella typhimurium) genes nuevos importantes
como pueden ser los genes de resistencia a antibióticos que pueden ubicarse en plásmidos por la susodicha transposición.
Se observa transferencia de ADN cromosómico en donantes Hfr (factor F cointegrado al genoma cromosomal)
o en sexducción (factor F recombinado = F' conteniendo algún gen cromosomal).
10) ¿Cuál es la diferencia entre una cepa Hfr y una F+?
R: Hfr proviene de “High frequency recombination”. El plásmido F tiene aproximadamente unas 100 kpb y codifica
para los genes tra que lo hacen transmisible, manteniendo en general una copia por célula. Las cepas F+, son las
que contienen el plásmido F como episoma. Como el plásmido F tiene algunas secuencias homólogas a secuencias
cromosómicas (transposones llamados elementos IS), en algunos casos ocurren eventos de recombinación, donde
el plásmido F se integra al cromosoma. En estos casos, el oriT y los genes tra siguen siendo funcionales, y promueven
la transferencia del cromosoma, que puede llegar incluso a ser completa. La transferencia cromosómica es
la causa de la alta frecuencia de recombinación de estas cepas y de allí su nombre Hfr. La cointegración del plásmido
(la cual se produce, usualmente, por entrecruzamiento via recombinasa (rec A combinada con recBCD) entre
el cromosoma y el factor F en regiones con secuencias homólogas, usualmente transposones duplicados en ambos
ADNs o, más raramente, como producto de una transposición sin resolución). Resolución quiere decir: separación
de los 2 círculos cointegrados después de que se produjo la copia o transferencia del transposón entre el círculo de
ADN dador al receptor).
11) ¿Qué es un F' y cómo se origina?
R: Un F' es un plásmido derivado del F que contiene fragmentos de ADN cromosómico. Cuando un plásmido F se
escinde de una cepa Hfr (resolución), en general ocurre por recombinación entre los sitios IS flanqueantes (los
mismos que permitieron la integración). Hay casos en que los eventos de recombinación ocurren entre secuencias
más lejanas (otros elementos IS o secuencias homólogas) y el plásmido que se escinde es mayor que el original y
contiene el fragmento cromosómico que estaba contenido entre las secuencias que recombinaron. Estos plásmidos
F se denominan F’. También se pueden generar plásmidos F’ por otros mecanismos como ser la transposición. Un
F’es una forma “natural” (in vivo) de clonado molecular en un vector plasmídico, sin uso de enzimas de restricción,
muy usada por los genetistas bacterianos. Los genetistas bacterianos suelen utilizar, para ello, un virus que es,
al mismo tiempo, un transposón llamado fago μ.
12) ¿Cómo determinaría orden y distancia entre genes utilizando la técnica de "apareamiento interrumpido"?
R: Cuando una cepa Hfr conjuga con una cepa F-, el ADN se transfiere desde el oriT. Puede llevar más de una hora
y media la transferencia completa, lo que generalmente no ocurre. El ADN transferido puede recombinar con el
cromosoma de la cepa aceptora. Dado que en la suspensión, la interrupción de la conjugación ocurre durante todo
el proceso, la frecuencia de recombinantes cae exponencialmente con la distancia al oriT. La frecuencia de recombinación
para un marcador es entonces una medida de la distancia al oriT. Para determinar el orden entre dos marcadores
se analizan la cantidad de recombinantes dobles. Cuanto mayor es la frecuencia de aparición de los dobles
recombinantes, menor es la distancia entre ellos (menor es la frecuencia de recombinantes entre ellos). Por lo tanto,
se hace cronometrando la aparición de recombinantes en una conjugación entre una Hfr y una F-que se interrumpe
artificialmente con una licuadora a distintos intervalos y que implique la transferencia de alelos diferenciables de
los genes a estudiar.
13) Algunos bacteriófagos tienen la capacidad de llevar a cabo dos tipos de ciclos dentro de su hospedador. Explíquelos
y ejemplifique. ¿Qué es un profago o un provirus?
R: Existen fagos en los cuales el proceso de infección puede tomar por dos vías antagónicas, lisis o lisogenia. En el
ciclo lítico, la funciones tempranas y tardías codificadas por el fago son activadas en forma programada originando
un gran número de partículas virales y provocando finalmente la lisis. En el ciclo lisogénico, la mayor parte de los
genes virales son reprimidos, el ADN viral se cointegra al genoma bacteriano formando un provirus (llamado pro-

33
fago en bacterias) y se multiplica silenciosamente en la bacteria. Hay procesos externos, como el daño al ADN que
producen la activación del ciclo lítico. Esta cointegración puede ser mediada por enzimas de recombinación codificadas
por los virus como es el caso de la integrasa del fago λ que, a diferencia de la recombinasa del huésped, produce
recombinación específica de sitio (una secuencia de ADN llamada attB, presente entre los operones gal y bio
de E. coli. Como esto es muy distinto a la recombinación homóloga tradicional, se lo denomina recombinación
ilegítima. El virus HIV (y otros retrovirus eucarióticos) también tienen una fase proviral. Si bien el mecanismo es
más complejo, los retrovirus son capaces de transducir genes cromosomales (por ejemplo se ha estudiado mucho la
transducción de oncogenes entre células eucarióticas, al igual que lo hacen los fagos en bacterias).
14) Compare transducción generalizada y especializada.
R: En la transducción, un bacteriófago (virus) transfiere DNA desde la bacteria en la cual se reprodujo a la bacteria
que infecta. El virus debe tener la característica de no producir la lisis del hospedero al cual transfiere el material
genético, es decir la partícula viral debe ser defectiva. Existen diferentes tipos de transducción, ellas son: Los fagos
que las realizan tienen estrategias diferentes de encapsidación. Los fagos que permiten la transducción generalizada
(por ej. P1) no son capaces de reconocer específicamente el ADN que encapsidan por lo que son capaces de
transducir cualquier segmento de ADN cromosómico, sin importar su secuencia. Es decir que, potencialmente,
pueden transferir cualquier segmento cromosómico del tamaño apropiado. Es decir, que es aquella en que cualquier
porción del genoma del hospedante del virus puede hacerse parte de la partícula viral madura reemplazando
al ADN viral.
Transducción Especializada o Restringida. Se define a ésta cuando el virus sólo puede transferir determinados
genes bacterianos cercanos a su sitio de integración genómica. Los fagos que permiten t.e. son aquellos que pueden
pasar por una fase lisogénica (por ej. el fago λ) integrándose en un sitio preciso del genoma (entre los operones gal
y bio en el caso de λ) y tienen mecanismos de reconocimiento de ADN al encapsidar (tipo secuencia cos del fago
λ) por lo que sólo son capaces de transportar genes vecinos al sitio de integración que accidentalmente permanecen
unidos al genoma viral en el entrecruzamiento que se produce al resolver el cointegrado (como primer paso hacia
la activación de la fase lítica). Además, en la t.g. el segmento de ADN donante se incorpora por recombinación
homóloga reemplazando al alelo nativo (la célula sigue siendo monoploide). En la t.e. el ADN donante se integra
como si fuera un profago y se produce un diploide parcial. Nota: todo esto se puede resumir en un cuadro.
15) Cómo sería afectada en su capacidad de dar colonias transducidas una cepa bacteriana rec-(deficiente en los
sistemas de recombinación celulares) al infectarla con un lisado transductor del bacteriófago λ? ¿y por el fago P1?
R: La inducción del fago λ requiere de la proteína RecA. RecA se activa por daño cromosómico (por formación de
ssDNA que es sustrato de RecA) y, a su vez, esta interactúa con el represor del ciclo lítico. Esto produce la derrepresión
de las funciones líticas y el ciclo lítico comienza. El fago λ se integra como profago al genoma bacteriano
en sitios específicos, attB. Requiere además funciones celulares como IHF y la integrasa que es una recombinasa
específica de secuencia (la secuencia attB) de λ, pero NO requiere RecA. Esto implica que no se vería afectada la
capacidad de transducir si la cepa aceptora es RecA-. En el caso del fago P1, la capacidad de transducción se vería
afectada, ya que el fago P1 transduce fragmentos de ADN cromosómico de la cepa dadora que tienen que recombinar
con las porciones homólogas de la cepa aceptora.
16) ¿Pueden recombinar los virus entre sí? ¿Qué mecanismos están involucrados?
R: Sí. En los casos de virus con genoma de ADN de doble cadena: recombinación homóloga usando las enzimas
de la célula huésped. En los virus a ADN de simple cadena, la recombinación puede realizarse entre las formas
replicativas (que son de doble cadena). Hay mecanismos de (pseudo)recombinación en virus a ARN cuya explicación
excede lo que se pretende enseñar en la materia.
17) Describa algunas aplicaciones de la utilización de fagos para la ingeniería genética.
R: El fago λ es un vector ampliamente utilizado en ingeniería genética en el que el ADN conteniendo los genes
codificantes para lisogenia fueron artificialmente reemplazados por ADN (por ej. humano) que es “transducido”
sin posterior lisogenización a bacterias (que no tienen otra opción que ser lisadas) para su clonado molecular, conservación
y multiplicación.
18) ¿Qué es la transformación bacteriana? ¿Se logra únicamente en forma artificial o también ocurre en poblaciones
naturales?
R: La transformación bacteriana es un proceso por el cual las bacterias incorporan ADN del medio. Se logra en
condiciones de competencia, es decir, cuando las bacterias son competentes para la transformación. La competencia
puede ser natural, lo que se observa en algunas especies o puede ser inducida en laboratorio. La transformación
natural implica, entre otras cosas, el ingreso de ADN de simple cadena en la célula receptora después de un “reconocimiento”
por receptores ubicados en la periferia celular, un reemplazo alélico en las colonias recombinantes. En
la transformación artificial (también llamada transfección), las células son forzadas a permeabilizar el ingreso de
ADN (que suele ser de doble hebra como por ejemplo un plásmido) mediante mecanismos artificiales. E. coli, por
ejemplo, no es una bacteria que intercambia ADN por transformación en la naturaleza y es la bacteria que más se
transforma (= transfecta) en el laboratorio.
19) ¿Se pueden mapear genes por transformación?
R: Sí; en forma similar a la transducción, la eficiencia de cotransformación es una medida de la cercanía de dos
loci determinados. Contrariamente a los mapeos utilizando cepas Hfr, pero en forma similar a la transducción, la
transformación es útil para los mapeos finos. Al igual que en la transducción generalizada, el % de cotransformación
de 2 genes es inversamente proporcional a su distancia. Estos métodos de mapeo genético en bacterias han
sido totalmente reemplazados, en la actualidad, por métodos de mapeo físico por lo que se les prestará menor importancia
a la que se le da en los libros de texto.

34
20) En la húmeda profundidad de la Baticueva, el Hombre Murciélago intenta olvidar su desengaño amoroso con
una famosa reportera de Ciudad Gótica mapeando una cepa bacteriana hilarante desarrollada en los laboratorios
secretos del Guasón. Mientras Alfred le acerca un sabroso vaso de batimel con una bacteria probiótica genéticamente
modificada, el encapotado contempla los datos proporcionados por la BatiPC:
Resultados de la transferencia por conjugación de material
genético en secuencias diferentes. Se indica tiempo
de entrada en un receptor F- (dador Hfr):
¿Podrá Bruno Díaz construir un mapa genético que incluya
todos estos hilarantes marcadores y señalar la distancia
de tiempo entre genes adyacentes? No se pierda la
continuación de este batiapasionante capítulo, a la misma
batihora, por el mismo baticanal y en la misma batimateria.
R: JA JE JU JI JUA JO AY JUU JUE JUO JUI y, dando la vuelta, de nuevo JA. De una forma similar a esta se
demostró por primera vez la circularidad del genoma de E. coli. Era la única forma de justificar resultados como
éstos.
Problemas:
1) El gráfico muestra el resultado de un experimento de apareamiento interrumpido entre las siguientes cepas de E.
coli: Hfr: a+ b+ c+ d+ strpsX F-: a- b- c- d- strpr
a) Defina en forma precisa a las variables del eje X y del eje Y.
b) ¿Por qué algunos marcadores alcanzan valores de frecuencias
más altos que otros?
c) Deduzca el orden y la distancia genética en minutos. ¿Qué
puntos de la curva utilizó?
d) ¿Cuál es la utilidad de la resistencia a antibiótico que posee la
cepa receptora?
2) Cuando el Teniente Horatio Caine dijo:- Confíen en mí, sé exactamente lo que hago-,a la experta Calleigh Duquesne
se le erizaron los pelitos de la nuca. Entonces Horatio se encerró durante siete días en el laboratorio del
cuartel (después de desalojar a punta de revólver al médico forense). Cuando salió, el Teniente anunció que había
resuelto el misterioso caso de los coliformes mutantes. Más tarde, en una ronda de prensa sensacionalista, declaró:
-Bueno, se trataba de un aislamiento de la cepa bacteriana Mágnum la cual es 44 Hfr y Str S y, lo que es más grave,
completamente salvaje. De este condenado germen, aislamos un engendro mutante (F - Str R arg - lac - ). La cuestión es
que conjugué ambos demonios pero interrumpiendo su disgustante cópula a distintos tiempos con lo que logré
hacerles confesar lo más íntimo de sus genes sometiendolas a un medio con estreptomicina y suplementados como
se indica en la tabla, con el sencillo trámite de contar el número de colonias al día siguiente. Pero en vez de contar
les disparé a cada una librando al mundo de ellas y calculé las balas utilizadas.
a) ¿A qué distancia del operón lac mapea el origen de transferencia en la cepa Hfr
usada?
b) ¿Cuáles son los genotipos de las bacterias que crecen en los distintos medios?
c) ¿Porqué los valores de la primer columna son menores que los de la tercer
columna?
d) ¿Qué estrategia se podría seguir para clonar el gen (salvaje) involucrado en la
síntesis de arginina cuya versión defectuosa está en la cepa F - ?
3) Se realizó una coinfección en medio líquido (a alta multiplicidad –densidad- de fagos y sobre una cepa sensible),
con dos fagos T4 mutantes: T4m - (playas pequeñas) y T4tu (playas turbias). Una alícuota del lisado resultante
fue usada para infectar (a baja multiplicidad de infección) nuevas bacterias de la misma cepa y se obtuvo un 7% de
playas grandes y claras (salvajes). ¿Qué porcentaje de playas pequeñas y turbias se habrá obtenido?
4) Se realiza un experimento de transformación con una cepa bacteriana
donante resistente a cuatro antibióticos: A, B, C y D. La cepa
receptora es sensible a las cuatro drogas. La población de células receptoras
tratada se divide y se siembra en placas de medios suplementados
con varias combinaciones de las drogas. Los resultados fueron:
a) Uno de los genes está claramente alejado de los otros tres, los cuales
parecen estar estrechamente ligados. ¿Cuál es el gen distante?
b) ¿Cuál es el orden de los tres marcadores que están ligados?
5) Teodorico Snopolsky se abocó a una tarea que le había quitado el
cepa genes ja je ji jo
1 tiempo 15 21 32 48
genes ju ji jua jo jue
2 tiempo 10 17 22 33 57
genes jui juo juu ay jo jua
3 tiempo 6 11 33 48 49 60
genes juo jui ja ju
4 tiempo 18 23 35 45
N° de colonias observadas en
t (min) lac glu arg+lac arg+glu
1 0 0 0 500
5 0 128 0 491
10 40 201 58 509
15 80 199 127 498
20 82 203 139 504
Antibióticos Nºcolonias BD 40
A 1.156 CD 786
B 1.148 ABC 30
C 1.161 ABD 42
D 1.139 ACD 630
AB 46 BCD 36
AC 640 ABCD 30
AD 942 Total 7.877
BC 51

ADN
donante
cepa
receptora
clases
transformadas
N° colonias
whi+ gin- whi- gin+ 248
whi- gin- whi+ gin- 175
whi- gin+ whi+ gin+ 3
whi- gin+ 315
whi+ gin+ whi- gin- whi+ gin- 201
whi+ gin+ 382
35
sueño durante la mayor parte de su vida: obtener bacterias
que sintetizaran whisky y ginebra. A continuación se reproduce
una página del cuaderno de Snopolsky, encontrado por
unos expedicionarios groenlandeses:
Anotación N°506: Para transformar una cepa bacteriana incapaz
sintetizar whisky (whi-) y ginebra (gin-) usé una mezcla de ADN de
dos cepas. Una whi+ gin- y la otra whi- gin+ y, por otra lado, e1
ADN de una cepa whi+ gin+. Obtuve clases transformadas en las
siguientes proporciones:
¿A qué se debe la aparición de un mayor número de colonias transformadas whi+ gin+ en el segundo caso?
6) Bitácora de vuelo: fecha espacial 1654.9. Habla e1 capitán Kirk. Toda la tripulación
del Enterprise sufre una diarrea infernal. E1 señor Spock afirma que se trata
de una extraña bacteria intestinal proveniente de la tercera luna del cuarto planeta
de la segunda estrella del sistema Papanópulos XXXIII. Sospecho que la bacteria
fue introducida involuntariamente por el señor Cheko después de la última visita a su novia en Nueva Creta. En el
tiempo que le queda libre después de repartir pastillas de carbón, el doctor McCoy logró identificar cuatro genes
implicados en la regulación de un sistema enzimático. También aisló una mutante: F-a-,b-,c- y d- StrR, la cual
normalmente da revertantes a+, b+, c+ o d+ a una frecuencia aproximada de 1 colonia revertante por cada 10 7
células sembradas en el medio selectivo correspondiente. Con esta cepa aisló un clon con las mismas auxotrofías
(a-b-c-d-) y con la misma tasa de reversión hacia a+ y d+ pero con una frecuencia de aparición de revertantes c+ y
b+ reducida a niveles no detectables. Se utilizó esta cepa como receptora en un experimento de apareamiento con
la Hfr a+ b+ c+ d+ StrS. La figura muestra los resultados obtenidos
usando medios selectivos que carecen de a, b, c o d.
Luego se tomaron 100 colonias d+, 100 b+ y 100 c+ de las placas de 30
minutos y se ensayó su genotipo para los otros dos marcadores. Los
resultados se resumen en la tabla. Explique.
7) Uno de los objetivos de la microbiología es “construir” microorganismos
recombinantes para que actúen como “remediadores” del medio
ambiente dentro de un ecosistema contaminado, y que al terminar su función se autodestruyan.
Existe un compuesto tóxico, 3-metil-benzoato (3MB) que es catabolizado por la bacteria Pseudomonas putida. Los
genes responsables del catabolismo del 3MB están organizados en un operón dentro de un plásmido denominado
TOL. Los genes de este operón están regulados positivamente en presencia de 3MB.
Construya, mediante conjugación, una cepa de Pseudomonas putida capaz de destruir al 3MB presente en un lago
contaminado, y que esta cepa se autodestruya luego de eliminar el contaminante. Se dispone de los siguientes elementos:
(A) a (C): Plásmidos que poseen origen de replicación de amplio rango de huésped (funciona en
d+ b+ c+
d+ ----- 93 93
b+ 95 ----- 100
c+ 92 100 ----

