CONCEPTOS y TECNICAS de BIOTECNOLOGIA - FBMC

CONCEPTOS y TECNICAS de
BIOTECNOLOGIA
(FCEyN FCEyN – UBA )
Biotecnología Biotecnolog a Industrial
Producción Producci n industrial de Metabolitos
Biorreactores
Miryan Cassanello
PINMATE – Dep. Industrias, FCEyN-UBA
E-mail: miryan@di.fcen.uba.ar

Productos biotecnológicos
biotecnol gicos: están en todos los sectores de la
vida diaria:
•drogas (genéricas
y no-genéricas)
•productos de
belleza
•procesamiento de
alimentos para
humanos y
animales
•procesamiento
textil y artículos
de limpieza
•aplicaciones
industriales:
producción masiva
de alcohol
•suplementos
nutricionales
Relevancia económica de los
productos generados industrialmente
mediante procesos biotecnológicos
Estadística: año 2002
(Fuente: Kent y Riegel, 2007)

Productos obtenidos mediante procesos biotecnológicos
biotecnol gicos
Productos Organismo típico utilizado Mercado
mundial
(ton/año)
Alcoholes Etanol Saccharomyces cerevisiae 20 millones
Ácidos
orgánicos
Butanol/acetone Clostridium acetobutylicum 2.000
Acido cítrico Aspergillus niger 230.000
Acido glucónico Aspergillus niger 50.000
Acido láctico Lactobacillus delbrueckii 20.000
Aminoácidos Acido Lglutámico
Corynebacterium glutamicum
300.000
L-lisina Brevibacterium flavum 30.000
L-fenilalanina Corynebacterium glutamicum 2.000
L-arginina Brevibacterium flavum 2.000
Antibióticos Penicilinas Penicillium chrysogenum 40.000
Cefalosporinas Cephalosporium acremonium 10.000
Tetraciclinas Streptomyces aureofaciens 10.000
(Fuente: Doran, 1995)

Producto Organismo típico utilizado Mercado mundial
(ton/año)
Enzimas Proteasas Bacillus spp. 600
α-Amilasa Bacillus amyloliquefaciens 400
Glucoamilasa Aspergillus niger 400
Glucosa isomerasa Bacillus coagulans 100
Pectinasa Aspergillus niger 10
Polímeros Xantanos Xanthomonas campestris 5.000
Dextrano Leuconostoc mesenteroides 200
Vitaminas B12 Propionibacterium shermanii 10
Vacunas Difteria Corynebacterium diphterie < 50 kg/año
Tétanos Clostridium tetani Pequeña
Proteínas Insulina Escherichia coli recombinante < 20 kg/año
terapéuticas
Interferón-α2 Escherichia coli recombinante 10
Hormona de Escherichia coli recombinante o Pequeña
crecimiento células recombinantes de
mamíferos

Biología Biolog
Bioquímica Bioqu mica
Biotecnología ROJA:
Aplicación en medicina
Biotecnología
Biotecnolog
ROJA
Biotecnología
Biotecnolog
VERDE
Biotecnología VERDE:
Aplicación en agroalimentos
BIOTECNOLOGIA
Ingeniería Ingenier Química Qu mica
Química Qu mica
Biotecnología AZUL:
Aplicación en
organismos marinos
Biotecnología
Biotecnolog
BLANCA
Biotecnología
Biotecnolog
AZUL
Biotecnología BLANCA (o industrial):
Aplicación en la industria en general,
productos químicos, nuevos materiales,
biocombustibles, etc.

BIOTECNOLOGIA
INDUSTRIAL
Biotecnología : actividad multidisciplinaria que comprende la
aplicación de los principios científicos y de la ingeniería al
procesamiento de materiales por agentes biológicos para proveer
bienes y servicios. (Definición de la OECD)
Agentes biológicos: células microbianas, animales, vegetales y
enzimas.
Bienes: cualquier producto industrial (alimentos, bebidas,
productos medicinales, etc.
Servicios: especialmente los relacionados con la purificación de
aguas y tratamiento de efluentes.

Bibliografía – libros de texto
Bioprocess Engineering. Basic concepts, Michael L. Shuler, Fikret
Kargi, Prentice Hall Int. Series, 2nd Ed. 2002.
Kent and Riegel’s Handbook of Industrial Chemistry and
Biotechnology, J.A. Kent (Ed.), Chapter 30: Industrial
Biotechnology: Discovery to Delivery, G. Chotani, T. Dodge, A.
Gaertner, M. Arbige, Springer, 11th Ed. 2007.
Principios de Ingeniería de los bioprocesos, Pauline M. Doran,
Editorial Acribia S.A, Zaragoza, España. 1995. (Traducido 1998)
•Biochemical Engineering Fundamentals, James E. Bailey, David. F.
Ollis, McGraw-Hill Int. Ed., 2nd . Ed. 1986.
•Biochemical engineering and biotechnology, Ghasem Najafpour,
Elsevier, (2007) ISBN-10: 0444528458; ISBN-13: 978-0444528452
•Bioreaction Engineering Principles, Jens Nielsen, John Villadsen,
Gunnar Lidén. Springer, 2da. Ed. (2005). ISBN-10: 0306473496;
ISBN-13: 978-0306473494

Bibliografía – algunos reprints de biotecnologia industrial
•Xu, J., Ge, X., Dolan, M.C., Towards high-yield production of pharmaceutical
proteins with plant cell suspension cultures. Biotechnology Advances 29 (2011)
278–299
•Brennan, L., Owende, P., Biofuels from microalgae—A review of technologies for
production, processing, and extractions of biofuels and co-products. Renewable and
Sustainable Energy Reviews 14 (2010) 557–577
•Huang, T-K., McDonald, K.A., Review: Bioreactor engineering for recombinant
protein production in plant cell suspension cultures. Biochemical Engineering
Journal 45 (2009) 168–184
•Rosche, B., Li, X.Z., Hauer, B., Schmid, A., Buehler, K., Microbial biofilms: a
concept for industrial catalysis? Trends in Biotechnology 27 (2009) 636–643
•Lacaze, G., Wick, M., Cappelle, S., Emerging fermentation technologies:
Development of novel sourdoughs. Food Microbiology, 24 (2007) 155–160
Gavrilescu, M., Chisti, Y., Biotechnology—a sustainable alternative for chemical
industry. Research review paper. Biotechnology Advances, 23 (2005) 471–499
•Butler, M., Animal cell cultures: recent achievements and perspectives in the
production of biopharmaceuticals. Appl Microbiol Biotechnol, 68 (2005) 283–291
•Kretzmer, G., Industrial processes with animal cells. Appl Microbiol Biotechnol, 59
(2002) 135–142

Objetivo de la
producción
industrial de
células o de
microorganismos
Producir las mismas células o
microorganismos (biomasa) en
gran escala
Producir en gran escala
compuestos (intracelulares o
extracelulares) resultantes del
crecimiento celular
(metabolitos)
Metabolitos
Primarios
Metabolitos
Secundarios

Metabolitos primarios
-Moléculas generalmente sencillas, que participan de los caminos
metabólicos esenciales. Son casi idénticos en todos los organismos.
-Son más baratos y sencillos de producir, tienen bajo contenido de
“actividad biológica” y frecuentemente son “commodities”
1. Componentes esenciales de las células/microorganismos:
proteínas, ácidos nucléicos, polisacáridos (gelanos, xantanos) y
poliésteres, ácidos grasos (insaturados), esteroles.
2. Derivados del metabolismo intermedio: azúcares (fructosa,
ribosa, sorbosa), ácidos orgánicos (gluconato, ácido láctico,
cítrico, acético, propiónico, succínico, fumárico), alcoholes
(xilitol, etanol, glicerol, sorbitol, butanol), aminoácidos (Lys,
Thr, Glu, Trp, Phe), vitaminas (B2, B12), nucleótidos
saborizantes (ácidos inocínico y guanílico), polisacáridos y
poliésteres de reserva.
Microorganismos productores: bacterias, levaduras y hongos

Metabolitos secundarios
-Moléculas mas complejas, que participan de caminos metabólicos
no-esenciales, pero confieren capacidades de supervivencia en
situaciones de stress.
-Son muy variados y su estructura es fuertemente dependiente de la
especie y variedad utilizada para su producción. Se generan en
condiciones particulares y son más valiosos y complicados de
producir ⇒ alto contenido de “actividad biológica”
-Generalmente son productos especiales (alto precio). Funcionan
en los organismos que los producen como:
1. Armas contra otros microorganismos (antibióticos, toxinas,
inhibidores enzimáticos, pesticidas)
2. Factores de crecimiento (hormonas)
3. Ionóforos
4. Agentes de interacción microbiana
5. Efectores externos

