USO DE COMPUESTOS PARA ELEVAR LA ACTIVIDAD DE ... - Inicio

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
ES 2 217 754 T3
Para la expresión de la actividad de rPDHKII, se transformaron células de la cepa M15pRep4 de E. coli con el
vector pQE32 que contiene ADNc de rPDHKII. Este vector incorpora un marcador 6-His sobre la proteína, en su
término N. Se hicieron crecer E. coli hasta una densidad óptica de 0,6 (600 nm), y se indujo la expresión de proteínas
por adición de 10 µM de isopropiltio-β-galactosidasa. Las células se hicieron crecer durante 18 horas a 18ºC, y se
cosecharon por centrifugación. La pasta de células resuspendidas se lisó por homogeneización, y el material insoluble
se eliminó por centrifugación a 24000 x g durante 1 hora. Se eliminó del sobrenadante la proteína marcada con 6-
His, usando una resina de ácido nitrilotriacético quelante de níquel (Ni-NTA: Quiagen Ltd.), matriz (Quiagen) la cual
se lavó con 20 mM de tris(hidroximetil)aminometano-cloruro de hidrógeno, 20 mM de imidazol, cloruro de sodio
0,5 M, pH 8,0, antes de la elución de la proteína unida usando un tampón que contiene 20 mM de tris(hidroximetil)
aminometano-cloruro de hidrógeno, 200 mM de imidazol, cloruro de sodio 0,15 M, pH 8,0. Las fracciones eluídas
que contenían la proteína 6-His se reunieron y se almacenaron en alícuotas a -80ºC en 10% de glicerol.
Cada nuevo lote de lote madre de enzima se valoró en un ensayo para determinar una concentración que dé aproximadamente
una inhibición de 90% de PDH en las condiciones del ensayo. Para un lote típico, el lote madre de enzima
se diluyó hasta 7,5 µg/ml.
Para el ensayo de la actividad de nuevos compuestos, se diluyeron los compuestos con 10% de DMSO, y se transfirieron
10 µl a pocillos individuales de placas de ensayo de 96 pocillos. Los pocillos de control contenían 20 µl de
DMSO al 10%, en lugar de compuesto. Se incubaron 40 µl de tampón que contiene 50 mM de tampón de fosfato de
potasio, pH 7,0, 10 mM de ácido etilenglicol-bis(β-aminoetiléter)-N,N,N,N-tetraacético (EGTA), 1 mM de benzamidina,
1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 0,3 mM de tosil-L-lisina-clorometilcetona (TLCK), 2 mM de
ditiotreitol (DTT), rPDHKII recombinante y los compuestos, en presencia de PDH quinasa a temperatura ambiente
durante 45 minutos. A fin de determinar la velocidad máxima de la reacción de PDH, se incluyó una segunda serie de
pocillos de control que contienen DMSO al 10% en lugar de compuesto, y que omiten rPDHKII. Entonces se inició
la actividad de PDH quinasa por adición de 5 µM de ATP, 2 mM de cloruro de magnesio y 0,04 U/ml de PDH (PDH
de corazón porcino, Sigma P7032), en un volumen total de 50 µl, y las placas se incubaron a temperatura ambiente
durante 45 minutos adicionales. Entonces se determinó la actividad residual de la PDH por adición de sustratos (2,5
mM de coenzima A, 2,5 mM de pirofosfato de tiamina (cocarboxilasa), 2,5mM de piruvato de sodio, 6mM de NAD,
en un volumen total de 80 µl), y las placas se incubaron durante 90 minutos a temperatura ambiente. Se estableció
la producción de NAD reducida (NADH) midiendo la densidad óptica a 340 nm y usando un espectrofotómetro de
lectura de placas. Se determinó de forma habitual la ED 50 para el compuesto de ensayo, usando resultados a partir de
12 concentraciones del compuesto.
(b) Elevación in vitro de la actividad del PDH en células primarias adecuadas
Este ensayo determina la capacidad de los compuestos para estimular la oxidación de piruvato en hepatocitos de
rata primarios.
Los hepatocitos se aislaron mediante el procedimiento de digestión con colagenasa de dos etapas, descrito por
Seglen (Methods Cell Biol. (1976) 13, 29-33), y se colocaron en placas de cultivo de 6 pocillos (Falcon Primaria) a
600000 células viables por pocillo en Medio de Eagles Modificado de Dulbecco (DMEM, Gibco BRL), que contiene
10% de suero fetal de ternera (FCS), 10% de penicilina/estreptomicina (Gibco BRL) y 10% de aminoácidos no esenciales
(NEAA, Gibco BRL). Después de 4 horas de incubación a 37ºC en 5% de CO2, el medio se sustituyó con Medio
Esencial Mínimo (MEM, Gibco BRL) que contiene NEAA y penicilina/estreptomicina como anteriormente, además
de 10 nM de dexametasona y 10 nM de insulina.
Al siguiente día, las células se lavaron con disolución salina tamponada con fosfato (PBS), y el medio se sustituyó
por 1 ml de disolución de Krebs tamponada con HEPES (25 mM de HEPES, 0,15 M de cloruro sódico, 25 mM de
hidrogenocarbonato de sodio, 5 mM de cloruro potásico, 2 mM de cloruro cálcico, 1 mM de sulfato de magnesio, 1
mM de dihidrogenofosfato de potasio), que contiene el compuesto a ensayar a la concentración requerida, en DMSO
al 0,1%. Los pocillos de control contenían DMSO al 0,1% solamente, y se determinó una respuesta máxima usando
un tratamiento con 10 µM de un compuesto activo conocido. Después de un periodo de preincubación de 40 minutos
a 37ºC en 5% de CO 2, las células se pulsaron con piruvato sódico hasta una concentración final de 0,5 mM (que
contiene 1- 14 C-piruvato de sodio (producto CFA85 de Amersham) 0,18 Ci/mmol), durante 12 minutos. Entonces se
retiró el medio y se transfirió a un tubo que se cerró inmediatamente con un tapón que contiene un pocillo en el centro
suspendido. El absorbente en el pocillo del centro se saturó con feniletilamina al 50%, y CO2 en el medio liberado por
la adición de 0,2 µl de ácido perclórico (PCA) al 60% (p/v). El 14 CO 2 liberado, atrapado en el absorbente, se determinó
mediante recuento por centelleo de líquidos. Se determinó de forma habitual la ED 50 para el compuesto de ensayo,
usando resultados a partir de 7 concentraciones del compuesto.
(c) Elevación in vivo de la actividad de PDH
La capacidad de los compuestos para aumentar la actividad de PDH en los tejidos pertinentes de ratas se puede
medir usando el ensayo descrito a continuación. Típicamente, el aumento en la proporción de PDH en su forma
activa no fosforilada se puede detectar en el tejido del músculo, cardíaco, hepático y adiposo después de una única
administración de un compuesto activo. Es de esperar que conduzca a una disminución de la glucosa en sangre después
de la administración repetida del compuesto. Por ejemplo, una administración única de DCA, un compuesto que se
sabe que activa PDH por inhibición de PDH quinasa (Whitehouse, Cooper y Randle (1974) Biochem. J. 141, 761-
40