Pseudomonas y Escherichia), contienen un gen de resistencia a ampicilina y las siguientes características:
- p3Mß-ßgal: promotor del operón que cataboliza el 3MB fusionado al extremo 5’del gen de la enzima ßgalacosidasa.
- p3Mß-lacI: promotor del operón que cataboliza 3MB fusionado al extremo 5’del gen de la del represor del operón
lactosa.
- Δlac y Δleu: La Δ (delta) significa que lo que sigue está delecionado (operón lac o leu, en este caso la deleción
involucra también al gen del represor I).
- tra: genes de transferencia del plásmido F
- mob: endonucleasa que corta en la región bom
- bom: origen de transferencia del plásmido F
- ptrp : promotor operón triptofano (otro distinto)
- plac: promotor del operón lactosa
- gef: es un “gen suicida”, es decir que codifica para una proteína que produce la muerte de la bacteria cuando se
expresa.
a) Diseñe una estrategia para construir (mediante conjugación) la cepa de Pseudomonas putida que sea capaz de
metabolizar el contaminante 3MB y que luego se autodestruya, indicando cuáles cepas y plásmidos elige y cómo
se selecciona la bacteria de interés.
b) Justifique las/los que descarta.
c) Esquematice mediante un gráfico la curva de crecimiento (número de bacterias en función del tiempo) y el número
de bacterias en función de la concentración de 3MB. Considere t=0 al lago contaminado en el momento del
agregado de las bacterias limpiadoras.
d) ¿Por qué se debe evitar el escape de la bacteria “limpiadora” al medio ambiente?
8) Habitualmente, Escherichia coli es una bacteria inocua, pero recientemente se reportó una cepa del tipo enterohemorrágico
(la O104:H4), que produce una potente toxina (toxina Shiga o verotoxina) que daña los glóbulos rojos
y los riñones (la enfermedad se llama síndrome urémico hemolítico) y causó una epidemia en Europa debido al
consumo de verduras orgánicas contaminadas. Es más dañina que las cepas previamente conocidas porque es capaz
de resistir mejor a los antibióticos (¡14 clases diferentes!). Se compone de un genoma recombinado de dos
bacterias de lejano parentesco. Una de ellas es la E. coli O104, identificada en 2005 en Corea, que aporta el 80%
de los genes. El resto proviene de otra, posiblemente de origen clínico, que aporta genes de resistencia a varios
antibióticos. Entre éstos están TEM-1 y CTX-M-15 que confieren resistencia a derivados de penicilina que podrían
provenir originalmente de Klebsiella (otra bacteria Gram –, causante de infecciones intrahospitalarias). Estos genes
se encuentran rodeados de transposones de tipo IS y Tn7. En internet circulan varias hipótesis conspirativas sobre
el origen artificial de esta nueva cepa. Por un lado están los “ecologistas” que culpan a las multinacionales que
buscan desalentar el consumo de verdura fresca orgánica causante de la epidemia europea y por el otro los que
hablan de bioterrorismo.
¿Puede Ud desmitificar estas interpretaciones explicando cómo podrían haberse transferido los genes TEM-1 y
CTX-M-15, ambos ubicados en el cromosoma de Klebsiella al genoma cromosómico de E.coli O104 sin intervención
humana deliberada (salvo por la práctica habitual de suministrar antibióticos en medicina humana y veterinaria)?
Hágalo usando esquemas, es decir dibujos de bacterias conteniendo genes, plásmidos y cromosomas (como en
el problema anterior) usando flechas que grafiquen los pasos con los nombres de los procesos genéticos involucrados.
Datos: TEM-1 y CTX-M-15 no tienen homología con genes de E. coli y ambas bacterias (Klebsiella y Escherichia)
tienen plásmidos de distintos tipos.
14. REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GENÉTICA
Bibliografía: Repaso IBMyC, Alberts y Genes IX, Lewin.
Guía teórica:
1) ¿Cuál es el concepto moderno o molecular de gen?
R: La respuesta típica sería que es “una secuencia de DNA codificante para una proteína”. Sin embargo, esta definición
estructuralista se acota a un período de tiempo determinado entre mediados de los ’50 y los ‘80. Entre Mendel
y Watson y Crick no se conocía cómo el DNA podía codificar una proteína y su definición era más “sencilla”
(un gen es la unidad de la herencia) la cual, si se quiere, es más abarcativa que la anterior. Como ej de definición
funcional está la de los sociobiólogos que definen como gen a un locus que se mantiene inalterado (alelo “constante”)
durante muchas generaciones (este concepto podría incluir varios “genes” estructurales ligados, por ej. El operón
lactosa completo, -incluyendo el gen represor- sería un solo gen para los sociobiólogos). Desde el descubrimiento
de los intrones y el splicing (particularmente el transplicing y el splicing alternativo) y la edición de RNA
rompieron la idea de la unidad “geográfica” y de continuidad transcripcional que tenía el concepto de gen.
Definición funcionalista de gen:
Unidades hereditarias que se transmiten de una generación a otra en forma uniforme y predecible conteniendo información
decodificable de estructuras y funciones.
36

37
Definición detallada de gen (combinación de estructura y función): Unidad de información (físicamente constituida
por un segmento de ácido nucleico, (DNA o RNA), que suele ser unitario (pero puede estar particionado o superpuesto
con otros genes) codificante para una “unidad o subunidad” funcional (polipéptido o RNA, por ej. ribosomal)
y tiene propiedades: tiene capacidad de variar (mutar, recombinar, es decir evolucionar) y una dinámica poblacional
(comportamiento frente a la selección natural o artificial) dentro del contexto de especies biológicas. Tienen
capacidad de almacenamiento y reproducción fidedigna de la información, así como su decodificación.
2) Hacer un esquema de un gen eucariótico típico, señalar qué parte se transcribe como mRNA y qué parte se expresa
como proteína. Comparar con uno procariótico
R: Los esquemas de los genes en los libros suelen tener varios errores conceptuales. Por ejemplo: en el esquema
que sigue, si bien se explicitan (con color rojo) detalles como las regiones 5´y 3’ no traducidas (pero transcriptas)
llamadas UTR, no se explicita que, así como hay un promotor (de la transcripción), existe también un terminador
(de la transcripción) con la señal de poliadenilación llamado trailer. Faltaría incorporar el potenciador (enhancer)
Estructura gen eucariota poco completa versus otra más completa de libros de texto:
En el caso de genes procarióticos, la situación es más compleja dado que los genes individuales pueden compartir
sus secuencias regulatorias con otros genes formando operones (no siempre, el gen I del represor del operón lactosa
no conforma un operón sino que se parece, en este sentido a los genes eucarióticos). Debido a esto, en los libros se
suele encontrar esquemas de operones y no de genes individuales (ej. operón lac formado por los genes Z, Y,A, ver
abajo).
En estos esquemas se suele incluir, además de los 3 genes
que conforman el operón, el gen del factor de transcripción
(I = represor) que está físicamente ligado a 5’ del operón,
pero no a otros genes reguladores igualmente importantes
(como el que codifica a la proteína CAP–CRP- en el caso operon lac). No se suele esquematizar (en el operón lac)
un segundo operador que es el sitio de unión (reconocimiento) de la proteína CAP, que serviría para que el operón
lac constituyera un ejemplo de regulación negativa (represor) y positiva (activador CAP). No se suele esquematizar
tampoco el promotor del gen I, ni los terminadores de
transcripción correspondientes y otras secuencias no codificantes
importantes del futuro mensajero (por ej. la secuencia
de unión a ribosomas llamada Shine Dalgarno), los
codones de iniciación (que muchos estudiantes suelen confundir
con el nucleótido +1) y los codones de terminación
de lectura.
2) ¿Qué mecanismos moleculares co- y postranscripcionales conoce que sean capaces de producir una sustancial
modificación en la secuencia de un transcripto primario? Describa los 4 tipos de procesamiento (splicing). Describa
la edición del RNA.
R: El procesamiento del ARN genera un ARNm maduro (para genes que codifican para proteínas) o ARNr a partir
del transcripto primario. El capping (agregado de una metilguanosina en el extremo 5¨), la poliadenilación (agregado
de una cola de poli A en el extremo 3’), el splicing (remoción de intrones) son ejemplos de modificación cotranscripcional,
mientras que el editing (cambio de bases) y el NMD (nonsense mediated decay) son ejemplos de
mecanismos de modificación post-transcripcional. Mediante sileciamiento/interferencia post-transcripcional también
se produce degradación o inactivación específica de ARNs. Otro mecanismo muy utilizado en bacterias es la
utilización de ribointerruptores (riboswitches) y aptámeros (secuencias complementarias de ARN ubicadas en la
región 5’ no codificante del ARNm) que, según el tipo de plegamiento secundario, pueden inducir terminación
temprana de la transcripción (atenuación) o el autoclivaje del ARN mediante ribozimas autocatalíticas. Muchos
transcriptos sufren splicing alternativo, remoción de intrones y unión de los exones de un gen. Como consecuencia
de esta modificación co-transcripcional se producen diferentes secuencias de ARNm que codifican distintas formas
de proteínas los cuales serán tejido específicas. Otro mecanismo de procesamiento es el ARN editing. En este proceso
la información contenida en una molécula de ARN se ve alterada. Se trata de mecanismos que incluyen deaminaciones
de C a U y de A a I, y también inserciones y deleciones. Afecta ARNt, ARNr y ARNm. En este último
caso, se ve afectada la secuencia aminoacídica de la proteína, de manera que la misma difiere de lo que se puede
predecir a partir de la secuencia de nucleótidos en la molécula de ADN. Se da mayormente en eucariotas y se relaciona
con la presencia de variantes de proteínas según el tejido. La degradación mediada por mutaciones terminadoras
o nonsense mediated decay (NMD), es un proceso de eliminación de ARNm portadores de una mutación
terminadora o de una mutación del marco de lectura que derivan en la creación de codones de finalización precoz
de la síntesis de una proteína. De no eliminarse estos ARNm se producirían polipéptidos defectuosos o incompletos
al ser traducidos. Estos polipétidos pueden retener parte de su función (por ejemplo actividad enzimática o capacidad
de unirse a otra proteína) pero no toda (por ejemplo se puede perder la regulación de la actividad enzimática o
la capacidad de unirse a otra proteína). Por lo tanto si se produjeran estos polipétidos, estas mutaciones podrían
resultar dominantes. Al eliminarse estos transcriptos por NMD muchas de estas mutaciones serán recesivas.

38
3) ¿A través de qué mecanismos un mismo segmento de DNA puede codificar varias proteínas distintas?
R: Por un lado se pueden producir distintos mRNAs por los siguientes mecanismos:
-Splicing alternativo
-Poliadenilación alternativa: un mismo “gen” puede tener más de un sitio de poliadenilación y dependiendo de las
situaciones fisiológicas, tejidos, etc. se puede utilizar uno u otro sitio. De esta forma se puede producir, a partir de
un mismo “gen”, proteínas con distintos extremos C-terminales. Esto sucede en el caso de los genes de las inmunoglobulinas
y de esta forma se regula si las mismas serán secretadas o formarán un receptor de membrana.
-Promotores alternativos: Puede haber más de un sitio de inicio de la transcripción y cada promotor dar un exón 1
diferente. De esta forma se pueden producir proteínas con distinto extremo N-terminal. Además cada promotor
puede tener una regulación diferente. Por otro lado, a partir de una proteína traducida se pueden producir distintas
variantes por modificación post-traduccional: fosforilación, glicosidación, clivaje específico de poliproteínas, acilación,
etc.
4) ¿A través de qué mecanismos se pueden regular los niveles de una determinada proteína?
R: -Estado de condensación de la cromatina
-Regulación de la transcripción
-Transporte del mRNA al citoplasma
-NMD (en caso de haber un STOP prematuro)
-Estabilidad del mensajero: Es tan importante encender rápido un gen cuando se necesita su producto como apagarlo
cuando ya no se lo necesita. Existen proteínas que se unen generalmente a la región 3´ no codificante del mRNA
que regulan positiva o negativamente la vida media del mensajero. También se puede regular por microRNAs.
-Traducibilidad del mensajero: en algunas situaciones fisiológicas o ante infecciones virales se favorece o desfavorece
la traducción de algunos mensajeros.
-Estabilidad de la proteína: Algunas proteínas son rápidamente degradadas luego de ser producidas.
5) ¿Cuál es la diferencia entre un operón, que codifica para un mensajero policistrónico, y un gen que codifica para
una poliproteína? ¿En qué tipo de organismos se presenta cada uno de estos mecanismos?
R: Un operón es una unidad transcripcional compuesta por una zona regulatoria de la transcripción y una serie de
genes ubicados hacia 3’ de dicha zona promotora-reguladora. Este segmento de ADN u operón se transcribe como
un todo y a partir del mensajero policistrónico, se producen varias proteínas, cada una a partir de su propio codón
de iniciación, como el caso del operón lactosa en bacterias. Un gen que codifica para una poliproteína es un gen
cuyo producto se clivará postraduccionalmente para producir múltiples péptidos. Los primeros son típicos de los
procariotas y los segundos de los eucariotas (virus eucariotas, precursores de neuropéptidos, etc.).
6) ¿Qué es un nucleosoma? ¿Qué proteínas participan?
R: Un nucleosoma es la unidad fundamental de empaquetamiento del ADN. Consiste en un núcleo o core central
de 8 proteínas básicas llamadas histonas que se ubican alrededor de un segmento de ADN superenrrollado de 146
pb.
7) ¿Cómo influyen los distintos órdenes de empaquetamiento del ADN en la expresión genética?¿Cómo varía el
grado de empaquetamiento durante el ciclo celular?¿Cómo resulta la susceptibilidad de corte por DNAasa I en
cromatina transcripcionalmente activa con respecto a la inactiva?
R: Durante la mitosis, los cromosomas se condensan y son transcripcionalmente inactivos. Sin embargo, durante la
interfase, la mayoría de las fibras de cromatina se descondensan. Este material se denomina eucromatina, la cual
contiene zonas transcripcionalmente activas con regiones de ADN no transcribibles. Es decir que la condensación
de la cromatina se asocia a la pérdida de la expresión génica. La DNAsa I corta secuencias de ADN doble cadena.
Si a las mismas se le unen factores de transcripción, existe una protección a la digestión con la enzima ya que estas
proteínas ocultan el sitio de corte de la DNAsa I.
8) ¿Cómo influye la metilación de las citosinas sobre la expresión genética en eucariotas? Comparar el grado de
metilación de la heterocromatina en relación con el resto del genoma.
R: La metilación del ADN se relaciona con una represión de la transcripción. La heterocromatina es cromatina
altamente condensada a lo largo de todo el ciclo celular, a diferencia de la eucromatina que se condensa en metafase.
Existen dos clases de heterocromatina, la facultativa, que puede ser genéticamente activa o inactiva, y la constitutiva
que permanece siempre en estado inactivo.
9) ¿Qué es un gen reportero? ¿Para qué se utilizan? Mencione algunos ejemplos.
R: Los genes reporteros son secuencias que codifican para proteínas de detección sencilla. Además deben estar
ausentes en la especie que se estudia para descartar una posible actividad endógena. Se utilizan para reemplazar
productos génicos difíciles de medir y poder, entonces, determinar la actividad promotora. Algunos ejemplos son:
-Luciferasa: Oxida a la luciferina emitiendo fotones los cuales son cuantificados en un luminómetro
-GFP: Proteína verde fluorescente de medusa
-CAT: Cloranfenicol acetil-transferasa
-β-galactosidasa y β-glucouronidasa: hidroliza un sustrato incoloro (X-gal o X-glu) para dar un producto azul
10) Indique las características moleculares distintivas de los diferentes tipos de factores de transcripción eucariotas.

39
R: Los factores de transcripción reconocen y unen una secuencia de nucleótidos corta, como resultado de una complementariedad
entre la superficie de la proteína y la región de la doble hélice en la zona del binding. En eucariotas,
estos factores presentan un dominio de unión al ADN y otro de activación. El de binding presenta un motivo estructural
de α-hélices y así se une al ADN. Los más comunes son: cierres de leucina, hélice-vuelta-hélice y dedos de
zinc.
11) a.- Describir el efecto de la regulación de la transcripción en procariotas en los siguientes casos:
I- Operón lactosa por el represor. II- Operón lactosa por CRP (o CAP)-AMPc. III- Operón triptofano por el represor.
b. ¿Qué utilidad tiene para la bacteria que la lactosa sea un inductor de su operón y en cambio el triptofano sea un
co-represor del suyo?
c. ¿Qué diferencias funcionales existen entre los represores bacterianos y los factores de transcripción eucarióticos?
¿y entre un operador y un enhansón (secuencia de unión de un factor de transcripción localizado en un enhancer o
en un promotor)?
R: a) I- El represor del operón lac reprime la expresión del operón ya que se pega a la zona operadora impidiendo
que la ARNpol inicie la transcripción. Sólo cuando en el medio haya ligando, en este caso, lactosa, habrá transcripción
del operón por remoción del represor. Se trata de un mecanismo de regulación negativa.
II- En el caso del operón lactosa, la proteína CAP (también llamada CRP) coopera en la expresión del operón.
Normalmente, la ARNpol se pega muy débilmente a la zona promotora. Pero si además se une la proteína CAP en
posición 5’ del promotor, se ve un aumento de los niveles de transcripción. Se trata de un mecanismo de regulación
positiva. La proteína CAP se une al ADN si en el medio existe AMPc. Los niveles de AMPc se elevan cuando no
existe, en el medio, otra fuente de carbono como la glucosa que ejerce lo que se conoce como represión catabólica,
inhibiendo (indirectamente) la transcripción del operón lac.
III- En el caso del operón triptofano, un set de cinco genes adyacentes codifican las enzimas necesarias para la síntesis
del aminoácido. Existe un represor que se pega al ADN junto con el triptofano. Se trata de un mecanismo de
regulación negativa, ya que al igual que el operón lac, el binding de la proteína regulatoria suprime la transcripción.
b) Que no se sintetice triptofano cuando haya trp en el medio, y que se induzca la síntesis de β-galactosidasa cuando
hay lactosa en el medio para aprovecharla como fuente de carbono y energía.
c) Ninguna y ninguna. Distintos nombres para igual función. La diferencia general es que los genes de procariotas
están predeterminados para expresarse (condición default) y los de eucariotas para no hacerlo y eso tiene que ver
(entre otros condicionantes) con las diferencias entre la subunidad σ de la transcriptasa y el TFII y el grado de condensación
relativo del DNA.
12) ¿Qué son los elementos genéticos reguladores (de la transcripción) en cis y en trans? Describirlos para:
a) el operón lactosa.
b) un gen eucariótico como el que codifica actina.
c) el gen de una proteína eucariótica inducida por una hormona esteroidea.
R: Existen elementos genéticos que modulan la transcripción desde una dada posición en el genoma (en cis), mientras
que otros producen elementos difusibles como proteínas que se unen a otras zonas del mismo u otro ADN (actúan
en trans).
a) cis: operador, sitio de unión (binding de CAP) y promotor. Trans: represor y CAP.
b) Cis: enhancers y promotor, trans: factores de transcripción que actúan sobre el promotor del gen.
c) Cis y trans: idem actina y el complejohormona-proteína que se une a una zona determinada del ADN después de
unirse a un receptor soluble intracelular (que es, a su vez, factor de transcripción).
13) ¿Cómo explica que las mutaciones que generan codones STOP prematuros sean dominantes si ocurren en el
último exón de un gen de globina, mientras que son recesivas si ocurren en los primeros exones?
R: Los mRNAs con codones de terminación prematuros que ocurren en los primeros exones son eliminados por
nonsense-mediated decay. Si los individuos son heterocigotas para dicha mutación y la dosis génica del alelo salvaje
es suficiente para mantener la función biológica, entonces los individuos serán sanos y por ende la mutación
recesiva. En cambio mutaciones en el último exón no son eliminadas por NMD y el producto de dicho alelo puede
tener un efecto dominante negativo interfiriendo con la función del alelo salvaje, resultando en una enfermedad
dominante.
14) ¿Qué son las ribozimas, los ribointerruptores y los aptámeros?
R: Las ribozimas son enzimas cuya composición química es ARN (en vez de proteína). También existen desoxiribosimas
(de ADN). En forma natural se las descubrió en el proceso de splicing autocatalítico de intrones de mitocondrias
del protozoo Tetrahymena. En este caso se trata de una ribonucleasa específica de secuencia pero existen
otras actividades naturales y sintéticas. Los ribointerruptores (riboswitches) son secuencias de ARN que determinan
la finalización de una transcripción de un ARNm o un splicing a través de secuencias que son parte del ARN llamadas
aptámeros (que tienen la posibilidad de formar estructuras internas de doble cadena por su complementaridad
de secuencia). Estas estructuras secundarias se ven afectadas porque la propiedad de interés de estos aptámeros
es que tienen una afinidad muy fuerte de unión a un metabolito regulador (parecido al de una enzima por su sustrato),
cuya presencia modifica el patrón de plegamiento del ARN desencadenando su degradación por una ribozima o
por terminación temprana de transcripción porque esta estructura secundaria actúa como terminador “informando”
a la transcriptasa que debe detener la transcripción.

