El cultivo de protoplastos en cítricos y su
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Actualizaci6n<br />
Agronomia Costarric<strong>en</strong>se 20(2): 187-204. 1996<br />
EL CULTIVO DE PROTOPLASTOS EN CITRICOS YSU POTENCIAL<br />
PARA EL MEJORAMIENTO GENETICO1<br />
ABSTRACT<br />
Protoplast culture in citrus and its pot<strong>en</strong>tial for g<strong>en</strong>etic improvem<strong>en</strong>t.<br />
Techniques that involve isolation, culture and reg<strong>en</strong>eration of citrus protoplasts<br />
for g<strong>en</strong>etic improvem<strong>en</strong>t are reviewed. The species and cultivars from which<br />
viable protoplasts were obtained are listed. Also, plants reg<strong>en</strong>erated through fusion<br />
experim<strong>en</strong>ts, cybrid formation and g<strong>en</strong>etic transformation of protoplasts<br />
are <strong>de</strong>scribed. Pot<strong>en</strong>tial uses of these techniques and their applications are discussed,<br />
emphasizing protoplast fusion, which has evolved to a higher <strong>de</strong>gree.<br />
VIctor M. Jim<strong>en</strong>ez *<br />
INTRODUCCI6N La diversidad g<strong>en</strong>etica que existe <strong>en</strong>tre las<br />
especies <strong>de</strong> Citrus y los g<strong>en</strong>eros empar<strong>en</strong>tados es<br />
Los cftricos constituy<strong>en</strong> el principal produc- muy gran<strong>de</strong> y ha sido poco estudiada. En el Cuato<br />
frutfcola <strong>en</strong> el comercio mundial. A pesar <strong>de</strong> <strong>su</strong> dro 1 se observa que la Subtribu Citrinae (Subtrialta<br />
capacidad para hibridarse <strong>en</strong> forma interespe- bu 2 <strong>de</strong> la Tribu Citreae, Subfamilia Aurantiodiae,<br />
cffica e incluso interg<strong>en</strong>erica, la aplicacion efecti- Familia Rutaceae) a la cual pert<strong>en</strong>ece Citrus, ha<br />
va <strong>de</strong> programas <strong>de</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>etico tradi- sido dividida <strong>en</strong> tres grupos <strong>su</strong>btribales, que concional<br />
se ha visto limitada por una serie <strong>de</strong> facto- ti<strong>en</strong><strong>en</strong> <strong>en</strong> total 28 g<strong>en</strong>eros y 125 especies (Swingle<br />
res biologicos propios <strong>de</strong>l grupo, <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> los y Reece, 1967).<br />
cuales se incluy<strong>en</strong> una biologfa reproductiva muy En el pres<strong>en</strong>te trabajo se hace una <strong>de</strong>scripcompleja<br />
y perfodos <strong>de</strong> juv<strong>en</strong>ilidad prolongados cion actualizada sobre el uso <strong>de</strong>l <strong>cultivo</strong> <strong>de</strong> proto-<br />
(Grosser y Gmitter, 1990a; Grosser, 1992). Algu- plastos como metodo para el mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>etinas<br />
<strong>de</strong> estas limitantes pue<strong>de</strong>n obviarse <strong>en</strong> gran co <strong>de</strong> cftricos, con <strong>en</strong>fasis <strong>en</strong> la fusion <strong>de</strong> protomedida<br />
mediante la utilizacion <strong>de</strong> tecnicas biotec- plastos, que es la metodologfa que ha t<strong>en</strong>ido manologicas,<br />
que involucran <strong>en</strong>tre otras: el <strong>cultivo</strong> in<br />
vitro, el aislami<strong>en</strong>to, <strong>cultivo</strong>, reg<strong>en</strong>eracion, fusion<br />
y transformacion <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong>, y la formacion<br />
yor <strong>de</strong>sarrollo.<br />
<strong>de</strong> cfbridos. Estas tecnicas permit<strong>en</strong> la incorpora- AISLAMffiNTO DE PROTOPLASTOS<br />
cion <strong>de</strong> caracterfsticas g<strong>en</strong>eticas que son <strong>de</strong> gran<br />
utilidad para conferir resist<strong>en</strong>cia 0 tolerancia con-<br />
Y REGENERACI6N DE PLANTAS<br />
tra <strong>en</strong>fermeda<strong>de</strong>s, plagas y condiciones adversas La manipulacion <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong> y la rege-<br />
(edaficas, climaticas, etc.), que afectan el r<strong>en</strong>di- neracion <strong>de</strong> plantas a partir <strong>de</strong> ellos es una herrami<strong>en</strong>to,<br />
asf como para mejorar la calidad <strong>de</strong>l fruto. mi<strong>en</strong>ta innovadora <strong>en</strong> programas <strong>de</strong> mejorami<strong>en</strong>to<br />
g<strong>en</strong>etico. Estos <strong>protoplastos</strong> provi<strong>en</strong><strong>en</strong> <strong>de</strong> celulas<br />
II<br />
*<br />
Recibido para publicaci6n ell <strong>de</strong> diciembre <strong>de</strong> 1995.<br />
C<strong>en</strong>~ro para Investig.aciones <strong>en</strong> Granos y ~emillas, Universldad<br />
<strong>de</strong> Costa RIca, San Jose, Costa RIca.<br />
alas cuales se les ha eliminado la pared celular, ya<br />
sea por medios mecanicos 0 mediante digestion<br />
<strong>en</strong>zimatica. La unica barrera <strong>en</strong>tonces <strong>en</strong>tre el pro
188 AGRONOMIA COST ARRlCENSE<br />
Cuadro I. G<strong>en</strong>eros pert<strong>en</strong>eci<strong>en</strong>tes a la familia Rutaceae y la <strong>su</strong>bfarnilia Aqrantio<strong>de</strong>ae (Swingle y Reece, 1967). Entre par<strong>en</strong>tesis se<br />
indica el nurnero <strong>de</strong> especies <strong>en</strong> el g<strong>en</strong>ero; y <strong>en</strong> negrita, aquellos <strong>en</strong> los que se ha t<strong>en</strong>ido cierto exito al hibridarlos somaticarn<strong>en</strong>te<br />
con Citrus (modificado <strong>de</strong> Grosser y Grnitter, 199Oc).<br />
TRIBU I. Claus<strong>en</strong>eae<br />
Subtribu I. Micromelinae Micromelum (9)<br />
Subtribu 2. Claus<strong>en</strong>inae Glycosmis (35) Murraya (11) Claus<strong>en</strong>a (23)<br />
Subtribu 3. Merrillinae Merrillia<br />
TRIBU II. Citreae<br />
Subtribu I. Triphasiinae W<strong>en</strong>zelia (9) Triphasia (3) Monanthocitrus Pamburus<br />
Oxanthera (4) Luvunga (12) Merope Paramignya (15)<br />
Subtribu 2. Citrinae Severinia (6) Fortunella (4) Pleiosp<strong>en</strong>nium (5) Eremocitrus<br />
Burkillanthils Poncirus (2) Limnocitrus Clym<strong>en</strong>ia<br />
Hesperathusa<br />
Atalantia (II)<br />
Microcitrus (6)* Citropsis (11) Citrus (16)<br />
Subtribu 3. Balsarnocitrinae Swinglea Balsamocitrus Aegle Feronia<br />
* Utilizado para la fonnaci6n <strong>de</strong> hfbridos.<br />
Afraegle (4) Feroniella (3) Aeglopsis<br />
toplasl,na celular y el medio externo es la membra- elevadas <strong>de</strong> variacion somaclonal <strong>en</strong> varios cultina<br />
plasmatica (B<strong>en</strong>gochea y Dodds, 1986). vos, <strong>en</strong> cftricos los embriones obt<strong>en</strong>idos conservan<br />
Los <strong>protoplastos</strong> <strong>de</strong> cftricos pue<strong>de</strong>n aislarse la i<strong>de</strong>ntidad g<strong>en</strong>etica con la planta madre y expre<strong>de</strong><br />
varios tejidos, incluy<strong>en</strong>do hojas, callos no em- san poca variabilidad. Los mejores re<strong>su</strong>ltados para<br />
briog<strong>en</strong>icos, tetradas florales (<strong>protoplastos</strong> haploi- el aislami<strong>en</strong>to <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong> se ban obt<strong>en</strong>ido utili<strong>de</strong>s),<br />
callos embriog<strong>en</strong>icos y <strong>cultivo</strong>s embriog<strong>en</strong>i- zando tejido friable con bajo cont<strong>en</strong>ido <strong>de</strong> aImidon.<br />
cos <strong>en</strong> <strong>su</strong>sp<strong>en</strong>sion, (Grosser y Chandler, 1987; Los <strong>cultivo</strong>s embriog<strong>en</strong>icos <strong>en</strong> cftricos g<strong>en</strong>eraIm<strong>en</strong>-<br />
Grosser y Gmitter, 1990a), si<strong>en</strong>do los dos ultimos te requier<strong>en</strong> <strong>de</strong> <strong>su</strong>b<strong>cultivo</strong>s continuos, a intervalos<br />
las fu<strong>en</strong>tes mas apropiadas para obt<strong>en</strong>er protoplas- <strong>de</strong> 1-2 meses, por largos perfodos <strong>de</strong> tiempo (g<strong>en</strong>etos<br />
con capacidad embriog<strong>en</strong>ica. ralm<strong>en</strong>te mayores <strong>de</strong> un afio), antes <strong>de</strong> que alcanc<strong>en</strong><br />
un grado <strong>de</strong> friabilidad a<strong>de</strong>cuado, asf como ni-<br />
Aislami<strong>en</strong>to <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong> a partir <strong>de</strong> callo veles apropiados <strong>de</strong> aImidon (Grosser, 1 994b).<br />
Kochba et al. (1972) obtuvieron callos em-<br />
Se pue<strong>de</strong> aislar <strong>protoplastos</strong> directam<strong>en</strong>te <strong>de</strong> briog<strong>en</strong>icos <strong>de</strong> C. sin<strong>en</strong>sis cv. 'Shamouti' a partir<br />
callos embriog<strong>en</strong>icos friables, <strong>de</strong>rivados <strong>de</strong> nuce- <strong>de</strong>l tejido nucelar <strong>de</strong> 6vulos <strong>de</strong> frutos inmaduros<br />
las u 6vulos mant<strong>en</strong>idos <strong>en</strong> un medio <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong> cultivados in vitro. La metodologfa <strong>de</strong>scrita por<br />
<strong>de</strong>sprovisto <strong>de</strong> reguladores <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to, y <strong>de</strong> ellos, asf como modificaciones posteriores ban<br />
callos friables no embriog<strong>en</strong>icos, obt<strong>en</strong>idos a par- permitido increm<strong>en</strong>tar el numero <strong>de</strong> lfneas nucelatir<br />
<strong>de</strong> 6rganos <strong>de</strong> plantulas <strong>en</strong> medios con altos ni- res <strong>de</strong> callo friable capaces <strong>de</strong> producir <strong>su</strong>sp<strong>en</strong>sioveles<br />
<strong>de</strong> auxina (Grosser et al., 1988b). A partir <strong>de</strong> nes celulares y <strong>protoplastos</strong> capaces <strong>de</strong> reg<strong>en</strong>erar<br />
los primeros es posible obt<strong>en</strong>er <strong>protoplastos</strong> em- plantas. <strong>El</strong> Cuadro 2 pres<strong>en</strong>ta una lista <strong>de</strong> las espebriog<strong>en</strong>icos<br />
con capacidad <strong>de</strong> reg<strong>en</strong>erar plantas cies y cultivares <strong>de</strong> cftricos <strong>en</strong> los cuales se ha innormales.<br />
Sin embargo, ha sido muy diffcil iniciar formado la obt<strong>en</strong>ci6n <strong>de</strong> callo friable.<br />