PROCESOS BIOTECNOLOGICOS o
FERMENTACIONES
Procesos que se llevan a cabo en un “bio”-reactor mediante los cuales
se transforman los sustratos de un medio de cultivo (materias primas)
en metabolitos y/o en biomasa (productos) empleando para este fin
microorganismos, células o enzimas.
Operaciones
unitarias
Biorreactor
o
Fermentador
Operaciones
unitarias

Principales etapas de un proceso biotecnológico biotecnol gico industrial:
Propagación
de los cultivos
Fermentación
Esterilización
Preparación de
medios
Separación
Purificación
Tratamiento
de efluentes
1)Propagación de cultivos: comienza en un tubo de ensayo o un tubo
congelado o liofilizado donde se conserva la cepa de interés, o de
una colonia del microorganismo previamente seleccionado. Se
propaga en el laboratorio progresivamente aumentando el volumen
del medio de cultivo.
2)Fermentación: Se prepara el medio de nutrientes y se esteriliza. Se
siembra un tanque de inóculos cuyo volumen depende de la escala
industrial. V inoculos ~50-1000L y V fermentador industrial ~10-1000 m 3 ).

Principales etapas de un proceso biotecnológico biotecnol gico industrial:
Propagación
de los cultivos
Fermentación
Esterilización
Preparación de
medios
Separación
Purificación
Tratamiento
de efluentes
3)Separación y purificación: operaciones mecánicas de ruptura de
células; separación de insolubles por filtración, centrifugación o
sedimentación; separaciones primarias por extracción, absorción,
adsorción, ultrafiltración; purificación por extracción líquidolíquido,
extracción en dos fases acuosas o cromatografía de
afinidad; aislamiento y acondicionamiento del producto.
4)No tiene relación directa con el producto pero es una etapa
imprescindible por los volúmenes involucrados y para preservar el
medio.

Selección Selecci n (screening ( screening)
En la selección del microorganismo/célula, se debe tener en cuenta:
1. La cepa a utilizar debe ser genéticamente estable.
2. La velocidad de crecimiento debe ser alta.
3. La cepa debe estar libre de contaminantes.
4. Sus requerimientos nutricionales deben cubrirse con medios de
cultivo de costo reducido.
5. Deben ser de fácil conservación por largos períodos de tiempo sin
pérdida de sus características.
6. Debe realizar el proceso fermentativo completo en tiempo corto.
7. Si el objetivo es un producto, este debe ser de alto rendimiento y
de fácil recuperación a partir del medio de cultivo.

Los nuevos métodos de “screening” incorporan técnicas de ingeniería
genética para crear diversidad.

Preparación Preparaci n de medios de cultivo – Esterilización
Esterilizaci n
Los componentes de los medios de cultivo son los “efectores
externos” de naturaleza química que deben cumplir con los
requerimientos del crecimiento y de formación de productos y
suministrar energía para el mantenimiento celular.
Componentes de un medio de cultivo:
1. Macronutrientes, agregados en concentraciones de g/L, fuentes
de C, N, S, P, K y Mg
2. Micronutrientes o elementos trazas, representados por las sales
de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co, agregados en conc. de mg o µg/L
3. Factores de crecimiento, constituidos por compuestos orgánicos
que no son sintetizados por las células y de función metabólica
específica; se suministran en baja concentración (vitaminas,
algunos aminoácidos, etc.)

Preparación Preparaci n de medios de cultivo – Esterilización
Esterilizaci n
Los medios pueden clasificarse considerando la naturaleza
química de los componentes en:
1. Medios sintéticos o medios químicamente definidos
2. Medios complejos, en cuya composición intervienen
sustancias de origen animal o vegetal (ej.: extracto de
levadura, macerado de maíz, harina de soja, etc.) que aportan
las sustancias fundamentales pero son químicamente
indefinidas y de composición variable.
Cualquiera sea el medio de cultivo, se debe esterilizar previamente
a ponerse en contacto con el inóculo. Esterilizar significa eliminar
toda forma de vida de un medio o material. Generalmente se lleva
a cabo por filtración o calentamiento.

Separación Separaci n y purificación purificaci n (downstream
( downstream): depende de la
eficiencia del proceso y del producto a obtener

Fermentaciones - fermentadores o biorreactores
Es el corazón del proceso y debe optimizarse para evitar posteriores
etapas de separación y purificación.
discontinuas o batch
Fermentaciones semicontinuas (fed-batch)
continuas
Para el diseño de los biorreactores se debe considerar la cinética del
crecimiento de las células o microorganismos (“biomasa”) y la
velocidad de formación de los productos deseados.
Cinética de crecimiento de biomasa
Definiciones
Crecimiento en cultivos discontinuos o batch: Factores que afectan
Cuantificación de la velocidad de crecimiento: Modelos, Ecuación
de Monod
Crecimiento en cultivos continuos: Quimiostato, turbidistato

Cinética Cin tica de crecimiento microbiano
productos
S ustrato + biomasa →
+
extracelulares
∑S
+ X → ∑P
+
Crecimiento
mayor cantidad
de biomasa
nX
aumento en el número de células
aumento del tamaño de las células
El crecimiento microbiano es un ejemplo de reacción autocatalítica.
La velocidad de crecimiento está relacionada con la
concentración de células.
Velocidad específica neta de
crecimiento (h -1 ):
X: concentración másica de células (g/L)
t: tiempo (h)
neta ≡ µ
1
X
dX
dt

La velocidad específica neta de crecimiento es la diferencia entre la
velocidad de crecimiento y la velocidad de desaparición de biomasa
por muerte celular o por metabolismo endógeno:
µ
neta
= µ
También se puede expresar la velocidad en función de la
concentración de número de células en lugar de la concentración
másica de las mismas. Si no se pueden medir las dos, se prefiere
la concentración másica.
Formas de medir la concentración de células
Se busca un método rápido, fácil de seguir en línea o de respuesta
rápida.
Directos
Métodos
Indirectos
g
−k
d

Determinación Determinaci n de la concentración concentraci n másica m sica de células: c lulas:
Métodos directos (en ausencia de otros sólidos en suspensión):
•Masa de células secas (centrifugado/filtrado/lavado/secado)
•Volumen de células centrifugadas en condiciones estándar
•Absorción de luz por células en suspensión
Métodos indirectos: se basan en un efecto que inducen, como ser la
velocidad de consumo de un sustrato o de formación de un producto.
•Productos: etanol, CO 2
•Sustratos: consumo de O 2 o de un sustrato base de C o N
•Propiedades físico-químicas: viscosidad, pH
Ejemplo: seguir la concentración de ATP, ≅ proporcional a la masa
de células.
luciferina
+
ATP
+
O
2
luciferasa
⎯⎯⎯→
LUZ
Sensible
>10 -12 gATP/L

Cinética Cin tica de crecimiento de un cultivo en batch
Etapas:
1) de latencia o
inducción
2) de crecimiento
exponencial
3) de desaceleración
4) estacionario
5) de muerte o
declinación
celular
3) 4)
Desaceleración:
Desaceleraci n: por consumo de un nutriente esencial o generación de
4) 5) Estacionario:
1)
Estacionario:
2) 1) Muerte:
subproductos
Muerte: Crecimiento Latencia: Latenciabaja
adaptación exponencial: el velocidad número del de inóculo células, crecimiento
rápida multiplicación al difícil nula.
medio. definir Las
Depende de
el células límite aún
tóxicos crecimiento desbalanceado, las células del células inóculo con son
la
activas
deben
etapa
readaptarse crecimiento (edad anterior.
y pueden producir metabolitos secundarios (ej. antibióticos,
y tamaño) a las balanceado condiciones y de los (composición nutrientes. hostiles. Se de puede células adaptar constante). ex-situ.
hormonas) productos de la desregulación celular

1) Latencia: Latencia adaptación del inóculo al medio. Depende del
inóculo (edad y tamaño) y de los nutrientes. Se puede adaptar
ex-situ.
2) Crecimiento exponencial: rápida multiplicación de células
crecimiento balanceado (composición de células constante).
3) Desaceleración:
Desaceleraci n: por consumo de un nutriente esencial o
generación de subproductos tóxicos crecimiento
desbalanceado, las células deben readaptarse a las condiciones
hostiles.
4) Estacionario: velocidad de crecimiento nula. Las células aún
son activas y pueden producir metabolitos secundarios (ej.
antibióticos, hormonas) productos de la desregulación celular
5) Muerte: baja el número de células, difícil definir el límite con
la etapa anterior.