15) ¿Qué relación existe entre los cromosomas politénicos de Drosophila con la resistencia a metotrexato en fibroblastos?
R: En ambos casos se produce gran amplificación de ADN, programada a nivel de desarrollo y afectando cientos
de genes en el primer caso y como respuesta al antibiótico localizada en el gen de la dihidrofolato reductasa
(DHFR) en el segundo.
Problemas:
1) El mapa del operón lac es: I P-O Z Y A
El promotor (P) es el sitio donde se une la RNA polimerasa
antes de comenzar la síntesis de mRNA. El operador (O)
es donde se une el represor (en ausencia de inductor) codificado
por el gen I. Dados los genotipos de los siguientes
diploides parciales, completar la siguiente tabla con "+" si
espera actividad de la pro- teína codificada por "Z" (ßgalactosidasa)
y de la codificada por "Y" (permeasa) o
con "-" si no espera actividad. Considere que las mutaciones
indicadas por "-" impiden:
que las correspondientes regiones no codificantes del operón se unan al ligando específico.
que las correspondientes regiones codificantes del operón puedan originar por traducción una proteína biológicamente
activa.
Is: gen del represor con una mutación que origina una proteína incapaz de unirse al inductor (pero su capacidad de
unirse al operador está intacta).
2) La figura muestra la estructura de un plásmido:
El gen Rλ del fago lambda codifica un represor que re- prime la transcripción de ciertos
genes del fago controlados por el promotor/operador PL; pero en este caso, Rλ tiene una
mutación tal que la proteína codifi- cada resulta termosensible: reprime a 30ºC, pero no
reprime a 42ºC porque su estructura 3-D se altera dramá ticamente. El gen R lleva su
propio promotor Prt que, a los efectos de este problema, consideraremos constitutivo. El
gen Zrev contiene la secuencia codificante de la ß-galactosidasa de E. coli en orientación
antisentido con respecto a su promotor: PL. Con este
plásmido se transforman mutantes de E.coli con distintas
características genotípicas, las cuales se detallan en la
tabla. Completar con + o con "-", según si espera o no
actividad enzimática.
Para aquellos casos en los que indicó que no hay actividad
de ß-gal, indique además, para cada uno, si se debe
a:
I- inhibición de la transcripción
II- inhibición de la traducción
III- Producción de una ß-gal inactiva
Rλ
40
β galactosidasa Permeasa
Genotipo -lac +lac -lac +lac
I+ P+ O+ Z+ Y+/I+ P+ O+ Z+
Y+ I- P+ O- Z+ Y-/I+ P+ O+ Z- Y+
I+ P- O- Z- Y+/I- P+ O- Z+ Y-
Is P+ O+ Z+ Y-/I+ P+ O+ Z- Y+
Is P+ O+ Z+ Y+/I- P+ O+ Z+
Y+ I- P+ O- Z+ Y-/I- P+ O+ Z- Y+
I- P- O+ Z+ Y+/I- P+ O- Z+ Y-
I+ P+ O+ Z- Y+/I- P+ O+ Z+ Y-
PL
Prt Zrev
plás Actividad ß-gal
genotipo mi- 30 ºC 42 ºC
do s/IPTG c/IPTG s/IPTG c/IPTG
I - P + O + Z + Sí
I + P - O + Z + No
I - P + O - Z + Sí
I + P + O - Z - Sí
IsP + O + Z - No
I - P + O + Z + / I + P + O + Z - Sí
3) La ribulosa bisfosfato carboxilasa (abreviada "Rubisco") es una enzima clave localizada en el interior de los
cloroplastos. Permite fijar CO2 en la síntesis de triosas en el estroma cloroplástico. Rubisco está formada por dos
tipos de subunidades, la subunidad grande (LSU), codificada en el genoma del cloroplasto, y la subunidad chica
(SSU), codificada en el genoma nuclear e importada desde el citoplasma. Ambas son ensambladas entre sí dentro
del cloroplasto con ayuda de una chaperona. Con el objeto de encarar,
Sin eliminar
(-90/-4)
eliminado
(-973/-90)
eliminado
(-972/-722)
eliminado
Luz
Osc.
Luz
Osc.
Luz
Osc.
Luz
Osc.
la producción de plantas con transgenes regulados por luz, se realizó el
siguiente experimento: se tomó un fragmento de ADN ubicado entre -
973 y -4 bp del gen de la SSU de papa (por convención, se denomina
+1 al sitio de iniciación de la transcripción) y se ligó río arriba de la
secuencia codificante del gen de origen bacteriano de la cloranfenicol
acetil-transferasa (CAT). Con esta construcción se transformaron protoplastos
(células desprovistas de pared) de hojas de tabaco y se las so
metió a condiciones de luz u oscuridad. Luego de varias horas, se aisló
ARN para analizar la expresión de CAT dentro de esos protoplastos,
mediante northern blot usando como sonda el cDNA de CAT.
Los resultados fueron: Luz
Oscuridad
Posteriormente se eliminaron los siguientes fragmentos del gen, y con
cada una de las nuevas construcciones se transformaron protoplastos,
se sometieron a las mismas condiciones y se aisló el ARN para hacer
nuevos Northern:

a) ¿Qué conclusiones se pueden sacar con respecto al papel de las secuencias de SSU manipuladas?
b) ¿Pudo haber afectado el resultado el que los protoplastos fueran de tabaco y no de papa?¿Por qué?
c) ¿Podrían haberse usado protoplastos preparados a partir de raíces de tabaco?
Finalmente, se realizó la siguiente construcción: el fragmento de -973/-722 de SSU se fusionó en los sentidos posibles
río arriba del promotor (P) del gen nopalina sintetasa (nos) de Agrobacterium tumefaciens, gen que se expresa
en vegetales y que no está regulado por luz.
Esta construcción se
fusionó río arriba de la
región codificante del
gen CAT. Luego de
transformar los protoplastos
con cada una
de las 2 construcciones
se hizo un northern,
todo bajo las
1)
2)
-973 -772
-772 -973
mismas condiciones que antes:
d) De acuerdo a los resultados obtenidos, ¿Qué tipo de elemento regulatorio está contenido en la secuencia -973/-
772 aislada del gen SSU?
4) Imagine que las sin-herculitis son una serie de
enfermedades genéticas en humanos producidas por
defectos recesivos en la expresión del gen de la herculina,
una proteína asociada al desarrollo y tono
muscular. La enfermedad no es mortal pero se caracteriza
por una tendencia a la flaccidez y la pereza.
Para analizar los distintos tipos de la enfermedad, se
dispone de biopsias musculares de individuos sanos
homocigotas, es decir no portadores (S) y de enfermos
(homocigotas) (X1, X2 , ...), además de un mapa
de restricción del gen de la herculina, un clon de
cDNA de longitud completa y anticuerpos antiherculina.
Figura:
Para comenzar se realiza una serie de Southern
(DNA genómico cortado con la enzima BamHI),
northern y western blots que se muestran en la figura;
a) Interpretar los resultados caracterizando cada
alelo mutante X1, X2, X3, X4 y X5.
SSU
P nos CAT
SSU
P nos CAT
5 kpb
4 kpb
1 kpb
Dado que los pacientes X4 y X5 presentaban el
mismo patrón de bandas en el Southern, en el northern
y en el western, y con el fin de determinar si
ambos pacientes presentaban la misma alteración, se
realizó otro experimento que consistió en la construcción de
plásmidos mediante fusión de: la zona 5' de un clon genómico
de la herculina de individuos enfermos con un patrón tipo X4 y
X5 (homocigotas) o de un individuo sano (S) + la parte codificante
del gen de la β-gal como reportero. Luego se realizaron
los siguientes experimentos de transfección:
b) ¿Cómo explica los resultados del experimento de transfección?
c) ¿Qué fenotipos tendrán individuos heterocigotas con genotipos
S/X1, S/X4, S/X5 y X4/X5?
d) Dibujar el resultado de Southerns (con enzima BamHI) de
individuos que sean portadores sanos de los alelos recesivos
X1, X2, X3 y X4.
e) ¿En qué casos el polimorfismo de sitios de restricción
con la enzima BamHI será útil para el diagnóstico prenatal de
la enfermedad?
E1 E3
500 500 pb pb 200 200 pb pb 800 800 pb pb
41
BamHI BamHI
BamHI
1000 pb 4000 pb
S X1 X2 X3 X4 X5 S X1 X2 X3 X4 X5
50 kDa
Gen sano
1,5 kpb
Southern Northern
S X1 X2 X3 X4 X5
Línea celular Plásmido Activ. β-gal
Fibroblastos 3T3 p5‟S / CAT ---
Fibroblastos 3T3 p5‟X4 / CAT ---
Fibroblastos 3T3 p5‟X5 / CAT ---
Mioblastos L6 p5‟S/CAT +++
Mioblastos L6 p5‟X4 / CAT +++
Mioblastos L6 p5‟X5 / CAT ---
BamHI BamHI
BamHI
1800 pb 5000 pb
f) Si se crea un ratón transgénico con una copia del gen humano sano completo y sabiendo que el gen sano de la
herculina de ratón tiene el siguiente mapa de restricción para la enzima BamHI, dibujar los resultados de los Southerns
de ratones sanos (homocigotas) transgénicos y no transgénicos hibridados con una sonda de herculina huma-
1)
2)
luz
oscuridad
luz
oscuridad

na, a alta y baja concentración salina.
5) Un estudiante de doctorado está decidido a
encontrar los factores que regulan la transcripción
del gen OMEGA8 en plantas. Se sabe
que los niveles de mRNA de OMEGA8 aumentan
cuando se exponen las plantas de tabaco a
baja temperatura, aunque la función real de
OMEGA8 es desconocida. Para lograr su objetivo,
el estudiante realiza una serie de construcciones
génicas donde fusiona fragmentos de la
región 5’ río arriba del gen OMEGA8 a la región codificante del gen de la luciferasa. Acto seguido introduce dichas
construcciones por transformación en plantas de tabaco. Cuando obtiene las líneas transgénicas, analiza la respuesta
del transgén a la temperatura y obtiene los siguientes resultados:
Nota: bloque blanco = región 5’ río arriba del gen OMEGA8, +1=
sitio de iniciación de la transcripción, bloque negro = región que codifica
para luciferasa.
a) ¿Qué conclusiones obtiene de los resultados de medición de actividad
de luciferasa en las plantas transgénicas?
b) ¿Qué controles agregaría al experimento con plantas transgénicas?
El resultado sorprende al estudiante por lo que se decide a realizar
experimentos para determinar qué secuencias en cis regulan la transcripción
del gen. Para ello aísla los fragmentos –1263 a –877 y –525 a
–226 y los marca en uno de los extremos 5’, los incuba con preparaciones
de proteínas nucleares de plantas de tabaco cultivadas a distintas
temperaturas, los trata con DNasa I y separa los fragmentos por
electroforesis en gel de poliacrilamida. De este experimento de
“footprinting” obtiene el siguiente autorradiograma:
Nota: la primera calle de cada gel corresponde a la incubación del
fragmento de DNA correspondiente con la DNasa I, en ausencia de
extracto nuclear.
c) ¿Qué le sugiere el “footprinting”?
d) En base a sus respuestas a) y c), haga un esquema de la región -1588/-1 indicando el rol de cada región
e) ¿Qué otro experimento de “footprinting” haría para confirmar este modelo?
f) ¿Por qué el estudiante hizo fusiones a la región codificante del gen de la luciferasa y no de la propia secuencia
codificante del gen OMEGA8?
6) Un investigador está estudiando la expresión de una enzima hepática X la cual también se expresa en páncreas
sólo en condiciones de estrés oxidativo. Ambas enzimas son estructural y bioquímicamente idénticas. El gen en
cuestión tiene la siguiente estructura:
Hígado Páncreas
Las flechas indican sitios de clivaje y poliadenilación. La región en gris es la región codifican-
CT S CT S
te.
E1 E2 E3
En primer lugar, realizó un northern blot con RNA extraído a partir de hígado y de páncreas
de ratones control y ratones sometidos a estrés:
a) Esquematizar los mRNAs maduros que se expresan en hígado y en páncreas.
b) ¿Cómo haría para confirmar su hipótesis? ¿Qué experimento realizaría para descartar que la
diferencia de tamaño de los mensajeros se deba a splicing alternativo del transcripto primario?
Interesado por la regulación de la expresión de esta proteína en páncreas el investigador clonó el promotor de la
enzima X río arriba del gen de la luciferasa y transformó, con esta construcción,
células de páncreas. Para su sorpresa, tanto las células sometidas
a estrés como las células control expresaron niveles similares y elevados
del gen reportero.
c) ¿Qué puede decir, hasta el momento, sobre la regulación de la expresión
de la enzima X en páncreas?
1 P
Luc
42
2 P Luc 3´UTR
Sospechando que la secuencia perteneciente a la región 3´ UTR presente en el mensajero en páncreas, pero ausente
en el hígado, podría estar relacionada con estos resultados, el investigador diseñó las siguientes construcciones: (P:

promotor constitutivo).
Con estas construcciones transfectó células pancreáticas y las sometió a condiciones de estrés o no (control) duran-
te 8 horas. Finalmente midió la actividad de luciferasa:
d) ¿Qué puede decir del papel de la región 3´UTR en la
regulación de la expresión de la enzima X?
6) Se desea desarrollar un mecanismo para expresar genes en el cerebro de ratón en un determinado momento de su
vida. Para ello Chen y col. diseñaron una estrategia utilizando el sistema Tet off. El sistema funciona de la siguiente
manera: el gen de interés se clona río abajo de un promotor (pTetOp) inducible por el factor de transcripción tTA.
A su vez el gen tTA se clona río abajo de un promotor tejido específico. El mecanismo es el siguiente:
PromTetOp Gen de interés PromTej. especifico. tTA
Cuando se expresa tTA se induce la transcripción del gen de interés dado que se une a las zonas regulatorias de
pTetOp. El sistema tiene un paso más de regulación: En presencia de tetraciclina, tTA no se puede unir a pTetOp
debido a un cambio en su conformación. Esta inhibición es reversible. Una vez removida la tetraciclina, tTA se
puede volver a unir a pTetOp.
Se diseñaron ratones transgénicos con las siguientes construcciones:
Línea 1 (pTetOp-luciferasa): Línea transgénica con una construcción que lleva el gen de la luciferasa río abajo de
TetOp.
Línea 2 (pEnolasa-tTA): Línea transgénica que lleva una construcción con el gen tTA río abajo de las zonas regulatorias
del gen de la Enolasa (pEnolasa).
Línea 3 (pNestina-tTa): Línea transgénica que lleva el gen tTA río abajo de las zonas regulatorias del gen de la
Nestina (pNestina).
Línea 4 (pActina-tTA): Línea transgénica que lleva el gen tTA río abajo de las zonas regulatorias del gen de la Actina
(pActina).
Se cruzaron los ratones pTetOp-luciferasa por cada una de las líneas fundadoras 2, 3 y 4. La F1 transgénica para
ambas construcciones (corroborada mediante Southern blot) se utilizó para los ensayos de actividad de luciferasa en
diferentes tejidos en ratones de 2 semanas de edad:
ACTIVIDAD LUCIFERASA
(2 semanas)
Nota: los números representan medidas
arbitrarias relativas de actividad de luciferasa.
a) Teniendo en cuenta los resultados de
la tabla, ¿en qué se diferencia la regulación
de los promotores analizados
(pNestina, pEnolasa, pActina y pTetOp)?
b) ¿Para qué sirve medir la actividad de luciferasa?
c) Esquematizar los northern blots esperados para Nestina y Enolasa en estriado y en corteza de ratas salvajes de
dos semanas de edad. (tamaño del mensajero de Nestina:1800 bases, tamaño del mensajero de Enolasa: 3200 bases).
Se quiere utilizar este sistema de expresión (TetOp- tTA) para el desarrollo de una terapia contra una enfermedad
neurodegenerativa. El objetivo es expresar una proteína neuroprotectora en el estriado de ratas sanas y enfermas, en
determinado momento de sus vidas y no en otro (NOTA: A las ratas se les puede dar de tomar agua con tetraciclina
el tiempo que sea necesario y ésta llegar a todos los tejidos).
d) ¿Bajo qué zonas regulatorias pondrías a la proteína neuroprotectora? ¿Qué línea transgénica utilizarías para hacer
el experimento? ¿Cómo harías el experimento?
15.- INGENIERÍA GENÉTICA
Bibliografía: Recombinant DNA, Watson y col.
Guía de estudio:
1) ¿Qué significa "clonar" un gen? Defina la expresión "ADN recombinante", "vector" e "inserto" Mencione un
método que sirva para reconocer fácilmente colonias de bacterias que llevan plásmidos que contienen insertos.
R: Clonar un gen (o una secuencia de ADN) significa aislarlo de su contexto original y colocarlo en otro contexto
donde pueda ser amplificado. Es decir, aislarlo del genoma (por ej. con enzimas de restricción) para insertarla en un
vector (por ej. un plásmido bacteriano) para que, después de introducida la construcción recombinante en una bacteria
como E. coli, se pueda multiplicar esta secuencia para su análisis molecular (por ej. secuenciación nucleotídi-
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Construcción 1 Construcción 2
Control 3000 400
Stress 3000 2000
Línea 1 F1 (1x2)
sola
F1 (1x3) F1 (1x4)
Cerebro Corteza 4 400 500 2300
Estriado 3 90 1400 2000
Hígado 2 6 7 1900
corazón 3 7 6 2150

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ca). El concepto difiere de la clonación biológica en el sentido de que acá estamos hablando de un segmento de
ADN y no de un organismo completo.
Método para reconocer bacterias que llevan plásmidos con inserto: visualización de color de colonias (b-gal, se ve
más adelante).
2) Defina la expresión "ADN recombinante"
R: ADN recombinante es un término que se originó cuando se desarrollaron las primeras técnicas de Ingeniería
Genética y se refiere a un fragmento de ADN que se origina por la unión “in vitro” de dos fragmentos distintos, que
pueden provenir, inclusive, de especies no relacionadas. Quimera (sinónimo) Nota: La expresión recombinante
(aquí) no es sinónimo de recombinación homóloga porque no hay un intercambio de segmentos homólogos. En
todo caso, se parece a la llamada recombinación ilegítima (como por ejemplo la integración de fago lambda para
hacerse lisogénico, ver guía de genética bacteriana).
3) ¿Qué tipos de vectores de clonado conoce que funcionen en células procariotas? ¿y en eucariotas?
R: Vector se refiere a un fragmento de ADN que tiene la capacidad de replicarse en un determinado huésped y ,
como el témino lo indica, puede servir de vehículo para multiplicar otro fragmento de ADN que haya sido fusionado
al mismo. Elementos básicos de un vector: ser transferible por algún método, ser seleccionable, ser propagable,
aceptar la inserción de DNA exógeno.
Inserto se refiere a un fragmento de ADN que se fusiona al vector; en general representa el ADN de interés, que
fusionado al vector puede replicarse en el huésped adecuado.
En células procariotas hay plásmidos y fagos. Los primeros con circulares y tienen un origen de replicación que
permite que se repliquen y se mantengan en la célula. Los hay de alto y bajo número de copia. Los fagos pueden ser
utilizados como vectores, donde el ADN se interés debe ser “insertado” en el genoma del fago. En ambos casos se
puede también diferenciar a los vectores de expresión, ya sean fagos o plásmidos, que tienen promotores y terminadores
que flanquean al inserto, de forma de producir un mRNA y la proteína correspondiente.
En células eucariotas también hay vectores virales y plásmídicos. Estos últimos sólo se se parecen a los bacterianos
naturalmente en levaduras. En células de mamíferos se los ha fabricado articialmente utilizando orígenes de replicación
y replicasas de origen viral (como los plásmidos derivados de SV40 en células Cos). Muchos de ellos fueron
modificados para incorporar orígenes de eplicación de E. coli para así poder replicar también en bacterias, especialmente
cómodo para producirlos en buena cantidad. Por eso se los denomina: de combinación (shuttle). En levaduras
también se desarrollaron cromosomas artificiales (YACs), que fueron los primeros en utilizarse para clonar
grandes fragmentos que fueron secuenciados en los albores de la genómica estructural. Posteriormente fueron sustituídos
por otro tipo de vectores com los BACs (Bacterial Artificial Chromosomes).
4) ¿Qué es una genoteca (o library genómica) y cómo se construye? ¿Qué diferencia tiene con una clonoteca (habitualmente
llamada library) de ADNc (cDNA)?¿Cómo se realiza una búsqueda, prospección, relevamiento (habitualmente
llamado screening)? ¿Cómo se puede marcar una sonda? Cómo se procede para identificar bacterias que
llevan una construcción de interés, luego de haber sido transformadas con una mezcla de ligación?
R: Genoteca o genomoteca es una “biblioteca” de ADN donde, en vez de colecciones de biblios. (que significa
libros) dispongo de colecciones de segmentos de genomas. En general son específicas de un organismo determinado.
Se utiliza ADN genómico que se corta ya sea con enzimas de restricción o por métodos físicos y se liga a un
vector, que puede ser un plásmido, un fago o un BAC. Este material se utiliza para transformar bacterias competentes
(explicar competencia) o para infectarlas, si se utiliza un fago. La población de bacterias obtenidas representa a
todos los posibles fragmentos del ADN genómico original. En el caso de la “library” de cDNA se utiliza ADNc en
lugar de ADN genómico, pero el proceso es similar, salvo que no es necesario cortar el ADNc (explicar cómo se
obtiene).
Hay varias formas de marcar sondas, las que numeramos a seguir.
“Random priming”: se incuba el fragmento con una población de oligonucleótidos (hexámeros y/o octámeros) en
presencia de fragmento Klenow (fragmento de la ADN polimerasa de E. coli), dNTPs, alguno de los cuales está
marcado en alpha y Mg++. Después de un proceso de desnaturalización y renaturalización se agrega la enzima, los
oligonucleótidos se unen al ADN y son utilizados como sustrato por la enzima. Actualmente el más usado.
“Nick translation”: si una de las cadenas de un plásmido se corta exponiéndo un extremo 3’OH, la ADN polimerasa
I utiliza ese extremo como sustrato e inicia la síntesis de ADN, desplazando a la cadena existente, y corriendo el
“nick”. Aquí también se lleva a cabo la reacción con dNTPs, alguno de los cuales está marcado y Mg++, además
de la ADN Polimerasa I de E. coli.
Marcación terminal: se puede marcar el extremo de un fragmento utilizando una quinasa específica y ATP marcado
en gama.
PCR: la reacción de PCR puede utilizarse introduciendo un dNTP marcado en la reacción o utilizando un “primer”
previamente marcado en su extremo 5’ con una quinasa. Lo mismo puede hacerse con hexámeros random.
Ribroprobes: con el plásmido adecuado, en presencia de una ARN polimerasa como la T7 y de ribonucleótidos, se
puede transcribir un gen “in vitro” y marcarlo pasa ser utilizado como sonda.
En el caso de las genotecas, se llama “screening” a la búsqueda del clon que contiene el fragmento de nuestro interés.
Existen esencialmente dos formas. La primera es utilizar un fragmento y oligonucleótido de nuestro gen marcado.
Este fragmento se hibrida con una membrana obtenida de una placa de petri conteniendo múltiples colonias o
playas de lísis, dependiendo del vector utilizado. El ensayo es análogo al “Southern blot”. La marca (sea radiactiva