y mant<strong>en</strong>er estas lfneas <strong>de</strong> callo, 10 que ha consti- <strong>El</strong> primer aislami<strong>en</strong>to <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong> totituido<br />
la etapa limitante para la aplicacion <strong>en</strong> gran pot<strong>en</strong>tes <strong>en</strong> cftricos rue realizado por Vardi et al.<br />
escala, <strong>de</strong> metodologfas que involucr<strong>en</strong> el <strong>cultivo</strong> (1975), utilizando como explante el caIlo embrio<strong>de</strong><br />
<strong>protoplastos</strong> (Grosser y Gmitter, 199Oc). Si bi<strong>en</strong> g<strong>en</strong>ico <strong>de</strong> naranja dulce (C. sin<strong>en</strong>sis) cv. 'Shamoula<br />
utilizaci6n <strong>de</strong> caIlo se ha relacionado con tasas ii' obt<strong>en</strong>ido por Kochba et al. (1972). <strong>El</strong> <strong>cultivo</strong> <strong>de</strong>
JIMENEZ: EI <strong>cultivo</strong> <strong>de</strong> protopla...tos <strong>en</strong> citricos y <strong>su</strong> pot<strong>en</strong>cial para el mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>etico 189<br />
Cuadro 2. G<strong>en</strong>eros, especies y cultivares <strong>de</strong> citricos <strong>de</strong> los cuales se ha obt<strong>en</strong>ido callo friable embriog<strong>en</strong>ico a partir <strong>de</strong> 6vulos cultivados<br />
in vitro.<br />
E...pecie Cultivar Refer<strong>en</strong>cia...<br />
C. aurantif()/ia -- Mitra y Chatuverdi (1972; citados por Button et al., ]974), Hidaka y Omura (1989),<br />
Swing. Ollitrault et al. (1992; citados por Engelmann et al., 1994), Grosser (comunicaci6n<br />
personal)<br />
C. aurantium L. - Vardi etal. (1982b), Galianaetal. (1993),Jim<strong>en</strong>ez y Guevara (1995)<br />
hfbrido Grosser (comunicaci6n personal)<br />
C. <strong>de</strong>licio.~a T<strong>en</strong>. - Ollitrault et al. (1992; citados por Engelmann et al., 1994)<br />
C.jambhiri Lush. 'Milam' Grosser (comunicaci6n personal)<br />
'Volkameriana' B<strong>en</strong>-Hayyim y Neumann (1983)<br />
C. limon (L.) 'Femminello Geraci y Tusa (1988), G<strong>en</strong>tile et al. (1993)<br />
Burm. Conti nella'<br />
'Villafranca' Kochba (no publicado, citado por Vardi et al., 1982b);<br />
Na<strong>de</strong>l y Spiegel-Roy (1987)<br />
C.meyeriY.Tan. 'Meyer' Singhetal.(1992)<br />
C. madur<strong>en</strong>.~i.~ Lour. -- Ling et al. (1989)<br />
C. miti.~ B]anco -'-""'-'- Sim et al. (1988)<br />
C.paradi.~i Macf. 'Duncan' Vardi etal. (1982b)<br />
'Marsh Seedless' Hidaka y Omura (1989)<br />
'Thompson Pink' Grosser (comunicaci6n personal)<br />
C. reticulata 'Cleopatra' Galiana et al. (]993), Ollitrault et al. (1992; citados por Engelmann et al., 1994),<br />
Blanco Gros ser (comunicaci6n personal)<br />
'Dancy' Vardi et al. (]982b)<br />
'Murcott' Vardietal.(1982b)<br />
'Ponkan' Vardietal.(1982b)<br />
C. .~in<strong>en</strong>.~i.~ Osb. 'Acosta 6' Jim<strong>en</strong>ez y Guevara (1995)<br />
'Bahia'<br />
'Hamlin'<br />
Kobayashi etal. (1984)<br />
Gmitter y Moore (1986), Ollitrault et al. (1992; citados por Engelmann et al., 1994),<br />
Niedz (1994)<br />
'Navelina ISA 315' Starrantino (no publicado, citado por Lucretti et al., 1990)<br />
'Pineapple' Galiana et al. (1993)<br />
'Salustiana'<br />
'Shamouti'<br />
Galianaetal (1993)<br />
Kochbaetal. (1972), Vardi etal. (1982b),<br />
Ollitrault et al. (1992; citados por Engelmann et al., 1994)<br />
'Shamouti Landau' Vardi etal. (1982b)<br />
'Succari' Grosser (comunicaci6n personal)<br />
'Tarocco' G<strong>en</strong>tileetal.(]993)<br />
'Trovita' Kobayashietal.(1984)<br />
'Ukumori'<br />
'Val<strong>en</strong>cia'<br />
Hidaka y Omura (1989)<br />
Hidaka y Omura (1989), Pasqual y Ando (1990), Grosser (~omunicaci6n personal)<br />
'Washington Navel' Button y Rijk<strong>en</strong>berg (1977), Kobayashi y Ohgawara (1988),<br />
Jim<strong>en</strong>ez y Guevara (1995)<br />
C. .~udachi Hort. - Kobayashi etal. (1984)<br />
C. tankan -- Hidaka y Omura (1989)<br />
C. un.~hiu Marc. 'Ishizuka-wa...e' Ling et al. (1990)<br />
'Kanazawa-wa...e' Ling et al. (1990)<br />
'Miyagawa-wa...e' Kunitakeetal.(1991)<br />
'Miyamoto-wa...e' Hidaka y Omura (1989)<br />
'Ohura-wase' Hidaka y Omura (1989)<br />
'Okit<strong>su</strong>-wase' Kunitakeetal. 1991<br />
continua...
190 AGRONOMIA COSTARRICENSE<br />
Cuadro 2. (Continuaci6n)<br />
R.,pecie Cultivar Refer<strong>en</strong>cia..,<br />
'Saruwatari' Hidaka y Omura (1989)<br />
'Sugiyama' Hidakay Omura (1989)<br />
'Tokumori-wase' Kunitake et al. (1991)<br />
Microcitrussp. ~ Vardietal.(1986)<br />
C. reticulata x C 'Nova' Grosser (comunicaci6n personal)<br />
paradi.\'i (Tangelo)<br />
'Page' Grosser (comunicaci6n personal)<br />
C. .\'in<strong>en</strong>.\'i.\' xC.<br />
reticulata<br />
(Tangor)<br />
'Murcott' Grosser (comunicaci6n personal)<br />
estos <strong>protoplastos</strong> condujo a la forrnacion <strong>de</strong> callo Hidaka y Omura, 1989).<br />
y la posterior obt<strong>en</strong>ci6n <strong>de</strong> embriones somaticos. EI aislami<strong>en</strong>to y reg<strong>en</strong>eracion <strong>de</strong> protoplas-<br />
Vardi (1981) y Vardi et al. (1982b) obtuvie- tos obt<strong>en</strong>idos a partir <strong>de</strong> callos <strong>de</strong> orig<strong>en</strong> no nuce-<br />
Ton <strong>protoplastos</strong> <strong>de</strong> los cultivaTes <strong>de</strong> naranja dulce Jar se limita a 10 logrado pOT Hidaka y Kajiura<br />
'Shamouti Nucelar' y 'Shamouti Landau'; <strong>de</strong> las (1988), qui<strong>en</strong>es obtuvieron callos con capacidad<br />
mandarinas (C. reticutata) 'Murcott', 'Dancy' y embriog<strong>en</strong>ica <strong>de</strong> la regi6n hipocotilar <strong>de</strong> embrio-<br />
'Ponkan'; <strong>de</strong> grapefruit (C. paradisi) 'Duncan'; <strong>de</strong> nes <strong>de</strong> C. sin<strong>en</strong>sis cv. 'Washington Navel', C.<br />
naranja agria (C. aurantium); y <strong>de</strong> limon 'Villa- yuko y C. reticutata cv. 'Ponkan'. Tambi<strong>en</strong> Ling<br />
franca' (C. timan). A partir <strong>de</strong> los <strong>protoplastos</strong> ob- et at. (1989) reg<strong>en</strong>eraron plantas <strong>de</strong> C. madur<strong>en</strong>sis<br />
t<strong>en</strong>idos lograron reg<strong>en</strong>erar plantulas con caracte- Lour. a partir <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong> obt<strong>en</strong>idos <strong>de</strong> callo <strong>de</strong>rirfsticas<br />
morfol6gicas norrnales. vado <strong>de</strong> la regi6n <strong>de</strong>l hipocotilo <strong>de</strong> plantulas difer<strong>en</strong>-<br />
Kobayashi et at. (1983) aislaron <strong>de</strong> manera<br />
similar <strong>protoplastos</strong> <strong>de</strong> callos nucelares <strong>de</strong> naranja<br />
ciadas POT <strong>cultivo</strong> <strong>de</strong> anteras.<br />
dulce cv. 'Trovita'. Posteriorrn<strong>en</strong>te, Kobayashi et Aislami<strong>en</strong>to <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong> a partir<br />
at. (1985) cultivaron <strong>en</strong> medio Ifquido los mismos<br />
callos anteriores, y aislaron pOT primera vez proto-<br />
<strong>de</strong> <strong>su</strong>sp<strong>en</strong>siones celulares<br />
plastos a partir <strong>de</strong> <strong>su</strong>sp<strong>en</strong>siones celulares. A partir <strong>de</strong> callos friables embriog<strong>en</strong>icos se<br />
Vardi et at. (1986) obtuvieron plantas a par- pue<strong>de</strong> iniciar facilm<strong>en</strong>te el <strong>cultivo</strong> <strong>de</strong> <strong>su</strong>sp<strong>en</strong>siotiT<br />
<strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong> <strong>de</strong>l g<strong>en</strong>ero Microcitrus. Esta nes celulares, ya que la composici6n misma <strong>de</strong>l<br />
rue la primera vez que se logr6 todo el proceso <strong>de</strong> callo perrnite que el tejido se disgregue facilm<strong>en</strong>te<br />
reg<strong>en</strong>eracion a partir <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong> hasta la for- <strong>en</strong> medio Ifquido <strong>en</strong> agitacion. Esto se ve favorecimaci6n<br />
<strong>de</strong> plantulas para una variedad monoem- do si se cultivan los callos <strong>en</strong> medio <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong><br />
brionica, y <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> las Rutaceas, <strong>de</strong> un g<strong>en</strong>ero <strong>de</strong>sprovisto <strong>de</strong> reguladores <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to pOT<br />
difer<strong>en</strong>te <strong>de</strong> Citrus. tiempo prolongado, ya que <strong>en</strong> los mismos se da un<br />
Kobayashi (1987) <strong>en</strong>contro, al observar 25 proceso <strong>de</strong> habituacion 0 in<strong>de</strong>p<strong>en</strong><strong>de</strong>ncia <strong>de</strong> la adiplantas<br />
reg<strong>en</strong>eradas a partir <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong> <strong>de</strong> na- ci6n extema <strong>de</strong> reguladores <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to (Kochranja<br />
dulce, que caracteres como morfologfa foliar ba y Spiegel-Roy, 1973).<br />
y floral, aceites <strong>de</strong> la hoja, patrones <strong>de</strong> iso<strong>en</strong>zimas Se ha obt<strong>en</strong>ido mayor cantidad <strong>de</strong> protoplasy<br />
numero <strong>de</strong> cromosomas, no variaban <strong>en</strong>tre los tos intactos a partir <strong>de</strong> <strong>su</strong>sp<strong>en</strong>siones celulares que<br />
individuos. Observo a<strong>de</strong>mas, uniforrnidad al com- <strong>de</strong> callos cultivados <strong>en</strong> medio solido (Kobayashi<br />
parar estos re<strong>su</strong>ltados con los obt<strong>en</strong>idos <strong>de</strong> plantu- et at., 1985; Citrus Research and Education C<strong>en</strong>las<br />
<strong>de</strong> orig<strong>en</strong> nucelar. Este y otros estudios evi<strong>de</strong>n- ter, Universidad <strong>de</strong> Florida, Grosser, 1994, (comucian<br />
que las plantas <strong>de</strong> Citrus <strong>de</strong>rivadas <strong>de</strong> proto- nicaci6n personal,), pOT 10 curil a veces se han preplastos<br />
pres<strong>en</strong>tan poca 0 ninguna variacion soma- ferido las primeras como material <strong>de</strong> orig<strong>en</strong> (Sim<br />
clonal (Kobayashi, 1987; Vardi y Galun, 1988; et at., 1988; Kunitake et at., 1991; Niedz, 1993).<br />
.
