GENIO Y FIGURA DE LA BETAÍNA ALDEHÍDO DESHIDROGENASA

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MENSAJE BIOQUÍMICO, Vol. XXVIII (2004) inhibidores de ambas enzimas, competitivos frente a NAD(P) + . Lo que resulta interesante es que el orden de potencia como inhibidores de estos nucleótidos es inverso en la enzima vegetal que en la enzima bacteriana. En la primera AMP es el inhibidor más potente, seguido de ADP y finalmente de ATP, mientras que en la segunda ATP inhibe más que ADP y éste más que AMP (Velasco-García, R, Mújica-Jiménez C y Muñoz-Clares RA, resultados no publicados). Este comportamiento es consistente con el papel biosintético de la BADH de amaranto y principalmente degradativo de la enzima de P. aeruginosa. Cambios conformacionales inducidos por los ligandos Las BADHs de Pseudomonas y amaranto sufren importantes cambios conformacionales cuando unen a las coenzimas (ambas enzimas) o a la betaína aldehído (la enzima de amaranto) (28,38). La cinética de estos cambios en ambas enzimas puede seguirse por una disminución en la reactividad o accesibilidad del tiolato del residuo de cisteína catalítico, lo que se refleja en una disminución en la velocidad y el grado de inactivación producido por modificación química con reactivos específicos de grupos tioles. Solamente en el caso de la enzima de amaranto, los cambios conformacionales inducidos por betaína aldehído o NADH se acompañan de pérdida de actividad catalítica, pero no así los inducidos por NAD + . Tanto la constante de velocidad de la pérdida de actividad como la actividad residual al equilibrio muestran una dependencia hiperbólica de la concentración del ligando (Fig 8), lo que indica que se establece un equilibrio entre una forma activa y otra inactiva de la enzima que tiene unido al ligando: Enzima + Ligando Enzima-Ligando Enzima * -Ligando Activa Inactiva Figura 8. (A) Cinética de inactivación de la BADH de amaranto por incubación con 0.25 (), 0.5 (o), 1 (), y 2 () mM betaína aldehído. Enzima incubada en ausencia del aldehído (). (B) Dependencia de la constante de inactivación de la concentración de betaína aldehído. (C) Dependencia del grado de inactivación al equilibrio de la concentración de betaína aldehído. 214
Oxidación de la cisteína catalítica 215 Muñoz Clares y Velasco García Las BADHs vegetales involucradas en la respuesta al estrés osmótico están localizadas en el cloroplasto y se sabe que las reacciones de transporte de electrones en este organelo generan especies reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés) por transferencia incompleta de electrones a los aceptores fisiológicos finales. Bajo las condiciones de estrés osmótico en las que la BADH de cloroplasto funciona, la producción de ROS se incrementa debido a que el cierre de los estomas, que es la primera respuesta de la planta para evitar la pérdida de agua por transpiración, conduce a una disminución en las reacciones de asimilación del CO2 y por tanto a una disminución en los niveles de aceptores de electrones. Se sabe también que durante la invasión de P. aeruginosa las células infectadas, como un mecanismo de defensa, producen ROS, a las que tiene que enfrentarse la bacteria (27). Como consecuencia, las BADHs de ambas fuentes funcionan en ambientes con estrés oxidativo, lo que parecería ponerlas en una situación especialmente difícil ya que, como hemos mencionado, su catálisis depende de la existencia en el sitio activo de un tiolato excepcionalmente reactivo y por tanto muy susceptible a oxidación. Se podría esperar por ello que estas enzimas fuesen rápidamente inactivadas bajo las condiciones oxidativas del cloroplasto o del sitio de infección. Sin embargo, puesto que ambas son activas bajo esas condiciones, es mucho más lógico suponer que han desarrollado algún mecanismo que les permite evitar la oxidación de su cisteína esencial, y que incluso pudieran sacar ventaja de las condiciones oxidativas para regular su actividad. Para explorar este posible mecanismo tratamos in vitro tanto a la BADH bacteriana como a la de la planta con peróxido de hidrógeno y confirmamos que efectivamente ambas enzimas son bastante resistentes a oxidación por este compuesto, incluso a concentraciones superiores a las que pueden darse in vivo. Sin embargo, cuando el tratamiento se realizó en presencia de betaína aldehído, ambas enzimas fueron altamente susceptibles de oxidación, inactivándose en su totalidad la enzima bacteriana y hasta un máximo de aproximadamente 50% la enzima vegetal. Este es un resultado sorprendente porque era de esperarse que el aldehído al reaccionar en forma covalente con el tiolato catalítico - primer paso de la catálisis - lo protegería de la oxidación. ¿Por qué entonces encontramos el efecto opuesto? La explicación definitiva no la tenemos por el momento, pero podría deberse a que este experimento se realiza bajo condiciones no catalíticas, es decir en ausencia de la coenzima, por lo que se forma un complejo enzima-betaína aldehído que no se forma durante la catálisis cuando tanto el aldehído como la coenzima están presentes, ya que la enzima une a la coenzima antes que al aldehído. En este complejo binario enzima-aldehído pudiera ser que no ocurriera la formación del tiohemiacetal, sino que por el contrario el tiolato catalítico quedase aun más expuesto al solvente o más reactivo de lo que lo está en la enzima libre. Una explicación alternativa es que sí se formara el tiohemiacetal pero que éste fuera susceptible a oxidación. Cualquiera que sea el mecanismo por el cual betaína aldehído incrementa la oxidación de la cisteína catalítica cuando se une a la enzima libre, una pregunta relevante es: ¿tiene alguna consecuencia fisiológica el que el aldehído no sólo no proteja a la enzima de la inactivación por el oxidante sino que la desproteja? Solamente lo tendrá en el caso de que in vivo, bajo alguna condición, exista una fracción de enzima que lleve unido exclusivamente al aldehído, lo que ocurrirá cuando los niveles del nucleótido oxidado sean muy bajos (recuérdese que el nucleótido se une con mayor afinidad a la enzima que el aldehído). En esta situación puede ser muy ventajoso para la célula el que la enzima se inactive, como discutimos a continuación. Implicaciones fisiológicas de los mecanismos de regulación a corto plazo Los mecanismos de inhibición e inactivación que hemos descrito adquieren relevancia fisiológica si se considera que la reacción catalizada por la BADH es irreversible. Una reacción irreversible es como un coche sin frenos moviéndose cuesta abajo. Si la velocidad de la reacción no se controla, el peligro es que todo, o una importante fracción del NAD(P) + sea reducido a
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