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o no radiactiva) indicará las colonias o placas positivas, las cuales se pueden recuperar de la placa madre. La segunda
forma es utilizar una forma de detectar la proteína expresada, en caso de los vectores de expresión. En general
puede hacerse utilizando anticuerpos que detectan la proteína producida y nos darán la posición de la colonia o
playa de lisis positiva, en un ensayo que es análogo al de un “western blot”.
Para identificar bacterias que llevan una construcción de interés, luego de haber sido transformadas con una mezcla
de ligación y seleccionadas para la presencia de plásmidos: Se preparan plásmidos a partir de un cierto número de
clones “positivos” y se los “chequea por restricción”, es decir se los digiere para comprobar el mapa de la construcción
realizada. A veces se hace PCR con primers específicos directamente de las colonias positivas (la Taq es
mucho más barata que las enzimas de restricción y permite analizar muchos clones a la vez).
5) ¿Cuál es la diferencia entre una transformación y una transfección?
R: En animales, transformación se refiere a la conversión de una célula o tejido en neoplásico, por lo que no es
correcto sinonimizarlo con transfección. En bacterias, también es preferible decir transfección porque la transformación
“natural” que vimos en genética bacteriana tiene diferencias con la artificial que se usa en ingeniería genética.
En plantas son sinónimos.
6) ¿En qué situaciones usaría Ud. las siguientes enzimas?:
Retrotranscriptasa; ligasa; Taq polimerasa; DNAasa I; RNAsa H
R: RT: Es una ADN polimerasa dependiente de ARN por lo que se la usa para fabricar ADN a partir de ARN por
ejemplo en el proceso de clonado molecular de ARNm. Nota: raramente se la puede usar como ADN polimerasa
dependiente de ADN cuando hay dificultades en la secuenciación manual de regiones con estructuras secundarias
que dificultan la acción de las ADN polimerasas tradicionales.
L: Para ligar fragmentos. Para unir un inserto a un vector. Requiere ATP y Mg.
Taq pol: en PCRs.
DNAasa I: para cortar ADN en forma inespecífica, por ejemplo para introducir los “nicks” en la marcación por
“nick translation”.
RNAsa H: para eliminar la hebra de ARN después de la acción de la tanscriptasa reversa.
7) Se quiere clonar el gen de una proteína que se expresa en cerebro de ratón. Ud. no tiene, ni puede llegar a saber,
la secuencia de aminoácidos de la proteína y depende exclusivamente de anticuerpos. ¿Qué tipo de genoteca usaría
para comenzar?:
a) ¿una genómica hecha con ADN obtenido de cerebro de ratón?
b) ¿una genómica obtenida de hígado de ratón?
c) ¿una de ADNc hecha con ARNm de corazón en pBR322?
d) ¿una de ADNc hecha con de ARNm de cerebro en pBR322?
e) ¿una genómica de expresión hecha en el fago λ gt11 hecha a partir de ADN de ganglios linfáticos de ratón?
f) ¿una genómica de expresión hecha a partir de ADN genómico obtenido de cerebro de ratón?
g) ¿una de ADNc de expresión hecha en fago λ gt11 a partir de ARN de cerebro de ratón?
R: La opción g) porque es en el tejido en el que el ARNm es más abundante.
8) ¿Qué es la mutagénesis dirigida in vitro? Mencione algún procedimiento para lograrla, uno usando células y el
otro sin usarlas.
R: Suponiendo que la secuencia que quiero mutar se encuentra entre 2 sitios de restricción de tipo cohesivo dentro
de un plásmido, puedo digerir con la enzima y religar para obtener una deleción. Otra: teniendo la secuencia clonada
en un plásmido, se la desnaturaliza con calor (para obtener ADN de cadena simple) e hibrida (anilla) con un
oligonucleótido sintétizado artificialmente de forma de tener una secuencia complementaria, salvo por un nucleótido
(que es el que interesa modificar) y que está ubicado en el centro del oligo. El ADN heterodúplex (tiene una
base mal apareada o missmatch) se incuba con una ADN polimerasa que usa el oligo como iniciador (primer) para
completar la cadena complementaria. Transformo bacterias con el plásmido heterodúplex y su replicación dentro de
la célula originará 2 moléculas hijas: una normal y la otra mutante.
Un ejemplo de mutagénesis usando células es el reemplazo alélico que se produce en un experimento de knock out
de un gen.
9) Dada una secuencia de interés: mediante qué estrategias se pueden generar mutaciones in vitro? Dé ejemplos de
generación de mutantes in vivo.
A) Partiendo de la secuencia de interés clonada en un plásmido, se pueden hacer deleciones, inserciones o reemplazos
puntuales 1) mediante el uso de primers específicamente diseñados que amplifiquen la secuencia con la modificación
deseada. Se trabaja con DNA simple cadena (por desnaturalización del plásmido, por obtención de moléculas
de simple cadena si el plásmido es derivado de un fago), primers y DNA polimerasa. (Hacer esquemas ilustrativos).
Las bacterias son transformadas con el plásmido heterodúplex y su replicación dentro de la célula originará 2
moléculas hijas: una normal y la otra mutada. 2) Se pueden hacer deleciones por digestión y religado de la secuencia
de interés. Se necesita disponer de sitios adecuados de enzimas de restricción.
B) Por amplificación de la secuencia de interés por PCR en condiciones de alto error (concentraciones bajas de
alguno de los ddnucleótidos, reemplazo de Mg por Mn). Los fragmentos son clonados y se obtiene una “library” de
mutaciones.

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Una secuencia de interés puede ser mutagenizada in vivo mediante la introducción en células de construcciones
adecuadas (algunas se describieron arriba). Una posibilidad es el reemplazo alélico que resulta en una modificación
funcional (Ej. generación de mutantes termosensibles) o en la anulación de la función ( Ej.: en un experimento de
knock out de un gen).
10) ¿Cuál es la diferencia entre una transfección transitoria y una estable? ¿En qué casos se utiliza la primera?
R: En la transitoria (no se dice transiente) el ADN ingresa al núcleo y se expresa, pero no se integra al genoma.
Después de un tiempo se degrada o se pierde por dilución a medida que no puede acompañar la replicación del
ADN cromosómico. Se usa para determinar más rápidamente la especificidad y nivel relativo de expresión de un
promotor. Se usa en muchos otros casos (reporters en células animales, expresión de proteínas de fusión por ej.).
Obtener clones “estables” en cultivos celulares animales es un proceso lento y engorroso (discutir).
11) ¿Cuáles son los métodos más comunes para transfectar células animales? ¿En qué casos o aplicaciones se utilizan
la transfección de células animales cultivadas in vitro versus la de animales transgénicos?
R: Coprecipitación con fosfato de Ca (el más antiguo, en desuso), microinyección (ídem), electroporación, liposomas,
lípidos catiónicos, e infección con vectores virales.
Aplicaciones: estudios de biología molecular y celular, industriales-farmacológicas (algunas comunes otras distintas
en ambos casos) = molecular farming. Mejoramiento (aunque no hay casos de esto último a nivel comercial).
12) ¿A qué se llama organismo "transgénico" u OGM u OVM? Dé ejemplos.
R: Las definiciones son necesariamente artificiosas y arbitrarias porque no basta con decir que se trata de un organismo
que contiene ADN procedente de otra especie o foráneo. Todos los cultivos modernos tienen esta característica
debido a que fueron mejorados mediante cruzamientos interespecíficos y hasta intergenéricos (el trigo, por
ejemplo, fue cruzado con el centeno para incorporarle genes de resistencia a enfermedades fúngicas) por lo que
serían transgénicos. Por lo tanto, se denomina así a los organismos obtenidos por biotecnología moderna, entendiendo
por biotecnología moderna a la ingeniería genética y a la fusión celular entre células de especies que no se
pueden cruzar entre sí. OGM es nomenclatura del Codex-FAO, OVM del Protocolo de Bioseguridad del Tratado de
Cartagenadependiente del Convenio de Biodiversidad de PNUMA (Prog. Nac. Unidas Medio Ambiente).
13) ¿Qué utilidad tiene el plasmido Ti de Agrobacterium tumefaciens?
R: El plásmido Ti contiene lo que se conoce como región T, que es la región que la bacteria transfiere a la planta en
el proceso de infección, y otra que contiene los genes “vir” que se requieren en “trans” para que la región T pueda
ser transferida. En los primeros ensayos de obtención de plantas transgénicas, la región T se modificó, agregando
los genes de interés y manteniendo los bordes derecho e izquierdo que son importantes para la transferencia. De
esta forma se logró transferir un ADN de interés a plantas. En este momento se utilizan plásmidos Ti desarmados,
es decir, que no contienen la región T, en conjunto con plásmidos pequeños que contienen los bordes de la región
T, flanqueando los genes de interés. Este tipo de plásmidos se denomina binarios y permiten que la manipulación
sea mucho más simple que con el plásmido Ti completo ya que este último tiene aproximadamente 250 kpb contra
las 10 kpb de los plásmidos binarios.
14) ¿Qué tipo de plantas se suelen transformar con el plasmido Ti de Agrobacterium tumefaciens y cuales por métodos
biolísticos y por qué?
R: Si bien es posible utlizar ambos métodos con todo tipo de plantas, las dicotiledóneas suelen ser transformadas
con Ti mientras que las monocotiledóneas lo son por el método biolístico debido a que existen grandes diferencias
en su eficiencia relativa. Esto es así porque estas últimas no son huéspedes naturales de Agrobacterium.
15)¿A qué se llama "vacuna recombinante"? ¿Hay alguna en el mercado?
R: Vacuna recombinante es aquella producida por métodos de ADN recombinante. En general consiste en la producción
del gen codificante para un antígeno (proteína recombinante) en un sistema viral heterólogo. El antígeno
funciona como vacuna cuando logra despertar en el organismo una respuesta inmune que lo protege del ataque del
patógeno que lleva ese antígeno. Un ejemplo muy utilizado es la vacuna contra la Hepatitis B.
Vaccinia- rabia. Retrovirus felino para perros....
16) ¿Qué significa "terapia génica"?
R: Es una terapia que implica el uso de vectores para lograr introducir ADN conteniendo un gen funcional en células
de un paciente con el propósito de revertir los síntomas de una enfermedad, generalmente producida por un gen
defectuoso.
17) ¿Cuáles son los riesgos para el ambiente y para la salud humana que pueden traer estas tecnologías?
R: Las inquietudes, algunas genuinas, otras no tanto, pueden agruparse en 3 categorías:
a) Potenciales efectos sobre la salud humana y animal (toxicidad, alergenicidad, transferencia horizontal de
resistencia a antibióticos, ingestión de ADN foráneo que “modificaría nuestra constitución genética”, utilización de
secuencias de ADN de origen viral por creer que TODOS los virus son patógenos para los humanos)
b) Potenciales consecuencias ambientales (daño a especies ajenas al proceso, como la mariposa Monarca; la
aparición de insectos resistentes; que el cultivo se convierta en una supermaleza incontrolada; que haya flujo de
genes desde cultivos a malezas; que las proteínas transgénicas se difundan en el ambiente; que disminuya la biodiversidad
y otros semejantes).

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c) Preocupaciones de tipo político, económico o social: concentración de beneficios monopólicos en empresas,
particularmente multinacionales; limitación de acceso a la biodiversidad genética por un patentamiento concebido
como apropiación comercial no ética; avasallamiento del derecho de agricultores; acrecentamiento de brechas
sociales y productivas entre productores pequeños y grandes; crecimiento de una agricultura industrial poco sustentable,
en detrimento de prácticas que lo sean; dificultades de la coexistencia con la agricultura orgánica.
Un riesgo que se debe considerar como de ocurrencia probable, es que el uso generalizado de plantas resistentes a
plagas y herbicidas seleccione la aparición de insectos y malezas capaces de superar dicha resistencia (ver problema
de genética de poblaciones en el anexo). La experiencia acumulada en casi 30 años de comercialización masiva del
primer producto derivado de un OGM, la insulina humana, y en 15 años de cultivos, no parece indicar que la mayoría
de estas inquietudes se puedan fundar genéricamente en la tecnología. Es decir, un OGM no conlleva riesgo por
ser tal, si bien podría tenerlo por el transgén específico que lleve incorporado. Debido a ello, los organismos nacionales
e internacionales de análisis y regulación estudian caso por caso el producto final. Por ejemplo, los riesgos de
soja con resistencia a herbicidas son distintos que los de maíz con el mismo gen incorporado por ingeniería genética
(o transgén), o a los de soja con otro transgén. Es más, los sistemas regulatorios suponen razonablemente que una
soja resistente a un herbicida como resultado de acciones de ingeniería genética tiene idénticos riesgos ambientales
que una obtenida por métodos convencionales. Los riesgos alimentarios se evalúan de acuerdo con procedimientos
bien establecidos y aceptados internacionalmente. Además de analizar su toxicidad y su degradación en jugos gástricos
sintéticos, análisis bionformático, estudios de toxicidad aguda en animales de laboratorio, etc; se realizan
pruebas de equivalencia sustancial entre alimentos derivados del cultivo convencional y otros preparados con el
OGM.
Si bien el riesgo de que los transgenes se incorporen por cruzamiento a otras plantas de la misma especie o de especies
relacionadas demostró ser real, los perjuicios, según se encontró, fueron más comerciales que ambientales. En
todo caso, la incidencia real de estos riesgos está muy lejos de obligar a la consideración de un abandono de los
cultivos OGMs. Por otro lado, se comprobó que, a pesar de la demora en la liberación de desarrollos realizados por
instituciones públicas de OGMs con caracteres que favorecen a los productores más pequeños (aunque se acaba de
aprobar un poroto transgénico con resistencia a virosis desarrollado por una institución pública en Brasil), éstos
también se beneficiaron notablemente al cultivar los OGMs de primera generación (por ej. productores de algodón).
18) ¿Qué pasó en Asilomar en la década del ’70? ¿Qué conoce del tema de la bioseguridad del manejo de OGMs en
Argentina y en el mundo?
R: Lo de Asilomar está en el Recombinant DNA de Watson: Poco después de que se descubrieran las enzimas de
restricción y se produjeran las primeras moléculas recombinantes, cuando aún no existía Greenpeace, los propios
científicos plantearon inquietudes de bioseguridad del tipo: ¿qué pasaría si una E. coli (habitante habitual del intestino
humano) recombinante con un oncogén se “escapa” al ambiente e infecta la humanidad? A partir de ese momento
se diseñaron laboratorios con distintos niveles de seguridad: desde P1 (muy bajo) para trabajar con plantas
(no se las consideraba “peligrosas”) hasta P4 (parecido a la película epidemia, igual nivel de seguridad que para
trabajar con Ébola). Posteriormente se demostró que la excesiva cautela no fue justificada y los niveles de seguridad
se restringieron al nivel del problema estudiado, más que a la metodología. Es más, hoy se considera más seguro
trabajar con secuencias clonadas de patógenos (como el HIV) que trabajar con el patógeno. El Ministerio de
Agricultura, Ganadería y Pesca publicó en su sitio de internet un documento donde responde a las preguntas que
frecuentemente se hace la gente sobre los transgénicos: http://www.minagri.gob.ar/ ir a Biotecnología
(http://www.minagri.gob.ar/site/agricultura/biotecnologia/80-DE%20INTERES). También se puede encontrar información
sobre el sistema regulatorio en Argentina
http://www. sagpya.mecon.gov.ar/new/0-0/programas/biotecnolo-gía/respuestas.php
También se puede encontrar mucha información seria en ArgenBio (http://www.argenbio.org/) organización dirigida
por una egresada de esta carrera.
Problemas:
1) Se desea clonar el gen que codifica una entomotoxina proteica con propiedades insecticidas que se encuentra en
Bacillus thuringiensis (bacteria del suelo originalmente aislada de insectos muertos), pensando en producir soja
transgénica resistente a lepidópteros. Para cumplir con la primera etapa del objetivo planeado, se cortó el DNA total
de B.t. con MboI en cantidad limitante (tubo 1). Por otra parte, el plásmido Bluescript (parecido al pUC19) fue incubado
con BamHI (tubo 2, ver tabla de sitios de reconocimiento en la guía 1 y comparar BamHI y MboI). Después
se mezclaron los contenidos de los tubos 1 y 2 en presencia de ligasa, incubándose durante la noche a 16 ºC
(tubo 3). Luego se transformaron células competentes (permeabilizadas con CaCl2) de una cepa de E. coli que era
RecA-, AmpS, lac- en presencia de ampicilina, IPTG y X-gal (X-gal es un sustrato cromogénico de la ßgalactosidasa
que da un producto azul). Como la relación entre colonias blancas y azules resultó apropiada, se decidió
continuar haciendo réplicas de las colonias en filtros de nitrocelulosa. Finalmente, los filtros se revelaron con
un anticuerpo anti-entomotoxina, mediante el método del segundo anticuerpo conjugado a fosfatasa alcalina. Diga
si es verdadero o falso y fundamente el razonamiento:
a) Los extremos generados por BamHI no pueden ligarse a extremos generados por MboI.
b) Se utilizó BamHI porque la enzima universalmente reconoce los codones de iniciación de todos los genes permitiendo
su correcta inserción en el vector utilizado con respecto a su posición respecto del promotor lac.
c) La ampicilina sirvió para seleccionar bacterias transformadas.

