Sistema BAX Q7: la PCR sencilla y robusta, diseñada para las ...

The world leader in serving science
Sistema BAX Q7
la PCR diseñada para las necesidades
de la industria alimentaria y
laboratorios de referencia y control
oficial

•E.coli O157:H7
•E.coli O157:H7 MP
•STEC
•Listeria sp
•Listeria monocytogenes
•Salmonella
•Enterobacter sakazakii
•Campylobacter sp
•Yeast & Mould Direct
•Yeast & Mould Enriched
•Campylobacter Enumeration
and Differentation
Dedicados a las Soluciones en Microbiología
Itziar Olea
2

Necesidades en el laboratorio de seguridad alimentaria
Necesidades
Lab Público
3
Contract
Lab
Usar solo métodos validados √√√ √√√ √
Acreditación 17025 √√√ √√√
Resultados en tests
√√√ √√√ √
interlaboratorio
Industria
alimentaria
Resultados en menor tiempo √ √√ √√
Precio competitivo √ √√√ √√√
Innovación √ √ √
Requerimientos de los países
importadores (USA, Rusia...)
√√√
√√√

Laboratorio de control oficial Unión Europea
Laboratorios de control oficial en la Unión Europea
Muestra de control oficial :
Existe la tendencia hacia la aplicación estricta de la normas
internacionales ISO y los criterios establecidos desde el
Laboratorio Europeo de Referencia correspondiente
Muestras prospectivas :
Empleo de la técnica de elección validada por el propio
laboratorio
4

Food Safety and Inspection Services - USDA
FSIS (Food Safety and Inspection Services U.S.
Department of Agriculture (USDA), Public health
regulatory agency) inspecciones internas y de las
importaciones de productos cárnicos, de aves de corral
y huevos.
• Realizan un revisión de la documentación exigida a los países
exportadores de carne y realizan análisis pertinentes
(reinspecciones).
5

Comercio Internacional
USA
USDA tiene certificadas para exportación 13
plantas de carne de porcino cruda y procesada
• Para USDA-FSIS la autoridad central competente es el
Ministerio de Sanidad. FSIS USDA lleva a cabo auditorías del
sistema de seguridad alimentaria en España en el sector
cárnico que implica todos los niveles de producción y
supervisión.
6

Comercio Internacional
USA
Requerimientos para laboratorios oficiales y de
autocontrol análisis de Salmonella y Listeria en el marco
de la exportación de carne y productos cárnicos a USA.
• Los análisis de salmonela y listeria sobre carnes susceptibles de ser
exportadas al mercado estadounidense son una exigencia del
Departamento de Agricultura de Estados Unidos (USDA), y según sus
disposiciones normativas, los laboratorios que realicen estos
análisis deben aplicar directamente los métodos autorizados por
el FSIS u otros métodos reconocidos como equivalentes. Esto
implica que deben estar científicamente validados y aprobados o
adoptados por una organización reconocida internacionalmente, y
deben garantizar el mismo nivel de protección de la salud pública que
los métodos aprobados por el propio FSIS.
7

Métodos oficiales que incluyen la técnica del Sistema BAX® de
Qualicon de Listeria monocytogenes y de Salmonella
USDA-FSIS nº MLG 4C.02
• Procedimiento FSIS del uso de la PCR como “screening” de
Salmonella en carne cruda, esponjas de toma de muestras en
canales, lavados de canales de pollo, carne lista para comer,
productos avícolas y huevo pasterizado
USDA-FSIS nº MLG 8A.03
• Procedimiento FSIS del uso de la PCR como “screening” de Listeria
monocytogenes en carne procesada, pollo, huevo líquido
pasterizado y esponjas ambientales.
• Ausencia de Listeria monocytogenes
8

Comercio Internacional
USA
Laboratorios de control oficial para productos cárnicos a exportar a
U.S.A, análisis de patógenos.
AESA (Agencia Española de Seguridad Alimentaria)
Productos cárnicos a exportar a U.S.A, análisis de patógenos.
Agencia de Protección de Salud de Girona
Laboratorio de Salud Pública de Valencia
9

Reglamento (CE) nº 2073/2005 Criterios
microbiológicos aplicables a productos alimenticios
10

Reglamento (CE) nº 2073/2005 Criterios
microbiológicos aplicables a productos alimenticios
Criterios de higiene de procesos
11

Reglamento (CE) nº 2073/2005 Criterios
microbiológicos aplicables a productos alimenticios
Criterios de seguridad alimentaria
Por consiguiente, procede añadir la sal de cocina en la nota 4 del capítulo 1 del anexo I del Reglamento (CE) no
2073/2005, en la que se enumeran los alimentos listos para el consumo en los cuales no es útil realizar pruebas
regulares en lo que respecta a L. monocytogenes.
12

Reglamento (CE) nº 2073/2005 Criterios
microbiológicos aplicables a productos alimenticios
13