Crecimiento balanceado: todos los componentes de las células
crecen con la misma velocidad → la composición media de las
mismas permanece constante. Es válido para la etapa de crecimiento
exponencial.
exponencial
En este período, la velocidad de crecimiento es independiente de los
nutrientes y resulta en una cinética de primer orden.
µ
g
≅µ
neta
1 dX dX
µ
= ⇒ = µ dt ⇒X
= X e
neta
0
X dt X
Tiempo necesario para duplicar la biomasa:
X=
2X
0
⇒
τ
d
=
ln( 2)
µ
neta
neta
t

Crecimiento no balanceado: los componentes de las células no
crecen con la misma velocidad → la composición media se modifica.
Esta situación caracteriza especialmente a la etapa estacionaria
El estrés producido por la falta de nutrientes o por la existencia de
subproductos o toxinas inhibidoras que generan un medio hostil
induce una reestructuración de las células para adaptarse a las nuevas
condiciones.
g
≠µ
neta
= µ
g
−k
Puede ocurrir:
•La concentración másica de células (X) es constante pero baja el
número de células viables.
•X baja por lisis de células. Puede aparecer un segundo período
de crecimiento, los productos de lisis o las células muertas
constituyen un sustrato alternativo (crecimiento críptico).
•X constante pero su metabolismo es activo; cambia la regulación
celular produciendo metabolitos secundarios.
µ
d

Coeficiente de mantenimiento: mantenimiento se emplea para definir la velocidad
específica de consumo de sustrato para energía de mantenimiento.
1 dS
⎞
m= - ⎟
X dt ⎠
m
Energía Energ a de mantenimiento: mantenimiento necesaria
para mantener la membrana celular activa
y el transporte de nutrientes, y para
funciones metabólicas esenciales como la
movilidad y la reparación de estructuras
dañadas.
Si no hay sustrato disponible, el mantenimiento inducirá pérdida de
masa celular (metabolismo endógeno para adaptarse al medio).

Otras definiciones: Coeficientes de rendimiento: rendimiento se definen en base
a la cantidad consumida de otro componente.
Rendimiento de formación de células por masa
de sustrato consumida (g células/g S)
Y X/S es un valor constante en la etapa de
crecimiento exponencial.
Luego de la etapa de crecimiento exponencial, Y X/S deja de ser
constante, es un rendimiento aparente porque el sustrato se emplea
para otros fines:
∆S=
∆S
+ ∆S
+ ∆S
+ ∆S
formacion
de biomasa
formacion
de productos
cimiento - cre para
energia
tenimiento - man para
energia
También se pueden definir rendimientos basados en otros componentes:
∆X
∆P
Y = − ; Y
X O
P/S = −
/ 2 ∆DO
∆S
YX/ S
∆X
=
−
∆S

Ejemplo: Organismos creciendo en condiciones aeróbicas en glucosa;
para la mayoría de las bacterias y levaduras:
Y
X/
S
= 0,
4−0,
6 g/
g
;
Y
X/O
(en condiciones anaeróbicas suelen ser menores)
⎛
⎜
⎝
Los rendimientos
dependen del medio
y de la fuente de C.
Para la mayoría de
los casos:
Y = 1±
0,
4 g/g
X/
S
g biomasa
g de C consumido
⎞
⎟
⎠
2
= 0,
9−1,
4 g/g

Relación Relaci n del crecimiento de biomasa con la formación formaci n de
productos:
Definimos la velocidad
específica de formación
1 dP
q P = = Y µ P/
X g
X dt
de producto, qP Se encuentran 3 situaciones:
(a) q P asociada al crecimiento celular, ej: producción de una
enzima constitutiva de la biomasa (metabolito primario).
q = α µ ⇒α
= Y
P
g
P/
X
(b) q P parcialmente asociada (etapa de desaceleración y
estacionaria), ej: fermentación de ácido láctico, xantanos y algunos
metabolitos secundarios.
= αµ
g
+ β
(c) q P no-asociada al crecimiento celular (etapa estacionaria, donde
la µ g =0) ej.: metabolitos secundarios como antibióticos.
qP
qP = β=
constante;
µ
g = 0

Relación Relaci n del crecimiento de biomasa con la formación formaci n de
productos:
1 dP
qP = = Y µ P/
X g = YP/
X
X dt
1 dX
X dt
Asociada Parcialmente asociada No asociada
q = α µ q α + β
q = β
P
g
P
= µ g
Metabolitos primarios Metabolitos secundarios
P

Factores que influyen – Temperatura del medio
La velocidad de
crecimiento
disminuye por
encima de la T op
La velocidad de
crecimiento
aproximadamente
se duplica cada
∆T = 10°C
-psicrófilos (T op < 20°C)
-mesófilos (20

•Por encima de T op ocurre muerte celular → disminuye el número
de células viables cuando la velocidad de muerte supera la de
crecimiento.
•Ambas velocidades siguen una ecuación tipo Arrhenius con
µ ' = exp( −E
/ RT ) =
A exp( −E
/ RT )
g
A a
kd d d
E a ≅ 10–20 kcal/mol E d ≅ 60–80 kcal/mol
La muerte celular es más sensible a T que el crecimiento
(importante para la esterilización)
•La T también afecta la velocidad de formación de producto pero
la T op y la E a suelen ser distintas.
•También influye sobre el Y X/S porque para T>T op , la energía de
mantenimiento es mayor baja Y X/S
•Para organismos inmovilizados puede cambiar el control.

Factores que influyen – pH del medio
Rango de
pH óptimo
Variación de la velocidad específica de crecimiento con el pH. Existe un
pH óptimo para cada tipo de célula, generalmente próximo a 7. Se puede
incrementar el rango adaptando las células por incrementos pequeños.

•El pH óptimo suele ser distinto para el crecimiento que para la
formación de producto.
•Los pH aceptables varían en ±1 o 2 unidades respecto del óptimo.
•El pH óptimo depende de la biomasa, el rango va de 3 a 8.
- levaduras: 3 – 6
- hongos: 3 – 7
- células vegetales: 5 – 6
- células animales: 6,5 – 7,5
•Algunos organismos pueden regular el pH empleando energía de
mantenimiento.
•El pH puede variar mucho por efecto del medio (fuente de N,
aminoácidos, CO 2 )

Factores que influyen – concentración concentraci n de O 2 disuelto (DO):
Es un sustrato importante para las fermentaciones aeróbicas.
•Debido a la baja solubilidad del O 2 en agua, puede ser un limitante de
la velocidad de crecimiento.
•La solubilidad del oxígeno en agua depende de la presión, de la
temperatura y de las sales disueltas (a presión atmosférica es 7ppm).
•La concentración crítica de oxígeno
disuelto C O2,critica es aquella por debajo
de la cual comienza a controlar la
velocidad de crecimiento:
• 5–10% de la concentración de
saturación para bacterias y levaduras y
≅ 10–50% de la concentración
de saturación para hongos (según
el tamaño)

Transporte de oxígeno a las células
•El O 2 se
introduce por
burbujeo y su
concentración
depende de la
agitación.
•Velocidad de
transferencia:
OTR
•Velocidad de consumo
de oxígeno (OUR):
⎜
⎛ * C −C
⎝ O2
= k a LG O b
L 2
OUR = q
X =
µ
O2 Y
g
X
X/
O
2
⎟
⎞
⎠

Factores que influyen – otros factores
•Potencial redox: afecta las reacciones de óxido-reducción. Esta relacionado
con la concentración de O 2 , el pH y las concentraciones de otros iones.
Potencial de reducción del medio:
E
( ) ( ( ) ( )
mV = E + 0,
06 log P + log H+
Se puede reducir bajando la concentración de O 2 (burbujeo de nitrógeno) o
por agregado de agentes reductores (cisteína, Na 2 S, HCl).
•Concentración de CO 2 disuelta puede afectar. Puede ser tóxica para algunas
células y necesaria para otras.
Se regula modificando la concentración en la corriente de burbujeo.
•Fuerza iónica: afecta el transporte de ciertos nutrientes desde y hacia el
interior de las células. Depende de la concentración y de la carga de los iones
en el medio:
FI
1 c Z2
∑
=
2
i
0
i
i
O
2