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d) La ampicilina sirvió para seleccionar bacterias transformadas con algún plásmido recombinante (es decir plásmido
con inserto).
e) Las colonias que llevaban algún plásmido recombinante (es decir con inserto) son azules.
f) Dado que la maquinaria transcripcional de E. coli es similar a la de B.t. fue posible encontrar algunos clones positivos
que contenían el gen de la entomotoxina completo (incluyendo su promotor) orientado en cualquiera de las
dos sentidos respecto al vector.
2) Utilizando como sonda un cDNA de la subunidad
mayor del receptor de GABA (un neurotransmisor) y
empleando condiciones de baja rigurosidad, se aisló a
partir de una genoteca de E. coli un fragmento de DNA
(llamado ORF más adelante) conteniendo un marco de
lectura abierto con cierta similitud de secuencia con la
sonda usada. Con el objeto de identificar la función de
este gen (la cual seguramente no es recibir neurotrans-
ClaI
2,9
amp R
pAMP R
5 kpb
ClaI
4,5
pTET-
ORF
6 kpb
tet R
ORF
ClaI
1,2
misores) se utilizó la siguiente estrategia: El plásmido pAMPR (ver Fig.) fue digerido con la enzima de restricción
Cla I y el fragmento de 1,6 kpb conteniendo el gen de la ß-lactamasa (enzima que hidroliza a la ampicilina y confiere
resistencia a este antibiótico) fue purificado e introducido en el sitio Cla I de pTETORF (ver Figura) Este
plásmido contiene el fragmento clonado (ORF) y un gen (tet r) que confiere resistencia al antibiótico tetraciclina.
La replicación de pTETORF es termosensible, funciona a 30°C y se inhibe a 42°C.
El plásmido recombinante pTETORFAMP se obtuvo por transformación en una cepa de E. coli recA - (incapaz de
hacer recombinación homóloga). Las bacterias transformadas con la ligación se crecieron a 30°C. Posteriormente,
el plásmido obtenido fue introducido por transformación en una cepa de E. coli salvaje (recA + ). Las bacterias fueron
cultivadas a 42°C durante 15 horas en presencia de ampicilina y luego una alícuota fue sembrada en ágar conteniendo
medio rico y ampicilina. Se hizo un plaqueo en réplica hacia una placa conteniendo el mismo medio más
tetraciclina. Las colonias resistentes a ampicilina y sensibles a tetraciclina fueron utilizadas en los ensayos siguientes.
A-¿Cuál es el objetivo del protocolo? ¿Por qué fueron elegidas las bacterias amp r tet s ? ¿Hubiera bastado con determinar
la resistencia a ampicilina?¿Por qué?
B-¿Qué hubiera pasado si las bacterias hubieran sido cultivadas a 30°C?
C-¿Qué ensayos haría para confirmar que las mutantes aisladas tienen el genotipo esperado?
Una vez confirmada la mutación, obtenemos como primera conclusión que ésta no parece afectar la capacidad de la
bacteria para crecer en medio rico.
D- ¿De dónde saca esa conclusión?
El experimento siguiente fue plaquear las bacterias mutantes en medio mínimo. No se encontraron diferencias
respecto de las salvajes en número ni en morfología de colonias. Luego de tanto tiempo de trabajo infructuoso y,
con tal de tener un resultado, los investigadores decidieron mapear por conjugación el locus ORF aprovechando las
características de la mutación introducida.
E-¿Que característica de las mutantes facilita el mapeo del locus ORF? ¿Podría hacerlo si no la tuvieran?
Muchos años después, un joven e inquieto estudiante de biología, buscando tema para su tesis de Licenciatura, rescató
de una congeladora esta vieja mutante y se propuso caracterizarla. Su razonamiento fue: si este gen no es esencial
en condiciones de crecimiento normales, quizás sea necesario en condiciones de estrés (calor, frío, hiperosmoticidad,
hipoosmoticidad). Haciendo curvas de crecimiento en medio líquido en estas condiciones, encontró que la
cepa mutante mostraba una marcada deficiencia (comparando con la salvaje) para crecer a temperaturas mayores a
45°C.
Al mostrarle este resultado a su ya decrépito director éste lo desanimó diciéndole que seguramente tanto tiempo en
la heladera había introducido nuevas mutaciones en la cepa. Aunque extrañado el estudiante enseguida pensó y
realizó un experimento que despejó toda duda sobre la causa genética de la deficiencia de la cepa congelada.
F- ¿Cuál fue el experimento realizado?
3) El tema de las patentes de secuencias nucleotídicas es polémico, particularmente en el caso de las secuencias
humanas. Para analizar el tema se analiza el caso histórico y emblemático de la patente No. 4943674 de Calgene (la
empresa de base tecnológica que comercializó el primer cultivo transgénico en Estados Unidos) que protege a secuencias
nucleotídicas de unión de factores transcripcionales específicos de fruto. La patente protege todo uso de
estas secuencias en cuanto a su uso en la obtención de plantas transgénicas que provoquen CUALQUIER tipo de
cambio fenotípico en el fruto de CUALQUIER planta (desde vid, sandía, citrus, peras, cerezas, ciruelas, etc. hasta
tomate, pepinos y zapallos). Para sustentar el reclamo, la empresa provee una serie de datos experimentales. A partir
de una clonoteca (colección de clones) de cDNA diferencial se clonó y caracterizó la secuencia codificante para
la poligalactouronasa (PGU). Esta enzima se sintetiza en los tomates maduros y ataca la pared celular produciendo
el ablandamiento del fruto, proceso no deseado comercialmente. La concentración del mRNA para PGU aumenta
más de 2000 veces cuando se compara la concentración en tomates rojos (maduros) con la de tomates verdes (inmaduros)
por lo que hipotetizan que la regulación del gen es fundamentalmente a nivel transcripcional. Posteriormente,
clonaron y secuenciaron el gen completo de la PGU (incluyendo su promotor) e hicieron una construcción
en la cual invirtieron la orientación de la secuencia codificante la cual introdujeron en plantas de tomate (transgéni-

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cas para la misma). Como consecuencia, se transcribe un RNA complementario al mRNA para PGU que al formar
una doble cadena con el mRNA bloquea su traducción (esta forma de inactivación de la expresión de genes se denomina
estrategia RNA antisentido). De esta forma se obtuvo el tomate Flav®Sav® (con mucho aroma y sabor)
que constituyó la primera planta transgénica comercializada a nivel mundial (1988).
a) Describa cómo obtuvieron la clonoteca diferencial.
b) Describa cómo clonaron el gen PGU completo.
c) Describa cómo haría para demostrar en forma más precisa, usando secuencias indicadoras (reporteras), el control
transcripcional ejercido por este promotor. No olvide detallar construcciones, vectores, métodos de transformación,
evaluación de la expresión, etc.
d) La descripción de la patente viene acompañada por la secuencia nucleotídica completa del promotor del gen de
la PGU. Sin embargo la empresa se preocupa particularmente en proteger no sólo la secuencia completa sino también
cualquier fragmento parcial de la misma ¿por qué?
e) La secuenciación del gen incluyó al terminador del gen. Sin embargo, a diferencia del promotor, la empresa no
solicita su protección mediante esta patente ¿por qué?
f) Si Ud. fuera funcionario de la oficina de patentes y le tocara evaluar esta presentación particularmente en cuanto
a la amplitud de la protección solicitada (derechos extensivos a todas las plantas, por ej.) ¿qué experimentos adicionales
solicitaría para sustentarla?
4) La hormona del crecimiento (HC) es una proteína que se sintetiza y se secreta en la glándula pituitaria. La expresión
de este gen depende de un factor de transcripción específico llamado Pit-1, el cual reconoce la secuencia de
ADN (T/A)NCTNCAT. Además de Pit-1, existen otros elementos regulatorios que juegan un papel importante en
la expresión de este gen como CRE, GRE y TRE, cuyas secuencias de reconocimiento son conocidas. La zona
promotora del gen HC de pollos (HCp), no ha sido tan bien estudiada como la de mamíferos. Se describieron sólo
500 pb de la región promotora del gen HCp, lo cual no permitía realizar un análisis profundo de la regulación de la
transcripción en esta especie. Ip, S et al. (Exp.Biol.Med 229: 640-649, 2004) decidieron entonces estudiar más extensamente
esta zona regulatoria, y lograron identificar un fragmento de 1,8 kbp de la región promotora de HCp.
-1727pb -541pb -113pb + 48pb %Act.Prom relativa a 1
LUCIF.
Pit-1
motivo ADN salvaje
motivo de ADN mutado
LUCIF.
LUCIF.
LUCIF.
LUCIF.
100
80
100
Secuencia codificante del gen de la enzima luciferasa.
80
a) Describa cómo le parece que hicieron los autores para clonar el gen completo de HCp (zona reguladora de 1,8
kpb + region codificante). Qué sonda/s habrán utilizado?
b) Cómo se le ocurre que los autores determinaron los posibles sitios de unión de Pit-1 y de otros elementos regulatorios?
Los resultados revelaron dos sitios de reconocimiento de Pit-1 en el fragmento de 1,8 kpb. : uno proximal –113/-
104 pb y el otro distal –541/-533 pb, y un posible motivo TRE (CAATGAGGTA) a –137/128. Para caracterizar
funcionalmente la zona 5’ del gen HCp, se realizaron ensayos de transfección in vitro usando como gen reportero al
gen de la luciferasa.
c) ¿Qué consideraciones cree Ud. que se deberían tener para elegir un gen reportero?
d) ¿Que construcciones genéticas los autores podrían haber utilizado para el ensayo de transfección?
e) ¿Qué células pudieron haber utilizado para el ensayo de actividad promotora por transfección? ¿Qué control/es
considera Ud. que los autores deberían haber realizado?

50
Con los ensayos de luciferasa concluyeron que la zona entre –187/+48 pb es la secuencia mínima para tener la mayor
actividad promotora. Luego, para determinar si los sitios proximales y distales de unión de Pit-1 eran ambos
funcionales, midieron actividad de luciferasa en el fragmento de 1,8 kpb al cual le habían introducido, previamente,
mutaciones en la zona distal, proximal o ambas. Los resultados se muestran en la siguiente figura.
f) ¿Cómo interpreta Ud. estos resultados?
Finalmente compararon las zonas regulatorias del gen HC de pavo (HCv) con las de HCp. Encontraron que dichas
zonas en ambas aves tienen un 90% de identidad de secuencia. Sin embargo, informaron que existe poca similitud
entre estas zonas del gen HCp y las zonas regulatorias de HCm (mamíferos como rata y humanos).
g) Qué le sugieren estos resultados?
5) Zheng y col (BMC Infect. Dis. 9 2009 y anteriores) investigaron la factibilidad de una vacuna a DNA para inmunizar
contra la gripe aviar (H5N1). En trabajos previos, clonaron los genes virales codificantes para hemaglutinina
(HA), neuraminidasa (NA) y nucleoproteína (NP).
a) Este virus tiene un genoma a RNA completamente secuenciado ¿Cuáles fueron los 4 primeros pasos necesarios
para clonar cada uno de estos 3 genes a partir del genoma purificado? Contestar brevemente sin justificar.
Una vez aislados los genes, los subclonaron en el siguiente vector plasmídico combinado (shuttle vector):
Aclaraciones:
ColE1 ori: Origen de replicación de Escherichia coli
Amp: gen de resistencia a ampicilina (incluyendo su promotor
y terminador de transcripción originales presentes en el Tn3 de
E. coli)
Pcaggs: Promotor de actina de pollo y enhancer de hCMV
(citomegalovirus humano)
HA: Secuencia codificante para la HA de influenza (en los
otros 2 plásmidos HA fue reemplazada por NA o NP, respectivamente)
polyA: Terminador del gen de la hormona de crecimiento bovina
puro: gen de resistencia a puromicina (antiobiótico eucariótico)
separado del gen HA por un sitio IRES (internal ribosome
entry site) que permite la unión del ribosoma (independiente
de CAP) y una expresión bicistrónica.
b) ¿Por qué y para qué se usa este vector combinado?¿Es capaz de replicar tanto en bacterias como en células de
vertebrados?
c) ¿Cuántos y cuáles productos de expresión esperaría encontrar a partir de este plásmido en E. coli y cuántos y
cuáles en vertebrados?
Después de hacer varias pruebas, electroporaron estos 3 plásmidos en ratones experimentales y, después de 7 días,
desafiaron los ratones mediante infección pulmonar con virus H5N1. La tabla muestra los resultados.
Tabla: Grado de protección de ratones inmunizados con la vacuna a DNA contra el desafío virus influenza H5N1
Dosis de Ratones sobrevivientes
DNA (µg) HA NA NP control
10 6/12 3/12 0/12 0/12
50 10/12 5/12 0/12 0/12
100 12/12 12/12 0/12 0/12
d) ¿En qué habrá consistido el control que se muestra en la última fila?
e) ¿Fue exitosa la vacuna? ¿Cuál fue el mecanismo molecular de la respuesta? (es decir, ¿se generaron anticuerpos
contra DNA o contra una proteína viral?)
f) ¿Fueron los 3 genes igualmente eficaces? Si no fue así ¿puede explicar por qué no?
g) Señale (sin justificar) una ventaja que tendría esta clase de vacuna contra la gripe en comparación con la convencional.
6) En la nueva versión de la película “El planeta de los simios: (R)evolución”, un científico trata de encontrar una
terapia génica para el Alzheimer y para ello requiere expresar ciertos genes en el cerebro de los pacientes. Para
poder hacerlo decide usar, como vectores, virus recombinantes neurotrópicos (que tengan afinidad y repliquen en
neuronas, células que normalmente no se dividen). El sistema experimental que utiliza para realizar sus experimentos
es obvio por el título de la película. En un determinado momento de la película, el primer vector pierde eficacia
porque es rechazado por el sistema inmune, por lo que decide ensayar un vector “más virulento”.
¿Qué virus habrá usado como vector? ¿Qué ventajas/desventajas comparativas tienen: retrovirus, lentivirus, adenovirus
(como el SV40) o poxvirus (como vaccinia) para estos fines?
Sabiendo que el Alzheimer y el Parkinson son producidos por agregación de una proteína conocida (ver problema 9
de “regulación” del anexo) cuyo gen está clonado y pudiera curarse con esta aproximación simplista como la de la
película, esquematice cómo sería la construcción subclonada en el virus recombinante.

16. GENÉTICA DEL DESARROLLO
Guía de estudio:
1) ¿Qué similitudes y diferencias tiene el desarrollo embrionario en vertebrados y en moscas? ¿Qué importancia
relativa tienen las gametas masculina y femenina (los óvulos o futuros huevos)?
2) ¿Qué diferencias y similitudes existen entre determinación (o compromiso) y diferenciación?
3) Describa la determinación autónoma versus la determinación en comité o grupal.
4) ¿Qué es una cascada regulatoria y un efecto de posición? ¿Sirven para explicar porqué el producto de un mismo
gen tiene efectos opuestos en distintos tejidos?
5) ¿Qué características tienen los genes que condicionan y participan en el desarrollo? ¿Son todos genes para factores
de transcripción?
6) ¿Son lo mismo que los genes homeóticos o éstos son un subgrupo de los mismos?
7) Si la mayoría de estas mutaciones (como la del problema 2) son letales. ¿Cómo hacen para mantener- las (y visualizar
su efecto sobre los embriones)?
8) ¿Existen similitudes entre los genes de artrópodos y vertebrados? ¿Implica esto una evolución convergente de
estos genes?
9) Explique por qué la herencia de los genes del desarrollo más tempranos (como en el caso del gen bicoid de Drosophila)
muestra efecto materno (como el que vio en la guía de herencia extranuclear).
Porque los productos de estos genes ya se encuentran, en forma de mRNA y/o proteína en el óvulo/huevo porque en
forma previa a la fecundación los expresó la madre y, por lo tanto, no hay posibilidad de que se expresen los genes
del embrión, por lo que si la madre es Aa y el hijo aa (porque recibió un a del padre), el fenotipo va a ser A como la
madre. Es efecto materno (y no herencia materna) porque a diferencia de la herencia materna, este fenotipo (A) no
se hereda, como sí lo hacen los genes ubicados en las mitocondrias.
Problemas:
1) Durante el desarrollo de la mosca Drosophila melanogaster participan varias moléculas conocidas como morfógenos,
siendo en las primeras etapas, de origen materno (los mRNAs que codifican para dichos morfógenos se traducen
en el huevo, pero provienen de las células nutricias maternas). Ejemplo de esto y responsables del establecimiento
del eje antero-posterior son:
-en la parte anterior del embrión, BICOID (bcd) y más tardíamente HUNCHBACK (hb), productos de los respectivos
mRNA maternos.
-en la parte posterior del embrión, NANOS (nos) y más tardíamente CAUDAL (cd), productos de los respectivosmRNA
maternos. Se demostró también que:
-la proteína bcd reconoce el 3’UTR del mRNA de cd y en la región promotora del gen hb
-la proteína nos reconoce el 3’UTR del mRNA de hb.
a)¿Qué tipo de acción presentan bcd y nos según lo comentado
anteriormente? Para contestar complete el siguiente
esquema con flechas de unión: (convenciones:
activación, ---| inhibición).
b) Con toda la información que tiene acerca de bcd, complete los fenotipos que espera observar en los experimentos
de la Fig asignando en cada caso, alguna de las 4 opciones que se muestran debajo de la figura, en donde se ha
ensayado el agregado de mRNA bcd en embriones con diferentes fondos genéticos En la Figura siguiente, complete
(con flechas) el esquema de los resultados de inyección de mRNA de bcd.
Las hembras homozigóticas para la mayor parte de las mutaciones en el gen autosómico bicoid no tienen descendencia
viable. Considere un cruzamiento entre hembras homozigóticas para el alelo silvestre de bicoid (b+b+) y
machos homocigóticos para un alelo mutante de ese gen (b-b-).
51

52
Calcule las frecuencias génicas del alelo mutante b en las generaciones G1, G2 y G3 considerando G1 la descendencia
del cruzamiento de hembras ++ con machos bb.
2) Para estudiar la regulación del gen "hairy" de Drosophila, se clonó la región promotora del mismo, reemplazando
la secuencia estructural por la del gen indicador lac Z (ß-galactosidasa de E. coli). Posteriormente, se transformaron
embriones sinciciales de Drosophila y se les suministró X-gal en el momento en que normalmente se expresa
el gen "hairy", observándose la aparición de 7 anillos (segmentos) coloreados de azul. A continuación se hicieron
deleciones en la región 5' de la región promotora para analizar la contribución de cada parte de esta región promotora.
Como resultado, se identificaron
secuencias regulatorias específicas
que resultaron ser responsables,
individualmente, de la formación
de cada uno de los anillos.
Para estudiar la acción de estas
secuencias, se tomó la construcción
responsable de la formación del
anillo 6, y con ella se transformaron
embriones de moscas mutantes
deficientes para el gen "knirps" y
para el gen "Krüppel", y otra que
expresa el gen "Krüppel" en forma
constitutiva con los siguientes resultados:
Con anticuerpos específicos e hibridacción "in situ" del mRNA, se ensayó la concentración relativa de los productos
de los genes knirps y Krüppel en el embrión de las moscas salvajes, observándose la siguiente distribución:
a) ¿Por qué se utilizó una secuencia estructural de ß-galactosidasa en
lugar de la secuencia estructural del mismo gen, pudiendo disponer de
anticuerpos para detectar la expresión de la proteína "hairy"?
b) ¿Por qué no se eliminó la región promotora conteniendo las CAT y
TATA boxes en los experimentos de deleción?
c) ¿Cómo explica la disminución en número, de 7 a 1, de los segmentos
"teñidos" con X-gal en las deleciones?
d) En base a los experimentos con mutantes y de detección de productos de los genes knirps y Krüppel ¿qué función
cumplen estos productos? En su contestación considere la posibilidad de que sean receptores de membrana,
hormonas, factores de transcripción, reguladores positivos, negativos, segundos mensajeros y/o proteínas específicas
de tejidos diferenciados como podría ser la hemoglobina de los glóbulos rojos de vertebrados.
3) Las flores se construyen según líneas similares compuestas por 4 verticilos concéntricos (sépalos, pétalos, estambres
y carpelos) que comprende cada órgano floral. Los estudios en Arabidopsis demostraron que si bien las
plantas no parecen tener proteínas con homeodominio, existen genes que cuando mutan provocan cambios homeóticos
en la arquitectura floral. El estudio del patrón de expresión espacial de mutantes fenotípicos originó el modelo
ABC que afirma que hay tres tipos de genes homeóticos. Los diferentes fenotipos para las mutaciones apetala-2
(en genes A), apetala-3 (en genes B) agamous (en genes C) y se presentan a continuación.
Verticilo 1 Verticilo 2 Verticilo 3 Verticilo 4
Salvaje sépalos pétalos estambres carpelos
Apetala2 (A) carpelos estambres estambres carpelos
Apetala 3 (B) sépalo sépalo carpelo carpelo
Agamous (C) sépalos pétalos pétalos sépalos
a) El cruzamiento de individuos mutantes apetala-2 con individuos salvajes produjo una F1 salvaje mientras que en
F2 se detectaron individuos 406 salvajes y 128 individuos mutantes. Los mismos cruzamientos empleando las otras
mutaciones evidenciaron resultados similares. Qué tipo de herencia podría justificar los fenotipos hallados?
b) ¿Cómo explicaría los fenotipos de los mutantes en relación al modelo ABC?