GUIDELINES FOR THE CONTROL OF CAMPYLOBACTER AND SALMONELLA IN CHICKEN
MEAT-Codex Alimentarius International Food Standards
CAC/GL 78-20 CAC/GL 78-2011 Codex Alimentarius
Las posibles medidas de control específicas de Salmonella y Campylobacter,
están representadas en las categorías siguientes:
• Basadas en las buenas prácticas de higiene (BPH).
Naturaleza cualitativa y están basadas en el conocimiento científico empírico y
la experiencia. Normalmente son obligatorias y pueden diferir
considerablemente de país a país.
• Basadas en el peligro.
Elaboradas a partir del conocimiento científico del nivel de un control probable
del peligro en un paso (o serie de pasos) en la cadena alimentaria, cuentan con
una base cuantitativa en la prevalencia y/o concentración de Campylobacter o
Salmonella y pueden ser validadas para medir su eficacia en el control del
peligro en dicho paso. El beneficio de una medida de control basada en el
peligro no puede ser determinado exactamente sin una evaluación de riesgos
específica; sin embargo, se espera que cualquier reducción significativa en la
prevalencia y/o concentración del germen patógeno proporcione un beneficio
significativo para la salud humana
14

GUIDELINES FOR THE CONTROL OF CAMPYLOBACTER AND SALMONELLA IN CHICKEN
MEAT
CAC/GL 78-20 CAC/GL 78-2011
8.9.2 Medidas de control basadas en el peligro
Para Campylobacter
Se ha demostrado que el uso de mosquiteros (mallas) para
reducir o eliminar la infestación de moscas en los gallineros de
pollos de engorde disminuye el porcentaje de las parvadas
positivas a Campylobacter spp. de 51.4% a 15.4%.
8.11.1 Medidas de control basadas en las BPH
Para Campylobacter y Salmonella
Todas las cajas y módulos involucrados en el transporte de las
aves vivas deberían ser limpiados, desinfectados y estar secos,
lo más que sea posible, antes de volverse a usar.
15

GUIDELINES FOR THE CONTROL OF CAMPYLOBACTER AND SALMONELLA IN CHICKEN
MEAT
CAC/GL 78-20 CAC/GL 78-2011
9.5.2 Medidas de control basadas en el peligro
Para Campylobacter
Se ha demostrado que los sistemas de lavado de canales que
usan de 1 a 3 lavados con agua con un cloro total de 25 a 35
ppm, reducen los niveles de Campylobacter cerca de un 0.5
log 10 UFC/ml de enjuague de una muestra de canal entera. Los
sistemas de rocío post lavado que usan clorito de sodio
acidificado (CSA) o TFS podrían reducir aún más los niveles de
Campylobacter hasta un promedio de 1.3 log 10 UFC/ml o de 1.0
log 10 UFC/ml de enjuague de muestra de canal entera,
respectivamente.
16

GUIDELINES FOR THE CONTROL OF CAMPYLOBACTER AND SALMONELLA IN CHICKEN
MEAT
CAC/GL 78-20 CAC/GL 78-2011
9.5.2 Medidas de control basadas en el peligro
Para Salmonella
Se ha demostrado que el lavado interno y externo usando un
rociador con agua clorada con una concentración de entre 20 y
50 ppm reduce la prevalencia de canales de pollos de engorde
positivos para Salmonella entre un 25% y un 20%. Un segundo
lavado interno y externo después del primero resultó en una
reducción de las canales de pollos de engorde positivos para
Salmonella de entre un 12 y 16%
17

El Departamento de Agricultura de los Estados Unidos: Julio 2011 nuevos
estándares de funcionamiento para la reducción de la prevalencia de las
bacterias Salmonella y Campylobacter en pollos (broiles) y pavos, dando
cumplimiento a una recomendación clave del Grupo de Trabajo de Inocuidad
de los Alimentos (Food Safety Working Group).
El Servicio de Inspección y Seguridad Alimentaría (FSIS) publicó una guía
para ayudar y direccionar a la industria avícola en el cumplimiento de los
nuevos estándares de Salmonella y Campylobacter y una guía para
reducir la contaminación del ganado con Escherichia coli O157: H7.
Las normas son las primeras para Campylobacter y marcan la primera
revisión para los estándares de Salmonella en pollos y pavos.
18

USDA FSIS — Nuevos estándares de funcionamiento para la
reducción de la prevalencia de Campylobacter
Guía consiste en el análisis de 51 lenjuagues de canales. Cada muestra se analiza mediante dos
métodos:
• Método directo que detecta altos niveles de contaminación
• Método con enriqueciemiento del caldo que detecta nivels bajos de contaminación
Método Nivel de
detección
Directo
(cuantitativo)
Enriquecimiento
(cualitativo)
Altos
niveles
Bajos
niveles
Número
de
muestras
51
19
Tamaño de
la muestra
Resultado
aceptable
1 mL No más de 8
positivos
Campylobacter
30 mL No más de 19-
27 positivos
Campylobacter
De las 51 muetras no pueden dar más de 27 positivos en total. Debido a que es un nuevo programa después
de que el 90% de las plantas de broilers hayan cumplido dos sets se estableceran categoría