JIMENEZ: EI <strong>cultivo</strong> <strong>de</strong> protopla.~tos <strong>en</strong> cftricos y <strong>su</strong> pot<strong>en</strong>cial para el mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>etico 191<br />
Aislami<strong>en</strong>to <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong> a partir <strong>de</strong> hojas<br />
La mejor fu<strong>en</strong>te <strong>de</strong> material foliar para aislar<br />
Aislami<strong>en</strong>to <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong> a partir<br />
<strong>de</strong> yemas florales<br />
<strong>protoplastos</strong> ha sido a partir <strong>de</strong> las plantulas nucela- Se ha logrado aislar <strong>protoplastos</strong> haploi<strong>de</strong>s<br />
res <strong>de</strong>sarrolladas in vitro, ya que se elimina lanecesi- <strong>de</strong> las tetradas que se <strong>en</strong>cu<strong>en</strong>tran <strong>en</strong> las yemas flodad<br />
<strong>de</strong> un proceso <strong>de</strong> <strong>de</strong>sinfeccion antes <strong>de</strong>l aisla- rales <strong>de</strong> grapefruit (C. paradisi) y 'pamela' (C.<br />
mi<strong>en</strong>to. Tambi<strong>en</strong> se pue<strong>de</strong> utilizar hojas <strong>de</strong> plantulas grandis), ya que <strong>su</strong>s yemas son <strong>de</strong> mayor tamafio y<br />
<strong>en</strong> camaras <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to, invema<strong>de</strong>ro 0 <strong>en</strong> el cam- faciles <strong>de</strong> <strong>de</strong>sinfectar (Grosser y Gmitter, 1990a).<br />
po, pero es necesario efectuar una <strong>de</strong>sinfeccion previa.<br />
Estos <strong>protoplastos</strong> pue<strong>de</strong>n cont<strong>en</strong>er <strong>en</strong> algunos Reg<strong>en</strong>eracion <strong>de</strong> plantas a partir <strong>de</strong><br />
casas metabolitos secundarios que pue<strong>de</strong>n interferir <strong>protoplastos</strong><br />
con el <strong>cultivo</strong> efici<strong>en</strong>te <strong>de</strong> los mismos y <strong>de</strong> los hl'bridos<br />
somaticos <strong>en</strong> ev<strong>en</strong>tos <strong>de</strong> fusion. A difer<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> Se ha logrado la reg<strong>en</strong>eracion <strong>de</strong> plantas par<br />
los <strong>protoplastos</strong> obt<strong>en</strong>idos <strong>de</strong> calla friable y <strong>su</strong>sp<strong>en</strong>- medio <strong>de</strong> embriog<strong>en</strong>esis somatica a partir <strong>de</strong> prosiones<br />
celulares embriog<strong>en</strong>icos, los <strong>protoplastos</strong> <strong>de</strong> toplastos <strong>en</strong> varios g<strong>en</strong>otipos <strong>de</strong> Citrus (Cuadro<br />
hoja no son capaces <strong>de</strong> reg<strong>en</strong>erar <strong>en</strong> media <strong>de</strong> culti- 3). La naranja dulce es la especie <strong>en</strong> la cual se ha<br />
vo <strong>de</strong>sprovisto <strong>de</strong> reguladores <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to. observado mejor respuesta.<br />
Cuadro 3. G<strong>en</strong>eros, especies y cultivares <strong>de</strong> cftricos <strong>de</strong> los cuales se han reg<strong>en</strong>erado plantula.~ a partir <strong>de</strong> protopla.~tos embriog<strong>en</strong>icos.<br />
E.~pecie Cultivar Refer<strong>en</strong>cia.~<br />
C. aurantium L. - Vardi etai. (1982b), Hidaka y Omura (1989)<br />
C. jambhiri Lush. -- Vardi et at. (1990), Li (1991, cita
192 AGRONOMIA COSTARRICENSE<br />
Los <strong>protoplastos</strong> pue<strong>de</strong>n cultivarse inicialm<strong>en</strong>te<br />
<strong>en</strong> media <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong> lfquido, 0 <strong>en</strong> medio so-<br />
Fusion <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong> <strong>en</strong> citricos<br />
lidificado con agarosa <strong>de</strong> bajo punto <strong>de</strong> fusion. Es A traves <strong>de</strong> la hibridacion somatica (fusion<br />
recom<strong>en</strong>dable colocarlos a una <strong>de</strong>nsidad <strong>de</strong> culti- <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong>) <strong>en</strong> cftricos se obvian una serie <strong>de</strong><br />
vo <strong>de</strong> aproximadam<strong>en</strong>te 105 <strong>protoplastos</strong>/ml <strong>de</strong> problemas <strong>de</strong> la hibridacion sexual. Este es un<br />
media (Grosser y Gmitter, 1990a), pero para obte- proceso aditivo, que la mayorfa <strong>de</strong> las veces re<strong>su</strong>lneT<br />
divisiones celulares a <strong>de</strong>nsida<strong>de</strong>s m<strong>en</strong>ores ta <strong>en</strong> la formacion <strong>de</strong> alotetraploi<strong>de</strong>s, <strong>en</strong> los cuales<br />
(103-102 <strong>protoplastos</strong>/ml), los <strong>protoplastos</strong> pue- se combinan los g<strong>en</strong>omas nucleaTes completos <strong>de</strong><br />
<strong>de</strong>n seT cultivados sabre una capa <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong> ambos padres (Grosser y Gmitter, 1990b). La hecuya<br />
division fue <strong>de</strong>t<strong>en</strong>ida 0 disminuida mediante terocigosidad pot<strong>en</strong>cial <strong>de</strong> los hfbridos somaticos<br />
irradiacion con rayos X 0 gamma (Vardi y Raveh, es gran<strong>de</strong>, <strong>de</strong>p<strong>en</strong>di<strong>en</strong>do <strong>de</strong> las difer<strong>en</strong>cias alelicas<br />
1976). acumulativas <strong>en</strong>tre los padres. Y, <strong>en</strong> contraste con<br />
<strong>El</strong> tiempo requerido para que los protoplas- la hibridacion sexual, don<strong>de</strong> la her<strong>en</strong>cia <strong>de</strong>l g<strong>en</strong>otos<br />
<strong>en</strong> <strong>cultivo</strong> form<strong>en</strong> calla <strong>de</strong>p<strong>en</strong><strong>de</strong> <strong>de</strong> factores ma citoplasmatico (cloroplastos y mitocondrias)<br />
como la fu<strong>en</strong>te <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong> y la <strong>de</strong>nsidad <strong>de</strong> es predominantem<strong>en</strong>te materna, el hfbrido somatiplateo<br />
(Vardi y Galun, 1988). G<strong>en</strong>eralm<strong>en</strong>te se co recibe contribuciones citoplasmaticas <strong>de</strong> ambos<br />
observan las primeras divisiones celulares a los prog<strong>en</strong>itores (Grosser y Gmitter, 199Oc; Ohgawara<br />
10-14 dfas, y la formacion <strong>de</strong> embriones somati- y Kobayashi, 1991). Cierta variabilidad g<strong>en</strong>etic a<br />
cas <strong>en</strong> forma espontanea alas 6-16 semanas adicional pue<strong>de</strong> re<strong>su</strong>ltar <strong>de</strong> la recombinacion g<strong>en</strong>e-<br />
(Grosser y Gmitter, 1990a; Vardi y Galun, 1988). tica nuclear y citoplasmatica 0 <strong>de</strong> variacion somaclonal<br />
(Grosser y Gmitter, 1990 b y c).<br />
FUSI6N DE PROTOPLASTOS <strong>El</strong> primer ejemplo <strong>de</strong> hibridacion somatica<br />
<strong>en</strong> Citrus fue <strong>de</strong>scrito par Ohgawara et at. (1985).<br />
La aus<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> la pared celular permite que Este hfbrido somatico interg<strong>en</strong>erico <strong>en</strong>tre especies<br />
cuando 2 0 mas <strong>protoplastos</strong> <strong>en</strong>tran <strong>en</strong> contacto sexualm<strong>en</strong>te compatibles, fue producto <strong>de</strong> la fufntimo<br />
bajo ciertas condiciones, se adhierm1 <strong>en</strong>tre sian, utilizando PEG, <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong> <strong>de</strong> hoja <strong>de</strong><br />
sf, y bajo un estfmulo apropiado pue<strong>de</strong> provocar Poncirus trifoliata, con <strong>protoplastos</strong> obt<strong>en</strong>idos <strong>de</strong><br />
que ambas celulas se fusion<strong>en</strong> <strong>en</strong> una sola unidad. calla embriog<strong>en</strong>ico <strong>de</strong> C. sin<strong>en</strong>sis cv. 'Trovita'. <strong>El</strong><br />
Si bi<strong>en</strong> ev<strong>en</strong>tos <strong>de</strong> fusi6n pue<strong>de</strong>n ocurrir <strong>en</strong> forma primer hfbrido interespecffico fue producido <strong>en</strong>tre<br />
espontanea <strong>en</strong> una <strong>su</strong>sp<strong>en</strong>si6n <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong>, la C. sin<strong>en</strong>sis 'Washington' y C. unshiu 'Hayashi'<br />
tasa a la cual ocurre es extremadam<strong>en</strong>te baja, y <strong>en</strong> (mandarina Sat<strong>su</strong>ma); esta fue una combinaci6n<br />
consecu<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> poca aplicaci6n practica. Se han importante para el mejorami<strong>en</strong>to <strong>de</strong> injertos, <strong>en</strong><br />
<strong>de</strong>sarrollado varios metodos para aum<strong>en</strong>tar la efi- los cuales el progreso mediante el mejorami<strong>en</strong>to<br />
ci<strong>en</strong>cia <strong>en</strong> este proceso. Los que han t<strong>en</strong>ido mayor tradicional ha sido limitado (Kobayashi et al.,<br />
aceptaci6n son la fusi6n mediada par polietil<strong>en</strong> 1988b).<br />
glicol (PEG) y par la aplicaci6n <strong>de</strong> una corri<strong>en</strong>te Grosser et at. (1988b), obtuvieron mas <strong>de</strong><br />
electrica (electro-fusi6n). <strong>El</strong> primero provoca la 150 hfbridos somaticos <strong>en</strong>tre especies <strong>de</strong> dos geaglutinaci6n<br />
<strong>de</strong> los <strong>protoplastos</strong>, favoreci<strong>en</strong>do el neros sexualm<strong>en</strong>te incompatibles: Severinia disticontacto<br />
<strong>en</strong>tre elIas, mi<strong>en</strong>tras que el segundo los cha (Blanco) Swing y C. sin<strong>en</strong>sis cv. 'Hamlin'.<br />
alinea mediante la aplicaci6n <strong>de</strong> un difer<strong>en</strong>cial <strong>de</strong> Fusionaron <strong>protoplastos</strong> <strong>de</strong>rivados <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong>s empot<strong>en</strong>ciales,<br />
y luego los fusiona al aplicar un pulso briog<strong>en</strong>icos <strong>en</strong> <strong>su</strong>sp<strong>en</strong>si6n <strong>de</strong> 'Hamlin' con protoelectrico<br />
<strong>de</strong> corri<strong>en</strong>te directa (ac) (B<strong>en</strong>gochea y plastos <strong>de</strong>rivados <strong>de</strong> callos <strong>de</strong>l epic6tilo <strong>de</strong> plantu-<br />
Dodds, 1986). las <strong>de</strong> Severinia. Estos g<strong>en</strong>eros estan empar<strong>en</strong>ta-<br />
La hibridaci6n somatic a efectiva se habfa li- dos <strong>en</strong> forma muy distante. La producci6n <strong>de</strong> este<br />
mitado hasta hace poco a solanaceas, crucifera- hfbrido evi<strong>de</strong>nci6 la capacidad <strong>de</strong> esta tecnica para<br />
ceas y leguminosas. Sin embargo, los hfbridos so- sobrepasar barreras <strong>de</strong> hibridaci6n sexual y <strong>de</strong> esta<br />
maticos obt<strong>en</strong>idos no han t<strong>en</strong>ido importancia forma utilizar germoplasma anteriorm<strong>en</strong>te no disagron6mica<br />
directa, principalm<strong>en</strong>te porque son ponible, pero importante, <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> la familia Ruportadores<br />
<strong>de</strong> caracterfsticas in<strong>de</strong>seables <strong>de</strong> las va- taceae.<br />
rieda<strong>de</strong>s silvestres, que reduc<strong>en</strong> <strong>su</strong>s v<strong>en</strong>tajas hortf- <strong>El</strong> primer hfbrido intertribal fue producto <strong>de</strong><br />
colas, incluy<strong>en</strong>do la calidad <strong>de</strong>l producto cosecha- la fusi6n <strong>de</strong> naranja dulce 'Hamlin' con Claus<strong>en</strong>a<br />
ble (Grosser y Gmitter, 1990b). lansium (Lour.) Skeels, un miembro <strong>de</strong> la Tribu I