Generación Generaci n de calor por crecimiento microbiano
•40–50% de la energía suministrada por las fuentes de C se
convierten en ATP (forma en que las células acumulan energía)
→el resto se libera como calor.
•El calor liberado se puede calcular a partir de las entalpías de
combustión del sustrato y de la biomasa formada:
Crecimiento
microbiano y
respiración
1/Y H (kJ/g célula)
CO 2 + H 2O
+
Ciclo entálpico
para calcular el
calor generado
combustion del
sustrato, ∆H
( kJ/
g)
celulas
Combustión de
las células
∆Hc (kJ/g)
S Sustrato + O ⎯⎯⎯⎯⎯⎯→CO
2 + H 2O
∆H
Y
S
X/
S
= ∆H
c
+
2
1
Y
H
⇒
Y
H
=
∆H
S
Y
−Y
X/
S
X/
S
∆H
c

•Algunos valores típicos: ∆Hc ~ 20 – 25 kJ/g células
Y H ~0,42 g/kcal (glucosa); 0,30 g/kcal (malato); 0,18 g/kcal (etanol)
0,12 g/kcal (metanol); 0,061 g/kcal (metano)
•El grado de oxidación del sustrato afecta fuertemente la cantidad de
calor que evoluciona por el metabolismo de las células.
•Para células en crecimiento activo, el requerimiento para
mantenimiento es bajo →la evolución de calor está directamente
relacionada con el crecimiento.
•Velocidad total de generación de calor en una fermentación batch se
calcula considerando la velocidad de crecimiento.
1
Qgenerado
netaX
V
Y
µ =
•En una fermentación aeróbica, se correlaciona con la velocidad de
consumo de oxígeno, dado que es el aceptor final de electrones.
Q =
0,
12
generado
Q
O
2
H

Configuraciones de refrigerantes en biorreactores: (a) camisa externa
(b) serpentín externo (c) serpentín interno helicoidal (d) serpentín
interno tipo deflector (e) intercambiador de calor externo

Reactor batch de
escala laboratorio

Reactor batch de
escala industrial

Estequiometría Estequiometr del crecimiento microbiano y formación formaci n de
productos
productos Procesos complejos →reflejan el transcurso de miles
de reacciones intracelulares.
Es importante poder comparar el rendimiento y la generación de calor
que se obtiene empleando distintos sustratos → la estequiometría de
conversión de sustratos a biomasa y a productos extracelulares se
suele representar por ecuaciones pseudoquímicas simples.
CH O
+
m
n + a O2
+ b NH3→
c CHαOβ
Nδ
+ d H2O
e CO2
CH mO n representa un mol del carbohidrato empleado como sustrato
CH αO βN δ representa un mol del material celular
La composición del material celular depende del tipo de
organismo. Un mol de material biológico es aquel que
contiene un átomogramo de C

Por que una fórmula mínima escrita como: CH aO bN d ?
Composición elemental de la bacteria Escherichia coli
Elemento % en masa seca
C 50
O 20
N 14
H 8
P 3
S 1
K 1
Na 1
Ca 0.5
Mg 0.5
Cl 0.5
Fe 0.2
Otros 0.3
92% de la masa seca
total esta formado por
C, O, N, H
Componentes minoritarios
no se tienen en cuenta en la
fórmula mínima

Los coeficientes estequiométricos y la fórmula mínima se calculan
planteando balances elementales, la información del cociente
respiratorio y un balance de electrones disponibles.
CH O
+
m
n + a O2
+ b NH3→
c CHαOβ
Nδ
+ d H2O
e CO2
Balances
elementales:
C:
H:
O:
N:
moles CO generados
RQ=
moles O consumidos
2
1=
c + e
m + 3b = cα
+ 2d
n + 2a = cβ
+ d + 2e
3b = cδ
Los balances para H y O pueden no dar información correcta por la
gran masa de agua que tienen las células →se requiere información
adicional.
●Cociente respiratorio (RQ): moles de CO2 producidos por mol de
O2 consumido provee una indicación del estado metabólico y puede
emplearse para controlar el proceso.
2 =
e
a

●Balance de electrones disponibles:
Para las reacciones mas complejas, con formación de productos
extracelulares, se agregan componentes hay un coeficiente
estequiométrico más y se requiere mayor información.
Además, los balances elementales no se relacionan con los
cambios de energía involucrados en la reacción.
se desarrolló el concepto de grado de reducción, γ, para poder
plantear balances de electrones y protones en bioreacciones.
Grado de reducción: número de equivalentes de electrones
disponibles por átomo-gramo de C. Los electrones disponibles son
aquellos que se transfieren al O 2 al formarse CO 2 o H 2O.
ν
i
∑
i, sustratos i i
: coef.
estequiometricos
; γi
ν γ = ∑ , productos
ν
γ
i i i
: grados
de
reduccion

Cinética Cin tica de crecimiento microbiano: Modelos
productos
Sustrato
+ biomasa →
+
extracelulares
∑S
+ X → ∑P
+
µ
neta
≡
( ) µ −
g
k d
≡
X: concentración másica de células (g/L)
t: tiempo (h)
1
X
dX
dt
mayor cantidad
de biomasa
nX
µ neta : Velocidad específica neta de crecimiento (h -1 )
µ g : Velocidad específica de crecimiento de biomasa (h -1 )
k d : constante de muerte celular o disminución de masa celular por
metabolismo endógeno (h -1 )

Cuantificación Cuantificaci n de la cinética cin tica de crecimiento: modelos cinéticos cin ticos
Descripción detallada debería involucrar diferenciaciones en la
estructura de la célula y la segregación del medio de cultivo en
unidades que pueden tener diferentes concentraciones y propiedades
físico-químicas modelos estructurados-segregados
Modelos Estructurados Tienden a representar la estructura de las
células. Pueden dividir la célula en sus componentes y considerar las
reacciones y cambio de metabolismo que tienen lugar en cada zona
de la célula, como respuesta a cambios en el medio.
Modelos Segregados Tienen en cuenta que el medio no es
homogéneo, permiten variaciones de concentraciones de biomasa y
de nutrientes y diferencias en las propiedades fisicoquímicas del
medio (viscosidad, densidad, pH, T, etc.). También permiten
considerar la posibilidad de agregación de células.

MAYOR COMPLEJIDAD
No estructurados
Segregados
No estructurados
No segregados
Estructurados
Segregados
Estructurados
No segregados
MAYOR CAPACIDAD DE REPRESENTAR LA REALIDAD
Son más
realistas, pero
son complejos y
demandantes de
tiempo de
cálculo.
El grado de realismo y complejidad de un modelo depende del
objetivo se debe elegir el modelo más simple capaz de
representar en forma adecuada al sistema que nos interesa.

Nos restringimos a los modelos No-estructurados/No-segregados
Modelos No-Estructurados Suponen una composición fija de
la célula (equivalente a suponer crecimiento balanceado).
-Son estrictamente válidos para la etapa de crecimiento
exponencial en batch
-No andan bien para transientes, salvo que la respuesta de la
célula sea rápida y/o las perturbaciones sean leves.
Modelos No-Segregados Consideran un medio homogéneo.
-Representan adecuadamente muchos casos.

Modelos cinéticos cin ticos de crecimiento: controlados por sustrato
Suponen que la cinética depende solamente de un único sustrato
esencial (por ej., glucosa). Los cambios en los otros sustratos no
afectan. Más difundido Modelo de Monod
µg(h -1 )
µ
g
=
K
µ
s
m
+
S
S
S (µM)
Supone que un único nico sistema
enzimático enzim tico controla el consumo de
sustrato y que dicho sistema
determina la velocidad de
crecimiento de biomasa. biomasa
La premisa es generalmente falsa,
pero la ecuación de Monod ajusta
una amplia gama de resultados
experimentales y es la expresión
más empleada para el diseño de
fermentadores.

µg(h -1 )
µ
g
=
K
µ
s
m
+
S
S
S (µM)
µ m: máxima velocidad específica
de crecimiento de biomasa
µ
g
=µ
m
cuando S>>
K
Ks: constante de saturación o de
velocidad media
µ = 1µ
cuando S=
K
Monod da buenos resultados para cultivos con baja velocidad de
crecimiento y baja densidad de células.
Para cultivos concentrados se usan expresiones similares,
modificando Ks: µ
g
=
K S
µ
S
0
m
0
S
+
S
o
g
2
µ
m
g
=
K
s
1
µ
+ K
m
s
0
S
S
0
s
+
s
S

Nociones de diseño dise o de fermentadores o biorreactores
•La elección del tipo de reactor y de la estrategia de operación define
la producción a obtener y la pureza del producto (número y tipo de
impurezas, reactivos sin convertir). También determina si se puede
lograr un producto de calidad constante y una operación confiable.
•En bioprocesos los reactores representan un gran % del capital.
Tipos de reactores comúnmente empleados
Discontinuos o batch: una vez que se carga, el proceso
ocurre sin ingreso de sustrato ni salida de productos.
Continuos (quimiostato): hay alimentacion
continua de sustrato y retiro continuo de productos
Semicontinuos (Fed-batch): hay ingreso
continuo o intermitente de sustratos, sin
retiro de productos.