Adoptado en 2007; Anexos II y III adoptados en 2009 Codex Alimentarius
DIRECTRICES SOBRE LA APLICACIÓN DE PRINCIPIOS GENERALES DE HIGIENE DE LOS
ALIMENTOS PARA EL CONTROL DE LISTERIA MONOCYTOGENES
EN LOS ALIMENTOS CAC/GL 61 – 2007
Aumentar la frecuencia de muestreo ambiental como consecuencia de la detección
de Listeria spp. y/o L. monocytogenes en las muestras ambientales. Ello dependerá
de la importancia de los hallazgos (p. ej., L. monocytogenes y un riesgo de
contaminación directa del producto).
Instrumentos y técnicas de muestreo
Adaptar el tipo de instrumentos y técnicas de muestreo al tipo de superficies y
lugares de muestreo.
Esponjas para el muestreo de grandes superficies planas
Hisopos pueden ser más apropiados para las grietas y las hendiduras
Espátulas para los residuos duros.
.
20

Adoptado en 2007; Anexos II y III adoptados en 2009 Codex Alimentarius
DIRECTRICES SOBRE LA APLICACIÓN DE PRINCIPIOS GENERALES DE HIGIENE DE LOS
ALIMENTOS PARA EL CONTROL DE LISTERIA MONOCYTOGENES
EN LOS ALIMENTOS CAC/GL 61 – 2007
Métodos de análisis
Los métodos de análisis utilizados para L. monocytogenes:
características de las muestras ambientales, sensibilidad aceptable.
La obtención de “huellas genéticas” de las cepas mediante una o más técnicas
genéticas disponibles (p. ej.,electroforesis en gel de campo pulsante, ribotipado,
etc.) puede proporcionar información muy útil respecto a las fuentes de
L. monocytogenes y a las vías que conducen a la contaminación de los alimentos.
21

Actuación en caso de resultados positivos
El programa de vigilancia tiene por objeto descubrir si L. monocytogenes . Los
fabricantes deberían prever encontrarlos ocasionalmente en el ambiente de
elaboración (obrador). Se debería diseñar y establecer, por lo tanto, un plan de
acción apropiado para responder debidamente a los resultados positivos. Se
debería considerar la conveniencia de realizar un estudio de los
procedimientos y controles de higiene.
El fabricante debería reaccionar en cada caso de resultado positivo; la
naturaleza de la reacción dependerá de las probabilidades de contaminación
del producto y del uso previsto de los productos.
El plan debería determinar la medida específica que se debería tomar y la
justificación correspondiente, lo cual podría abarcar desde ninguna medida (no
hay riesgo de recontaminación), la intensificación de la limpieza, el rastreo de
fuentes de contaminación específicas (aumento de pruebas ambientales), la
revisión de las prácticas de higiene hasta la retención y evaluación del
producto.
22

Requerimientos higiénicos de seguridad de productos
alimenticios
23

PCR en Laboratorios de Inspección (I)
AQSIQ (The General Administration of Quality, Supervision,
Inspection and Quarantine, de la República Popular China):
• Especifica: el Sistema Bax como método oficial para la
detección de patógenos en las importaciones y exportaciones
de alimentos para Salmonella, Listeria monocytogenes , E. coli
O157, Campylobacter jejuni y Enterobacter sakazakii).
24

Aprobaciones, adopciones y certificados BAX®
AOAC International Official Method
Salmonella #2003.09; L. monocytogenes #2003.12
AOAC-RI Performance Tested Method – includes Q7
Salmonella #100201; Listeria monocytogenes #070202; E. coli O157:H7 #010401; E. coli O157:H7 MP #050501; Genus Listeria
#030502; Campylobacter jejuni/coli/lari #040702; Staphylococcus aureus #120701; Reverse-Transcriptase PCR Listeria species
#030801
USDA-FSIS Adoption
Salmonella #MLG 4C.00; Listeria monocytogenes #MLG 8A.03; E. coli O157:H7 and E. coli O157:NM #MLG 5A.00 – MP assay
USDA-APHIS NPIP Approval
Salmonella
Health Canada Certification – includes Q7
Salmonella #MFLP-29; Listeria monocytogenes #MFLP-28; Genus Listeria #MFLP-15e; E. coli O157:H7 #MFLP-30; E. coli
O157:H7 MP –Supp #2 to MFLP-30; Enterobacter sakazakii #MFLP-27
AFNOR Approval – includes Q7
Salmonella #QUA 18/3-11/02; E. coli O157:H7 MP #QUA 18/04-03/08; Listeria monocytogenes 24E #QUA 18/05-07/08;
Genus Listeria 24E #QUA 18/06-07/08
Danish Veterinary and Food Administration – includes Q7
Salmonella
NordVal – includes Q7
Salmonella #30
Brazil MAPA Official Reference Method
Salmonella MLG-4C.01; Listeria MLG-8A.01
Japanese Ministry of Health, Labour and Welfare
Listeria; Listeria monocytogenes
People’s Republic of China AQSIQ
Standard SN/T1869-2007 – includes Salmonella; E. coli O157:H7 MP; Listeria monocytogenes; Campylobacter jejuni/coli/lari;
Enterobacter sakazakii
Russian Federal Consumer Rights and Human Health Control Service (Rospotrebnadzor)
Standard #02.036-208 – includes Salmonella; Campylobacter jejuni/coli/lari; Genus Listeria; Listeria monocytogenes;
E. coli O157:H7
25

