XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CYNARIN, ACID CLOROGENIC, CYNAROSID VÀ SCOLYMOSID TRONG LÁ ACTISÔ BẰNG PHƯƠNG PHÁP UHPLC-PDA

Đ Ề T À I K H O A H Ọ C V À

C Ô N G N G H Ệ C Ấ P T R Ư Ờ N G

vectorstock.com/27117080

Ths Nguyễn Thanh Tú

eBook Collection

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG

ĐỒNG THỜI CYNARIN, ACID CLOROGENIC,

CYNAROSID VÀ SCOLYMOSID TRONG LÁ ACTISÔ

BẰNG PHƯƠNG PHÁP UHPLC-PDA

WORD VERSION | 2021 EDITION

ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA EMAIL

TAILIEUCHUANTHAMKHAO@GMAIL.COM

Tài liệu chuẩn tham khảo

Phát triển kênh bởi

Ths Nguyễn Thanh Tú

Đơn vị tài trợ / phát hành / chia sẻ học thuật :

Nguyen Thanh Tu Group

Hỗ trợ trực tuyến

Fb www.facebook.com/DayKemQuyNhon

Mobi/Zalo 0905779594

.

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG





Mã số: <Mã số đề tài>

Chủ nhiệm đề tài: ThS. Nguyễn Thị Ánh Nguyệt

Tp. Hồ Chí Minh, 02/2019

.

.

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG





Mã số: <Mã số đề tài>

Chủ nhiệm đề tài

(ký, họ tên)

Nguyễn Thị Ánh Nguyệt

Tp. Hồ Chí Minh, 02/2019

.

. i

DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI

1. Nguyễn Thị Ánh Nguyệt

2. Trần Văn Quyền

.

. ii

MỤC LỤC

DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI .................... i

MỤC LỤC ............................................................................................................................ ii

DANH MỤC BẢNG ............................................................................................................ iv

DANH MỤC HÌNH ............................................................................................................. v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................................... vii

ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................... viii

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .............................................................................................. 10

1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CHI CYNARA .......................................................... 10

1.1.1. Vị trí phân loại ........................................................................................................... 10

1.1.2. Hình thái thực vật ...................................................................................................... 11

1.1.3. Phân bố sinh thái ........................................................................................................ 14

1.1.4. Bộ phận dùng, thu hái, chế biến, bảo quản ................................................................ 14

1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CHI CYNARA ...................................................... 15

1.2.1. Dẫn xuất caffeoylquinic ............................................................................................. 15

1.2.2. Flavonoid ................................................................................................................... 16

1.2.3. Sesquiterpen lacton .................................................................................................... 17

1.2.4. Inulin .......................................................................................................................... 18

1.2.5. Các thành phần khác .................................................................................................. 18

1.3. TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA ACTISÔ ...................................................................... 19

1.3.1. Tác dụng chống oxy hóa ............................................................................................ 19

1.3.2. Tác dụng trên gan mật ............................................................................................... 19

1.3.3. Tác dụng làm giảm cholesterol .................................................................................. 20

1.3.4. Tác dụng kháng khuẩn – kháng nấm ......................................................................... 20

1.3.5. Tác dụng trên tim mạch ............................................................................................. 20

1.3.6. Tác dụng trên hệ tiêu hóa ........................................................................................... 21

1.3.7. Tác dụng kháng viêm ................................................................................................. 21

1.3.8. Tác dụng kháng ung thư ............................................................................................ 21

1.3.9. Tác dụng kháng HIV .................................................................................................. 21

1.4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KIỂM NGHIỆM ACTISÔ ........................ 22

1.4.1. Tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV .......................................................................... 22

1.4.2. Tiêu chuẩn Dược điển Anh, Dược điển Châu Âu ...................................................... 22

.

. iii

1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CÁC HỢP CHẤT PHENOL

TRONG ACTISÔ BẰNG HPLC ......................................................................................... 24

1.5. MỘT SỐ CHẾ PHẨM TRÀ TÚI LỌC TRÊN THỊ TRƯỜNG ................................... 28

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................... 30

1.6. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ...................................................................................... 30

1.6.1. Nguyên liệu ................................................................................................................ 30

1.6.2. Dung môi, hóa chất .................................................................................................... 31

1.6.3. Thiết bị, dụng cụ ........................................................................................................ 31

1.7. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................ 32

1.7.1. Xây dựng quy trình định tính, định lượng đồng thời cynarin, acid clorogenic,

scolymosid, cynarosid trong lá Actisô bằng UPLC ............................................................. 32