Reactores discontinuos o batch
Producción de biomasa o de un producto asociado a crecimiento
(metabolito primario):
En un batch se observan 4 etapas:
1) Preparación para la nueva operación (limpieza, esterilización,
llenado del reactor)
2) Sembrado y período de inducción
3) Período de crecimiento exponencial
4) Recuperación del producto del reactor
La suma del tiempo involucrado en las etapas 1+2 y 4 es un tiempo
muerto, tm, a considerar en el diseño del reactor
varía con el tamaño del reactor y con el tipo de fermentación pero
generalmente es del orden de las horas (3–10 hs)
tiempo total de operación para llegar a una concentración final de
biomasa Xf :
1 ⎛ X ⎞
⎜ f
t = t + ln
⎟
c m µ ⎜ ⎟
neta ⎝
X0
⎠

La concentración final de biomasa, Xf , depende de la cantidad de
sustrato limitante del crecimiento y del rendimiento:
X X Y ( S S)
kg
f − 0 = X/
S 0 −
m3
La mayoría de las fermentaciones operan con una relación X f/X 0 de
aproximadamente 10–20. La velocidad de producción de biomasa
por operación del reactor batch, r b , se calcula dividiendo la masa
total que podemos formar por el tiempo que lleva la operación:
r
Y
S
X/
S 0
= b µ ln t
( 1/
) ( X X ) +
neta f 0 m
kg
m3s
Una operación en un quimiostato en condiciones óptimas conduce
a una producción significativamente superior. De todos modos, la
mayoría mayor a de las fermentaciones son procesos discontinuos.
discontinuos

Por qué?
• En muchos casos no interesa el producto asociado a crecimiento;
el crecimiento de las células puede incluso inhibir la producción
del producto deseado. En esos casos el producto deseado se genera
solo con velocidades de dilución muy bajas, muy por debajo de la
que lleva a la óptima productividad de biomasa.
Para producción producci n de metabolitos secundarios, la productividad
en un batch puede superar significativamente a la de un
quimiostato. quimiostato.
•Otra razón importante para que se prefiera la operación
discontinua es la inestabilidad genética. Los microorganismos que
se emplean suelen ser especies que han sido manipuladas y tienen
menor velocidad de crecimiento que las originales.
Un quimiostato impone una selección selecci n severa cuando hay
mezclas de cultivo, conduciendo a la cepa de mayor velocidad
de crecimiento.

Por qué?
•Otro factor a tener en cuenta es la operabilidad y la confiabilidad
de la operación. Los reactores batch conducen a productos con
mucha variabilidad genera problemas en las etapas de
purificación. Sin embargo en los sistemas continuos una falla
mecánica o de control de alguna variable de operación o de la
esterilización del proceso puede conducir a problemas severos.
Las consecuencias de una falla de operación operaci n son mas graves
en un sistema continuo y las pérdidas p rdidas mayores.
•La economía de mercado influye en la selección del reactor. Un
sistema continuo es un sistema dedicado a un dado proceso un
único producto.
Muchos productos de fermentaciones se requieren en pequeñas peque as
cantidades y su demanda es difícil dif cil de proyectar. Los sistemas
batch son más m s versátiles, vers tiles, el mismo reactor puede emplearse
para distintos productos.

Cultivos continuos se agrega un medio con nutrientes frescos en
forma continua, a un volumen de control que contiene las células.
Se retiran continuamente productos y parte de las células.
-Cuando se alcanza el estado estacionario, X, S y P permanecen
constantes en un dado punto del reactor.
-Los cultivos continuos proveen un medio de cultivo constante para
el crecimiento de las células y para la formación de productos
calidad calidad uniforme de los productos
-Pueden ser una herramienta importante para determinar como un
microorganismo responde al medio, y para generar un producto en
condiciones óptimas.
Sistemas con mezclado
Quimiostato perfecto: perfecto Tanques
Sistemas para
Turbidistato continuos idealmente
lograr cultivos
agitados (TCIA)
continuos
Flujo Pistón Ideal (FPI): mezclado radial
perfecto y mezclado axial nulo; nulo poco
empleado, salvo para inmovilizados

Quimiostato: el crecimiento de biomasa suele estar controlado
por un nutriente esencial y el resto se agrega en exceso. Las
condiciones químicas del medio son constantes.

Turbidistato: la concentración de células en el reactor se mantiene
constante. La alimentación se regula mediante el monitoreo de la
densidad óptica del cultivo. Se alimenta medio fresco cuando la
turbidez supera un límite prefijado. El volumen se mantiene constante
retirando una cantidad de fluido equivalente a la que se agrega.
•Se usa menos que el quimiostato porque es más elaborado y porque el
medio cambia.
•Puede ser muy útil
para seleccionar
subpoblaciones que
puedan soportar
condiciones de
stress, porque la
concentración de
células se mantiene
constante.

FPI (Flujo Pistón Ideal):
como no hay retromezclado,
los elementos de fluido con
células activas no pueden
inocular elementos de fluido
nuevos aguas arriba
se requiere el reciclo
continuo de células para
inoculación continua del
medio fresco alimentado.
L(+G,S)
L(+G,S)
•Un FPI es equivalente a un batch, en el cual la posición en el
reactor equivale a un dado tiempo en el reactor batch.
•Equipos con células inmovilizadas (trickling filters) se asemejan
a un FPI y no necesitan el reciclo, se usan extensamente en
tratamiento de efluentes.

Fotobiorreactor tubular helicoidal de
1000 L (Murdoch University, Australia)
Recuperación de microalgas a partir
del medio de cultivo por filtración
Cyanotech Corporation
(www.cyanotech.com), Hawaii, USA.

Cultivos continuos: Quimiostato ideal
Es un tanque agitado que se opera con circulación continua (TCIA)
del medio de cultivo. La mayoría requiere control (pH, T y C O2).
•Se alimenta medio estéril (X 0= 0) a un tanque perfectamente
agitado (y aireado si es fermentación aeróbica). Se deja salir la
suspensión de células para mantener las concentraciones y el
volumen de líquido constante.
Fv
S0, X0, P0 Burbujeo
de gas
Fv
S, X, P
Las concentraciones a la
salida del reactor son
iguales a las del interior
por la hipótesis de
mezclado perfecto
Volumen de líquido =
volumen de reactor = V

Balances de masa Ecuaciones de diseño
Planteando balances de masa para los distintos componentes, se
obtienen las ecuaciones de diseño.
⎛ Masa que ⎞ ⎛ Masa que ⎞ ⎛ Masa ⎞ ⎛ Masa ⎞ ⎛ Masa ⎞
⎜sale
del VC⎟
⎜ ⎟ ⎜ ⎟ ⎜ ⎟ ⎜ ⎟
−
entra al VC
⎟+
consumida
⎜
⎜ ⎟−
generada
⎟
⎜ ⎟=
acumulada
⎜ con los con los dentro del dentro del ⎜ dentro del ⎟
⎜ ⎟ ⎜ ⎟ ⎜ ⎟ ⎜ ⎟ ⎜ ⎟
⎝ productos ⎠ ⎝ reactivos ⎠ ⎝ V.C. ⎠ ⎝ V.C. ⎠ ⎝ V.C. ⎠
Si el volumen de control V.C. es un QUIMIOSTATO
Un quimiostato opera en estado estacionario se cancela el término
de acumulación de masa:
⎛Masa
que sale⎞
⎛Masa
que entra⎞
⎜ del V.C. con ⎟+
⎛Masa
consumida⎞
= ⎜
⎟+
⎛
⎞
⎜
⎟ al V.C. con
Masa generada
⎜
⎟
⎜
⎟ ⎝ dentro del V.C. ⎠ ⎜
⎟ ⎝dentro
del V.C. ⎠
⎝los
productos ⎠
⎝ los reactivos ⎠