¿Por qué emplear la PCR? (I)
Velocidad: La PCR puede ahorrarles al menos 2 días con
respectos a métodos más tradicionales.
Los kits de detección de Listeria monocytogenes y Listeria spp por
y Staphylococcus aureus PCR del Sistema Bax ofrecen un tiempo
de ensayo mínimo. Por lo general, permiten obtener un resultado al
día siguiente.
26

Confianza:
¿Por qué emplear la PCR? (II)
Proporcionan una sensibilidad y especificidad superior al 98%, lo
que reduce la necesidad de un gran número de pruebas de
confirmación.
Sistemas validados y adoptados por Laboratorios de inspección y
rutina de referencia
27

Inclusión de un control interno de amplificación por muestra
28

Real Time E.coli O157
29

Automatización
¿Por qué emplear la PCR? (III)
Cada turno de trabajo puede iniciar y finalizar sus propias
muestras
Técnica simplificada, con mínima manipulación por parte del
técnico
30

Probabilidad de detección por PCR en la presencia de un
control interno de amplificación
31

Ensayos BAX® son sensibles.
Salmonella 1E4 cfu/ml e. primario
E. coli O157:H7 1E5 cfu/ml enriquecimiento
E. coli O157:H7(MP assay with 20 ul sample) 1E4 cfu/ml enriquecimiento
Real-Time E. coli O157:H7 1E4 cfu/ml enriquecimiento
Listeria monocytogenes 1E5 cfu/ml enriquecimiento
Listeria monocytogenes 24E 1E4 cfu/ml enriquecimiento
Genus Listeria 1E5 cfu/ml enriquecimiento
Genus Listeria 24E 1E4 cfu/ml enriquecimiento
Reverse-Transcriptase Listeria species

Matriz alimentaria
Industria Alimentaria vs PCR
Industria
•Rápida
•Sencilla
•Fiable
•Reproducible
•Sensible
34
Técnica de PCR

Productos Lácteos
Leche desnatada en polvo, leche en polvo entera, leche líquida
(cruda/entera/semidesnatada/desnatada), condensada,
evapoprada, crema ácida, queso rallado, fórmulas infantiles,
queso en crema, pudding (arroz/tapioca), quesos
(cheddar/american/camembert/blue/cabra/limburger),
helados, mantequilla y postres con derivs. lácteos y
huevos, etc
Carne
Pollo,pavo, cerdo, vaca, cordero, embutidos, fiambres,
vísceras, muestras ambientales, etc
Pescados
Salmón, gambas,ensalada de atún, bacalao, palitos de
cangrejo, ensalada marinera, carne de cangrejo, etc.
Chocolate
Chocolate a la taza, postres a base de chocolate, capuccino,
chocolate en tableta, cacao, batidos de chocolate , chocolate
en polvo, etc
Matrices
35
Especias
Cebolla, cominos, pimienta, ajo, chili, eneldo, tomillo,
albahaca, orégano, romero, canela, mostaza en grano, etc
Frutas/Vegetales/Ensaladas
Manzana, melón, uvas, brotes, ensalada de
patata,ensalada de col, zumo de frutas, semillas de
rábano, etc
Granos
Harina de trigo, harina integral, cereales varios, arroz,
tallarines, frutos secos (cacahuetes/almendras/nueces),
harina de maiz, pipas de girasol, germen de trigo, harina de
soja, etc
Otros
Salsas y sopas deshidratadas, mantequilla de cacahuete,
saborizantes y potenciadores de sabor, pasas, cremas no
lácteas, polvos para te frío, pastelería variada, granos de
café, carragenatos, café instantáneo, etc.
Muestras especiales: cosméticos y heces de animales