17. GENÓMICA Y POSTGENÓMICA
Guía de estudio:
1) ¿Para qué sirven los marcadores genéticos (moleculares y no
moleculares)?
R: Para mapear. Existen distintos métodos de mapeo: físico y
genético. Los mapas físicos se construyen a partir de la secuenciación
del ADN y otras técnicas moleculares, como el mapeo
con enzimas de restricción (como se vio en la guía 1 –Biología
Molecular-) usando o no Southern blot, la hibridación in situ, la
alineación de insertos genómicos clonados en BAC y YAC,
caminatas cromosómicas, comparación sinténica de genomas
filogenéticamente relacionados, etc. Los mapas genéticos se
construyen a partir de análisis de ligamiento en poblaciones segregantes
posteriores a la recombinación y sumando distancias
entre loci sucesivos lo más próximos posibles (ver guía 7 de
mapeo). Ambos mapas no coinciden en cuanto a las unidades utilizadas (número de nucleótidos o pares de bases
versus unidades de recombinación) ni en las distancias relativas (las frecuencias de recombinación no son parejas a
lo largo de todo el cromosoma), pero sí en el orden de los marcadores.
2) Compare el uso de marcadores genéticos moleculares, bioquímicos y morfológicos.
R: Su uso para mapeo genético es similar, salvo cuando los marcadores morfológicos están determinados por más
de un locus (epístasis) o son de distribución continua (“cuantitativos”). Pero aún en estos casos existen formas de
utilizarlos que se verán en otras guías. Los marcadores morfológicos pueden verse influidos por el ambiente, el
momento de desarrollo, el órgano y otros factores. A menos que se conozca su base molecular (secuencia nucleotídica)
no pueden ser usados para mapeo físico (salvo que sean marcadores citogenéticos = morfología cromosómica).
Los marcadores bioquímicos (fundamentalmente patrones de electroforesis de proteínas e isozimas), tienen
particularidades intermedias.
3) ¿En qué medida los marcadores moleculares permiten relacionar los mapas genéticos con los mapas físicos?
R: Porque se puede relacionar su localización genética con su hibridación y mapeo físico en clones genómicos
alineados de BACs y YACs. Una serie de clones solapados se denomina contig. Para formar el contig, se emplean
secuencias cortas y únicas presentes en los insertos clonados como si fueran marcas distintivas (por ejemplo, un
sitio de restricción en el contexto de la secuencia nucleotídica de un gen que se puede revelar mediante un RFLP).
Esas marcas específicas se denominan STS (sequence-tagged sites). Es decir que un RFLP determinado puede ser
un STS. Debido a lo tedioso y poco automatizable de la técnica de RFLP; como usualmente se conoce la secuencia
nucleotídica, se la convierte en una técnica basada en PCR llamada CAPS. Como estos mismos RFLP (CAPS) pueden
mapearse poblaciones segregantes, esto permite superponer el mapa genético con el mapa físico.
4) a) ¿Cómo clasificaría de acuerdo a la metodología a las distintas técnicas conducentes a obtener marcadores
genéticos moleculares (RFLP, AFLP, RAPD, SSR, SNP). Haga una comparación entre ellas.
R: Los RFLP fueron los primeros marcadores de ADN en ser utilizados. Surgen de comparar los patrones de restricción
de Southern blot entre distintos individuos, especies, etc. observando diferencias (polimorfismos) en sitios
de corte. Debido a que se basan en la hibridación molecular lo que permite el reconocimiento entre secuencias que
no son totalmente homólogas, se los considera marcadores relativamente conservados que permiten comparaciones
evolutivas entre especies, géneros y familias relacionados (dependiendo de la secuencia, se puede progresar en la
escala taxonómica hasta más arriba). Se continúan usando en estudios de sintenia (mapeo comparativo). Como
contrapartida, resulta más complicado encontrar variabilidad (polimorfismos informativos) intraespecíficos para
hacer, por ejemplo, genotipificación (identificación a nivel de individuo o fingerprinting). Hoy en día, los RFLPs
han sido desplazados en gran medida por los SNPs (polimorfismo de nucleótido simple –único-, se pronuncia
SNiP). Los SNP no tienen una única metodología como los RFLP sino varias, aunque todas ellas requieren de PCR
en alguno de sus pasos. Cualquier técnica que permite visualizar un cambio en un nucleótido se clasifica como
SNP. Como ejemplo ya se mencionó a los CAPs que implican la amplificación y posterior digestión del producto
de PCR con una enzima de restricción (aquel que fuera responsable del polimorfismo en el RFLP). Hoy en día, los
polimorfismos a detectar son identificados a partir de estudios previos de secuenciaciones genómicas más que de
RFLP. No todos los SNPs requieren restricción. Otra técnica bastante clásica clasificada como SNP es la SSCP que
consiste en desnaturalizar el ADN y diferenciar electroforéticamente las diferencias de migración de los plegamientos
secundarios intracatenarios derivados del cambio nucleotídico. Estos marcadores ofrecen varias ventajas respecto
de los RFLP: a) existe mayor número de alelos en la población (en humanos se stima que hay un SNP cada 1000
pb) y b) el grado de heterocigosis es alto, con lo que resultan ser más informativos. Comparten con los RFLP la
ventaja de no ser anónimos (se conoce su identidad –secuencia, pertenencia a un gen, por ej.-) y su codominancia
(posibilidad de diferenciar heterocigotas de homocigotas).
Los otros marcadores de mayor utilización (junto con los SNPs) son los microsatélites o SSR (single sequence repeats)
están constituidos por un motivo (secuencia corta de ADN) de repetición en tándem de di-, tri y tetranucleótidos.
La repetición más común es la del dinucleótido CA en animales y TA en vegetales. Aquí lo que varía no es
53

54
un único nucleótido, sino el número de veces en que se repite el motivo de repetición, lo que es detectado como
productos de amplificación que poseen tamaños que varían según la cantidad de repeticiones. Son los marcadores
más utilizados para genotipificación (también llamado genotipado o fingerprinting). Los RAPDs (randomly amplified
polymorphic DNA, se pronuncia RAPiD) son marcadores moleculares que surgen luego de utilizar un único
oligonucleótido iniciador (primer) en la reacción de PCR. Son polimorfismos para fragmentos de ADN amplificados
al azar del genoma, obteniéndose una serie de bandas de distintos tamaños según donde se haya pegado ese
primer. Este conjunto de bandas sirve como una huella de ADN que puede emplearse para caracterizar a un individuo.
Se dice que es al azar pues se utilizan primers que no se sabe en qué lugar del genoma hibridan. Por eso se
dice que son anónimos porque se desconoce la secuencia y (salvo mapeo específico) su localización cromosómica.
Como son oligonucleótidos de 10 bases, en general “pegan” en varias regiones del genoma, por lo que al correr el
producto de la PCR en geles de agarosa, generalmente se observan varios fragmentos, que miden hasta 2 kpb. Otra
desventaja es que son marcadores dominantes (no se puede diferenciar al heterocigota del homocigota) y problemas
de reproducibilidad. Su mayores ventajas son los costos y la posibilidad de usarlos con cualquier genoma de cualquier
especie aunque se desconozca absolutamente todo de su secuencia genómica. Al igual que los RFLPs, se los
puede mejorar secuenciando y convirtiendo en marcadores de PCR específica (en este caso se llaman SCARs). Los
AFLP representan una sofisticación más reproducible que combina restricción con endonucleasas y amplificación
selectiva por PCR. Si bien comparte desventajas y ventajas con los RAPD (son dominantes y anónimos, no requieren
de información genómica previa), son más costosos pero su mayor costo se ve compensado por la generación
de muchas más bandas polimórficas por corrida (data points) y mayor reproducibilidad.
restricción PCR hibridación dominan- codomnan.
RFLP + - + tes - +
AFLP + + - + -
RAPD - + - + -
SSR - + - - +
SNP +/- + - - +
b) ¿Cuál es el origen de la variación genómica (mutaciones) detectada por cada una de ellas y cuál es su magnitud?
sustitución INDEL Hiper Alta Conservado
RFLP - + - - +
AFLP + - - + -
RAPD - + - + -
SSR - + + - -
SNP + - - + -
Aclaraciones: sustituciones: cambio de nucleótidos, INDELs: Inserciones o DELeciones, Hiper: hipervariables
(altísima tasa de mutación/evolución, máximo polimorfismo), Alta: variación, Conservado (particularmente cuando
afecta secuencias funcionales codificantes)
5) Suponiendo que en un genoma dado las 4 bases posibles se encuentran representadas en forma similar y totalmente
al azar (contenido de GC = 50% uniformemente distribuido a lo largo del genoma): a) ¿Cuál es la distancia
promedio esperable entre sitios de restricción para enzimas que reconocen especificidades de secuencia de 6 pares
de bases, como EcoRI? ¿y para una de 4 o de 8 pb? b) ¿Cuántos sitios de restricción y, por lo tanto, bandas de DNA
en un gel, se generarían en un genoma humano (109 pb), bacteriano (106 pb), o mitocondrial humano (104 pb) se
generarían con EcoRI? c) ¿Cuántas bandas generarían los RAPD que usualmente se hacen con decámeros y se detectan
por PCR?
R: a) Un sitio de restricción de 6 bases aparecerá, como promedio, una vez cada 46 bases, es decir 4.096 pb. Una de
4 será cada 44 pb = 256 pb, uno de 8 pb será de una cada 65.536 pb. b) 109 dividido por 4x103 = 250.000 bandas o
sitios para el genoma humano; 250 para una bacteria y entre 2 y 3 para el genoma mitocondrial. c) Por un lado debemos
considerar que los sitios complementarios a los primers tienen que ser “perfectos” (los 10 nucleótidos tienen
que ser perfectamente complementarios, lo que no es necesariamente cierto). Por lo tanto la distancia se podría
calcular como para los sitios de restricción 410 = 1.048.576. En un genoma humano habría 1000 sitios, en uno bacteriano,
uno sólo. De todos modos, para que haya bandas se requieren 2 condiciones adicionales: que las orientaciones
estén invertidas y “apuntando” hacia adentro entre primers vecinos (se reduce a un cuarto = 250 y la distancia
media aumenta a 4 millones) y que la distancia sea menor a los 4000 pb porque la Taq polimerasa deja de funcionar
eficientemente más allá de este tamaño. La probabilidad de que 2 sitios distintos estén en una posición arbitraria es
de uno en 410 x 410 = 42x10 = 1.099.511.627.776 ~ 1012. Sabiendo que las distancias para una amplificación detectable
varían entre un poco menos de 100 y aproximadamente 2500-2600 pb, la probabilidad de encontrar 2 secuencias en
alguno de esos nucleótidos es 44-2x10 x 2500 = 10-12 x 2,5.103 = 2,5 x 10-9, lo que significa que espero encontrar entre
2 y 3 bandas por genoma de organismo superior por primer, es decir que de las 250 bandas potenciales, sólo el 1%
está a la distancia necesaria para dar bandas amplificables. Sin embargo, el número de bandas observadas es mayor,
debido a que no es requerida una complementaridad de bases perfecta en las condiciones de anillado de los primers.
6) ¿Qué ventajas tendría el usar enzimas que son sensibles (no cortan) a la metilación de citosinas en el sitio de
restricción (como es el caso de PstI) y que ocurren con enorme frecuencia en el DNA heterocromatinizado de organismos
eucarióticos?

55
R: Si lo que se busca es clonar genes transcripcionalmente activos este comportamiento es una ventaja porque sólo
se clonaría aquello que es digerido por la enzima. El DNA metilado daría fragmentos demasiado grandes para ser
detectado o clonado (el DNA de muy alto peso molecular se transfiere pobremente a filtros en los Southerns y por
su tamaño no puede ser clonado eficientemente en los vectores más comunes, entre otras razones). También servirían
para diferenciar “alelos” epigenéticos (como los que están en el cromosoma X en mujeres) o diferencias de
estados del gen entre tejidos expresantes (hipometilados) versus silenciados (hipermetilados).
7) ¿En qué consiste el clonado posicional y el "caminado cromosómico"? ¿Para qué se utiliza?
R: Clonado posicional: El clonado posicional se utiliza cuando no se dispone de otra información del gen que se
desea clonar más que su posición cromosómica relativa respecto a un marcador molecular. La idea es poder disponer
en el mismo inserto clonado en un vector, tanto el gen deseado como la secuencia del marcador molecular o en
algún otro vector de secuencia vecina contigua (contig). Este tipo de clonados fueron posibles a partir de la aparición
de vectores que permiten clonar segmentos de ADN grandes (200.000 bases hasta 1.000.000 de bases) como
los BAC y YAC. Caminado cromosómico: Los extremos de un fragmento clonado se usan como sondas para seleccionar
otros clones de la genoteca. Estas sondas detectan clones de regiones del ADN que se superponen con el
clon inicial Se aisla un pequeño segmento de ADN de un extremo del material, se inserta en el primer clon y se lo
usa como sonda para volver a rastrear la genoteca en busca de un clon que contenga ese segmento y la secuencia
contigua del genoma. Con el segundo clon se puede obtener un tercero, y así sucesivamente, hasta tener un conjunto
de segmentos clonados que se solapan. Permite el clonado posicional. Es decir, conociendo la localización del
gen y disponiendo de uno vecino clonado, se puede aprovechar esta vecindad para así clonarlo.
8) ¿Cómo se encara un proyecto genómico? ¿Por dónde se empieza? ¿Qué tipo de vectores de clonado son los más
habitualmente usados?
R: Como no se puede secuenciar sobre los cromosomas (la longitud de ADN es muy larga y el ADN está “mezclado”)
lo primero que debo hacer es segmentarlo en fragmentos manejables por las actuales técnicas moleculares.
Esto se hace en 2 etapas: primero se clona en vectores que permiten insertos grandes (BAC y YAC) y a éstos últimos
se los subclona en vectores con insertos más pequeños (fagos y plásmidos). Ahora bien, al segmentar un genoma
pierdo el ordenamiento lineal que tenía el ADN en el cromosoma por lo que tengo que organizar los clones
en grupos de contigs y así rearmar el ordenamiento perdido. Esto se logra mediante mapeo físico y genético por lo
que, en realidad, todo proyecto genómico comienza siendo un proyecto de mapeo.
9) ¿Qué es el transcriptoma y los EST? ¿Cómo se construyen y para qué sirven?
R: Como el procedimiento arriba descripto es largo, laborioso y a veces económicamente inviable, se procede paralelamente
(o exclusivamente) por otra vía que aporta, además herramientas que son necesarias para el mapeo. En
este procedimiento se privilegia la secuenciación de lo que más interesa y que son los genes. Como los genes (a
diferencia de las secuencias intergénicas no codificantes) se transcriben, una forma es armar clonotecas de ADNc
de distintos tejidos y en distintas situaciones ambientales y fisiológicas y secuenciarlas en forma grosera y masiva.
De esta manera se obtiene una colección de secuencias representativas del transcriptoma denominadas EST (expressed
sequence tags o secuencias expresadas) de las cuales se desconoce mayormente su función. En muchos
casos, esta función puede deducirse en base a la homología de las secuencias con las de genes caracterizados en
otras especies mediante búsqueda y comparación con las bases de datos de los bancos de genes. Estos ESTs pueden
usarse para el diseño de micromatrices (chips de ADN) y para mapeo por RFLP/SNP y servir como marcas ancladas
(STS).
10) ¿A qué se llama genómica funcional y análisis de proteoma? En este contexto ¿para qué se usa el etiquetado
mediante transposones o “transposon-tagging”? ¿Qué son las micromatrices o microarrays y chips de DNA? ¿Para
qué se usan? ¿Qué técnicas para la caracterización de interacciones proteína-proteína conoce?
R: La genómica funcional es la rama de la genómica que estudia la función molecular asociada a las secuencias
expresadas descriptas por los proyectos genómicos. Estos estudios comprenden tanto estudios predictivos “in silico”
por comparación de una secuencia incógnita con secuencias depositas en bases de datos como la corroboración
de su función molecular a través de distintas estrategias. Estas estrategias incluyen estudios de complementación
génica por sobre expresión o silenciamiento de secuencias incognitas, la asociación de determinado fenotipo con
mutantes inducidas tanto por mutagenesis química como por “transposon tagging”. Esta última estrategia permite
utilizar secuencias conocidas correspondientes a transposones que interrumpen genes de interés como etiquetas
para asilar estos genes. En la última década la genómica funcional ha contado con el desarrollo de micromatrics de
ADN o chips que son soportes sólidos que incluyen un elevado numero de secuencias correspondientes a un organismo,
pudiendo estar representado el transcriptoma completo de una especie para estudios de expresión concertada
en disitntas estadios de desarrollo, distintas condiciones de crecimiento, respuestas a estreses bióticos u abióticos,
etc. La proteómica estudia el conjunto de proteinas presentes en determinadas condiciones de desarrollo y/o crecimiento
en los sitemas biológicos de interes, permitiendo la determinación de las secuencias primarias así como de
su possible estructura e interacción con otras proteínas a través de sistemas de estudios de interacción proteínaproteína
como el sistema doble hibrido en levaduras.