Quimiostato - ecuaciones de diseño
⎛Masa
que sale⎞
⎛Masa
que entra⎞
⎜ del V.C. con ⎟+
⎛Masa
consumida⎞
+
⎛
⎞
⎜
⎟=
⎜ al V.C. con ⎟ Masa generada
⎜
⎟
⎜
⎟ ⎝
⎠ ⎜
⎟ ⎝
⎠
⎝los
productos
dentro del V.C.
dentro del V.C.
⎠
⎝ los reactivos ⎠
Fv
Fv Balance de masa de células:
S0, X0, P0 S, X, P
Gas
V
µ
F X=
F X + V
V V 0 X neta
⇒ F X=
F X ( + V µ −k
)X
Definiendo el factor de dilución como caudal/volumen: D = FV /V
⇒ ( DX=
DX + µ −k
)X
0 g d
Si se alimenta medio estéril (X0= 0) y
el mecanismo endógeno es despreciable
⇒ DX=
DX ( + µ −k
)X
0
g
d
V
V
0
F V: caudal volumétrico de medio
de cultivo agregado (L/h)
⇒
D
= µ
g
g
d

D =
µ g
Importancia de este resultado: En un quimiostato en
EE, alimentado con medio estéril y en condiciones
en las que el metabolismo endógeno es despreciable,
la velocidad o factor de dilución, D, iguala a la
velocidad de crecimiento de células
se puede manipular la velocidad de crecimiento como un parámetro
independiente modificando las variables de operación
el quimiostato es una herramienta experimental poderosa
Si la velocidad de crecimiento sigue la expresión de Monod
D=
µ
µ
S m = g K + S
s
S: concentración de sustrato limitante
del crecimiento de biomasa en EE
Si se impone un factor de dilución D > µ m , las células no se podrán
reproducir lo suficientemente rápido para mantenerse se lavan, o
se vacía el quimiostato (“washout”)

BM sustrato en estas condiciones (EE y sin metabolismo endógeno):
⎛Masa
que sale⎞
⎛Masa
que entra⎞
⎜ del V.C. con ⎟+
⎛Masa
consumida⎞
= ⎜
⎟+
⎛
⎞
⎜
⎟ al V.C. con
Masa generada
⎜
⎟
⎜
⎟ ⎝ dentro del V.C. ⎠ ⎜
⎟ ⎝dentro
del V.C. ⎠
⎝los
productos ⎠
⎝ los reactivos ⎠
1
1
F S + Vµ
X + Vq X =
V
g
P
Y
Y
M
X/
S
F V: caudal volumétrico de medio de cultivo agregado (L/h)
S: concentración de sustrato limitante del crecimiento (g/L)
V: volumen del reactor (L)
µ g: velocidad especifica de crecimiento de biomasa (1/h)
X: concentración de biomasa (g/L)
q P (gP/gcélulas/h): velocidad específica de productos extracelulares
Y M X/S (g células/gS) : máximo rendimiento de biomasa a partir de S
Y P/S (gP/gS) : rendimiento de producto extracelular a partir de S
P/
S
Formación de biomasa Formación de producto
F
V
S
0

Concentración másica de células en estas condiciones (EE y sin
metabolismo endógeno):
D
( S −S)
0
=
µ
X
Y
Como además µ g = D , si la formación de
g
M
X/
S
+
q
X
Y
M ( )
productos extracelulares es despreciable:
X = Y S −S
X/
S 0
Y
M
Estrictamente, X/
S depende de la concentración de sustrato y de la
velocidad de crecimiento, no es exactamente igual para cualquier S0 P
P/
S
La productividad en un fermentador continuo se
obtiene como el producto del factor de dilución por la
concentración de células, DX (g/Lh)

Productividad en un quimiostato, suponiendo válida Monod (EE sin
metabolismo endógeno ni formación de productos extracelulares): se obtiene del
producto del factor de dilución por la concentración de células, DX (g/Lh):
D=
µ
La velocidad de dilución que maximiza la producción de biomasa se obtiene
de derivar DX con respecto a D e igualar a cero:
D
X=
Y
g
=
µ
K
M
X/
S
s
=µ
( S −S)
S
⇒ S=
+ S
m
⎛
⎜1−
⎜
⎝
DK
m
K
−D
op( X)
m
s
K + S s 0
0
µ
s
⎞
⎟
⎟
⎠
⇒
DX
⎛
⎜DS
⎜
⎝
2 D Ks
−
µ −D
Normalmente K s

Reemplazando la expresión de D op en la ecuación que da la productividad
de biomasa DX:
DX
)
op
=
Y
M
X/
S
D
op
⎛
⎜S
⎜
⎝
0
D K op s
−
µ −D
m op
Se obtiene la máxima productividad de biomasa que se puede alcanzar en
un quimiostato en EE, sin metabolismo endógeno y sin formación de
productos extracelulares:
⎛ K ⎞
DX op
+
X/
S m⎜
0 s s s
K S ⎟
⎝
+ s 0 ⎠
) M
s
= Y µ ⎜1−
⎟ S + K − K ( K S )
Normalmente K s

Efecto del factor de dilución sobre la concentración de células,
concentración de sustrato y la productividad. D (1/h) S (kg/m 3) X (kg/m 3)
0.06 0.006 0.427
0.12 0.013 0.434
0.24 0.033 0.417
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
S (kg/m 3 )
X (kg/m 3 )
0 0.2 0.4 0.6 0.8
D (h -1 )
µ
m
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
S0
DX
(kg/h.m 0.3
3 )
0.2
0.1
0
0.31 0.04 0.438
0.43 0.064 0.422
0.53 0.102 0.427
0.6 0.122 0.434
0.66 0.153 0.422
0.69 0.17 0.43
0.71 0.221 0.39
0.73 0.21 0.352
0 0.2 0.4 0.6 D (h0.8 -1 )

Algunas aplicaciones de los sistemas continuos:
- producción de algunas proteínas
- tratamiento de efluentes, en particular cuando se emplean
microorganismos o enzimas inmovilizadas.
- producción de etanol
- producción de productos asociados a crecimiento,
especialmente en gran escala (por ejemplo, ácido
láctico)
Modificaciones de los sistemas continuos para emplearse en
bioprocesos
Quimiostato con reciclo
La generación de biomasa es “autocatalitica” mayor
concentracion de biomasa lleva a mayor velocidad de
crecimiento.
Para lograr en un quimiostato una concentración de biomasa
mayor, se pueden reingresar al reactor las células que salen.

Quimiostato con reciclo: el reciclo de células incrementa la
productividad y también la estabilidad en algunos sistemas, dado
que minimiza las perturbaciones (ej.: en tratamiento de efluentes,
muy sujeto generalmente a las variaciones en la alimentación).
αFv
S 1,cX 1,P 1
V
Gas
Fv
S0,X0,P0 Fv(1+α)
S 1,X 1,P 1
Fv
S1,X2,P1 α: relación de reciclo
basada en caudales
volumétricos.
c: factor de concentración
relación de la
concentración de
células en la corriente
de reciclo sobre la que
sale del reactor
Separador de células: puede ser
por filtración, centrifugación o
sedimentación

Balances de biomasa :
⎛ Masa que ⎞ ⎛ Masa que ⎞ ⎛ Masa ⎞ ⎛ Masa ⎞ ⎛ Masa ⎞
⎜sale
del VC⎟
⎜ ⎟ ⎜ ⎟ ⎜ ⎟ ⎜ ⎟
−
entra al VC
⎟+
consumida
⎜
⎜ ⎟−
generada
⎟
⎜ ⎟=
acumulada
⎜ con los con los dentro del dentro del ⎜ dentro del ⎟
⎜ ⎟ ⎜ ⎟ ⎜ ⎟ ⎜ ⎟ ⎜ ⎟
⎝ productos ⎠ ⎝ reactivos ⎠ ⎝ V.C. ⎠ ⎝ V.C. ⎠ ⎝ V.C. ⎠
( α)
F X − ( F X + αF
cX ) − V X = 0
1 V 1 V 0 V 1
neta 1
+ µ
µ
fresca reciclo
En EE: dX 1/dt = 0
y si se alimenta medio
estéril X 0=0 ⇒
neta
1
( 1+
α)
F X −(
F cX )
V X =
α
µ
neta
= D
V
1
( 1+
α−cα
)
V
αFv
S 1,cX 1,P 1
1
V
Gas
Fv
S0,X0,P0 Fv(1+α)
S 1,X 1,P 1
Fv
S1,X2,P1