JIMENEZ: EI <strong>cultivo</strong> <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong> <strong>en</strong> cftricos y <strong>su</strong> pot<strong>en</strong>cial para el mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>etico 193<br />
Claus<strong>en</strong>eae (Cuadro 1). Debido a que las plantulas En cftricos g<strong>en</strong>eralm<strong>en</strong>te se efectua la fusi6n<br />
<strong>de</strong> este hfbrido no <strong>de</strong>sarrollaron falces, los brotes <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong> <strong>de</strong>rivados <strong>de</strong> hojas 0 callos no emfueron<br />
microinjertados <strong>en</strong> citrange 'Carrizo'. S610 briog<strong>en</strong>icos, con <strong>protoplastos</strong> obt<strong>en</strong>idos <strong>de</strong> callo<br />
Se obtuvieron dos plantas, las cuales crecieron friable 0 <strong>su</strong>sp<strong>en</strong>si6n celular embriog<strong>en</strong>ica (Grosbi<strong>en</strong><br />
hasta que alcanzaron 30 cm <strong>de</strong> altura; pero ser y Gmitter, 1990a), para po<strong>de</strong>r efectuar una seluego<br />
<strong>de</strong>g<strong>en</strong>eraron, y finalm<strong>en</strong>te murieron. Esto lecci6n temprana. Los <strong>protoplastos</strong> <strong>de</strong>rivados <strong>de</strong><br />
rue atribuido a incompatibilidad <strong>de</strong> injerto, 0 a una hoja no pue<strong>de</strong>n resintetizar la pared celular 0 iniincompatibilidad<br />
somatica lat<strong>en</strong>te. Posteriorm<strong>en</strong>te ciar mitosis <strong>en</strong> medio <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong> <strong>de</strong>sprovisto <strong>de</strong> rese<br />
logr6 la fusi6n <strong>de</strong> naranja dulce 'Hamlin' con guladores <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to, por 10 que los proto-<br />
Feronia timonia (L.) Swing., un miembro <strong>de</strong> la plastos no fusionados <strong>de</strong> esta especie muer<strong>en</strong><br />
Subtribu 3, Balsamocitrinae (Cuadro 1).. Sin em- (Grosser y Gmitter, 1990b). En los obt<strong>en</strong>idos <strong>de</strong><br />
bargo, las plantulas <strong>en</strong>raizadas <strong>de</strong> esta combina- callo la capacidad para formar plantas normales se<br />
ci6n no sobrevivieron la transfer<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> condicio- ve reducida a causa <strong>de</strong> <strong>su</strong> <strong>cultivo</strong> por perfodos<br />
nes asepticas, e int<strong>en</strong>tos repetidos <strong>de</strong> microinjertar- prolongados, con 10 cual se y<strong>en</strong> disminuidas las<br />
las han sido infructuosos. Tanto Ctaus<strong>en</strong>a como posibilida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> reg<strong>en</strong>eraci6n (Ohgawara et at.,<br />
Feronia ti<strong>en</strong><strong>en</strong> una compatibilidad <strong>de</strong> injerto lirni- 1985; Grosser y Gmitter, 1990a).<br />
tada con Citrus (Swingle y Reece, 1967). En el Por otra parte, <strong>en</strong> los productos <strong>de</strong> fusi6n<br />
Cuadro 1 se pres<strong>en</strong>tan los g<strong>en</strong>eros con los cuales ocurre cierta complem<strong>en</strong>taci6n que permite el crese<br />
ha logrado cierto exito al hibridarlos con Citrus. cimi<strong>en</strong>to <strong>de</strong> los hfbridos somaticos (Grosser y<br />
Saito et at. (1991) indican que el procedi- Gmitter, 1990b). Apar<strong>en</strong>tem<strong>en</strong>te la capacidad emmi<strong>en</strong>to<br />
<strong>de</strong> fusi6n qufmica utilizando PEG con<strong>su</strong>me briog<strong>en</strong>ica <strong>en</strong> cftricos esm bajo el control <strong>de</strong> g<strong>en</strong>es<br />
mucho tiempo, y es complicado y t6xico para los dominantes, que pue<strong>de</strong>n expresarse <strong>en</strong> los produc<strong>protoplastos</strong>;<br />
y que las tecnicas <strong>de</strong> electrofusi6n <strong>de</strong>- tos <strong>de</strong> fusi6n, permiti<strong>en</strong>do la obt<strong>en</strong>ci6n <strong>de</strong> plantas<br />
sarrolladas reci<strong>en</strong>tem<strong>en</strong>te son muy simples y efi- completas (Grosser y Gmitter, 1990a), y reci<strong>en</strong>teci<strong>en</strong>tes.<br />
Los primeros ht'bridos somaticos producidos m<strong>en</strong>te se ha planteado la posibilidad <strong>de</strong> que haya<br />
por medio <strong>de</strong> electrofusi6n fueron las sigui<strong>en</strong>tes alguna inger<strong>en</strong>cia <strong>de</strong>l g<strong>en</strong>oma mitocondrial (Saito<br />
combinaciones: <strong>su</strong>dachi (C. <strong>su</strong>dachi) y lima 'Mexi- et at., 1993) como se <strong>de</strong>scribe mas a<strong>de</strong>lante.<br />
cana' (C. aurantifotia) (Saito et al., 1991); mandarina<br />
'Sat<strong>su</strong>ma' (C, unshiu) y lim6n rugoso (C. jamb- Verificacion <strong>de</strong> los hibridos somaticos<br />
hiri) 0 yuzu (C, junos) (Hidaka y Omura, 1992). . ,<br />
<strong>El</strong> Cuadro 4 pres<strong>en</strong>ta una recopilaci6n <strong>de</strong> ,A pe~ar <strong>de</strong> que el esquema <strong>de</strong> ~el~cI.on d,eslos<br />
hfbridos somaticos interespecfficos e interge- ~r~t? ant<strong>en</strong>orm<strong>en</strong>te permlte un~ dlscnmmacl6n<br />
nericos informados para cftricos hasta la fecha, Im~lal d~ los protopla.st?~ no f~slonados, es,nececon<br />
informaci6n sobre el metodo <strong>de</strong> fusi6n, el nu- sarlo v<strong>en</strong>ficar la condlclon h~nda 0 no hfbnda <strong>de</strong><br />
mero <strong>de</strong> lantulas hfbridas obt<strong>en</strong>idas y el uso po- carla ?na <strong>de</strong> las pl~ntas o~te~ldas. Para este procet<br />
. I d P I ' so exist<strong>en</strong> una s<strong>en</strong>e <strong>de</strong> tecmcas, las cuales se <strong>de</strong>s-<br />
<strong>en</strong>cla e as mlsmas.<br />
T d ' b. I I' .ta .<br />
0 avla no se conoc<strong>en</strong> l<strong>en</strong> as Iml clones<br />
, ' d 1 h ' b .d ., .( t . C 't<br />
g<strong>en</strong>etic as e a I n aclon som(1 Ica <strong>en</strong> I rus,<br />
A I t.b' l .d d d . . rt fl '<br />
par<strong>en</strong>tem<strong>en</strong>te a compa I I I a e mJe 0 re eJa<br />
.b . .<br />
cn <strong>en</strong> a contmuaci 6n,<br />
.. , '<br />
Se espera que los hfbndos somatlcos <strong>en</strong> Cltrl-<br />
,., ,<br />
cos t<strong>en</strong>gan una morfologla vegetatlva mtermedla<br />
. 1 .<br />
clerto pot<strong>en</strong>cla para I n aclones som(1 Ica exi 0-,<br />
, '<br />
sa~, .Aunque se han produc!do ~lantas hfbndas so-<br />
,<br />
y mamfiest<strong>en</strong> una expresl6n compuesta <strong>de</strong> marca-<br />
dores moleculares. Las tecnicas disponibles para<br />
~atlcas ~ntre ocho combmaclones sexualm<strong>en</strong>~e verificar que las plantas reg<strong>en</strong>eradas, pre<strong>su</strong>mibleincompatibles<br />
~Cu~dro 4~, s610 un~ se ha pr?~ucI- m<strong>en</strong>te <strong>de</strong> heterocariones, son <strong>en</strong> realidad hfbridos<br />
do ~ntre c?mbmaclones incompatIbles por mJerto somaticos, incluy<strong>en</strong> la evaluaci6n vi<strong>su</strong>al por una<br />
(Shmozakl et at., 1992), persona familiarizada con la morfologfa <strong>de</strong> los pa-<br />
. , . . , .<br />
Selecclon <strong>de</strong> embrlones hibrldos somatlcos<br />
dres, la <strong>de</strong>terminaci6n <strong>de</strong>l numero <strong>de</strong> cromosomas<br />
durante la mitosis, la caracterizaci6n molecular me-<br />
.<br />
,<br />
1 h ' b . d .<br />
.<br />
( t .<br />
. t e<br />
. "diante electroforesis <strong>de</strong> ADN 0 iso<strong>en</strong>zimas yla se-<br />
. , La clav~ para ,un programa, exI~oso <strong>de</strong> hlbn- paraci6n cromatografica <strong>de</strong> aceites <strong>de</strong> hoja. Sin emdaclon<br />
somatica ~e,sl<strong>de</strong> <strong>en</strong> la .a~llcacI6n <strong>de</strong> un ~s- bargo, ninguno <strong>de</strong> estos metodos por sf solo provee<br />
quema <strong>de</strong> selecclon muy <strong>en</strong>cl<strong>en</strong>te, que permlta conclusiones <strong>de</strong>terminantes, ya que carla uno ti<strong>en</strong>e<br />
i<strong>de</strong>ntificar y seleccionar los hfbridos. <strong>su</strong>s limitaciones (Grosser y Gmitter, 1990a),<br />
n<br />
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,
194 AGRONOMIA COST ARRICENSE<br />
Cuadra 4. Hibridos somaticos obt<strong>en</strong>idos <strong>en</strong> la familia Rutaceae mediante fusi6n <strong>de</strong> protopla.~tos.<br />
Prog<strong>en</strong>itores y fu<strong>en</strong>te<strong>de</strong> protopla.~tos( I) Tipo <strong>de</strong> NQ. <strong>de</strong> Usa Refer<strong>en</strong>cia<br />
fusi6n(2) planta.~ pot<strong>en</strong>cial(3)<br />
Hibridos interespecfficos:<br />
C. auranf(t()lia lima 'Key' (s.e.) + C. PEG >40 P,I Grosser ef at. (1989)<br />
sin<strong>en</strong>sis 'Val<strong>en</strong>cia' (hoja)<br />
C. auranf(t()lia lima mexicana (c.e. cibrido) +<br />
C. limon 'Eureka' (hoja)<br />
E 5 I Saito et at. (1994)<br />
C. autanfium naranja agria + C. limonia PEG? I Grosser (1993)<br />
'Rangpur'<br />
C. auranfium naranja agria (c.e.) + C. PEG 113 P Louzada et at. (1992)<br />
volkameriana 'lim6n Volkamer' cig6tico (hoja)<br />
C.jambhiri'Milam' (c.e.)+C. limon PEG I P,I Tusaetal.(1992)<br />
'Pemminello' (hoja)<br />
C. jambhiri 'Milam' + C. reficulafa 'Sun Chu<br />
Sha'<br />
PEG? I Grosser (1993)<br />
C. paradi.vi 'Thompson Pink' (s.e.) + tangor<br />
'Murcott' (hoja)<br />
PEG 19 I Grosser ef at. (1992b)<br />
C. reficulafa mandarina 'Cleopatra' (c.e) + C.<br />
auranfium naranja agria (hoja)<br />
PEG 171 P Louzada et at. (1992)<br />
C. reficuiafa mandarina 'Cleopatra' (c.e) + C.<br />
jambhiri 'lim6n rugosa' (hoja)<br />
PEG 5 P Louzada ef at. (1992)<br />
C. reficulafa mandarina 'Cleopatra' (c.e) + C. PEG >1000 P Louzada et at. (1992)<br />
limonia 'Rangpur' (hoja)<br />
C. reticula fa mandarina 'Cleopatra' (c.e) + C. PEG 8 P Louzada et at. (1992)<br />
volkameriana 'lim6n Volkamer' (hoja)<br />
C. .vin<strong>en</strong>.vi.v 'Bahia' navel (s.e.) + C. paradi.vi<br />
'Marsh' (hoja)<br />
PEG 1000 P Louzadaefal.(1992)<br />
'Rangpur' (hoja)<br />
C. .vin<strong>en</strong>.vi.v 'Hamlin' (c.e.) + C. reticula fa PEG I I Grosser et al. (1992a)<br />
'Dancy' (hoja)<br />
C. .vin<strong>en</strong>.vi.v 'Hamlin' (c.e.) + [mandarina PEG? I Grosser (1993)<br />
'Clem<strong>en</strong>tina' x tangelo 'Minneola']<br />
C. .vin<strong>en</strong>.vLv 'Trovita' (s.e.) + C. un.vhiu PEG ? I Kobayashi y Ohgawara (1988)<br />
'Haya.~hi' mandarina Sat<strong>su</strong>ma (hoja)<br />
C. .vin<strong>en</strong>.vLv 'Val<strong>en</strong>cia' (s.e.) + C. jambhiri PEG 12 P Grosser ef at. (1992b)<br />
lim6n rugosa (hoja)<br />
C..vin<strong>en</strong>.vLv'Val<strong>en</strong>cia'(s.e.)+C./imon PEG 25 P,I Tusaefal.(1990)<br />
'Pemminello' (hoja)<br />
C. .vin<strong>en</strong>.vLv 'Val<strong>en</strong>cia' + [tangelo 'Robinson' x PEG? I Grosser (1993)<br />
tangor 'Temple']<br />
C. sin<strong>en</strong>sis 'Washington' navel (s.e.) + C. PEG I I Kobayashi et at. (1988b)<br />
un.vhiu 'Hayashi' mandarina Sat<strong>su</strong>ma (hoja)<br />
C. sin<strong>en</strong>.vLv 'Washington' navel (s.e.) + tangor PEG? I Kobaya.~hiefal.(1988a)<br />
'Murcott' (hoja)<br />
C. .vudachi (s.e.) + C. auranfi!olia lima E 12 I Saito et at. (1991)<br />
mexicana (hoja)<br />
C. .vudachi (s.e.) + C. limon 'Eureka' (hoja) E 6 ? Saito et at. (1993)<br />
C.un.vhiu'Saruwatari'(s.e.)+C.jambhiri E?? Hidakay Omura (1992)<br />
lim6n rugosa (hoja)<br />
C. unshiu 'Saruwatari' (s.e.) + C. junos yuzu (hoja) E?? Hidaka y Omura (1992)<br />
Tangelo 'Nova' (c.e.) + C. .vin<strong>en</strong>.vis 'Succari' (hoja) PEG 2 I Grosser et at. (1992a)<br />
Tangelo 'Nova' (c.e.) + C. grandis 'Hirado<br />
Buntan' cig6tico (hoja)<br />
PEG >10 I Grosser (1992)<br />
continua...