1.7.2. Đánh giá quy trình định lượng ................................................................................... 35

CHƯƠNG 2. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ....................................................................... 41

2.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CY, AC, SCO, CR

TRONG LÁ ACTISÔ BẰNG UPLC-PDA ......................................................................... 41

2.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký UPLC ............................................................................... 41

2.1.2. Khảo sát điều kiện chiết xuất lá Actisô ...................................................................... 48

2.1.3. Quy trình định lượng CY, AC, CR và SCO .............................................................. 53

2.2. ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ................................................................... 54

2.2.1. Khảo sát độ tinh khiết của các chất đối chiếu ............................................................ 54

2.2.2. Tính tương thích của hệ thống ................................................................................... 57

2.2.3. Tính tuyến tính ........................................................................................................... 59

2.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)......................................... 61

2.2.5. Khảo sát tính chọn lọc ............................................................................................... 62

2.2.6. Khảo sát độ lặp lại ..................................................................................................... 63

2.2.7. Khảo sát độ đúng ....................................................................................................... 66

2.3. ỨNG DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỂ ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG AC, CY,

SCO, CR TRONG ACTISÔ ................................................................................................ 68

CHƯƠNG 3. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................ 75

3.1. KẾT LUẬN ................................................................................................................... 75

3.2. ĐỀ NGHỊ ...................................................................................................................... 75

CHƯƠNG 4. TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 77

.

. iv

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Một số loài trong chi Cynara .............................................................................. 10

Bảng 1.2. Các đặc điểm hình thái của 9 kiểu gen của loài Actisô trồng ............................ 12

Bảng 1.3. Chương trình HPLC phân tích các hợp chất phenol ........................................... 25

Bảng 1.4. Một số điều kiện định lượng các hợp chất trong Actisô bằng HPLC ................ 26

Bảng 2.5. Một số chế phẩm trên thị trường ......................................................................... 30

Bảng 2.6. Đánh giá độ chính xác theo nồng độ chất phân tích ........................................... 38

Bảng 2.7. Mối liên quan giữa tỷ lệ phục hồi và nồng độ chất phân tích ............................. 39

Bảng 3.8. Chương trình chạy tiệm tiến được lựa chọn ....................................................... 45

Bảng 3.9. Bảng so sánh 2 điều kiện HPLC và UPLC ......................................................... 48

Bảng 3.10. Bảng độ tan của AC, CY, SCO, CR ................................................................. 49

Bảng 3.11. Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết của AC, CY, SCO, CR ................................... 50

Bảng 3.12. Bảng khảo sát thời gian chiết của AC, CY, SCO, CR ..................................... 51

Bảng 3.13. Bảng khảo sát số lần chiết của AC, CY, SCO và CR ....................................... 52

Bảng 2.14. Kết quả đánh giá độ tinh khiết của hợp chất đã phân lập ................................. 55

Bảng 2.15. Kết quả đánh giá độ tinh khiết của cynarosid phân lập .................................... 56

Bảng 3.16. Độ tinh khiết của các chất chuẩn ...................................................................... 57

Bảng 3.17. Kết quả giá trị trung bình của thông số các pic trong mẫu thử ......................... 57

Bảng 3.18. Kết quả giá trị trung bình của thông số các pic trong mẫu chuẩn ..................... 58

Bảng 3.21. Kết quả khảo sát LOD và LOQ của AC, CY, SCO, CR ................................... 62

Bảng 3.22. Độ lặp lại acid clorogenic ................................................................................. 64

Bảng 3.23. Độ lặp lại của cynarin ....................................................................................... 64

Bảng 3.24. Độ lặp lại của scolymosid ................................................................................. 65

Bảng 3.25. Độ lặp lại của cynarosid .................................................................................... 65

Bảng 3.26. Tóm tắt độ lặp lại và hàm lượng của các chất định lượng ............................... 65

Bảng 3.27. Kết quả độ đúng của acid clorogenic ................................................................ 66

Bảng 3.28. Kết quả độ đúng của cynarin .......................................................................... 66

Bảng 3.29. Kết quả độ đúng của scolymosid ...................................................................... 67

Bảng 3.30. Kết quả độ đúng của cynarosid ......................................................................... 67

Bảng 31. Tóm tắt tỷ lệ phục hồi của quy trình định lượng ................................................. 67

.