αFv
S 1 ,cX 1 ,P 1
V
Gas
Fv
S0 ,X0 ,P0 Fv(1+α)
S 1 ,X 1 ,P 1
BM sustrato limitante (en EE):
Fv
S1 ,X2 ,P1 µ
neta
= D
[ 1+
α(
1−c)
]
Como c > 1 ⇒ α(1-c) < 0
neta < µ
D
Cuando hay reciclo, el
quimiostato puede operar con
una velocidad de dilución
mayor que la de crecimiento
⎛Masa
que sale⎞
⎛Masa
que entra⎞
⎜ del V.C. con ⎟+
⎛Masa
consumida⎞
= ⎜
⎟+
⎛
⎞
⎜
⎟ al V.C. con
Masa generada
⎜
⎟
⎜
⎟ ⎝ dentro del V.C. ⎠ ⎜
⎟ ⎝dentro
del V.C. ⎠
⎝los
productos ⎠
⎝ los reactivos ⎠
( 1 α)
F S + V X + Vq X = F S + αF
S
M
V 0 V 1
+ µ
V
1
g
1
1
Y
X/
S
P
1
1
Y
P/
S
Formación de biomasa Formación de producto

BM sustrato limitante
(en EE y en ausencia de productos extracelulares):
( 1 α)
F S + V X + Vq X = F S + αF
S
M
V 0 V 1
+ µ
V
1
⇒ Vµ
g
X
1
g
1
Y
⇒
= µ µ
1
M
X/
S
1
Y
=
X
X/
S
1
F
=
Si k 0⇒
= = D
d g neta
V
P
1
1
Y
P/
S
( S + αS
) −(
1+
α)
F S
0 1
V 1
D
µ
g
Y
M
X/
S
[ 1+
α(
1−c)
]
( S −S
)
0
1
M YX/
S X = 1 1+
α
( S −S
)
0
( 1-c)
La concentración de células en un quimiostato en EE con reciclo se
incrementa por el factor 1/[1+α(1-c)]
⇒
1

⇒
Si es válida Monod
y para k d=0
S=
µ
g
µ
S m = = µ
K + S
K [ 1+
α(
1-c)
] D
M
s
YX/
S X =
µ −[
1+
α(
1-c)
]D1
[ 1+
α(
1-c)
]
m
X 1,cr
X 1,sr
sin reciclo
Velocidad de
generación generaci n de
biomasa
c = 2 ; α = 0.5
s
con reciclo
neta
⎛
⎜S
⎜
⎝
0
−
= D
αFv
S 1,cX 1,P 1
[ 1+
α(
1−c)
] ⇒
[ ( ) ]
[ ( ) ] ⎟ 1+
α 1-c
D ⎞
− 1+
α 1-c
Ks
µ D
m
⎠
V
Gas
Fv
S0,X0,P0 Fv(1+α)
S 1,X 1,P 1
Fv
S1,X2,P1

Quimiostatos múltiples en cascada: en algunas fermentaciones,
particularmente para la producción de metabolitos secundarios (ej.:
un antibiótico), conviene separar las etapas de crecimiento de
biomasa y de formación del producto deseado pues las condiciones
óptimas son diferentes
con múltiples m ltiples quimiostatos, quimiostatos,
se pueden fijar condiciones
distintas en cada uno: pH, pH,
temperatura, conc. conc.
de nutrientes
por ejemplo, se pueden ajustar las condiciones para tener:
-Un primer tanque donde se promueva el crecimiento de biomasa
-Un segundo tanque donde se promueva la formación de producto(*)
(*) el crecimiento será desbalanceado y un modelo no-estructurado
no es el más apropiado. Los resultados serán aproximados.

Quimiostatos múltiples en cascada:
Primer quimiostato
S
K
=
µ
D
s 1
1 −D
m 1
1
M
X/
S
( S S )
X = Y −
0
1
Fv,S 0 ,X 0
X 1
S 1
V 1
Fv,X 1 ,S 1
X 2
S 2
Fv’,S 0 ’,X 0 ’
V 2
Fv,X 2 ,S 2
en EE, válido Monod y con metabolismo endógeno despreciable
Segundo quimiostato
BM de biomasa
dX2
F X − F X + V µ X = V = 0 en EE
V 1 V 2 2 neta,
2 2 2 dt
( ) ⎟ FV
X − X = µ X
2 1 neta,
2 2
V2
⎛ X ⎞
⇒ µ = ⎜ 1 D 1−
neta,
2 2⎜
⎝
X2
⎠
Como X 1 < X 2 ⇒ µ neta,2 < D 2

Ejemplo de aplicación de un sistema multietapa con agregado de una
corriente: cultivo de células modificadas por ingeniería genética
•En general se agregan promotores a los sistemas con células que
contienen ADN recombinante para inducir la producción de la
proteína de interés.
•La presencia del promotor favorece la producción de la proteína
pero reduce la velocidad de crecimiento de las células que contienen
plásmidos, respecto de las que lo han perdido.
un quimiostato de una única etapa tendrá problemas de
inestabilidad genética.
empleando un sistema de 2 etapas:
Primer quimiostato para producción de células (sin promotor)
Segundo quimiostato para producción de la proteína (c/promotor):
Se logra mantener la estabilidad genética por el continuo agregado
de células frescas.

Operación con alimentación semi-continua “Fed-batch”:
En este tipo de sistemas se agregan nutrientes frescos al fermentador
en forma continua o intermitente. Muy apropiado para mitigar
problemas de inhibición por sustrato
S0,X0,P X
0
Fv,S0 (X
f,Sf,Pf 0)
V 0
X 0,S 0,P 0
1)Carga
V
X,S,P
2)Realimentación
V f
Xf,Sf,Pf 3)Recuperación
del producto
1) Desde la carga hasta el momento de la realimentación periódica,
el sistema se comporta como un batch: X=
X M + Y S − S
X m es la máxima X a alcanzar con S 0 , que se da
cuando S

Operación con alimentación semi-continua “Fed-batch”:
Fv,S 0 (X 0 )
dX
dt
V
X,S,P
2)Realimentación
Cuando X ≅ X m , se agrega una corriente de
nutrientes frescos con un caudal volumétrico
Fv y de una concentración S 0. La variación de
volumen es:
dV
dt
Fv =
⇒
V V =
0 +
( Fv)
t
Durante la realimentación, el BM de biomasa
es:
d(
VX)
dX dV
F X + Vµ
X=
= V + X
V 0 neta dt dt dt
entra + se genera=
se acumula
F
X dV
dX
= X + µ X−
= DX + X µ
µ
0 neta
0 neta
V
V dt
dt
Como el sustrato se consume casi todo ⇒ dX/dt ≅ 0
(condición de estado cuasi-estacionario). Luego:
( −D)
⇒ ≅X(
D)
V − neta
neta ≅ µ
Como D ↓ porque ↑ V, µ neta va disminuyendo continuamente.
D

Operación con alimentación semi-continua “Fed-batch”:
Fv,S 0 (X 0 )
BM para el sustrato:
V gX
Vq X d(
VS)
F S
P
V 0 − − =
YM
Y dt
X/
S P/
S
V
X,S,P
2)Realimentación
Si no consideramos la formación de
productos y dado que la masa de sustrato
se mantiene siempre µ g ( XV)
baja y ≅ constante: FVS0
=
Y
µ
entra −
se consume
= se acumula
( XV)
d M
0 0 V 0 X/
S
( XV)
≅ F S Y ⇒ ( XV)
= X V + F S Y t
⇒
dt
= µ neta V 0
M
X/
S
(es igual en ausencia de metabolismo endógeno)
M
X/
S
Es decir, la masa de células generadas es linealmente proporcional
al tiempo, lo cual se observa experimentalmente en un fed-batch.

Operación con alimentación semi-continua “Fed-batch”:
Variación de las
concentraciones de
biomasa, sustrato y
producto, y de la
velocidad de
crecimiento y volumen
del cultivo en función
del tiempo, para el
primer ciclo de un
reactor alimentado
(fed-batch):
V (mL) 1000
X (g/L)
P (g/L)
800
600
400
200
0
V (mL)
X (g/L)
µ (h -1 )
P (g/L)
0.6
0.4
0.2
0 0.5 1 1.5 t 2(h)
µ (h -1 )
0

Sistemas con microorganismos inmovilizados: la inmovilización
de microorganismos tiene aplicación si los productos son
extracelulares
Ventajas sobre los cultivos con células en solución:
•Proveen una alta concentración de células
•Las células se usan en forma continua y se eliminan costosos
procesos de recuperación y reciclo de células
•Se eliminan el problema del “washout” a altas velocidades de
dilución
•Se pueden lograr altas productividades
•Se puede lograr un medio local favorable que conduce a mayores
rendimientos y una mejor performance del biocatalizador
•En algunos casos mejora la estabilidad genética
•En algunos casos disminuye el daño por abrasión de las células

Sistemas con microorganismos inmovilizados
Desventajas respecto de los cultivos en solución:
•El problema más grave es que no se pueden emplear para
productos que no sean excretados de las células
•La inmovilización generalmente conduce a problemas de
limitaciones por transferencia de masa
•El sistema se torna muy heterogéneo por las limitaciones de
transporte y es difícil de controlar
•Si las células están vivas, el crecimiento y la evolución de gases
ocasiona problemas y puede conducir a ruptura del soporte.
Los métodos de inmovilización son similares a los que se utilizan
para enzimas. Se complica con las células vivas.