BAX® System PCR Assays for Screening
Available today:
Salmonella
RT- STEC
E. coli O157:H7 MP (multiplex)
Listeria monocytogenes 24 horas (validado AFNOR)
Listeria monocytogenes 48 horas (AOAC-OMA)
Genus Listeria 24 y 48 horas
Enterobacter sakazakii
Yeast and mold
Real-Time Campylobacter jejuni/coli/lari
Real-Time Vibrio cholerae/ parahaemolyticus/vulnificus
Real-Time Staphylococcus aureus
Real-Time Salmonella
36
Cada kit contiene 96 tests:
• PCR tubos con tabletas
• Tapas ópticas
• Reactivos de lisis

Enriquecimiento
Lisis
Hidratación
Amplificación de DNA
Detección
Resultados
Proceso del Sistema BAX
37
Compatible con las metodologías
habituales
Los reactivos listos para su uso y
las tabletas de PCR, simplifican
el proceso, haciéndolo excepcionalmente
fácil de usar
Pasos totalmente automatizados que
conducen a resultados precisos y de fácil
interpretación

Preparación de la muestra: “extracción”
1-Adición de solución de Proteasa
a la muestra enriquecida
38

Preparación de la Muestra : “extracción”
Preparación de la solución de proteasa
39

Preparación de la muestra :”extracción”
y 2- Calentamiento
1º calentamiento
20 minutos a 37°C (Salmonella, E.coli O157:H7, Enterobacter sakazakii,
Campylobacter coli/jejuni/lari, Mohos y Levaduras)
60 minutos a 55°C (L. monocytogenes, Listeria spp)
2º calentamiento 10 minutos a 95°C (común)
Enfriar 5 minutos en bloque frío (común)
40

Ventajas de la lisis del sistema BAX
•El protocolo MAS FÁCIL para obtención del DNA
•Mínimo número de pasos y manipulación
•Preparación de muestras estandarizada y común para
todas las matrices alimentarias y dianas
•NO NECESITA CUANTIFICAR EL DNA (no necesita
espectrofotometro, ni centrifugas)
41

Inicialización del sistema (común)
42

Creación de una plantilla
Introducir información de las muestras.
43

Elección de la diana
Creación de una plantilla
44

TODO incluido en el paquete inicial
-Instalación
-Entrenamiento práctico EN las instalaciones del cliente
45

Calentamiento del Termociclador/Detector
Seleccionar “Operation > Run Full Process” en la barra del menú …
…o haga “click” sobre el icono “Full Process” en la barra de herramientas
Un simple paso para todo tipo de determinación
46

Ventajas de la inicialización del A-BAX
•Gran capacidad de carga, desde 1 hasta 96
muestras
•Simplicidad del procedimiento de entrada de datos
•Procesa distintos patógenos diana en el mismo
ciclo de amplificación/detección
•Un sola forma de iniciación al programa para
todas las determinaciones
47

Hidratación de las tabletas de PCR
(común)
48
TODOS los
componentes de la
reacción PCR

con TODOS los reactivos necesarios
para la reacción de amplificación y
detección contenidos en una tableta
49
La única PCR
estable y de larga caducidad

Ventajas
•Control de inventario y almacenamiento simplificado
•Simplicidad de protocolo
•“Robustez” de los reactivos
•Minimización de errores
•Ahorro de tiempo
50

Ventajas
:: Cada turno de trabajo puede iniciar y finalizar sus
propias muestras
:: Los tecnicos emplean para 96 muestras un máximo de
45 minutos de manipulación en comparación a las 3 horas
de manipulación de otras PCR.
51

Cargar las muestras en el termociclador
52

“Status” del proceso (seguimiento en pantalla)
53

Finalización
54

Tiempo
3 horas 30 minutos
Resultados
(SYBR Green) (Presencia/Ausencia)
60 minutos
(en “Real Time”)
Facilidad de interpretación
55

Resultados “screening” de patógenos
Los resultados aparecen en pantalla
Negativo
Positivo
Resultados claros, sencillos, sin necesidad de interpretación
56

DETECCIÓN, CUANTIFICACIÓN y
DIFERENCIACIÓN
●Campylobacter jejuni/coli/lari
NordVal has certified the BAX® System for detecting Campylobacter
jejuni/coli/lari in chicken cloacae swabs.
NordVal Certificate #39 (http://www.nmkl.org/NordVal/Sertifikater/NordVal39-09.pdf)
57

BAX® System Real-Time PCR Assay for Campylobacter
jejuni/coli/lari
Detecta y cuantifica las tres
especies en la misma muestra
• Proporciona cfu/ml para cada especie
• Resultado día siguiente en muestras enriquecidas
(vs. 3-5 días en cultivo)
• Ensayo directo en muestras muy contaminadas (2.5
hr TTR)
• Validado en lavados de canales y productos listos
para consumo
• Sensibilidad 10 4 cfu/ml
• Muy buena inclusividad y exclusividad
58

BAX® System Real-Time PCR Assay for Campylobacter
jejuni/coli/lari : preparación de la muestra
• Productos procesados
• Preparar dilución 1:10 de la muestra en
caldo Bolton con suplemento y sin sangre.
• Incubar en microaerofilia a 42°C for 24-48
hours.
59

