TESIS FICOTOXINAS MARINAS EVA FONFRIA

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24 Introducción Figura 15. Detección de la variación del índice de refracción mediante SPR. A) El fenómeno de SPR se observa como una caída en la intensidad reflejada para un cierto ángulo de incidencia, que depende del índice de refracción de la cara no-iluminada. B) Al producirse la unión analito-ligando, la masa en superficie varía cambiando el índice de refracción, que a su vez cambia el ángulo donde se produce SPR. C) Sensograma: Representación del cambio de ángulo (en RU) frente al tiempo, que permite seguir el progreso de la interacción en la superficie a tiempo real Una vez se ha preparado el chip sensor con el ligando inmovilizado en la superficie, el sensograma típico que se obtiene en un biosensor basado en SPR durante un ciclo de análisis consta de cuatro etapas: línea basal, asociación, disociación y regeneración (figura 16). El ciclo empieza mediante la inyección de tampón en flujo continuo para establecer la línea basal que servirá de punto de referencia. En la etapa de asociación, el tampón es reemplazado por la muestra. Si se produce la interacción analito-ligando, el sensograma mostrará un perfil de subida, típico de la unión entre dos moléculas. En la etapa siguiente, de disociación, se vuelve a inyectar tampón en un flujo constante. Si la interacción tiene una alta afinidad el valor de unión (respuesta) se mantendrá, mientras que si KD es alta, el sensograma mostrará una
25 Introducción caída progresiva. Por último, en la etapa de regeneración, se expone la superficie a condiciones drásticas (de pH, sales, etc.) para eliminar todo el analito unido al ligando (sin dañar este último) y preparar la superficie para un nuevo ciclo. Si la regeneración es óptima, la línea basal posterior a esta etapa es la misma que al empezar el ciclo. Figura 16. Ciclo de análisis de un sensograma: a) línea basal. b) etapa de asociación. c) etapa de disociación. d) etapa de regeneración. e) línea basal. La cuantificación de la interacción puede realizarse de varias formas. En esta tesis se utilizaron los valores de unión relativos (incremento de RUs entre un punto preestablecido de la etapa de disociación y un punto preestablecido de la línea basal) para la interacción anticuerpo-STX y la pendiente de la curva de asociación para la unión YTX-PDE 1. Aplicaciones Aunque el fenómeno SPR era conocido desde la década de los cincuenta [176] no fue hasta 1990 que el primer biosensor basado en esa tecnología (de la casa comercial Biacore ®) salió al mercado [174]. Desde entonces, la aplicación de esta técnica se ha utilizado en numerosas áreas científicas (proteómica, microbiología, virología, bioquímica, patología, inmunología…) [177, 178]
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