Cuadro 4. (Continuaci6n)<br />
JIMENEZ: EI <strong>cultivo</strong> <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong> <strong>en</strong> citricos y <strong>su</strong> pot<strong>en</strong>cial para el mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>etico 195<br />
Prog<strong>en</strong>itores y fu<strong>en</strong>te <strong>de</strong> protopla.'\tos( I) ! .,, Tipo <strong>de</strong> No. <strong>de</strong> Uso Refer<strong>en</strong>cia<br />
fusi6n(2) planta.'\ pot<strong>en</strong>cial(3)<br />
Tangelo 'Page' (c.e.) + C. .~in<strong>en</strong>.~i.~ 'Succari' (hoja) PEG 2 I Grosser (1994a)<br />
Hibrido <strong>de</strong> C. aurantium ('Smooth Flat PEG >70 P Louzada et al. (1992)<br />
Seville') (c.e.) + C. jambhiri lim6n rugoso (hoja) ,I;,<br />
Hibridos interg<strong>en</strong>ericos; padres sexualm<strong>en</strong>te compatibles:<br />
C. reticulata mandarina 'Cleopatra' (c.e) + PEG 5 P Grosser et al. (1992b)<br />
citrumelo 'Swingle' (hoja)<br />
C. reticulata mandarina 'Cleopatra' (c.e) + P. PEG >200 P Grosser (1992)<br />
tri!o!iata 'Arg<strong>en</strong>tine' (hoja)<br />
C. reticulata mandarina 'Cleopatra' (c.e) + P. PEG >150 P Grosser et al. (1992b)<br />
trifoliata 'Flying Dragon' (hoja)<br />
C. .~in<strong>en</strong>.~i.~ 'Bahia' (s.e.) + citrange 'Troyer' (hoja) PEG 20 P,I Ohgawara et al. (1991)<br />
C. .~in<strong>en</strong>.~i.~ 'Hamlin' (s.e.) + Ponciru.~ PEG >300 P Grosser et al. (1988a)<br />
triftJliata 'Flying Dragon' (hoja)<br />
C. .~in<strong>en</strong>.~i.~ 'Succari' + P. trifllliata 'Arg<strong>en</strong>tine' PEG? P Grosser (1993)<br />
C. .~in<strong>en</strong>.~i.~ 'Trovitai (s.e.) + P. trifoliata (hoja) PEG > lOP Ohgawara et al. (1985)<br />
C. .~in<strong>en</strong>.~i.~ 'Trovitai (s.e.) + citrange 'Troyer' (hoja) PEG 17 P,I Kobaya.'\hi y Ohgawara (1988)<br />
C. .~in<strong>en</strong>.~i.~ 'Val<strong>en</strong>cia' (c.e.) + citrange 'Carrizo' (hoja) PEG 7 P,I Louzada et al. (1992)<br />
C..~in<strong>en</strong>.~i.~'Val<strong>en</strong>cia'(c.e.)+Fortunel/a<br />
cra.~sifolia 'Meiwa' kumquat (hoja)<br />
PEG >40 P,I D<strong>en</strong>getal.(1992)<br />
Hibridos interg<strong>en</strong>ericos; padre-'\ sexualm<strong>en</strong>te incompatibles:<br />
C. aurantiflJlia lima 'mexicana' (s.e.) + E '7 P Takayanagi et al. (1992)<br />
Ferlmiel/a Lucida (hoja) ,<br />
C. aurantiflJlia lima 'mexicana' (s.e.) + E? P Takayanagi et al. (1992)<br />
Swinglea glutinll.~a (hoja)<br />
C. reticulata mandarina 'Cleopatra' (s.e.) + PEG >35 P Grosse, et al. (1990)<br />
Citrllp.~i.~ gil/etiana (hoja)<br />
C..~in<strong>en</strong>.~i.~'Hamlin'(c.e.)+Atalantia PEG 5 P,I Louzadaetal.(1993)<br />
ceylanica (hoja)<br />
C. .~in<strong>en</strong>.~i.~ 'Hamlin' (s.e.) + CitroJl.~i.~ PJ::G >150 P,I Grosser y Gmitter (1990b)<br />
gil/etiana (hoja/callo n.e.')<br />
C. .~in<strong>en</strong>.~i.~ 'Hamlin' (s.e.)'+ Severinia PEG >50 P,I Grosser et al. (1992b)<br />
buxifolia (callo n.e.)<br />
C..~in<strong>en</strong>.~i.~'Hamlin'(s.e.)+Severinia PEG >150 P,I Grosseretal.(1988b)<br />
di.~ticha (callo n.e.)<br />
C. .~in<strong>en</strong>.~i.~ 'Trovita' (s.e.) + Murraya E? P Shinozaki et al. (1992)<br />
paniculata (hoja)<br />
(I )s.e.: <strong>su</strong>sp<strong>en</strong>si6n embriog<strong>en</strong>ica; n.e.: no embriog<strong>en</strong>ico; c.e.: callo embriog<strong>en</strong>ico; (2)PEG: fusi6n quimica utilizando polietil<strong>en</strong> glicol;<br />
E: fusi6n mediante la aplicaci6n <strong>de</strong> una corri<strong>en</strong>te electrica; (3)P: patr6n; I: injerto<br />
Evaluacion morfologica. Las difer<strong>en</strong>cias morfo- 1990b) Y <strong>de</strong> pigm<strong>en</strong>tos rajas <strong>de</strong> Severinia (Groslogicas<br />
que exist<strong>en</strong> <strong>en</strong>tre Citrus y los g<strong>en</strong>eros rela- ser et at., 1988b).<br />
cion ados facilitan <strong>en</strong> gran medida la i<strong>de</strong>ntificaci6n Aunque es mas diffcil utilizar difer<strong>en</strong>cias<br />
<strong>de</strong> los hfbridos somaticos. Caracteres bajo el con- morfologicas para i<strong>de</strong>ntificar hfbridos somaticos<br />
trol <strong>de</strong> g<strong>en</strong>es dominantes 0 codominantes se i<strong>de</strong>n- interespecfficos, se pue<strong>de</strong>n utilizar caracterfsticas<br />
tifican g<strong>en</strong>eral m<strong>en</strong>te con facilidad <strong>en</strong> los hfbridos m<strong>en</strong>os promin<strong>en</strong>tes, como el tamafio <strong>de</strong>l 'ala' <strong>en</strong><br />
somaticos, particularm<strong>en</strong>te cuando se cruzan pa- el pecfo10, 1a forma y el grosor <strong>de</strong> la hoja, que gedres<br />
muy poco relacionados fi1og<strong>en</strong>eticam<strong>en</strong>te. neralm<strong>en</strong>teson intermedios a los <strong>de</strong> los prog<strong>en</strong>ito-<br />
Las plantas hfbridas pue<strong>de</strong>n i<strong>de</strong>ntificarse par 1a res (Grosser y Gmitter, 1990a).<br />
expresion <strong>de</strong> cualquier caracter unico al prog<strong>en</strong>i- Uti1izar caracteres morfol6gicos como unico<br />
tor no embriog<strong>en</strong>ico. Algunos ejemplos incluy<strong>en</strong>: metoda no es correcto, ya que se ha <strong>en</strong>contrado,<br />
la expresion <strong>de</strong> la hoja trifoliada <strong>de</strong> Poncirus par ejemplo, morfologfa intermedia <strong>en</strong> reg<strong>en</strong>eran-<br />
(Grosser et at., 1988a; Ohgawara et at., 1985), la tes originados par fusi6n <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong>, vera con<br />
hoja p<strong>en</strong>tafoliada <strong>de</strong> Citropsis (Grosser y Gmitter, eliminacion <strong>de</strong> cierta cantidad <strong>de</strong> material cromo-
196 AGRONOMIA COSTARRICENSE<br />
s6mico (pre 0 posfusi6n). Estas plantas no portan diploi<strong>de</strong> y bastante similitud con el prog<strong>en</strong>itor <strong>de</strong>toda<br />
la informaci6n g<strong>en</strong>etica que <strong>de</strong>b<strong>en</strong> incluir los rivado <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong> <strong>de</strong> hoja. Mediante este anaverda<strong>de</strong>ros<br />
hfbridos somaticos tetraploi<strong>de</strong>s. lisis se comprob6 que estas plantas eran <strong>en</strong> realidad<br />
cfbridos, con g<strong>en</strong>oma nuclear <strong>de</strong>l prog<strong>en</strong>itor<br />
Determinacion <strong>de</strong>l numero <strong>de</strong> cromosomas. Los embriog<strong>en</strong>ico, y g<strong>en</strong>oma mitocondrial <strong>de</strong>l otro.<br />
experim<strong>en</strong>tos <strong>de</strong> fusi6n somatica <strong>en</strong> cftricos g<strong>en</strong>e- Como se m<strong>en</strong>cion6 anteriorm<strong>en</strong>te, y se <strong>de</strong>scribe<br />
ralm<strong>en</strong>te se ori<strong>en</strong>tan hacia la obt<strong>en</strong>ci6n <strong>de</strong> hetero- con mas <strong>de</strong>talle a<strong>de</strong>lante, existe, probablem<strong>en</strong>te,<br />
cariones, celulas tetraploi<strong>de</strong>s que pose<strong>en</strong> g<strong>en</strong>om as un efecto <strong>de</strong>l g<strong>en</strong>oma mitocondrial <strong>en</strong> la capacicompletos<br />
<strong>de</strong> ambos prog<strong>en</strong>itores. La evaluaci6n dad <strong>de</strong> reg<strong>en</strong>eraci6n <strong>de</strong> los <strong>protoplastos</strong> <strong>en</strong> medio<br />
<strong>de</strong> los posibles hfbridos mediante conteo <strong>de</strong> cro- <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong>.<br />
mosomas unicam<strong>en</strong>te, es poco confiable, ya que Tambi<strong>en</strong> las tecnicas moleculares, utilizadas<br />
los reg<strong>en</strong>erantes homocariones (2 juegos comple- por sf solas, a pesar <strong>de</strong> ser muy precisas, pue<strong>de</strong>n<br />
tos <strong>de</strong> cromosomas <strong>de</strong>l mismo prog<strong>en</strong>itor), tam- dar falsos positivos. Por ejemplo, si las plantas rebi<strong>en</strong><br />
poseeran un numero tetraploi<strong>de</strong> <strong>de</strong> cromoso- g<strong>en</strong>eradas son quimeras, <strong>de</strong>bido a un orig<strong>en</strong> multimas,<br />
y podrfan ser confundidos con hfbridos hete- celular <strong>en</strong> lugar <strong>de</strong> unicelular, <strong>en</strong>tonces las tecnirocariones.<br />
cas moleculares indicarfan la pres<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> hfbridos,<br />
<strong>de</strong>bido a la pres<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> poblaciones <strong>de</strong> celu-<br />
Analisis electroforetico <strong>de</strong> iso<strong>en</strong>zimas <strong>de</strong> hoja.<br />
Los sistemas <strong>de</strong> iso<strong>en</strong>zimas mas utiles para la ve-<br />
las heterog<strong>en</strong>eas <strong>en</strong> la planta.<br />
rificaci6n <strong>de</strong> hfbridos somaticos, son aquellos con APLICACIONES DE LA FUSI6N DE<br />
el control g<strong>en</strong>etico mas simple y con la mayor dis- PROTOPLASTOS<br />
paridad <strong>de</strong> alelos <strong>en</strong>tre los prog<strong>en</strong>itores (cada prog<strong>en</strong>itor<br />
<strong>de</strong>be t<strong>en</strong>er al m<strong>en</strong>os un alelo distinto <strong>de</strong>l La fusi6n <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong> pue<strong>de</strong> t<strong>en</strong>er 'apliotro).<br />
De los sistemas <strong>en</strong>zimaticos que se han es- caciones hortfcolas <strong>de</strong> gran importancia, tanto patudiado<br />
hay 3 que han probado, a traves <strong>de</strong>l tiem- ra el mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>etico <strong>de</strong> patrones como <strong>de</strong><br />
po, ser muy utiles: fosfoglucomutasa (PGM), ma- injertos. Con relaci6n a los pnmeros, se conoc<strong>en</strong><br />
Jato <strong>de</strong>shidrog<strong>en</strong>asa (MDH) y fosfohexosa isome- mas <strong>de</strong> 20 caracterfsticas hortfcolas y patol6gicas<br />
rasa (PHI), <strong>en</strong> los cuales los alelos iso<strong>en</strong>zfmicos se importantes que son controladas 0 <strong>de</strong>terminadas<br />
expresan <strong>en</strong> forma codominante (Grosser y Gmit- <strong>en</strong> cftricos por los patrones (Grosser y Gmitter,<br />
ter, 1 990a). 1990a). Para el <strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> patrones mejorados<br />
Los analisis por iso<strong>en</strong>zimas pue<strong>de</strong>n ser <strong>en</strong>- <strong>en</strong> cftricos exist<strong>en</strong> dos aplicaciones principales: la<br />
gafiosos <strong>en</strong> casos <strong>en</strong> los cuales ha ocurrido perdida producci6n <strong>de</strong> hfbridos alotetraploi<strong>de</strong>s <strong>de</strong> cultiva<strong>de</strong><br />
material g<strong>en</strong>etico. Tambi<strong>en</strong>, esta tecnica es <strong>de</strong> res que posean caracterfsticas complem<strong>en</strong>tarias y<br />
poco valor cuando se necesita la verificaci6n <strong>de</strong> la formaci6n <strong>de</strong> hfbridos <strong>en</strong>tre Citrus y especies<br />
cfbridos (como se vera mas a<strong>de</strong>lante), ya que las silvestres incompatibles. Por <strong>su</strong> parte, el mejoraiso<strong>en</strong>zimas<br />