BAX® System Real-Time PCR Assay for Campylobacter
jejuni/coli/lari : preparación de la muestra
• Lavados de canales
• Enjuague de canales en 400 ml de agua de peptona
tamponada
• Añadir 30 ml del enjuague a30 ml del bolton doble
concentración con suplemento
• Incubar en condiciopnes de microaerofilia 42°C for 24-
48 hours.
Muestras muy contaminadas, sin enriquecimiento
• Enjuagar la canal con 400 ml de APT y proceder con la lisis
60

Resultados cuantitativos y especiación en 70 minutos
61

Sistema BAX® 24E Listeria monocytogenes & Listeria spp.
• Caldo único de enriquecimiento: 24 LEB
• Enriquecimiento de 24-28 horas
• Validación AFNOR and AOAC-RI
• Tiempo para el resultado de 29 horas
• Sensibilidad 10 4 cfu/ml
• Validación muestras ambientales “Stomach” esponja con 90 mL
temperatura ambiente 24 LEB. Incubar a 37°C, 24-28 horas.
62

Sistema BAX® 24E Listeria monocytogenes & Listeria spp.
Pasos adicionales BAX® Listeria 24E
Tipo de muestra
Si la muestra incluye el tampón 24 LEB (bacterias acido
lácticas), agitar la bolsa sin filtro y dejar que las
partículas sedimenten antes de transferir la muestra
enriquecida al tubo cluster
63
Tampón 24 LEB
24E Listeria
Genus assay
24E L. mono
assay
Pescado ahumado
Charcutería cocinada optional optional
Charcutería cruda optional
Otras matrices

Sistema BAX® 24E Listeria Genus Listeria
64

BAX® System Real-Time PCR para
Staphylococcus aureus
• Validado en carne de vacuno picada y fórmulas infantiles
• Detecta presencia/ausencia (1 cfu/10g)
• Valor umbral (10 cfu/g) en muestras diluidas
• Resultados en 24 horas (vs. más de 2 días por cultivo)
• Proceso en tiempo real en 90 minutos
• Excelente inclusividad/exclusividad
65

Tecnologías – Ensayos BAX Q7
SYBR Green – intercala en DNAs de doble
cadena
• Anális de las curvas de fusión
• Resultados positivos o negativos (presencia/ausencia)
• Ensayos robustos
• Salmonella, E. coli O157:H7 MP, Listeria Genus, L. mono, M&L, C.
sakazakii
Real Time PCR – emplea sondas fluorescentes
• 5 canales de fluorocromos permite el empleo de varias sondas en un mismo
ensayo
• Cualitativo y cuantitativo
• C. coli/jejuni/lari, S. aureus, Vibrio vulnificus/parahaemolyticus/cholerae,
E. coli O157:H7, Salmonella spp
66

SYBR GREEN ANALISIS DE CURVA DE FUSION
Debido al incremento de
temperatura
67
DNA se
desnaturaliza
Tm

Standard PCR assays
Algoritmos que transforman curvas de disociación
Raw
Data
Processed
Data
68

Standard PCR assays
Resultado positivo o negativo
69

Review results – Standard, 24E and Reverse-Transcriptase PCR assays
Use rack view for overall data
All results display in grid.
Negative
Positive
Indeterminate
Signal error
Rack
data
70

Review results – Standard, 24E
Review melting curves
Melting curves display peaks within a set temperature range for
the control and target (if present).
Strong positive
result
Negative
result
Positive control peaks
71
Target peak
Positive control peak

Review results – Standard, 24E and Reverse-Transcriptase PCR assays
Review melting curves
Each target has a unique melting curve:
Salmonella positive
E. coli O157:H7 positive
E. coli O157:H7 MP
positive
Genus Listeria
(std. & 24E) positive
L. monocytogenes
(std. & 24E) positive
72
E. sakazakii positive
Yeast & Mold positive

5’
3’
5’
Real-time PCR assays
Fluorescent detection with probes
Forward
Primer
Extension begins – Probe is intact
Target-specific
Reporter dye Quencher dye
R Probe Q
73
Reverse
Primer
Quencher dye greatly reduces fluorescent signal from Reporter dye
5’
3’
5’

5’
3’
5’
Probe is displaced
Extension progresses – Probe is displaced
R
74
Q
Reporter dye begins to move away from Quencher dye
5’
3’
5’

5’
3’
5’
Probe is cleaved
Extension progresses – Probe is cleaved
R
Reporter dye separates from Quencher dye and emits fluorescent signal
75
Q
5’
3’
5’

5’
3’
5’
Probe is removed
Extension complete – probe is removed
R Q
The more target in the sample, the sooner fluorescent signal reaches the detection threshold.
76
5’
3’
5’

Sondas scorpio
Sonda escorpio combina: primer y sonda específicos
Donador y aceptor próximos en el bucle
El bloqueante impide que se replique la secuencia de la sonda en el bucle
77