. v

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Vị trí phân loại của Actisô .................................................................................. 10

Hình 1.2. Vị trí phân loại của Actisô trong loài Cynara cardunculus L. ............................ 11

Hình 1.3. Các thế hệ lai F1 của Cynara Cardunculus L. .................................................... 13

Hình 1.4. Dẫn xuất của acid caffeoylquinic ........................................................................ 16

Hình 1.5. Dẫn xuất Flavonoid. ............................................................................................ 17

Hình 1.6. Dẫn xuất Sesquiterpen lacton. ............................................................................. 17

Hình 1.7. Sắc ký đồ dịch chiết hoa đầu của Actisô ............................................................. 25

Hình 1.8. Sắc ký đồ dịch chiết lá và hoa Actisô .................................................................. 26

Hình 1.9. Một số chế phẩm trên thị trường ......................................................................... 29

Hình 3.10. Sắc ký đồ của AC, CY, SCO, CYR chuẩn ở bước sóng 323 nm ...................... 41

Hình 3.11. Sắc ký đồ của AC,CY, SCO, CYR chuẩn ở bước sóng 349 nm ....................... 41

Hình 3.12. Phổ hấp thu UV của acid clorogenic, cynarin, scolymosid và cynarosid ........ 42

Hình 3.13. SKĐ khảo sát dung môi pha động ..................................................................... 42

Hình 3.14. SKĐ khảo sát chương trình chạy ...................................................................... 44

Hình 3.15. SKĐ khảo sát tốc độ dòng ................................................................................. 45

Hình 3.16. SKĐ khảo sát nhiệt độ cột ................................................................................. 46

Hình 3.17. SKĐ định lượng AC, CY,SCO, CR bằng phương pháp HPLC ........................ 47

Hình 3.18. SKĐ định lượng AC, CY,SCO, CR bằng phương pháp UPLC ........................ 47

Hình 3.19. Biểu đồ độ tan của AC, CY, SCO và CR .......................................................... 48

Hình 3.20. SKĐ của 2 dung môi chiết EtOH 70% và Nước ............................................... 49

Hình 3.21. Biểu đồ nhiệt độ chiết AC, CY,SCO và CR ..................................................... 50

Hình 3.22. SKĐ của 2 nhiệt độ chiết 60 o C và 100 o C ........................................................ 50

Hình 3.23. Biểu đồ thời gian chiết AC, CY, SCO và CR ................................................... 51

Hình 3.24. Biêu đồ các lần chiết AC, CY, SCO và CR ...................................................... 52

Hình 2.25. Sắc ký đồ HPLC kiểm tra độ tinh khiết của acid clorogenic phân lập .............. 55

Hình 2.26. Sắc ký đồ HPLC kiểm tra độ tinh khiết của cynarosid phân lập ....................... 56

Hình 3.28. Sắc ký đồ khảo sát tính tương thích hệ thống của mẫu thử ............................... 57

Hình 3.29. Sắc ký đồ khảo sát tính tương thích hệ thống của mẫu chuẩn .......................... 57

Hình 3.30. Đường tuyến tính của acid clorogenic .............................................................. 59

Hình 3.31. Đường tuyến tính của cynarin ........................................................................... 60

.

. vi

Hình 3.32. Đường tuyến tính của scolymosid ..................................................................... 60

Hình 3.33. Đường tuyến tính của cynarosid ....................................................................... 61

Hình 3.34. sắc ký đồ của acid clorogenic ở nồng độ LOD ................................................. 62

Hình 3.35. Sắc ký đồ của cynarin ở nồng độ LOD ............................................................. 62

Hình 3.36. Sắc ký đồ của cynarosid ở nồng độ LOD .......................................................... 62

Hình 3.37. Sắc ký đồ của acid scolymosid ở nồng độ LOD ............................................... 62

Hình 3.38. Sắc ký đồ khảo sát tính chọn lọc ....................................................................... 62

Hình 3.39. Phổ UV khảo sát tính chọn lọc của acid clorogenic .......................................... 63

Hình 3.40. Phổ UV khảo sát tính chọn lọc của cynarin ...................................................... 63

Hình 3.41. Phổ UV khảo sát tính chọn lọc của scolymosid ................................................ 63

Hình 3.42. Phổ UV khảo sát tính chọn lọc của cynarosid ................................................... 63

Hình 3.43. Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại của acid clorogenic và cynarin ........................... 64

Hình 3.44. Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại của scolymosid và cynarosid .............................. 64