comunm<strong>en</strong>te utilizadas esmn codifica- mi<strong>en</strong>to <strong>de</strong> injertos se ha ori<strong>en</strong>tado principalm<strong>en</strong>te<br />
das <strong>en</strong> el nucleo. En tales casos, 0 para verificar hacia la producci6n <strong>de</strong> triploi<strong>de</strong>s sin semilla, con<br />
hfbridos creados por fusi6n <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong> <strong>de</strong> es- calidad <strong>de</strong> fruto similar al <strong>de</strong> las yarieda<strong>de</strong>s actuapecies<br />
muy cercanas <strong>en</strong>tre sf, se pue<strong>de</strong>n aplicar les, 10 cual podrfa estimular el crecimi<strong>en</strong>to <strong>de</strong>l<br />
tecnicas <strong>de</strong> caracterizaci6n <strong>de</strong> ADN mas s<strong>en</strong>sibles,<br />
tanto a g<strong>en</strong>omas nucleares como citoplasmaticos<br />
mercado <strong>de</strong>fruta fresca.<br />
(Grosser y Gmitter, 1990a). Mejorami<strong>en</strong>to <strong>de</strong> patrones<br />
AnaIisis <strong>de</strong> ADN ribosomal y mitocondrial. Es- Formacion <strong>de</strong> hibridos alotetraploi<strong>de</strong>s <strong>en</strong>tre<br />
tas tecnicas son mas sofisticadas que los analisis cultivares con caracteristicas complem<strong>en</strong>tarias.<br />
<strong>de</strong> iso<strong>en</strong>zimas. Se utiliza el ADN ribosomal ya Debido a que la hibridaci6n somatica es un proceque<br />
se ha observado que es altam<strong>en</strong>te conservado so aditivo, sin segregaci6n, las caracterfsticas que<br />
a nivel filog<strong>en</strong>etico, y por 10 tanto permite <strong>de</strong>ter- estan bajo el control <strong>de</strong> g<strong>en</strong>es dominantes ocodominar<br />
difer<strong>en</strong>cias con mayor propiedad. <strong>El</strong> ADN minantes <strong>en</strong> uno <strong>de</strong> los padres ti<strong>en</strong><strong>en</strong> gran posibimitocondrial<br />
se utiliz6 para la verificaci6n <strong>de</strong> cf- lidad <strong>de</strong> expresarse <strong>en</strong> cualquier hfbrido somatico<br />
bridos y para esclarecer la naturaleza <strong>de</strong> plantas alotetraploi<strong>de</strong>. Algunas caracterfsticas que estan<br />
reg<strong>en</strong>eradas <strong>en</strong> un ev<strong>en</strong>to <strong>de</strong> fusi6n, con g<strong>en</strong>oma bajo el dominio <strong>de</strong> g<strong>en</strong>es dominantes <strong>en</strong> Citrus
JIMENEZ: EI <strong>cultivo</strong> <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong> <strong>en</strong> citricos y <strong>su</strong> pot<strong>en</strong>cial para el mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>etico 197<br />
son: poliembrionfa, resist<strong>en</strong>cia al frIo, a Phytopht- ma triploi<strong>de</strong> 'Persa'. Los triploi<strong>de</strong>s g<strong>en</strong>eral m<strong>en</strong>te<br />
hora parasitica, al virus <strong>de</strong> la tristeza y al nemato- se obti<strong>en</strong><strong>en</strong> <strong>de</strong> la hibridacion <strong>de</strong> madres tetraploido<br />
Tyl<strong>en</strong>chulus semip<strong>en</strong>etrans (Hutchison, 1985). <strong>de</strong>s con padres diploi<strong>de</strong>s; pue<strong>de</strong>n <strong>su</strong>rgir <strong>en</strong> forma<br />
A<strong>de</strong>mas, IDS g<strong>en</strong>es recesivos <strong>de</strong>letereos que se <strong>en</strong>- espontanea <strong>en</strong> poblaciones <strong>de</strong> plantulas nucelares<br />
cu<strong>en</strong>tran <strong>en</strong>mascarados <strong>en</strong> IDS prog<strong>en</strong>itores no se u obt<strong>en</strong>idas <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong> in vitro <strong>de</strong> cultivaTes poexpresan<br />
<strong>en</strong> IDS hfbridos somaticos. POT ejemplo, liembrionicos diploi<strong>de</strong>s, mediante la aplicacion <strong>de</strong><br />
el hfbrido somatico <strong>en</strong>tre C. sin<strong>en</strong>sis 'Hamlin' colchicina (Oiyama y Okudai, 1986; Grosser y<br />
(naranja dulce) y P. trifoliata 'Flying Dragon' Gmitter, 1990a). Se obt<strong>en</strong>er plantas triploi<strong>de</strong>s mepue<strong>de</strong><br />
llegar a exhibiT todas las caracterfsticas diante cruces sexuales <strong>en</strong>tre un hfbrido somatico<br />
complem<strong>en</strong>tarias <strong>de</strong> cada prog<strong>en</strong>itor, como resis- tetraploi<strong>de</strong> y una planta diploi<strong>de</strong>, 0 bi<strong>en</strong> fusionant<strong>en</strong>cia<br />
a Phytophthora, tristeza y nematodos, aportadas<br />
por 'Flying Dragon', y cierta tolerancia a<br />
do directam<strong>en</strong>te celulas diploi<strong>de</strong>s con aploi<strong>de</strong>s.<br />
'blight' POT naranja dulce. Tambi<strong>en</strong> ti<strong>en</strong>e la v<strong>en</strong>ta- Produccion <strong>de</strong> padres alotetraploi<strong>de</strong>s para uso<br />
ja <strong>de</strong> reducir el tamafio <strong>de</strong>l arbol para lograr plan- <strong>en</strong> cruces sexuales 4x:2x. La hibridacion somatitaciones<br />
con mayor <strong>de</strong>nsidad. Los patrones diploi- ca interespecffica provee un metodo excel<strong>en</strong>te<br />
<strong>de</strong>s 'Carrizo' y 'Troyer' que se originaron <strong>de</strong> cru- para la produccion <strong>de</strong> prog<strong>en</strong>itores heterocigotos<br />
ces sexuales <strong>en</strong>tre C. sin<strong>en</strong>sis y P. trifoliata. Sin (<strong>en</strong>tre padres complem<strong>en</strong>tarios), los cuales<br />
embargo no exhib<strong>en</strong> todas las caracterfsticas ante- podrfan seT utilizados <strong>en</strong> cruces sexuales <strong>de</strong> tetrariores,<br />
<strong>de</strong>bido a la segregacion meiotic a (Grosser ploi<strong>de</strong>s x diploi<strong>de</strong>s para g<strong>en</strong>erar una prog<strong>en</strong>ie<br />
y Gmitter, 1990 a y c). cigotica triploi<strong>de</strong>, pot<strong>en</strong>cial m<strong>en</strong>te sin semilla.<br />
Formacion <strong>de</strong> hibridos alotetraploi<strong>de</strong>s <strong>en</strong>tre<br />
Podrfa seT v<strong>en</strong>tajoso utilizar hfbridos somaticos<br />
alotetraploi<strong>de</strong>s que exhiban una heterocigQcidad<br />
Citrus y especies silvestres sexualm<strong>en</strong>te incom- maxima <strong>en</strong> dichos cruces, con el fin <strong>de</strong> producir<br />
patibles. Muchos g<strong>en</strong>eros empar<strong>en</strong>tados con variacion maxima <strong>en</strong> la prog<strong>en</strong>ie. POT ejemplo, si<br />
Citrus expresan ciertas caract<strong>en</strong>sticas <strong>de</strong> impor- el hfbrido somatico <strong>en</strong>tre lim~ 'Key' y naranja<br />
tancia (tolerancia a factores <strong>de</strong> estres, caracterfsti- dulce 'Val<strong>en</strong>cia' es fertil, podrfa seT hibridado secas<br />
hortfcolas y productividad). Tambi<strong>en</strong> son una xualm<strong>en</strong>te con ciertos cultivaTes diploi<strong>de</strong>s <strong>de</strong> lima,<br />
fu<strong>en</strong>te pot<strong>en</strong>cial importante para resist<strong>en</strong>cia a para int<strong>en</strong>tar transferir tolerancia al frIo, mejorar<br />
'blight', 10 cual no se ha <strong>en</strong>contrado <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong>l ge- el tamafio y calidad <strong>de</strong>l fruto, y toleranciaJresisnero<br />
Citrus. Muchas especies empar<strong>en</strong>tadas con t<strong>en</strong>cia a <strong>en</strong>fermeda<strong>de</strong>s <strong>de</strong> la naranja dulce <strong>en</strong> una<br />
Citrus son compatibles pOT injerto, pero incompa- prog<strong>en</strong>ie triploi<strong>de</strong>, sin semilla, <strong>de</strong>l tipo <strong>de</strong> la lima<br />
tibles sexualm<strong>en</strong>te, y no son aceptadas <strong>de</strong>s<strong>de</strong> el (Grosser et al., 1989). Tambi<strong>en</strong> el hfbrido somatipunto<br />
<strong>de</strong> vista hortfcola cuando son utilizadas di- co <strong>en</strong>tre naranja 'Washington' y mandarina Sat<strong>su</strong>rectam<strong>en</strong>te<br />
como patrones (Citropsis gilletiana, ma 'Hayashi' (Kobayashi et al., 1988b) pue<strong>de</strong> seT<br />
Severinia, Feronia, Swinglea, etc.) (Grosser y cruzado sexualm<strong>en</strong>te con <strong>su</strong> complem<strong>en</strong>tario di-<br />
Gmitter, 1990b). Sin embargo, pOT medio <strong>de</strong> la hi- ploi<strong>de</strong>, ya sea mandarina 0 naranja dulce, para<br />
bridacion somatica pue<strong>de</strong>n aportar una serie <strong>de</strong> ca- g<strong>en</strong>erar plantas pot<strong>en</strong>cial m<strong>en</strong>te sin semilla, faciles<br />
racterfsticas importantes que no estarfan disponi- <strong>de</strong> pelar, con maduracion temprana y con bu<strong>en</strong>a<br />
bles <strong>de</strong> otra forma, como resist<strong>en</strong>cia a calidad <strong>de</strong> fruto. Muchas mas combinaciones<br />
Phytophthora citrophthora, a nematodos y a otra triploi<strong>de</strong>s serlin posibles con forme se g<strong>en</strong>er<strong>en</strong><br />
serie <strong>de</strong> ag<strong>en</strong>tes bioticos muy perjudiciales (Gros- nuevos prog<strong>en</strong>itores alotetraploi<strong>de</strong>s interespecffiseT<br />
et al., 1988b; Grosser y Gmitter, 1990b). Algunos<br />
hfbridos somaticos <strong>de</strong>sarrollados <strong>en</strong> este<br />
coso<br />
s<strong>en</strong>tido han sido propagados e introducidos <strong>en</strong> Produccion directa <strong>de</strong> triploi<strong>de</strong>s por medio <strong>de</strong><br />
campos experim<strong>en</strong>tales, con el objeto <strong>de</strong> evaluar la fusion <strong>de</strong> n+2n. La fusion <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong> so<strong>su</strong><br />
pot<strong>en</strong>cial como patrones (Grosser, 1992). maticos diploi<strong>de</strong>s, con <strong>protoplastos</strong> cigoticos haploi<strong>de</strong>s,<br />
tal y como se ha realizado con otras espe-<br />
Mejorami<strong>en</strong>to <strong>de</strong> injertos cies, produce hfbridos triploi<strong>de</strong>s, probablem<strong>en</strong>te<br />
sin semilla. Dichos hfbridos se podrfan obt<strong>en</strong>er me-<br />
Las plantas triploi<strong>de</strong>s <strong>de</strong> citricos pue<strong>de</strong>n seT diante la fusion <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong> diploi<strong>de</strong>s con protovigorosas<br />
y producir frutos practicam<strong>en</strong>te car<strong>en</strong>tes plastos gameticos haploi<strong>de</strong>s, aislados <strong>de</strong> tetradas <strong>de</strong><br />
<strong>de</strong> semillas, como 10 evi<strong>de</strong>ncio el estudio <strong>de</strong> la li- g<strong>en</strong>otipos seleccionados pOT <strong>su</strong>s caracterfsticas
198 AGRONOMIA COSTARRICENSE<br />
complem<strong>en</strong>tarias. Par ejemplo, la fusion <strong>de</strong> proto- ma sabre los <strong>protoplastos</strong> donadores (los que van a<br />
plastos embriog<strong>en</strong>icos <strong>de</strong> mandarina 'Dancy' (un transferir las organelas) para disminuir la division<br />