Real-time PCR assays
Detection with Scorpion probes
78

Primer is extended
79

Extended primer is denatured
80

Probe hybridizes and fluoresces
81

Real-time PCR assays
Analysis reports quantitative and qualitative values
Detection is integrated with amplification – 90 minutes
processing.
When fluorescent signal reaches the detectable
threshold (Ct), the amplification curve begins to rise.
Qualitative output is positive or negative.
Quantitative output is CFU/ml for each target, referring
to concentration going into lysis.
82

Real Time E.coli O157
83

Bacterial DNA targets for PCR
-House keeping genes
-Non codifying sequences
-Virulence factors
- STEC - Screening test for stx(+), eae(+),
- E. coli O26, O111, O121
- E. coli O45, O103, O145
- E coli O157 H7
84

Screening and identification STEC
- STEC - Screening test for stx(+), eae(+)
- Panel assay E. coli O26, O111, O121
- Panel assay E. coli O45, O103, O145
- Assay E. coli O157 H7
- Salmonella spp
85

The world leader in serving science

The world leader in serving science
RiboPrinter ® :
sistema de identificación y
caracterización microbiana
MRAMA 2007
Itziar Olea

¿Qué es RiboPrinter ® ?
Sistema automatizado
de tipación y
subtipación molecular
2

TIPACIÓN
Demostrar que aislados bacterianos de la misma
especie recogidos de orígenes distintos, de lugares
diferentes y a distintos tiempos proceden del mismo o
diferente clon.
IMPORTANCIA
Por ejemplo en la industria alimentaria:
determinar el origen de una contaminación
3

Escenario
CONTAMINACIÓN
4

Escenario
Salmonella
Listeria monocytogenes
E.coli O 157:H7
Staphylococcus aureus
. . . . . .
5

Escenario
Distintas cepas de la misma especie pueden
tener características bioquímicas muy
similares y….sin embargo ser:
Diferentes
Provenir de distintos orígenes
Tener distinta virulencia
o resistencia a los agentes físicos/químicos
o distinta adaptabilidad . . ,
6

Técnicas Fenotípicas
Tradicionalmente
Marcadores Fenotípicos:
•Perfiles bioquímicos
•Serotipado
•Bacteriofagotipado
Bateria de antisueros
•Producción de bacteriocinas
•Perfil de proteinas de membrana externa
•Sensibilidad antibiótica
•…….
•Los marcadores fenotípicos no son expresados de una manera estable bajo ciertas
condiciones ambientales o de cultivo
y pueden variar también y de manera importante bajo la presión de los antibióticos utilizados
en el hospital
7
No disponibles para todas
las especies bacterianas

Tipación Molecular
AFLP
RFLP
RAPD
PFGE
DNA sequencing
. . . .
•Reproducibilidad
•Sensibilidad
•Poder de discriminación
•Simplicidad técnica
•Rapidez
•Facilidad de Interpretación
•Estandarización
•……….
RiboPrinter®
8

RiboPrinter® System- Sistema de Identificación y
Caracterización Microbiana
9

RiboPrinter ® Identificación - Género
11

RiboPrinter ® Identificación - Especie
Listeria
12

RiboPrinter ® - Identificación nivel raza
Listeria monocytogenes
13

RiboPrinter ® System
Capacidad de empleo de Múltiples Enzimas
Enzimas estándar: EcoRI & PvuII
Otras enzimas que se pueden emplear (ejem.
HaeIII, PstI, …)
• Para cortar microorganismos para los que la
digestión con EcoRI o PvuII no es adecuada
• Cuando se precisa aún mayor discriminación
14

Más que un Sistema de Identificación
12
Procesamiento Automatizado
Capacidades de Identificación
Capacidades de Caracterización
Análisis de datos Automatizado
• Interpretación de datos objetiva
• Flexible, exportable, datos compartibles
Resultados en 8 horas
16

The world leader in serving science
RiboPrinter ®
System
Proceso

RiboPrinter ® System
PROTOCOLO
Lisis celular y digestión con enzimas de restricción para
producir fragmentos específicos de DNA
Separación por pesos moleculares en Electroforesis
Transferencia a membrana
Hibridación de los fragmentos específicos a sondas
unidas a sustrato quimioluminiscente
Detección y captura de las imágenes de los fragmentos
con la cámara fotográfica
18

RiboPrinter® System- Protocolo
Procesamiento Automatizado
•Preparación del DNA
•Separación y Transferencia
•Procesamiento de la membrana
•Detección
Análisis Automatizado
•Identificación
•Caracterización
19

Análisis Automatizado de Patrones - Identificación
Los patrones obtenidos se comparan
con una librería de patrones de referencia
taxonómicos (Dupont ID ó del Cliente)
La similaridad por encima de un límite
dado nos da la identificación
20