Hình 3.45. Ảnh hưởng của bộ phận dùng lên hàm lượng lá tím ......................................... 69

Hình 3.46. Ảnh hưởng của bộ phận dùng lên lá trắng ........................................................ 69

Hình 3.47. Ảnh hưởng của điều kiện phơi đến hàm lượng lá tím ....................................... 70

Hình 3.48. Ảnh hưởng của điều kiện phơi đến hàm lượng lá trắng .................................... 70

Hình 3.49. Ảnh hưởng của tháng thu hoạch đến hàm lượng lá tím .................................... 71

Hình 3.50. Ảnh hưởng của tháng thu hoạch đến hàm lượng lá trắng ................................. 71

.

vii .

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt

ACN

MeOH

EtOH

DĐVN

LOD

LOQ

HPLC

PDA

t o

UV-Vis

SKĐ

AC

CY

SCO

CYR,CR

Chữ nguyên

Acetonitril

Methanol

Ethanol

Dược điển Việt Nam

Limit of Detection (Giới hạn phát hiện)

Limit of Quantitation (Giới hạn định lượng)

High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

Photo Diod Array Detector (Đầu dò dãy diod quang)

Nhiệt độ

Ultraviolet and Visible (Tử ngoại khả kiến)

Sắc ký đồ

Acid clorogenic

Cynarin

Scolymosid

Cynarosid

.

. iii

ĐẶT VẤN ĐỀ

Actisô (Cynara scolymus L.) là loại cây thảo sống nhiều năm có nguồn gốc từ miền

nam Châu Âu. Diện tích trồng Actisô khoảng 125.000 ha/năm và sản lượng hàng

năm là 1,42 triệu tấn. Trong đó, Tây Ban Nha (25.000 ha), Ý (50.000 ha) và Pháp

(13.000 ha) đóng góp vào khoảng 75% tổng diện tích trồng [40].

Trên thế giới, Actisô được dùng làm thuốc và thực phẩm chức năng để trị các bệnh

về gan, mật. Ngoài ra, theo những nghiên cứu gần đây, dịch chiết lá Actisô còn có

tác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng u, kháng HIV… Nhìn chung, ở nước

ngoài có rất nhiều công trình nghiên cứu về cây Actisô, điển hình có các nghiên cứu

về thành phần hóa học, tác dụng dược lý, phương pháp định tính, định lượng các

hợp chất chính (các flavonoid và dẫn xuất acid caffeoyl quinic), và một số thử nghiệm

trên lâm sàng như hiệu quả làm giảm triệu chứng khó tiêu và hạ cholesterol [41].

Tại Việt Nam, rất nhiều chế phẩm từ Actisô với số lượng và chất lượng khác nhau,

đa dạng về hình thức từ trà túi lọc đến các dạng thuốc viên, thuốc sủi, thuốc nước để

uống. Do đó, việc kiểm tra chất lượng của các sản phẩm này cần được quan tâm.

Dược điển Việt Nam IV định lượng cynarin bằng phương pháp đo phổ tử ngoại

(UV). Tuy nhiên phương pháp này có độ chọn lọc không cao vì trong lá Actisô

ngoài cynarin còn có các đồng phân khác đều có cùng phổ UV. Vì vậy, cần một

phương pháp hiện đại để định lượng chính xác hàm lượng hoạt chất có trong Actisô.

Ngoài ra, cũng cần định lượng acid clorogenic, scolymosid và cynarosid – không

những là các chất chứa hàm lượng đáng kể trong Actisô mà còn có tác dụng đáng

chú ý của Actisô như tác dụng chống oxy hoá và hạ cholesterol. Nhóm nghiên cứu

đã có công trình công bố định lượng đồng thời 4 chất trên bằng phương pháp PDA-

HPLC [44]. Tuy nhiên, ngày nay hệ thống máy UHPLC ra đời với nhiều ưu điểm

hơn so với HPLC là tốc độ phân tích nhanh, độ nhạy và độ phân giải tốt hơn, tiết

kiệm dung môi. Gần đây, với nhu cầu phân tích ngày càng nhiều nên một số nơi

như trung tâm kiểm nghiệm, viện kiểm nghiệm các tỉnh thành và một số xí nghiệp

bắt đầu có nhu cầu sử dụng hệ thống này và sẽ tăng dần trong tương lai.

.