Problemas:
1) Mediante hibridación in situ, se pudieron localizar 5 YACs de DNA humano (YAC-A a YAC-E) en una región
cromosómica determinada del genoma humano y se desea hacer un mapa físico de alineamiento de dichos clones
(mapa de contigs). Los 5 clones fueron evaluados mediante hibridación con 3
STS (sequence-tagged sites o sitios de secuencia indicadora –marcadora-).
Para obtener los STS, se digirió DNA con una enzima de restricción y se
construyó una genoteca en fago lambda con los fragmentos resultantes. Se
analizaron varios de los clones de esta genoteca mediante hibridación con
DNA genómico humano, descartando todos aquellos clones que hibridaban
con DNA repetitivo. De aquellos que hibridaban con secuencias únicas, se seleccionaron 3, los cuales se hibridaron
con los YACs obteniéndose los siguientes resultados:
a) ¿Por qué se descartaron aquellos clones de la genoteca en fago lambda que no hibridaban con secuencias únicas?
b) Dibuje un mapa físico con la alineación de los 3 STS y ordene (en paralelo) el mapa de contigs de los YACs.
2) Durante una recorrida por Kazajstán, un grupo de científicos logra identificar, entre los cultivos de agricultores
locales, algunos individuos de trigo resistentes a Fusarium. Cuando cruzan dichos individuos con cultivares sensibles,
la F1 resultó ser resistente. En la F2 encuentran 75% de resistentes. Realizaron múltiples retrocruzas, pero
lamentablemente, a pesar de lograr transferir la resistencia, los individuos resistentes muestran una considerable
pérdida de rendimiento porque las semillas se dispersan antes de la cosecha. Por lo tanto, los investigadores se abocaron
a encontrar el gen de resistencia, para poderlo transferir a cultivares elite por transgénesis.
Logran encontrar cinco marcadores en el cromosoma 4D que están asociados a la resistencia. Analizan unas 1000
plantas de la F2 y observan que casi todas las plantas resistentes tienen los alelos de Kazajstán para los cinco
RFLPs (M1, M2, M3, M4 y M5, ubicados en ese orden en el cromosoma 4D). Es decir, son KK (homocigotas para
los alelos de Kazajstán) o KL (heterocigotas para los alelos de Kazajstán), mientras que las plantas sensibles son
LL (homocigotas para los alelos del cultivar de elite local). Sólo en 8 plantas lograron observar algún evento de
recombinación entre los marcadores, obteniendo esta tabla:
Planta M1 M2 M3 M4 M5 Resistencia
1 het het LL LL LL Si
2 LL het het het het Si
3 KK KK KK het het Si
4 LL LL het het het No
5 LL LL LL LL het No
6 het het het het KK Si
7 KK het het het het Si
8 LL LL LL het het No
a) ¿Entre cuáles marcadores (cuál es el intervalo) se encuentra el gen de
resistencia?
b) ¿Qué tipo de genoteca necesitaría para poder identificar al gen responsable
de la resistencia?
c) ¿De cual especie y cultivar debería provenir dicha genoteca?
d) ¿Cómo identificaría los clones que podrían contener el gen de interés?
e) ¿Por qué cree usted que no pudieron separar la resistencia de la característica
de dispersión de semillas? Agregue una columna a la tabla e indique
si ese individuo dispersa o no las semillas.
3) La levadura fue la primera de las especies eucarióticas que fue totalmente secuenciada y constituye un sistema
modelo de investigación debido al tamaño relativamente chico de su genoma y el número también relativamente
chico de genes. Se sabe que hay ~6000 genes codificantes para proteínas, de los cuales hay 2400 para los que no se
tiene ni idea de qué función cumplen. Uno de los temas que siempre concitó interés es el proceso de esporulación
(que en levaduras está asociado a la meiosis). La misma se puede controlar y sincronizar con relativa sencillez ya
que se incuban levaduras diploides en un medio con deficiencia de nitrógeno, lo que dispara la meiosisesporulación.
La misma ocurre en 3 fases bien diferenciadas. La I o temprana, en la que se abandona el estado vegetativo
para pasar al esporulado. La II o media, coincide con la meiosis I. La III o media-tardía coincide con la
meiosis II. Previamente a la aparición de los arreglos de DNA (DNA arrays) o chips de DNA, se habían identificado,
mediante Northern blots unos 250 mRNAs. Con la llegada de los chips, el número cambió drásticamente (Chu y
col. 1998, Science 282:699). Se preparó mRNA total de cada una de las fases y se hibridó contra las secuencias de
los 6000 genes. Se identificaron 256 genes que se activan específicamente durante la fase I. En la gran mayoría de
ellos se identificó la secuencia: 5‟GGCGCC3‟ a 600 pb del nucleótido 1 del gen, en dirección 5´.
a) ¿Qué le sugiere este resultado?
Se identificaron 158 genes adicionales específicos de la fase II, de los cuales, el 70% tienen otra secuencia consenso
denominada MSE. Además, aparecieron otros 61 genes específicos de la fase III. Finalmente, una observación
curiosa fue que 600 genes que se encontraron activos en la fase vegetativa no pudieron ser detectados durante todo
el proceso de esporulación.
b) ¿Tendrá algún interés este último dato?
c) Podrá hacer una estimación de qué proporción de los genes está implicado, directa o indirectamente con el proceso
de esporulación?
d) ¿A qué se dedica el resto de los 6000 genes?
4) Mégy y colaboradores (Genome Biology, 2002) publicaron un trabajo de identificación de ESTs (secuencias
transcriptas) específicamente expresadas en el corazón. Entre los ESTs identificados encontraron: NADH dehidrogenasa,
ubiquinona, miosinas, tropomiosina y actina (involucrados en la contracción muscular), coligina (interactúa
con el colágeno cardíaco), 13 no mostraron poseer funciones relacionadas (hasta este trabajo) con el corazón y 11
no tenían función alguna conocida. Además, 5 de ellos (TG114, TG13, TG131, TG132_7, TG78) fueron relaciona-
56
STS
YAC
A B C D E
1 + + + - -
2 - + + + -
3 + + - - +

57
dos previamente con problemas cardíacos. Es decir, la enfermedad se relaciona con la malfunción de los mismos.
La figura muestra la topología de la región regulatoria en el extremo 5´ de 17 promotores de genes cardíacos.
Figura CAAT, GC, TATA y CAP son secuencias consenso relacionadas a la unión de la RNA polimerasa
II. Otros motivos llamados TRANSFAC y MEME se representan como puntas de flecha. Los cuadrados
oscuros (GKLF) representan sitios de unión de un factor de transcripción parecido al Krüppel de Drosophila.
Similarmente, (Tcf11 _Rora, TCf11_API_C) representan otros motivos nucleotídicos identificados.
a) ¿Qué son y qué función cumplen estas secuencias en la región 5´no codificante de estos genes?
b) ¿Porqué algunas secuencias están en la mayoría de los genes y otras no? ¿Es esta una muestra representativa?
c) Dado que a esta altura está totalmente secuenciado el genoma humano ¿porqué estos investigadores utilizaron
esta metodología “más antigua” para poder identificar genes cardíacos? Es decir, ¿porqué no les alcanzó esa información
previa? ¿Se podrían haber utilizado “chips” (microarreglos de DNA)?
d) ¿Encuentra alguna relación entre unión de factores de transcripción y patologías cardíacas? ¿Cuál? ¿Podría proponer
a uno (o varios) gen/es sospechoso/s a la lista?
e) Con estos datos limitados ¿podría proponer una hipótesis de explicación molecular de las patologías cardíacas?
f) ¿Cómo confirmaría sus hipótesis de la relación establecida en el punto d y e a nivel funcional? Recuerde que, por
razones de ética (hacia nuestra especie) todos los experimentos se hacen con ratones.
5) P36 es una proteína de 36 kDa de Mycobacterium tuberculosis cuya función fue asociada a los mecanismos de
virulencia del bacilo. La ahora Licenciada Laura Klepp estudió durante su trabajo de tesis de Licenciatura, la interacción
de dicha proteína con el proteoma micobacteriano empleando un sistema de doble híbrido en bacterias basado
en la inducción, mediada por cAMP del operón lactosa via proteína CAP. El sistema se basa en la expresión, por
un lado, del dominio T25 de la adenilato ciclasa y por otro lado, del dominio T18. Cuando estos dominios están
separados, no se detecta actividad de adenilato ciclasa. En cambio cuando se produce una interacción proteínaproteína
que las acerca físicamente, se recompone dicha actividad. Se clonó el gen P36 en el plásmido pKT25 (anzuelo
codifica el dominio T25) y también se construyó una genoteca de M. tuberculosis en el plásmido pUT18C
(codifica el dominio T18 en fusión con el gen de la proteína a “pescar”). Para ello, lo primero que se llevó a cabo
fue la amplificación del gen P36 por PCR.
a) El oligonucleótido 5´ fue diseñado de manera que se respete el marco de lectura del fragmento codificante para
T25 presente en el sitio de clonado ¿Por qué?
b) Ya obtenido y caracterizado el “anzuelo”, vino la parte de la proteína a pescar: se subclonaron fragmentos producidos
al azar del genoma de M. tuberculosis en pUT18C. Los plásmidos recombinantes se introdujeron, junto con
los que contienen secuencias del gen para P36, en células competentes de E. coli por co-transformación y se obtuvieron
clones positivos. ¿Cómo identificaron aquellos clones en los que las proteínas derivadas de P36 se reconocieron
y unieron con otras expresadas en el vector pUT18C?
c) Las secuencias con capacidad de unión pudieron ser asignadas a 2 genes ya secuenciados (Rv1417 y Rv2617) de
función desconocida, pero que posiblemente sean proteínas de membrana y transmembrana. ¿Cómo se hizo para
asignar las secuencias a estos 2 genes? ¿Cómo haría para investigar la función de estas secuencias nuevas?
d) El plámido pKT25 (donde se clonó el “anzuelo”) tiene un gen de resistencia a neomicina, mientras que el
pUT18C (donde van insertos los potenciales “pescados”) tiene un gen de resistencia a ampicilina. ¿Por qué esta
diferencia?
e) ¿Cómo es el genotipo de las E. coli que se utilizan para este tipo de experimentos en cuanto al gen de la adenilato
ciclasa? ¿Ac+ o Ac-? ¿Por qué? ¿Qué hubiera pasado si E. coli expresaba algún gen propio muy similar a Rv1417,
Rv2617 o P36?
f) ¿Cómo fue la composición del medio de selección? ¿mínimo o rico (conteniendo glucosa)?

17- TRANSPOSONES
Guía de estudio:
1) Explique la siguiente terminología
- secuencias de inserción – transposones - repeticiones invertidas
R: Secuencias de inserción: traducción de “insertion sequences” o IS, que fueron descubiertas como tales en genomas
bacterianos, de allí su nombre. Son transposones simples, autónomos, ya que codifican para las enzimas que
permiten su transposición (una transposasa). En sus extremos contienen secuencias invertidas repetidas (casi idénticas),
que son reconocidas por la transposasa. Cuando se insertan en el genoma huésped, se producen pequeñas repeticiones
(direct repeats) a cada lado del transposón.
Transposones: son fragmentos discretos de ADN que tienen la capacidad de moverse a otros sitios del genoma.
Contrariamente a lo que ocurre con plásmidos y fagos, su movimiento se restringe al genoma huésped.
Repeticiones invertidas: “inverted repeats”, los extremos de los transposones se caracterizan por tener secuencias
similares (de allí repeticiones) en orientación invertida la de un extremo respecto de la del otro.
2) Explique, a nivel molecular, la forma de chupetín observada al microscopio electrónico adoptada por cadenas
simples de DNA que contienen transposones, luego de desnaturalización y lenta renaturalización.
R: Cuando secuencias conteniendo transposones son desnaturalizadas y renaturalizadas, los extremos repetidos
invertidos pueden reaccionar en forma intramolecular, formando una estructura doble cadena. Como la transposasa
no tiene regiones repetidas, se mantiene como ADN de simple cadena. Los extremos invertidos forman la base de la
estructura de chupetín, mientras que la transposasa forma el cuerpo de la misma.
3) ¿Cómo se cree que han evolucionado las bacterias que hoy son resistentes a varios antibióticos al mismo tiempo?
R: Existen transposones compuestos, que llevan secuencias del huésped. Un ejemplo son aquellos formados por
dos IS. Dos IS cercanos pueden comportarse como un único transposón y llevar consigo las secuencias que los
separan. En algunos de estos casos, algunas de las IS perdió la capacidad de transposición y todo se transpone como
una unidad. En otros casos, ambas IS son funcionales, pero con una frecuencia baja suelen transponer en conjunto,
llevando consigo las secuencias que los separan. Si bien estos eventos son de baja frecuencia, cuando las secuencias
que se transponen llevan resistencia a antibióticos, estos eventos son seleccionados y aparecen con más frecuencia.
Los transposones no se transfieren entre bacterias, pero sí lo hacen los plásmidos en los que pueden insertarse los
transposones; de ahí que la mayoría de las bacterias con multiresistencias lleven las mismas en plásmidos.
4) Marque las diferencias entre los mecanismos no replicativo y replicativo de transposición. ¿Qué enzimas participan?
R: En el mecanismo no replicativo, el transposón se mueve de un lugar a otro del genoma, sin dejar una copia en el
sitio dador. En el mecanismo replicativo, se genera una nueva copia en el sitio de transposición. En ambos casos
actúa una transposasa, que unida a los extremos del transposón, es la encargada de clivar una cadena del sitio dador
y una del aceptor y ligarlas en forma cruzada, por un mecanismo que tiene similitudes con las topoisomerasas. Las
estructuras que se forman tienen similitud con las orquillas de replicación. Si dichas horquillas son sustrato para la
maquinaria de síntesis de ADN, entonces habrá una duplicación del transposón, se formará un cointegrado y esté
será resuelto por una recombinación homóloga, catalizada por una resolvasa, también codificada por el transposón.
Si las horquillas no son sustrato para la síntesis de ADN, entonces se produce un segundo corte y ligación en el sitio
aceptor, pero el sitio dador no se reconstituye, por lo que el “salto” del transposón produce una rotura del ADN en
dicho sitio.
5) ¿Qué evidencias experimentales demuestran que en algunos casos la transposición ocurre a través de un RNA
intermediario?
R: En muchos transposones se encuentran “huellas” del procesamiento del mRNA, como ser uniones exónexón
precisas, colas de poli A y extremos 5‟ que coinciden con el inicio de la transcripción
6) ¿Qué analogía tienen los retrovirus con los transposones?
R: Los retrovirus también tienen extremos repetidos y se insertan en el genoma del huésped.
7) ¿Qué son y cómo funcionan los elementos controladores en maíz?
R: Los elementos controladores de maíz también son transposones. Se los denominó originalmente “controlling
elements”. Existen varias familias en el genoma del maíz. Dentro de cada familia se los puede clasificar en autónomos
y no autónomos. Los primeros pueden transponer por sí mismos, mientras que los segundos perdieron la
actividad transposasa, por mutación o deleción, y son estables a menos que actúe en “trans” una transposasa de un
elemento autónomo de la misma familia.
8) ¿Qué son los elementos P de Drosophila?
R: Los elementos P de Drosophila también son transposones, que se encuentran en las cepas P. Estos transposones
se activan cuando se cruzan machos P por hembras M. La activación del transposón produce lo que conocemos
como disgénesis del híbrido, ya que la transposición continuada en la línea germinal produce esterilidad en los híbridos
de dicha cruza. El cruzamiento opuesto no produce disgénesis y eso ocurre por un efecto materno en las
líneas P, que reprime la transposición. La transposición sólo ocurre en la línea germinal. La explicación molecular
58

59
de dichos eventos radica en que el transposón codifica para dos productos de “splicing alternativo” que difieren en
la inclusión o no del intrón “3”. Cuando el “intrón” se incluye, el producto de 66 kDa es un represor de la transposición,
mientras que cuando el intrón no se incluye, el producto es la transposasa de 87 kDa. En la línea germinal se
produce el evento de “splicing” que elimina el intrón 3 y se produce la transposasa activa. El efecto materno se
explica por la presencia del represor en la línea germinal.
9) ¿Cómo se supone que surgieron los pseudogenes?
R: En algunos casos, los pseudogenes “procesados” se originaron de secuencias de ARN que fueron retrotranscriptas.
Si bien no contienen información necesaria para su transposición, pueden haber sido sustrato para un sistema de
retrotransposones. En general este tipo de pseudogenes se encuentra en porciones del genoma no relacionadas con
la del locus que les dio origen. En otros casos, los pseudogenes aparecieron por duplicación de los genes originales,
seguida de una pérdida de la capacidad de expresarse de una de las copias. En este último caso no hay ARN intermediario,
la estructura del pseudogen no revela huellas de procesamiento de ARN.
Problemas:
1) En 1938, Marcus Rhoades analizó genéticamente el
maíz negro (pigmentado) mexicano. De la autopolinización
de una variedad totalmente pigmentada, surgió
una progenie con los siguientes fenotipos:
Estos resultados fueron confirmados por su contempo-
ránea Barbara McClintock quien, profundizando sobre el tema, logró interpretar agudamente sus observaciones
citogenéticas, lanzando, en los '50s, una teoría muy resistida en su momento sobre genes "móviles". Tres décadas
más tarde, la Genética Molecular permitió la interpretación de esos datos, al identificar un gen dominante P que
determina la pigmentación y otro gen dominante (situado en otro cromosoma) que controla la reversión a un alelo
Pm mutado por inserción de un elemento móvil.
a) ¿Cuáles son los genotipos de la planta parental y de la progenie?
b) ¿Qué tendrá el gen controlador que le falta al transposón que se metió en el gen de la pigmentación?¿Qué deben
tener en común los dos?
c) ¿En qué tipo de células (somáticas o germinales) y en qué momento del desarrollo ocurrió la reversión en los
granos mosaico?
d) ¿Cuál sería el resultado de un Southern de las partes blancas y pigmentadas de los granos mosaico, usando el gen
P como sonda?
2) Una estrategia alternativa a los marcadores moleculares para el clonado de genes es el "transposon tagging", es
decir etiquetado de genes mediante transposones. Se realizó la transformación -vía Agrobacterium- de Arabidopsis
thaliana resistente al hongo Cladosporium fulvum, con el elemento Ds a unas plantas, y con un elemento Ac defec-
tivo a otras plantas. Como resultado, se obtuvieron algunas
transgénicas visiblemente mutadas (plantas enanas, albinas,
sin flores, etc.), pero ninguna presentando fenotipos
mosaico. Sin embargo, al cruzar ambos tipos de transgénicas
entre sí (con Ds x con Ac), la progenie resultante incluía
varios individuos con fenotipos mosaico debido a
mutaciones somáticas. Uno de los fenotipos analizados fue
el aspecto de las hojas luego de inocular con Cladosporium
fulvum, llamando la atención una planta que tenía una
hoja saludable excepto en una zona necrótica-dañada por
el hongo- bien delimitada. Al hacer un Southern sembrando
DNA -cortado por Hind III- aislado de dos zonas de la
hoja mosaico (resistente (R) y susceptible (S) al hongo), el
resultado fue:
12/16: granos totalmente pigmentados
3/16: granos blancos con manchas pigmentadas
1/16: granos blancos
kpb S R S R
Sonda: Ds Sonda: Ac
a) Haga un esquema que muestre qué zona del plásmido Ti (o derivado de Ti) usaría para colocar a los transposones
con el fin de transgenizar a las plantas? ¿Cómo haría para lograr una selección de las plantas verdaderamente transformadas?
b) ¿Por qué aparecieron mutantes somáticas (fenotipos mosaico) en la F1 y no en las parentales?
c) ¿En qué se basa el "tagging" del gen a clonar, en este caso?
d) ¿Podría , en base al Southern, asegurarse por cuál mecanismo (replicativo o no replicativo) transpone Ds?
e) Si usted desea clonar el gen de resistencia a partir de una biblioteca genómica indique:
I.la fuente de DNA para hacer la "library" (¿qué parte de la planta?)
II.el tipo de "library" (¿genómica o de cDNA?)
III.si usara alguna enzima de restricción. ¿Cuál?
IV.el tipo de vector para construir la "library" (indique, además, si debe permitir o no expresión de insertos y por
qué)
V.la sonda que usaría y el fundamento del "screening"
VI.en qué consistiría el análisis del clon aislado?
15--
13--
7--
6--
3--

