metodos_estudio_interaccion_planta_patogeno

ESTUDIO DE LAS
INTERACCIONES PLANTA- PLANTA
HONGOS PATOGÉNICOS
PATOG NICOS
Clase I - conceptos
Marciel J. Stadnik
CC
LABFITOP
UFSCV
UFSCV
stadnik@cca.ufsc.br
Clasificación Clasificaci n de hongos:
Cuanto a la relación relaci n parasitaria:
Parásitos Par sitos obligados: obligados:
Ciclo de vida ocurre
exclusivamente en el tejido vivo del huésped hu sped
Parásitos Par sitos no obligados
Saprófitos Sapr fitos facultativos
Patógenos Pat genos facultativos
Preguntas? Preguntas?
> Respuestas
Cual órgano rgano y tejido es infectado por el hongo?
Como ocurre la infección? infecci n? directa o indirecta?
Cuales células c lulas del huésped hu sped son colonizadas?
(epidermis, mesófilo mes filo, , etc.)
Cuáles Cu les son los mecanismos involucrados con
la defensa de la planta contra el hongo?
Clasificación Clasificaci n de hongos
Cuanto a las relaciones nutricionales (Luttrell ( Luttrell,1974): ,1974):
Necrotrófico
Necrotr fico (Pertotrofico
Pertotrofico): ): patógeno pat geno mata
las células c lulas do huésped hu sped antes de colonizarlas
Alternaria spp.
Hemibiotrófico
Hemibiotr fico: patógeno pat geno forma inicialmente una asociación asociaci n
con células c lulas vivas del huésped, hu sped, y mas tarde se vuelve
necrotrófico
necrotr fico
Ex: Colletotrichum spp.
Biotrófico Biotr fico: patógeno pat geno se nutre de tejido vivo
Oídios dios, , Rojas
Características
Caracter sticas
organismos biotróficos
biotr ficos
estructuras de infección infecci n altamente
desarrolladas
baja actividad de enzimas líticas l ticas
camadas interfaciales que separan las
membranas plasmáticas plasm ticas del hongo y planta
mecanismos de supresión supresi n de defensa del
huésped hu sped
haustórios haust rios
(Mendgen Mendgen & Hahn, Hahn,
2002).
1

Modo de infección infecci n y
colonización
colonizaci
Rojas (basidiomycota
basidiomycota)
Oídios dios (ascomycota
ascomycota) )
Colletotrichum lindemuthianum y
Colletotrichum gloeosporioides
= presentan diferentes tipos y grados de
desarrollo biotrófico biotr fico. .
Uromyces appendiculatus
Roja de la soja
(Phakopsora
Phakopsora pachyrhizi)
pachyrhizi
Penetración directa !
Koch et al. (1983)
Rojas
(biotr biotróficos ficos del mesófilo)
mes filo)
Formación Formaci n de apresório
apres rio en
respuesta a características
caracter sticas
topográficas
topogr ficas
Microscopía Microscop de luz
Tests in vitro sobre papel celofán
celof
Allen et al. (1991)
2

Oídios dios
(biotr biotróficos ficos de la epidermis)
epidermis
Proceso de infección infecci n de
Blumeria Blumeria graminis graminis
MICROSCOPÍA DE
FLUORENCIA
COMPUESTOS FENÓLICOS
MICROSCOPÍA
ELECTRÓNICA DE
VARREDURA
SUPERFICIE
Análisis An lisis inmunocitológicas
inmunocitol gicas y geles
Microscopia de
fluorescencia (MF)
Padrón Padr n de expresión expresi n de ARD1
- Arabitol Desidrogenase
(A) Representación Representaci n de las
estructruras de infección infecci n de la
roja: 1, uredósporo
ured sporo (SP); 2, tubo
germinativo (GT) 4 h después despu s de
la germinación; germinaci n; 3–6, 3 6, estructuras de
infección infecci n in vitro en estadíos estad os
siguientes: 3, apresório apres rio (AP) (6 h);
4, vesícula ves cula subestomatal (SV) (12
h); 5, hifa de infección infecci n (IH) (18 h);
6, célula c lula-madre madre haustorial (HM)
estadío estad (21 h); 7, haustório haust rio (HA);
8, hojas infectadas; 9, no
infectadas (estructuras 2–6 2 6 obtidas
in vitro).; vitro).;
NB, gola do pescoço; pesco ;
EM, matriz extrahaustorial.
extrahaustorial.
(B) Gele de agarosa
(C) Northern blot de geles
descritos en (B). ( ).
Blumeria graminis
Link et al. (2005)
Luz incidente 100 a 400nm
Filtro antes de la lente objetiva permite apenas
el pasaje de luz excitada
Componentes autofluorescentes (ex.
compuestos fenólicos) fen licos)
Fluorocromos como sondas
En materiales fijados y no fijados
Proteínas Prote nas fluorescentes (expresadas
( expresadas o
microinyectadas)
microinyectadas)
en células lulas vivas.
3