Análisis Automático de Patrones: Identificación
•Comparación con un
perfil ya conocido de patrones
(Custom o DuPont ID Library)
21
Umbral de simillitud

DuPont ID Database Actualizada - Identificación
Contiene más de 6400 patrones RiboPrint(TM)
Representando 207 Géneros y más de 1400 especies/serotipos
Taxonomia actualizada y consistente con International Journal of
Systemic and Evolutionary Microbiology
Colaboración con las Colecciones Internacionales de Cultivos Tipo
ATCC, DSMZ, Riken
22

Análisis Automatizado de Patrones -
Caracterización
Permite comparar muestras
sin conocer la identidad del
microorganismo
Proporciona información
por debajo del nivel de
especie
Te “dice” si la muestra es la
MISMA o DIFERENTE
23
0.90 sim

Búsqueda de Listeria monocytogenes en un producto
Product Sample
Drain Sample
Slicer Sample
24

Caracterización – Nuevo Ribogrupo
32
14
32
25

RiboPrinter® System Caracterización e Identificación de
Bacterias
26

RiboPrinter ® System -Aplicaciones
Producción de Alimentos
Producción de Medicamentos
Medicina Humana y Veterinaria
Investigación Microbiológica
Estudios Ambientales
Epidemiología
Control de Calidad
27

Riboprinter® - Tipación Molecular
• Reproducibilidad
• Sensibilidad
• Poder de discriminación
• Facilidad de uso
• Facilidad de Interpretación
• Rapidez
• Estandarización
28

RiboPrinter ® System
RiboPrinter®
Totalmente automatizado
Caracterización e Identificación
molecular
Resultados en 8 horas
32 muestras/dia (4 lotes de 8)
Resultados automatizados y
almacenados electrónicamente
29

RiboPrinter ® System Desechables
30

vs
31

Identificación RiboPrinter ®
Más de 6400 perfiles de referencia disponibles:
• Bacillus
• Listeria
• Escherichia
• Lactobacillus
• Lactococcus
• Leuconostoc
• Pediococcus
• Pseudomonas
• Salmonella
• Staphylococcus
• Vibrio
32

Output– Creación de patrones RiboPrinter®
Escala de grises
Gráfica dual
Onda
33

Ventajas del análisis de DNA
Siempre puede ser extraido de una bacteria
Misma estrategia analítica
Aplicación a cualquier DNA
La mayor parte de los procedimientos no requieren
reactivos especie-específicos
Posibilidad de estudiar marcadores neutrales
34

Técnicas Fenotípicas
Tradicionalmente
Marcadores Fenotípicos:
•Perfiles bioquímicos
•Serotipado
•Bacteriofagotipado
Bateria de antisueros
•Producción de bacteriocinas
•Perfil de proteinas de membrana externa
•Sensibilidad antibiótica
•…….
•Los marcadores fenotípicos no son expresados de una manera estable bajo ciertas
condiciones ambientales o de cultivo
y pueden variar también y de manera importamnte bajo la presión de los antibióticos
utilizados en el hospital
35
No disponibles para todas
las especies bacterianas

PFGE RFLP REP-PCR RAPD CFLP AFLP DNA sequencing
Embeber
microorganismo
s en bloque de
agarosa
Digestión con
proteasa
Amplificación
por PCR
Digestión RE Gel
electroforesis
Amplificación
por PCR con
primers ERIC y
REP
Digestión R E Gel
electroforesis
Amplificación
PCR con un
primer simple
Gel
electroforesis
36
Amplificación PCR Digesti´ón con
enzimas de
restyricción
Digestión con
exonucleasas
Tinción del gel Tinción del gel Purificación en
columna
Electroforesis Tinción del gel Interpretación Digestión de ruptura Gel
electroforesis
Interpretación Interpretación Electroforesis Interpretación
del gel
Transferencia a
membrana de nylon
durante toda la noche
Exposición a la
quimioluminiscencia
Interpretación
Comparación de pasos implicados en los procesos de varios métodos de tipaje molecular
Reacciones PCR para
secuenciación
Linker Ligation Gel electroforesis
PCR selectiva Analisis de secuencia
auxiliado por ordenador
Interpretación

Ribotyping: Sonda de hibridación
Proveniente de E. coli rRNA ribosomal operon
Aprox 6,5 kb
Contiene secuencias que codifican para:
• 16S rRNA
• Región espaciadora que incluye Glu-tRNA
• 23S rRNA
• 5S rRNA
4.1
37

Ribotyping: Ejemplo utilizando EcoRI
EcoRI Sites
3.1
Gene X
Increasing
Fragment
Size
PROBE
16S rRNA
B
D
C
A
E
RiboPrint ® pattern generated
by EcoRI restriction of one
ribosomal RNA operon
38
23S rRNA
A B C D E
5S
Gene Z

RiboPrinter ® System información
39

Personalización de la información
40

Identificación & Caracterización
41

Comparación de patrones
42