tipo muy popular, facil <strong>de</strong> pelar, pero con mucha nuclear, y trataron los receptores (I os que aportan<br />
semilla) con <strong>protoplastos</strong> gameticos haploi<strong>de</strong>s <strong>de</strong> el g<strong>en</strong>oma nuclear) con el antimetabolito iodoacealgun<br />
cultivar <strong>de</strong> grapefruit 0 pamela, podrfa lle- tala para inactivar el citoplasma. Despues <strong>de</strong> la fuvar<br />
al <strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> tangelos triploi<strong>de</strong>s sin semilla. sion donador-receptor, rue posible recobrar las<br />
Al contrario <strong>de</strong> las fusiones somaticas <strong>en</strong>tre dos plantas cfbridas <strong>de</strong>bido a la complem<strong>en</strong>tacion <strong>en</strong>tre<br />
prog<strong>en</strong>itores especfficos, cada planta reg<strong>en</strong>erada a el citoplasma <strong>de</strong> las plantas donadoras, y el nucleo<br />
partir <strong>de</strong> una fusion separada <strong>de</strong> n+2n es unica, <strong>de</strong> las receptoras (Grosser y Gmitter, 1 990a).<br />
<strong>de</strong>bido a que cadaprotoplasto haploi<strong>de</strong> es un pro- Vardi y colaboradores utilizaron el procediducto<br />
<strong>de</strong> segregacion (Grosser y Gmitter, 1990a). mi<strong>en</strong>to m<strong>en</strong> cion ado anteriorm<strong>en</strong>te para g<strong>en</strong>erar<br />
Si ti<strong>en</strong>e exito, este metoda t<strong>en</strong>drfa muchas plantas cfbridas <strong>de</strong> Citrus. Realizaron las sigui<strong>en</strong>v<strong>en</strong>tajas<br />
sabre el metoda <strong>de</strong>scrito anteriorm<strong>en</strong>te tes combinaciones (Gal un et at., 1987; Vardi et<br />
<strong>de</strong> obt<strong>en</strong>er triploi<strong>de</strong>s a partir <strong>de</strong> cruces sexuales<br />
<strong>en</strong>tre diploi<strong>de</strong>s y tetraploi<strong>de</strong>s. La primera serfa la<br />
at., 1987, 1989):<br />
- Hfbrido <strong>de</strong> 'Poorman' X Poncirus trifotiata<br />
reduccion <strong>de</strong>l tiempo necesario para producir los (donador) con limon Villafranca (C. limon)<br />
triploi<strong>de</strong>s. La segunda es que el uso <strong>de</strong> un g<strong>en</strong>oma<br />
diploi<strong>de</strong> intacto, sin <strong>su</strong>frir recombinacion ni segre- -<br />
(receptor).<br />
Hfbrido <strong>de</strong> 'Poorman' X P. trifotiata (donagacion,<br />
podrfa mant<strong>en</strong>er ocultos ciertos caracteres dor) con naranja agria (C. aurantium) (rerecesivos<br />
<strong>de</strong>letereos, <strong>en</strong> la prog<strong>en</strong>ie re<strong>su</strong>ltante. Caracterfsticas<br />
importantes bajo el control <strong>de</strong> g<strong>en</strong>es<br />
ceptor).<br />
Naranja agria (C. aurantium) (donador) con<br />
dominantes 0 codominantes <strong>en</strong> el prog<strong>en</strong>itor diploi<strong>de</strong>,<br />
0 recesivos <strong>en</strong> ambos prog<strong>en</strong>itores, serfan -<br />
limon Villafranca (C. limon) (receptor).<br />
Microcitrus sr. (donador) con limon rugoso '<br />
expresados <strong>en</strong> una prog<strong>en</strong>ie g<strong>en</strong>erada par fusion<br />
<strong>de</strong> n+2n. Como re<strong>su</strong>ltado, una mayor cantidad d.e -<br />
(C.jambhiri) (receptor)<br />
Microcitrus sr. (donador) con naranja agria<br />
la prog<strong>en</strong>ie <strong>de</strong>be exhibir las caracterfsticas <strong>de</strong> inte- (C. aurantium) (receptor").<br />
res, <strong>en</strong> contraste con 10 que se esperarfa <strong>en</strong> la pro- En todas las combinaciones anteriores se <strong>en</strong>g<strong>en</strong>ie<br />
<strong>de</strong> un cruce sexual <strong>de</strong> un tetraploi<strong>de</strong> con un contraron plantas cfbridas con el g<strong>en</strong>oma nuclear<br />
diploi<strong>de</strong>. EI numero <strong>de</strong> combinaciones par<strong>en</strong>tales y la morfologfa g<strong>en</strong>eral <strong>de</strong>l prog<strong>en</strong>itor receptor, y<br />
posibles esta limitado par la disponibilidad <strong>de</strong> If- el g<strong>en</strong>oma mitocondrial <strong>de</strong>l donador (Vardi et at.,<br />
neas <strong>de</strong> callos embriog<strong>en</strong>icos totipot<strong>en</strong>tes y arbo- 1987, 1989). En las primeras 3 combinaciones<br />
les <strong>de</strong> cultivares que produzcan tetradas <strong>de</strong> tamafio m<strong>en</strong>cionadas, no se pudo verificar la transfer<strong>en</strong>cia<br />
<strong>su</strong>fici<strong>en</strong>te que resistan el proceso <strong>de</strong> <strong>de</strong>sinfeccion. <strong>de</strong> cloroplastos <strong>de</strong>l prog<strong>en</strong>itor donador, ya que los<br />
Otro factor limitante es que las fusiones n+2n solo ADN cloroplasticos ti<strong>en</strong><strong>en</strong> patrones <strong>de</strong> restricci6n<br />
pue<strong>de</strong>n realizarse durante la estacion <strong>en</strong> que las i<strong>de</strong>nticos <strong>en</strong> ambos prog<strong>en</strong>itores (Vardi et at.,<br />
yemas tlorales estan disponibles, a m<strong>en</strong>os que sea 1987). Sin embargo, <strong>en</strong> las ultimas dos combinaposible<br />
controlar la fIoraci6n <strong>en</strong> inverna<strong>de</strong>ro ciones, se observo incorporacion <strong>de</strong> cloroplastos<strong>de</strong><br />
(Grosser y Gmitter, 1990a). los prog<strong>en</strong>itores donadores <strong>en</strong> los receptores. Esto<br />
se pudo verificar, porque el g<strong>en</strong>era Microcitrus sf<br />
TRANSFERENCIA DE ORGANELAS pres<strong>en</strong>ta difer<strong>en</strong>cias <strong>en</strong> los patrones <strong>de</strong> restriccion<br />
ENTRE PROTOPLASTOS <strong>de</strong>l ADN cloroplastico con respecto a los <strong>de</strong> Citrus<br />
(Vardi et at., 1989).<br />
Cuando <strong>en</strong> un ev<strong>en</strong>to <strong>de</strong> fusi6n <strong>de</strong> proto- Esta linea <strong>de</strong> investigacion g<strong>en</strong>erara inforplastos<br />
se pier<strong>de</strong> el nucleo <strong>de</strong> uno <strong>de</strong> los prog<strong>en</strong>i- macion importante con respecto a la i<strong>de</strong>ntificatares<br />
y permanec<strong>en</strong> las organelas <strong>de</strong>l otro prog<strong>en</strong>i- cion, her<strong>en</strong>cia y transfer<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> caracteres importor<br />
0 <strong>de</strong> ambos, se forma un cfbrido (B<strong>en</strong>gochea y tantes codificados por el ADN <strong>de</strong> las organelas<br />
Dodds, 1986). Aunque pue<strong>de</strong> ocurrir formaci6n <strong>de</strong> (Vardi y Galun, 1988). Por ejemplo, <strong>en</strong> vista <strong>de</strong><br />
cfbridos <strong>en</strong> forma espontanea, esto g<strong>en</strong>eralm<strong>en</strong>te que Microcitrus posee esterilidad masculina codi<strong>su</strong>ce<strong>de</strong><br />
<strong>en</strong> porc<strong>en</strong>tajes muy bajos. Por ello se ban ficada par la mitocondria, es factible introducir es<strong>de</strong>sarrollado<br />
metodologfas que estimul<strong>en</strong> <strong>su</strong> for- ta caracterfstica <strong>de</strong> importancia agronomica al gemaci6n.<br />
Galun y Aviv (1986) ap1icaron un esque- nero Citrus, con el fin <strong>de</strong> obt<strong>en</strong>er frutos sin semima<br />
basado <strong>en</strong> el empleo <strong>de</strong> radiaciones X 0 gam- lla (Ohgawara y Kobayashi, 1991).
JIMENEZ: EI <strong>cultivo</strong> <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong> <strong>en</strong> citricos y <strong>su</strong> pot<strong>en</strong>cial para el mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>etico 199<br />
En ev<strong>en</strong>tos <strong>de</strong> electrofusion <strong>en</strong>tre C. <strong>su</strong>dachi das por Ohgawara et at. (1989), las cuales t<strong>en</strong> fan<br />
y C. aurantifotia (lima) 0 C. timon (limon), Saito caract<strong>en</strong>sticas similares al prog<strong>en</strong>itor no embrioet<br />
at. (1993) observaron cierto numero <strong>de</strong> reg<strong>en</strong>e- g<strong>en</strong>ico. Con estos y otros re<strong>su</strong>ltados, Saito et at.<br />
rantes con g<strong>en</strong>oma diploi<strong>de</strong> y caract<strong>en</strong>sticas simi- (1993) especulan que el g<strong>en</strong>oma mitocondrial <strong>de</strong><br />
lares a limon y lima (prog<strong>en</strong>itores <strong>de</strong>rivados <strong>de</strong> celulas <strong>de</strong> callos nucelares juegan un papel impor<strong>protoplastos</strong><br />
<strong>de</strong> hoja). Mediante analisis <strong>de</strong>l ADN tante <strong>en</strong> el proceso <strong>de</strong> embriog<strong>en</strong>esis <strong>en</strong> cftricos,<br />
mitocondrial se comprobo que estas plantas eran ya que los <strong>protoplastos</strong> <strong>de</strong> los prog<strong>en</strong>itores no em<strong>en</strong><br />
realidad cfbridos, con el g<strong>en</strong>oma nuclear <strong>de</strong>l briog<strong>en</strong>icos no reg<strong>en</strong>eran normalm<strong>en</strong>te. En el<br />
prog<strong>en</strong>itor no embriog<strong>en</strong>ico, y g<strong>en</strong>oma mitocon- Cuadro 5 se <strong>en</strong>cu<strong>en</strong>tra una lista <strong>de</strong> las plantulas<br />
drial <strong>de</strong>l otro. Re<strong>su</strong>ltados semejantes obtuvieron obt<strong>en</strong>idas a partir <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong> no embriog<strong>en</strong>iestos<br />
mismos autores analizando plantas reg<strong>en</strong>era- cos <strong>en</strong> ev<strong>en</strong>tos <strong>de</strong> fusion.<br />
Cuadro 5. Plantulas diploi<strong>de</strong>s con caracterfsticas <strong>de</strong>l prog<strong>en</strong>itor no embriog<strong>en</strong>ico, obt<strong>en</strong>idas <strong>en</strong> ev<strong>en</strong>tos <strong>de</strong> fusi6n.<br />
E.~pecie Cultivar Metodo <strong>de</strong> fusi6n( I) Refer<strong>en</strong>cia<br />
C.aurantifolia - E Saitoetal.(1991)<br />
C. aurantium - PEG Louzadaetal. (1992)<br />
C.jambhiri lim6nrugoso PEG Grosseretal.(1992b)<br />
C. limon Eurekai E Saito et al. (1993)<br />
C. limon Femminelloi I!EG Tusa et al. (1990)<br />
C.limonia Rangpurf PEG Louzadaetal.(1992)<br />
C. paradi.vi Marshi PEG Ohgawara et al. (1989)<br />
C.paradi.vi Duncani PEG Grosseretal.(1992b)<br />
C. .vin<strong>en</strong>.vi.v Succarii PEG Grosser et al. (1992a)<br />
C. .vin<strong>en</strong>.vi.v xC. reticulata (Tangor) Murcotti PEG Grosser et al. (1992b)<br />
C. .vin<strong>en</strong>.~i.v x Ponciru.v trij()liata (Citrange)<br />
C. v()lkameriana<br />
Troyerf<br />
-<br />
PEG<br />
PEG<br />
Ohgawara et al. (1991)<br />
Louzada et al. (1992)<br />
(I )PEG: fusi6n quimica utilizando polietil<strong>en</strong> glicol: E: fusi6n mediante la aplicaci6n <strong>de</strong> una corri<strong>en</strong>te electrica<br />
Reci<strong>en</strong>tem<strong>en</strong>te se utilizo una linea embrio- dulce 'Trovita', un g<strong>en</strong> quimerico que cont<strong>en</strong>fa el<br />
g<strong>en</strong>ica cfbrida, re<strong>su</strong>ltante <strong>de</strong> una fusi6n <strong>de</strong> C. au- promotor <strong>de</strong> la nopalina sintetasa, el g<strong>en</strong> estructurantifotia<br />