3) Recientemente, un grupo de investigadores estudiaron
los mecanismos de regulación del elemento transponible
mariner, que está presente en genomas de invertebrados,
hongos y humanos. Obtuvieron un macho transgénico
que tenía reemplazado un fragmento del gen
white, localizado en el cromosoma X, por otro homólogo,
pero interrumpido por un mariner cuya transposasa
no era funcional. Esta variante de transposón con transposasa
no funcional se denominó peach. El gen white
codifica para un pigmento rojo del ojo y cuando está mutado por inserción, no se expresa y los ojos resultan blancos.
Por sucesivas cruzas, se obtuvo una población de machos y hembras con todos sus cromosomas X conteniendo
el gen white interrumpido por peach. Por otro lado, se logró una construcción denominada hsp, en la que el elemento
mariner salvaje se puso bajo la regulación del promotor del gen de la proteína hsp70 (heat shock protein), que es
inducible por calor. Esta segunda construcción se introdujo en uno de los cromosomas del par 2 de moscas transgénicas
que ya eran peach, obteniéndose moscas hsp/+. Se realizaron cruzas entre moscas transgénicas peach, en las
que uno de los parentales tenía 1 dosis de hsp (hsp/+) y el otro parental, ninguna (+/+). Se contó el porcentaje de la
progenie, criada a 25ºC (actividad basal de hsp) o a 37ºC (actividad inducida de hsp), que exhibía ojos rojos.
a) Interprete los resultados numéricos
b) ¿En qué etapa del desarrollo ocurren los eventos que dan a origen a la progenie con ojos rojos?
c) En este tipo de cruza también aparecen individuos con ojos blancos con manchas rojas (fenotipo mosaico). ¿Cómo
justifica estos resultados? ¿En qué etapa del desarrollo ocurrieron los procesos que originaron los ojos mosaico?
d) Las hembras mosaico presentan un mayor número de manchas rojas que los machos mosaico. ¿Cual es la causa?
4) Un ejemplo muy llamativo de “transposon tagging” es el del trabajo publicado por Ling y col. en Science
282:943 (1998) en el que clonaron el gen Matusalem (Methuselah) que prolonga la vida de las moscas (y de gusanos).
Recientemente (febrero del 2002) se publicó en varios diarios la identificación del gen homólogo en humanos.
Los investigadores introdujeron, de manera controlada como para evitar la disgénesis del híbrido, elementos P en
una cepa de Drosophila que no los tenía (cepa M).
a) ¿Cómo supone que lo hicieron?
b) ¿Le parece que aparecieron mosaicos? ¿Por qué?
Si bien identificaron varios mutantes en la M1 (primera generación de mutantes equivalente a lo que comúnmente
se llama F1 pero que en este caso no proviene de un cruzamiento sino de un tratamiento mutagénico), encontraron
muchas más en la M2 (o en generaciones posteriores de endocría entre hermanas, equivalente a la F2, segunda generación
después de la mutación).
c) ¿Por qué es esto? Entre los nuevos mutantes había uno que les llamó mucho la atención: era capaz de vivir un
promedio de 77 días en vez de los 57 que vivían, como promedio, las moscas normales, por lo que bautizaron Matusalem
al gen en cuestión.
d) ¿Quién fue Matusalem? ¿Quiere decir que este gen en forma normal alarga la vida? Además estas mutantes eran
más resistentes al ayuno y a condiciones de estrés oxidativo. Por todas estas razones, inmediatamente clonaron y
secuenciaron el gen en cuestión.
e) ¿Por qué esto les resultó, relativamente, fácil de hacer? ¿Por qué no les habría sido tan fácil mutagenizando con
un producto químico como el EMS? El gen resultó ser un receptor de superficie celular de 514 aminoácidos del tipo
de los receptores G, pero de función desconocida. Con este gen se pudo clonar rápidamente un gen muy similar en
Caenorhabditis elegans (un nemátodo muy estudiado como modelo en análisis genómico y del cual ya se conocía
buena parte de la secuencia genómica). Su mutación tenía efectos fenotípicos muy similares a lo observado en moscas.
f) ¿Qué le indican estos resultados respecto a la evolución del gen?
g) ¿Cómo se pudo aislar tan rápidamente este nuevo gen de nemátodos y modificar el mismo para hacer estas observaciones
sin repetir el transposon tagging de las moscas?
18. EPIGENÉTICA
1) La impronta genómica ("genomic imprinting") es una rara
propiedad que presentan algunos genes de transcribir y expresar
sólo el alelo derivado del progenitor de un determinado
sexo, es decir o del padre exclusivamente, o de la madre
exclusivamente y no del otro; mientras que el alelo proveniente
del progenitor del otro sexo no se expresa. El alelo
que no se expresa es el que se dice que está “imprinteado”.
Cada gen tiene su patrón de imprinting específico. Se cree
que este fenómeno está relacionado con los casos epigenéticos
de silenciamiento pretranscripcional descriptos en plantas
dado que la metilación representaría una impronta o marca
a nivel molecular para distinguir el alelo paterno del materno (para una revisión del tema: Cell 77, 473-476
[1994]).
60
Genotipo del cromosoma ºC % progenie (c/ ojos
2 de los padres
rojos)
hsp/+ ; +/+ 25 8
37 17
hsp/+ ; hsp/+ 25 18
37 48
+/+ ; +/+ 25 1
37 2

61
El gen del factor de crecimiento "insuline-like growth factor" tipo 2 (IGF2) humano, que se expresa en las etapas
embrionaria y fetal, está sujeto a "imprinting". El "imprinting" está asociado a un grado de metilación diferencial en
cada uno de los alelos, que se establece en las gametas, no siendo claro aún cómo es que un patrón de metilación se
mantiene en el DNA de las células somáticas de la descendencia, y cómo es capaz de borrarse en la línea germinal
de la descendencia del sexo opuesto.
Para estudiar este fenómeno en el gen del IGF2, se aprovechó uno de sus polimorfismos que cae en una región del
exón 9 que corresponde a la región 3' no codificante, que da dos alelos posibles: uno que presenta el sitio para la
enzima Apa I, y otro que carece de él (Nature Genetics 4, 98-101 [1993]). Usando dos oligonucleótidos específicos
del exón 9, los autores del trabajo amplificaron una región de 236 pb que abarca a dicho sitio. La enzima Apa I
corta al fragmento amplificado a partir del primer alelo mencionado, en dos fragmentos: uno de 173 pb y otro de 63
pb, como muestra la figura:
Ud. es un biólogo muy riguroso y crítico (eso está bien) y duda de mucho de lo que le dicen sus docentes (eso no
está tan bien) con respecto a la existencia del "imprinting", queriendo revisar Ud. mismo lo hecho por los autores
del trabajo. Diseñe un protocolo experimental para determinar si el gen IGF2 está sujeto a "imprinting" y si éste es
de tipo materno o paterno, indicando:
a) ¿Qué individuos analizaría?
b) ¿Qué genotipo (homocigota o heterocigota con respecto al sitio Apa I) eligiría en los individuos a analizar?
¿Cómo determinaría esos genotipos?
c) ¿Qué técnicas usaría? ¿Qué tipo de muestra usaría de cada individuo (¿DNA o RNA?).
2) Las plantas poseen diversas estrategias de defensa para contrarrestar el ataque de patógenos. En Arabidopsis, por
ejemplo, la presencia de un péptido correspondiente a los
últimos 22 residuos de la flagelina de bacterias (flag22)
sirve de señal para desencadenar grandes cambios en los
niveles de transcriptos de ciertos genes. Navarro et al.
(2006) hallaron que la respuesta a flag22 involucraba principalmente
cuatros genes, cuyos patrones de abundancia de
transcriptos se muestran a continuación:
TIR1, ABF2, ABF3: receptores de auxinas miR393: microRNA
393 *Todas las diferencias son significativas.
1.25
Cantidad
Relativa
de 0.7
mRNA 0.50
0.25
Sin flag22
a) ¿Cómo se modificaron los niveles de mRNA en cada
TIR1 ABF ABF miR39
caso?
Con el objeto de estudiar la regulación de estos genes en presencia de patógenos se obtuvieron plantas transgénicas
que contenían la región promotora de cada uno de ellos río arriba de la región codificante de GFP (Green Fluorescent
Protein). Al someter las plantas transgénicas a tratamiento con flag22 durante 30 minutos y medir los niveles
de mensajero de GFP se observaron los siguientes resultados:
b) ¿Cómo interpreta los resultados del experimento 2 teniendo
en cuenta lo observado en el experimento 1? ¿Qué tipo de regulación
estaría siendo ejercida en cada caso? El análisis de secuencia
de la región codificante de TIR1, ABF2 y ABF3 reveló
que los tres genes poseen una región conservada de 25 pb que
puede ser reconocida por microRNAs. c) Proponga un mecanismo
para explicar los cambios observados en los niveles de
transcriptos de los cuatro genes en respuesta a flag22.
3) Muchos tipos de cáncer humano tienen su causa en la hipometilación
del ADN. Para estudiar este fenómeno se generaron
ratones transgénicos conteniendo alguna de estas construcciones:
i) Vector conteniendo un promotor de SV40 (constitutivo, proveniente
de un adenovirus) controlando la expresión de la se-
2
Cantidad
relativa
de mRNA
GFP
TIR1 ABF
Con
Sin flag22
Con flag22
ABF miR39
cuencia estructural de la metiltransferasa 1 (Dnmt1) en orientación antisentido
ii) Vector conteniendo un promotor de SV40 (constitutivo, proveniente de un adenovirus) controlando la expresión
de la secuencia de la metiltransferasa 1 (Dnmt1) en orientación sentido.
iii) Vector conteniendo el promotor constitutivo proveniente del fago controlando la expresión de la secuencia
estructural de la metiltransferasa 1 (Dnmt1) en orientación sentido
iv) Vector conteniendo el promotor constitutivo proveniente del fago controlando la expresión de la secuencia
estructural de la metiltransferasa 1 (Dnmt1) en orientación antisentido
Se sabe que la enzima Dnmt1 controla la metilación del ADN en ratones y que su sobreexpresión permite metilar
exhaustivamente todo potencial ADN metilable y que su disminución causa una sustancial hipometilación del ADN
en todos los tejidos.
a) ¿Cuál de los 4 vectores usaría? ¿Por qué?

62
b) En base al vector elegido, ¿cómo espera que sea el grado de metilación general del ratón transgénico? Explique
el mecanismo
c) ¿Con cuáles de las siguientes técnicas corroboraría que el ADN está hipometilado? Justifique (indique los controles
que haría).
i) digestión con sendas ER que reconocen sitios metilados y no metilados, respectivamente, seguido de Southern
Blot con la sonda Dnmt1
ii) ensayo de protección a la digestión por ADNasaI
iii) preparación de ARN de ratón salvaje y ratón transgénico, seguida de Northern Blot con la sonda Dnmt1
iv) digestión con ER que reconocen sitios metilados, seguido de Southern Blot con la sonda de igf2 (insulin-like
growth factor-2, conocido gen que sufre impronta génica)
v) secuenciación bisulfítica genómica directa de Dnmt1y/o igf2
vi) secuenciación bisulfítica del cDNA de Dnmt1y/o igf2
El ratón transgénico desarrolló tumores en varios tejidos. Se determinó que el gen Tm, candidato a causar tumores
en hígado, se encontraba hipometilado en estos ratones. Ud. sabe que Tm presenta dos alelos, Tm1: sin sitio para
EcoRI y Tm2 con sitio para EcoRI.
d) ¿Cómo haría para probar que Tm sufre impronta (imprinting) en ratones salvajes? Ud cuenta tanto con ratones
homocigotas como con heterocigotas.
e) Suponiendo que realmente existe impronta de Tm en el macho ¿cómo sería la proporción de Tm1 y Tm2 metilados
y no metilados en la F2, es decir los nietos de un cruzamiento entre ratones ♂ homocigotas para Tm1 y ♀
Tm2?
4) La obtención de plantas transgénicas para conferir resistencia a enfermedades virales tiene larga data. Las primeras
lo fueron por expresión de funciones (proteínas) virales (como la cápside) las cuales interfieren la estrategia
de multiplicación de los virus. También se logró bloquear la traducibilidad de los mensajeros virales expresando
secuencias de ARN de orientación antisentido. Luego se enfocó en el aprovechamiento del silenciamiento posttranscripcional
mediante la expresión de secuencias nucleotídicas virales. Vazquez Rovere y col. (Arch. Virology
146:1337, 2001), obtuvieron papas transgénicas que expresaban las siguientes 3 construcciones genéticas
conteniendo el gen de la replicasa del virus PLRV (ORF2b):
Aclaraciones:
ATG-rep: Construcción que contiene el gen de la replicasa
con el codón de iniciación (ATGAUG); No codific-rep:
Idem sin ATG; Anti-rep: construcción antisentido
(la secuencia se encuentra invertida); RB y LB:
bordes derecho e izquierdo del segmento T de Agrobacterium
tumefaciens; 35S, mas5’: promotores constitutivos
fuertes; t-nos, mas3’ terminadores de transcripción;
ORF2b: gen de la replicasa; nptII: gen de resistencia a
kanamicina; Flechas: indican la orientación 5’3’ de la
secuencia.
a) ¿Para qué se usó la resistencia a kanamicina?
Las plantas transgénicas fueron desafiadas con el virus y
se encontraron plantas con resistencia (y otras con susceptibilidad)
con cualquiera de las 3 construcciones. Para
caracterizar el mecanismo que media esta resistencia, se
bombardearon hojas de las papas transgénicas utilizando
un cañón génico y una construcción que codifica para
una proteína de fusión GUS::replicasa (Fig. 2, la GUS –
ß-glucouronidasa– es detectable en forma similar a la ßlac).
La fusión, sin embargo, afecta parcialmente la actividad enzimática. Es decir, la enzima funciona un poco
peor, pero funciona. De esta forma se consigue la expresión (transitoria) de las construcciones genéticas bombardeadas
en las células impactadas y su fácil visualización en forma de puntos azules (fig.2).
Nota: No se grafican las transgénicas con la construcción ATG-rep porque dan casi igual que las no codrep.
b) ¿Para qué se hicieron los experimentos de la Fig. 2? Interprete los resultados:
i) ¿Cómo me doy cuenta de cuánto afecta a la actividad GUS la fusión con la replicasa? ¿Qué resultados comparo
para evaluarlo?
ii) ¿Para qué sirven, además, los experimentos realizados con la construcción 2 (GUS sólo)?
iii) ¿A qué atribuye las diferencias entre A1 y A2 y entre S1 y S2? ¿Qué relación tiene con la resistencia?
iv) ¿Cuál mecanismo (por proteína, por bloqueo de la traducción –antisentido-, por silenciamiento posttranscripcional)
media la resistencia?

Aclaraciones: GUS-rep: construcción genética capaz de
expresar una proteína (y su mRNA) de fusión
GUS+replicasa, GUS: Idem sólo GUS. uid-A: gen codificante
para GUS; A1 y A2 son 2 plantas transgénicas representativas para la construcción antisentido (Anti-rep);
S1 y S2 plantas con la construcción “sentido” (no codific-rep). (S) y (R) representan plantas susceptibles y resistentes.
Ken (NT) es un control de la misma variedad de papa que el resto (Kennebec) pero no transformada.
19. GENÉTICA APLICADA y GENÉTICA del CÁNCER
1) Un gen de predisposición a un cáncer de expresión típicamente femenina como el cáncer de ovario o de mama
a) ¿podría ser transmitido genéticamente a través de los hombres de una familia? Explique cómo y esquematice una
genealogía hipotética. No olvide mencionar si el gen es de expresión dominante o recesiva.
b) Formule una hipótesis desde el punto de vista de la regulación de la expresión genética la especificidad sexual de
este oncogén.
2) La 2-amino-3-metilimidazo[4,5-f]quinolina (IQ) es una amina heterocíclica aromática que se podría formar
durante la cocción de ciertas comidas. Como algunos compuestos de esta familia son genotóxicos, se decidió investigarla.
Primero se utilizó el test de Ames, con resultados negativos. Sin embargo se demostró in vitro que, en
presencia de citocromo P450 se produce una N-oxidación a 2-(hidroxiamino)-3-metilimidazo [4,5-f] quinolina, la
cual reacciona con el DNA formando N-(deoxiguanosin-8-il)-2-amino-3-metil-imidazo[4,5-f]quinolina (dG-C8-
IQ). La reversión de mutaciones por test de Ames de este último compuesto (a diferencia del precursor) mostró
mutaciones de cambio de lectura de uno o dos pares G:C. Cuando se ensayó con el sistema Mutamouse® se obtuvieron
los siguientes valores (* = diferencia. significativa respecto al control):
Observe la tabla en la siguiente hoja y responda:
a) ¿Por qué el control (al que se le inyectó agua) da valores positivos en los 3 órganos analizados?
b) Hipotetice por qué los resultados son diferentes en diferentes órganos
c) A la luz de estos resultados ¿Considera Ud que la IQ produce una respuesta mutagénica generalizada o específica
de tejido?
Órgano Tratamiento total placas Mutan- FMx10
tes
–5
Control 1 701 030 47 2.8±1.1
Hígado 1x20 mg/kg 1 415 460 72 5.1±2.3*
5x20 mg/kg 2 710 226 349 12.9±6*2*
63
Para estudiar si el mecanismo de acción tiene algo
que ver con el hipotetizado, se secuenciaron todas las
placas blancas derivadas de DNA de hígado y se tabularon
los porcentajes relativos de tipo de mutación en
los controles y en las tratadas con IQ (recordar que se
trata de porcentajes relativos y que si IQ produce, en
Control 1 299 750 35 2.7±1.2
Colon 1x20 mg/kg 1 223 900 68 5.6±3.5* algún caso algún porcentaje menor al control, eso no
5x20 mg/kg 1 316 970 97 7.4±1.4* Tipo mutación Control IQ
Control 1 540 100 51 3.3±1.3
GC 38% 15%
Transición
Riñón 1x20 mg/kg 1 523 600 71 4.7±2.1
AT A 9% 1%
T GCG
25% 52%
5x20 mg/kg 1 611 830 95 5.9±0.8* Transversión
C GCT
16% 7%
significa que haya generado un número absoluto menor de
A AT C 3% 4%
placas blancas que el control).
Cambio de marco G +1 T 6% 1%
d) ¿Detecta Ud algún tipo de mecanismo preferencial?
Cambio de marco A –1 3% 19%
¿Cuál?
Deleción 2 pb 0% 1%
e) Todo lo anterior resultó importante para la detección de
mutaciones somáticas (como las oncogénicas o carcinogénicas)
¿Le parece que los ratones transgénicos también podrían servir
para estudiar mutaciones germinales?
f) ¿Qué tejido se le ocurre que sería el más apropiado para estudiar
este aspecto?
3) Las quitina-deacetilasas (CDA) son enzimas involucradas en la
modelación de epidermis y traqueidas de los insectos. Tribolium
castaneum (TC) es el gorgojo de la harina (un coleóptero perjudicial)
y se lo quiere controlar interfiriendo su desarrollo con métodos
inocuos que no impliquen el uso de insecticidas en la harina.

64
Para ello Arakane y col (2009) clonaron los genes CDA encontrando que se trata de una familia multigénica. El gen
CDA2 sufre splicing alternativo por lo que se detectaron los transcriptos diferenciales a través de sondas
específicas (llamadas TcCDAa y b).
a) Esquematice (solo dibujos, sin explicaciones) una estructura hipotética de la organización del gen CDA2
(indicando intrones y 4 exones) y de sus transcriptos maduros. Marque qué secuencias pudieron haber elegido para
confeccionar las sondas diferenciales a y b.
Como no encontraron diferencias entre los 2 transcriptos, decidieron estudiar la función de los productos génicos.
Para ello, se inyectaron larvas con RNAs de doble cadena (dsRNAs). La Fig B muestra northern blots después de
inyectar con dsRNA para TcCDA2a, TcCDA2b y dsVer (gen no relacionado que controla el color bermellón de los
ojos y se expresa en el adulto). Las sondas utilizadas fueron las diferenciales (TcCDA2a y b) y la TcRpS6 (no relacionada
con CDA) complementaria al gen que codifica para la proteína 6 de ribosomas de expresión constitutiva.
b) ¿Qué efecto tuvo la inyección de cada uno de los 3 dsRNAs? ¿Para qué incluyeron dsVer y TcRpS6 en este
experimento?
Además observaron las consecuencias morfológicas del experimento
anterior a lo largo del tiempo (0, 1 y 2 son días después de la inyección
de dsRNA). La foto tachada indica larvas moribundas o muertas.
c) Interprete este experimento. Específicamente: ¿para qué están los
experimentos de la primera columna?, ¿resulta lo mismo o diferente
knockear CDA2 y CDA2b ¿Podría afirmarse que CDA2, por ejemplo,
es un gen homeótico? ¿Por qué?
Lista de Alumnos EGE: es una lista de distribución de información para alumnos del Departamento
de Ecología, Genética y Evolución, acerca de becas, cursos y otras cuestiones de interés.
No es una lista de discusión. Puede Ud. suscribirse a la lista en:
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o accediendo desde el link en la página del Departamento.
También en esta página encontrará los correos electrónicos de los representantes estudiantiles
del EGE, para realizar cualquier consulta.

Turno: ……..
GENÉTICA I – 2012 (2do cuatrimestre)
Apellido y Nombre:………………………………………………LU: …………
E-mail: ……………………………………….TE:………………………………
Materias que cursa:………………………………………………………………
TP
Final
Zoología Botánica Biometría Video Talón
CLASE Asistencia Nota / observaciones/Parcialitos
MENDEL 1
MENDEL 2
DIVISIÓN CELULAR
G. HUMANA
MEIOSIS
MAPEO 1
MAPEO 2
POBLACIONES
MM 1
MM 2
ALT. ESTRUCTURALES
ALT. NUMÉRICAS
GENOTOXIXIDAD
CUANTITATIVA
QTL-MOSCAS
FIN MOD. 1
DET.SEXO
ORGANELAS /MUTAC.
MM/POB
BIOINFORMÁTICA
BACTERIANA
REGULACION
ING GENÉTICA 1
ING GENNÉTICA 2
EPIG / DESARROLLO
GENÓMICA/POSTG
TRANSPOSONES
FIN MOD 2
Nota inicial
Recuperatorio
1er parcial 2do parcial CONCEPTO Nota final
65