Inmovilización
Activa: captura o unión de células por
métodos físicos o químicos
Pasiva: formación de biofilms, crecimiento
de múltiples capas de células sobre un
soporte sólido
•También se pueden emplear reactores de membrana, generalmente
tubulares (la estructura se asemeja a un intercambiador de calor de
carcasa y tubos). Los tubos son de una membrana semipermeable.
Las células se inoculan en la carcasa y el sustrato se bombea por los
tubos, a los cuales difunde el producto.
•Un buen soporte debe ser rígido y químicamente inerte; debe
contener a las células firmemente y tener alta capacidad.

Fermentadores: Equipos comúnmente empleados
•Tanques agitados
•Columnas de burbujeo
•Air-lift o reactor de arrastre
•Lechos rellenos
Esquema de un tanque agitado
H/D~1–2
H/D~3–6
Esquema de una
columna de burbujeo

Tanques agitados de escala
laboratorio

Tanques agitados de escala
laboratorio con células
inmobilizadas

Fermentadores comerciales de escala laboratorio (V ~ 2-20 2 20 litros)
Global Medical Instrumentation – http://www.gmi-inc.com

Fermentadores de escala banco-piloto banco piloto (V ~ 15-75 15 75 litros)

Fermentadores de
escala piloto
V ~ 100-1000 100 1000 litros

Biorreactor de
escala piloto

Planta piloto de bioprocesos

Esquema de un tanque
agitado de mayor escala

Variables que se controlan en un biorreactor industrial

Esquema de un fermentador
tipo tanque agitado de escala
industrial (100m 3 ).
H ~ 15 m de alto
D ~ 4,2 m de diámetro
Tiene líneas de vapor
para realizar la
esterilización in situ de
las válvulas, cañerías y
sellos. Se debe esterilizar
también el aire que
ingresa por filtración o
por calentamiento.

Biorreactor de
escala industrial

Reactor tanque industrial
-generalmente de acero inoxidable 316L SS, puede operar presurizado.
-debe minimizar zonas muertas y permitir la inserción de sensores
-relación de aspecto H/D=2.5–3.0 para crecimiento de bacterias porque
mejora la transferencia de oxígeno. Para células animales se usan tanques
de baja relación de aspecto H/D=1.5 para facilitar el mezclado
-se debe poder vaciar
totalmente
-si tiene menos de
500L pueden ser de
vidrio

Reactor tanque agitado: tipos de turbinas empleadas y efectos en la
agitación que inducen
Agitación inducida por turbinas
radiales del tipo Rushton
Agitación inducida por turbinas
axiales

Interior de un
tanque agitado

Reactor tanque agitado: efecto de los baffles
Los baffles mejoran notablemente la turbulencia, rompen los vórtices
que se forman por la agitación. Se los ubica levemente desplazados
de la pared para disminuir la formación de zonas estancas.

Reactor tanque agitado: efecto de los baffles en un reactor de 2L
400rpm – sin baffles 400rpm – con baffles
vórtice

Agitación y distribución de gas en reactores agitados
•La determinación de la velocidad de transferencia de oxígeno y el
calor liberado son claves para el diseño de los fermentadores.
•La velocidad de transferencia de O 2 depende de la dispersión de gas,
que es función del tipo de reactor; ej: en tanques agitados, aumenta al
aumentar la velocidad de agitación.
> RPM

Influencia de la velocidad de agitación sobre la turbulencia y la
dispersión de gas inducida por agitación mecánica en un reactor
de laboratorio de 2L.
300 rpm 450 rpm 750 rpm

Fracción gaseosa (adimensional)
Reactor agitado en
suspensión de escala
banco: 20cm de
diámetro y de alto
(volumen ~ 8L)
Tomografía de una sección del
reactor agitado.
Jets gaseosos de los inyectores de gas
Perfil de velocidades (cm/s) del líquido
en un reactor gas-líquido agitado. Se
observa la formación del vórtice
característico de las turbinas radiales.

Reactor tanque agitado:
Problemas ocasionados por
la evolución de espuma:
-peligro de contaminación
-complica la circulación de
gases
vórtice
-complica el mezclado
-cambian las velocidades
de transferencia masa y de
calor

Configuraciones comunes de fermentadores: columnas de burbujeo
Columna de burbujeo de escala banco: V~10L

Columnas de burbujeo
Regímenes de flujo en columnas de
burbujeo: depende del caudal de gas y del
distribuidor que se emplee

Columnas de burbujeo para el
cultivo de algas

Configuraciones comunes de fermentadores
Configuraciones de recirculación interna inducida por el flujo de
aire “Air-lift”
Air-lift con
inserción de
aire en el
tubo central
Air-lift con inserción
de aire en el anillo y
mezclado en el tubo
central
Air-lift con inserción de aire en
el tubo central y recirculación
inducida

Reactor air-lift de
laboratorio con entrada de
aire en el anillo circular
Zona donde se produce la
separación entre el gas que se
libera hacia el exterior del
reactor y el líquido que recircula
Riser: zona donde se hace la
inyección de aire, el flujo es
ascendente y contiene burbujas
Downcomer: zona donde el líquido
desciende, a lo sumo tiene pequeñas
burbujas disueltas

Air-lift vertical con mezclado en el tubo central: perfiles
de velocidades, energía cinética y tensión de deformación
Escala
banco
(0,2 x 2)m
Shear Stress Kinetic Energy

Reactor de tipo air-lift circulante

Airlifts de forma
triangular para el
cultivo de algas
(planta piloto de
cogeneración de
energía del MIT)

Configuraciones comunes de fermentadores
Reactores de lecho fijo – uso frecuente en tratamiento de efluentes y
en producciones dedicadas
Reactores trickle-beds o de lecho a goteo
Cocorriente Contracorriente
Columnas de burbujeo
rellenas

Inmovilización pasiva (biofilms):
Los biofilms son grupos de células que crecen en multicapas
sobre soportes sólidos.
•El soporte puede ser inerte o biológicamente activo.
•La formación de biofilms es común en equipos de fermentación
industriales (ej: tratamiento de efluentes y fermentaciones de hongos).
• La interacción entre las células y el soporte puede ser muy compleja.
•Los biofilms presentan ventajas y desventajas similares a las de los
sistemas de microorganismos inmovilizados en forma activa.
•Las condiciones dentro de un biofilm grueso varían con la posición y
afectan la fisiología de las células porque los nutrientes difunden
hacia el interior del film y los productos hacia fuera.
•El espesor del biofilm afecta la performance: biofilms muy finos van
a dar baja velocidad de crecimiento por la baja concentración de
biomasa y los muy gruesos tienen problemas difusionales, que pueden
ser o no un inconveniente, dependiendo de lo que se quiera lograr.
Normalmente existe un espesor de film optimo para el crecimiento de
biomasa y otro para la formación de productos.

Estrategias de escalado:
-Multiplicación
-Reglas de uso
-Análisis del régimen
y escalado hacia menor
tamaño
La multiplicación implica
replicar muchas veces el
resultado que se obtiene
en un reactor de escala
relativamente pequeña, en
lugar de llevar a cabo el
proceso en un reactor de
mayor tamaño.

Producción de ácido glucónico

Producción de gluconato de sodio con A. niger

Producción de antibiótico

Producción de lisina (10000 ton/año)
en 20 fermentadores de 250 m 3

Drogas medicinales

Reglas de uso : basadas en análisis dimensional y criterios de
similaridad de algunos parámetros
% de uso en la industria Criterio de escalado
30 Potencia/Volumen
30 k La LG
20 Velocidad en la punta del agitador
20 Concentración de oxígeno
Otras: velocidad (rpm) del agitador o impeler; diámetro del
agitador; caudal desplazado por el impeler; caudal desplazado
por el impeler, por unidad de volumen; numero de Reynolds

Análisis del régimen
y escalado hacia
menor tamaño
La concentración de
oxígeno es diferente en
distintas zonas del
reactor. Se puede simular
considerando varios
reactores con distinta
alimentación de oxígeno

Modelo del sistema que supone
dos compartimientos con distinta
concentración de oxigeno