Electron microscopy
Live-cell Live cell imaging
1- Staining
- Conidia collected from 7-16 16 old cultures and
suspended in water (1x10 6 conidia/mL)
conidia/mL)→
inoculate PDB in slide culture chamber. chamber
- Incubated for 24h,48 and 72h.
- Calcofluor White(0,12 M)→ M) for cell wall
- DAPI→ DAPI for nuclei
- DiCO 6 → for mitochondria
- Carboxy-DFDA
Carboxy DFDA → for vacuoles
- Inverted microscope equipped with blue
diode and argon ion lasers
Spores collected by
touching a 15-day 15 day old
culture with nylon
hybridisation membrane,
membrane,
or fixed and mounted
directly pod. pod
from de bean
Técnicas cnicas microscópicas microsc picas para la
evaluación evaluaci de anastomosis conidial
Labelling
GFP
Live‐cell imaging
Carboxy‐DFDA
Electron microscopy
Staining Scanning Transmission
DAPI
DiCO 6
Calcofluor White
Microscópio
Microsc pio óptico ptico &
GUS e GFP
Expresión Expresi génica nica a nivel celular mediante el uso de
genes repórteres rep rteres visualmente detectables
GUS (β-D-glucoronidasa
( glucoronidasa)
Marcadores histoquímicos histoqu micos y genes repórteres rep rteres
Son introducidos em el hongo de interés. inter . Amuestras
son colectadas y colocadas para reaccionar con el
substrato de GUS(5-bromo
GUS(5 bromo-4-cloro cloro-3-indolyl indolyl-β-D-
glucorónido
glucor nido (X-GlcA GlcA) ) → precipitado azul
http://www.springerlink.com/content/w751815875t11p4
0/fulltext.pdf
2- Labelling with GFP
- Protoplast obtained from young mycelia in NaCl as osmotic
stabilizer
- Incubation of protoplasts for 3h with Lyzing Enzymes. Enzymes
- Tranformation of protoplasts with the plasmid pMF357 which
carried hH1-sgfp hH1 sgfp gene and hph gene for hygromycin
resistance
- Mixture transfered to regeneration agar and hygromycin B
- Conidia obtained from transformants were spread onto PDA
containing hygromycin.
hygromycin
- Single conidia expressing hH1-sFGP hH1 sFGP were selected using a
fluorescence stereo microscope with GFP filter set
4

Propidium iodide
(nuclei)
DAPI (nuclei) Carboxy‐DFDA (vacuoles)
Calcofluor White (cell walls) hH1 ‐GPF
Metodologia
1) Colecta de discos de tejido foliar después de la inoculación
1) Solución I: (etanol/ácido acético glacial; 3:1, v/v) para fijación y clareamento de
los tejidos.
- 24 -48 h/ cambios de soluciones
2) Solución II: lactoglicerol (ác. lático, glicerol y agua)
para continuar el clareamento y conservación.
4) Visualización al microscopio óptico (hasta 3 meses)
Stadnik e Buchenauer (2000):
Puntos importantes:
- Conducción con máximo cuidado para evitar el desprendimiento de esporas adheridos
suavemente en las hojas.
- Las estructuras del hongo son teñidas con azul de anilina en lactofenol (0,1%) o Coomansie
blue o tripan blue.
- El porcentaje de germinación, la formación de apresórios y la penetración son evaluados
sobre cada disco foliar, observando-se 100 esporas/disco.
Crecimiento del hongo in in
planta planta
Incubar por 12 h y
substituir la solución
de clareamento por
glicerol 70%.
Incubación con solución de
coloración (azul de tripan
2,5 mg/mL em lactofenol + 2
volúmenes de etanol) a
100°C por 1 min.
Incubar por 6 h y
substituir la solución
de clareamento por
una nueva.
Weigel e Glazebrook (2002)
Resfriar el
material por 1 h a
temperatura
ambiente.
Remover la solución
de coloración y
adicionar cloral
hidratado (2,5 g/mL).
Metodología Metodolog básica sica
SOLUCIÓN DE CONSERVACIÓN
DISCOS FOLIARES
SOLUCIÓN PARA
CLAREAMENTO
Fitopatologia Brasileira, 31 (supl.) 79-80, 2006
Detección Detecci de la reacción reacci de
hipersensibilidad en
Arabidopsis
Arabidopsis
Incubar en solución
de diaminobenzidina
(1 mg/mL) por 8 h
Weigel e Glazebrook (2002)
Decoloración en
etanol 100% por 3h.
Solución de
conservación
(glicerol 70%)
5

Detección Detecci de la reacción reacci de
hipersensibilidad en poroto
Conservación en
ácido láctico: glicerol:
agua (1:1:1, v/v/v)
Decoloración en ácido
tricloroacético 0,15%
p/v; en etanol:
clorofórmio (4:1)
Foto: Reacción Reacci de
hipersensibilidad
Hϋckelhoven (1999)
Solución de
diaminobenzidina
(1mg/mL)
Desarrollo biotrófico
biotr fico de
los oídios o dios
A
Fotos: Crecimiento del hongo
in in planta planta
Plantas inoculadas con una gota de 10uL de una
suspensión suspensi de esporas de A. brassicicola (10 6
conídios/mL)
con dios/mL)
Evaluación Evaluaci realizada a los 4 dias después despu de la
inoculación inoculaci
Metodología Metodolog básica sica
SOLUCIÓN DE CONSERVACIÓN
DISCOS FOLIARES
SOLUCIÓN PARA
CLAREAMIENTO
Técnicas cnicas histoquímicas
histoqu micas
Johansen (Capítulo (Cap tulo IX)
Clareamiento y tinción tinci de los tejidos
6

Oídio dio del Pepino
Podosphaera Podosphaera xanthii xanthii
Hemibiotróficos
Hemibiotr ficos
(Colletotrichum
Colletotrichum lindemuthianum)
lindemuthianum
Antracnose del frijol
Tipos de haustórios
haust rios
Hemibiotróficos
Hemibiotr ficos
(dos “faces faces” de un patógeno
pat geno)
Colletotrichum lindemuthianum
7

Colletotrichum lindemuthianum (24 hai)
Colletotrichum Colletotrichum gloeosporioides
gloeosporioides
Manzano
?
Colletotrichum gloeosporioides (48 hai)
8