con C. <strong>su</strong>dachi (Saito et at., 1993), para ral que codifica para la aminoglicosido fosfotransefectuar<br />
una fusion con C. timon 'Eureka'. Se 10- ferasa II y la regi6n terminadora <strong>de</strong>l virus <strong>de</strong>l mogro<br />
la obt<strong>en</strong>ci6n <strong>de</strong> hfbridos alotetraploi<strong>de</strong>s que saico <strong>de</strong> la coliflor (CaMV). Utilizaron PEG para<br />
inclufa el g<strong>en</strong>oma mitocondrial <strong>de</strong> C. <strong>su</strong>dachi, efectuar la introduccion directa <strong>de</strong> plasmidos <strong>de</strong><br />
transferido a craves <strong>de</strong>l cfbrido (Saito et at., 1994)<br />
.<br />
ADN a los <strong>protoplastos</strong> <strong>de</strong>rivados <strong>de</strong> callos embriog<strong>en</strong>icos.<br />
Mediante esquemas <strong>de</strong> selecci6n a<br />
TRANSFORMACI6N GEN<strong>El</strong>lCA nivel celular utilizando kanamicina, lograron aislar<br />
microcallos transformados, aunque no logra-<br />
La transformacion g<strong>en</strong>etic a es un metodo rOll la reg<strong>en</strong>eracion <strong>de</strong> plantulas.<br />
atracti vo para agregar caract<strong>en</strong>sticas especfficas Posteriorm<strong>en</strong>te, Vardi et at. (1990) obtuvieimportantes,<br />
codificadas por uno 0 pocos g<strong>en</strong>es, rOll dos plantas transg<strong>en</strong>icas <strong>de</strong> limon rugoso, a<br />
con la finalidad <strong>de</strong> obt<strong>en</strong>er injertos 0 patrones me- las cuales les introdujeron los g<strong>en</strong>es que codifican<br />
jorados sin alterar la integridad <strong>de</strong>l cultivar. La para la neomicin fosfotransferasa II (nptIl) y la<br />
transformaci6n <strong>en</strong> Citrus ha <strong>de</strong>mostrado ser mu- cloranf<strong>en</strong>icol acetiltransferasa (cat), utilizando un<br />
cho mas diffcil que <strong>en</strong> las especies herbaceas metodo similar al anterior. Este constituyo el prianuales<br />
<strong>de</strong> solanaceas, que se utilizan como siste- mer ejemplo <strong>de</strong> transformacion directa <strong>de</strong> protomas<br />
mo<strong>de</strong>lo. Sin embargo, los progresos que se plastos <strong>de</strong> una especie leiiosa que tuvo como rehall<br />
obt<strong>en</strong>ido reci<strong>en</strong>tem<strong>en</strong>te son al<strong>en</strong>tadores <strong>su</strong>ltado finalla reg<strong>en</strong>eracion <strong>de</strong> plantulas.<br />
(Grosser, 1992). En el Cuadro 6 se <strong>en</strong>cu<strong>en</strong>tra una lista <strong>de</strong> los<br />
Kobayashi y Uchimiya (1989) realizaron la informes <strong>de</strong> transformacion g<strong>en</strong>etic a <strong>en</strong> cftricos<br />
primera transformacion g<strong>en</strong>etica <strong>en</strong> cftricos y <strong>en</strong> que involucraron la utilizaci6n <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong>. En<br />
una especie leiiosa; <strong>en</strong> <strong>protoplastos</strong> <strong>de</strong> naranja la actualidad, no hay ejemplos <strong>de</strong> plantas transge-<br />
.
200 AGRONOMIA COSTARRICENSE<br />
Cuadro 6. G<strong>en</strong>otipos <strong>de</strong> citricos sobre los cuales se han efectuado ev<strong>en</strong>tos <strong>de</strong> transformaci6n g<strong>en</strong>etica que involucr<strong>en</strong> la utilizaci6n<br />
<strong>de</strong> protopla...tos.<br />
E...pecie Cultivar Metodo <strong>de</strong> transformaci6n( I ) No. <strong>de</strong> plantas Refer<strong>en</strong>cia<br />
C.jambhiri -- PEG 2 Vardi etal. (1990)<br />
C.reticulata 'Ohta' electroporaci6n 0 HidakayOmura(1993)<br />
C. .fin<strong>en</strong>.fi.f 'Hamlin' PEG 12 Schell (1991)<br />
C. .fin<strong>en</strong>.fi.f 'Trovita' PEG 0 Kobayashi y Uchimiya (1989)<br />
nicas <strong>de</strong> Citrus que cont<strong>en</strong>gan g<strong>en</strong>es <strong>de</strong> importan- Gmitter. 1 990b). Tambi<strong>en</strong> mediante transfer<strong>en</strong>cia<br />
cia agrfcola. Sin embargo, conforme avance la in- <strong>de</strong> organelas se pue<strong>de</strong> conocer mas sabre la comvestigaci6n<br />
al respecto, se lograra una mejora <strong>su</strong>s- posici6n <strong>de</strong> los g<strong>en</strong>omas citoplasmaticos, como<br />
tancial <strong>en</strong> las tecnicas. y <strong>en</strong> consecu<strong>en</strong>cia, aum<strong>en</strong>- ev<strong>en</strong>tuales fu<strong>en</strong>tes <strong>de</strong> caracterfsticas <strong>de</strong> interes patara<br />
el numero <strong>de</strong> g<strong>en</strong>otipos importantes capaces ra incorporar a cultivares comerciales.<br />
<strong>de</strong> ser transform ados (Grosser, 1992). Es probable que a muy carta plaza se est<strong>en</strong><br />
D<strong>en</strong>tro <strong>de</strong> las caracterfsticas posibles <strong>de</strong> ser vi<strong>en</strong>do los b<strong>en</strong>eficios <strong>de</strong> la aplicaci6n <strong>de</strong> muchas<br />
introducidas mediante esta tecnica se <strong>en</strong>cu<strong>en</strong>tra el <strong>de</strong> las metodologfas discutidas. Actualm<strong>en</strong>te se<br />
g<strong>en</strong> que codifica para la protefna <strong>de</strong> capsi<strong>de</strong> <strong>de</strong>l <strong>en</strong>cu<strong>en</strong>tran <strong>en</strong> evaluaci6n <strong>en</strong> condiciones <strong>de</strong> camvirus<br />
<strong>de</strong> la tristeza <strong>de</strong> los cftricos, para tratar <strong>de</strong> po, una serie <strong>de</strong> plantas producto <strong>de</strong> la fusi6n soconferir<br />
resist<strong>en</strong>cia a esta <strong>en</strong>fermedad. Tambi<strong>en</strong>, matica <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong>. Estos ban sido injertados<br />
la tecnologfa 'antis<strong>en</strong>se' (que se basa <strong>en</strong> la intro- sabre patrones que estimulan la floraci6n precoz,<br />
ducci6n <strong>de</strong> una secu<strong>en</strong>cia complem<strong>en</strong>taria a la se- con el fin <strong>de</strong> acelerar las <strong>de</strong>terminaciones <strong>de</strong> ferticu<strong>en</strong>cia<br />
que codifica para el producto cuya expre- lidad. Hfbridos somatic os con pot<strong>en</strong>cial para ser<br />
si6n que se quiere inhibir, con 10 cuallos ARNm utilizados como patrones, estan si<strong>en</strong>do propagarespectivos<br />
se aparean e inhib<strong>en</strong> mutuam<strong>en</strong>te <strong>su</strong> dos, evaluados para resist<strong>en</strong>cia a <strong>en</strong>fermeda<strong>de</strong>s,<br />
traducci6n, reduci<strong>en</strong>do la pres<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> un produc- injertados con varios cultivares e introducidos <strong>en</strong><br />
to g<strong>en</strong>ico <strong>de</strong>terminado) ti<strong>en</strong>e un gran pot<strong>en</strong>cial pa- pruebas <strong>de</strong> campo con patrones comerciales, para<br />
ra reducir los niveles <strong>de</strong> <strong>en</strong>zimas 0 protefnas regu- comparar <strong>su</strong> r<strong>en</strong>dimi<strong>en</strong>to. Estos arboles estan creladores<br />
in<strong>de</strong>seabl~s (ej. la pectIn esterasa <strong>en</strong> na- ci<strong>en</strong>do a un ritmo similar al <strong>de</strong> patrones comerciaranja<br />
dulce). Habra mas ejemplos conforme se les (Grosser y Gmitter. 1990c). Sin embargo. estas<br />
i<strong>de</strong>ntifiqu<strong>en</strong>, afsl<strong>en</strong> y clon<strong>en</strong> mas g<strong>en</strong>es (Grosser, plantas <strong>de</strong>b<strong>en</strong> pasar par perfodos prolongados <strong>de</strong><br />
1992). evaluaci6n antes <strong>de</strong> estar disponibles para los productores<br />
para <strong>su</strong> <strong>cultivo</strong> a nivel comercial.<br />
CONCLUSIONES Es importante recalcar que ninguna <strong>de</strong> estas<br />
tecnicas reemplazara los programa~ <strong>de</strong> hibridaci6n<br />
Las tecnicas m<strong>en</strong>cionadas a 10 largo <strong>de</strong> este tradicional.. Su pape.\ principal recaera <strong>en</strong> facilitar<br />
trabajo permitiran oportunida<strong>de</strong>s unicas para estu- <strong>en</strong> forma cualitativa y cuantitativa la creaci6n <strong>de</strong><br />
diar el control g<strong>en</strong>etico <strong>de</strong> caracterfsticas <strong>de</strong> importancia<br />
econ6mica <strong>en</strong> cftricos. <strong>de</strong> las cuales se<br />
variaci6n g<strong>en</strong>etic a util. G<strong>en</strong>otipos pot<strong>en</strong>cialm<strong>en</strong>te<br />
importantes, obt<strong>en</strong>idos <strong>en</strong> estos programas concon<br />
ace muy poco. Serfa posible, par ejemplo, <strong>de</strong>- juntos, requeriran evaluaciones int<strong>en</strong>sivas y ext<strong>en</strong>terminar<br />
<strong>su</strong> aditividad 0 dominancia/recesividad sivas <strong>en</strong> el campo (Grosser, 1992).<br />
mediante la creaci6ri <strong>de</strong> combinaciones especfficas<br />
<strong>de</strong> tipos par<strong>en</strong>tales tolerantes y <strong>su</strong>sceptibles y RESUMEN<br />
estudiar asf el comportami<strong>en</strong>to <strong>de</strong> hfbridos somaticas.<br />
Tambi<strong>en</strong>, estudios <strong>de</strong> la meiosis y la fertilidad Se hace una revisi6n <strong>de</strong> las difer<strong>en</strong>tes tecnirelativa<br />
<strong>de</strong> los hfbridos somatic os que llegu<strong>en</strong> a cas que involucran el aislami<strong>en</strong>to. <strong>cultivo</strong> y regefloraci6n.<br />
pue<strong>de</strong>n producir informaci6n valiosa <strong>en</strong> neraci6n <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong> <strong>de</strong> cftricos para el mejocuanto<br />
a la homologfa <strong>de</strong> cromosomas <strong>en</strong>tre Citrus rami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>etico <strong>de</strong>l <strong>cultivo</strong>. Se <strong>en</strong>umeran y <strong>de</strong>sy<br />
los g<strong>en</strong>eros empar<strong>en</strong>tados, que pue<strong>de</strong>n re<strong>su</strong>ltar crib<strong>en</strong> los especies y cultivares a partir <strong>de</strong> los cuautiles<br />
<strong>en</strong> int<strong>en</strong>tos para <strong>de</strong>scribir la relaci6n taxon6- les se ban podido obt<strong>en</strong>er <strong>protoplastos</strong> viables y<br />
mica <strong>en</strong>tre miembros <strong>de</strong> esta familia (Grosser y reg<strong>en</strong>erar plantas completas, asf como los re<strong>su</strong>lta-
JIMENEZ: EI <strong>cultivo</strong> <strong>de</strong> <strong>protoplastos</strong> <strong>en</strong> citricos y <strong>su</strong> pot<strong>en</strong>cial para el mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>etico 201<br />
dos exitosos <strong>en</strong> experim<strong>en</strong>tos d~ fusion, formacion Iracheiphila toxin, shows <strong>en</strong>hanced release of chitina.~e<br />
<strong>de</strong> cfbridos y transformacion g<strong>en</strong>etica. Se discut<strong>en</strong><br />
I . I d I ,. I.<br />
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