. ix

Do đó để có thể đáp ứng được với nhu cầu trên, đề tài “Xây dựng quy trình định

tính, định lượng đồng thời acid clorogenic, cynarin, scolymosid và cynarosid trong

lá Actisô bằng phương pháp UPLC-PDA” được thực hiện với các mục tiêu chính

như sau:

1. Xây dựng qui trình định tính, định lượng đồng thời cynarin, acid clorogenic,

cynarosid, scolymosid có trong lá Actisô bằng UPLC-PDA

2. Khảo sát hàm lượng hoạt chất theo các điều kiện làm khô khác nhau.

3. Khảo sát sự thay đổi hàm lượng thay đổi hoạt chất theo từng thời vụ thu hái

khác nhau.

4. Khảo sát sự thay đổi hàm lượng hoạt chất theo từng bộ phận cây.

5. Đánh giá hàm lượng các hoạt chất trong một số chế phẩm từ lá Actisô

.

10 .

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CHI CYNARA

1.1.1. Vị trí phân loại

Theo hệ thống phân loại ngành thực vật hạt kín của A. L. Takhtajan công bố năm

1987 và đã sửa đổi năm 2009, vị trí của chi Cynara thuộc họ Asteraceae như sau

(Hình 1.1) [9], [31]

Bảng 1.1. Một số loài trong chi Cynara

Một số loài trong chi Cynara [16], [32]

1. Cynara alba Boiss. ex DC.

2. Cynara algarbiensis Coss. ex Mariz

3. Cynara auranitica Post

4. Cynara baetica (Spreng.) Pau

5. Cynara cardunculus L.

6. Cynara cornigera Lindl.

7. Cynara Cyrenaica Maire & Weiller

8. Cynara humilis L.

9. Cynara hystrix Ball

10. Cynara kurdica Handel-Mazzetti

11. Cynara pygmaea Willd

12. Cynara senneni Pau ex Sennen

13. Cynara sibthorpiana Boiss. & Heldr. Diagn

Ngành Ngọc lan

(Magnoliophyta)

Lớp Ngọc lan

(Magnoliosida)

Phân lớp Cúc

(Asteridae)

Liên bộ Cúc

(Asteranae)

Bộ Cúc

(Asterales)

Họ Cúc

(Asteraceae)

Chi Cynara L.

14. Cynara syriaca Boiss. Hình 1.1. Vị trí phân loại của Actisô

Trong cách phân loại trước đây, theo Rottenberg và Zohary (1996) Cynara

cardunculus L. var sylvestris (Lamk) Fiori là tổ tiên của Actisô trồng hiện nay

(globe Artichoke) [var. Sativa Moris, var. Scolymus (L.) Fiori, ssp. scolymus (L.)

Hegi] và rau ca đông lá rậm (leafy cardoon) hay rau ca đông trồng (cultivated

.

11 .

cardoon) (var. altilis DC) [42].

Dựa trên nghiên cứu về đặc điểm hình thái của cây Actisô, Wiklund và cộng sự

(1992) đã khẳng định rằng Actisô trồng (globe Artichoke), rau ca đông lá rậm (leafy

cardoon) và rau ca đông dại (wild cardoon) đều cùng 1 loài duy nhất là Cynara

cardunculus L..

Gần đây, Pignone và Sonnante (2004) đã nghiên cứu về sinh hóa và chất đánh dấu

hóa học để phân loại Cynara cardunculus L. như mô tả ở Hình 1.2, gần giống với

cách phân loại của Wiklund (1992):

Cynara cardunculus L.

var. scolymus (L.) Fiori

Actisô trồng

(Globe Artichoke)

var. sylvestris (Lam.) Fiori

Actisô dại

(Wild Artichoke)

var. altilis DC

Actisô lá rậm

(Leafy cardoon)

Hình 1.2. Vị trí phân loại của Actisô trong loài Cynara cardunculus L.

Trong đó, Cynara cardunculus var. sylvestris (Lam.) Fiori là tổ tiên của 2 loài var.

scolymus (L.) Fiori và var. altilis DC.

1.1.2. Hình thái thực vật

Tên nước ngoài: artichaut (Pháp), artichoke (Anh), artischoke (Đức).

Tên Việt nam: Actisô

Tên khoa học: Cynara scolymus L. Họ Asteraceae.

Nguồn gốc: Actisô là một loại thực vật cổ xưa có thể ăn được, gần với chi carduus.

Về nguồn gốc, loại thực vật này được tìm thấy ở khu vực phía bắc Châu phi. Cho đến

thế kỷ 15, loài này mới được đưa từ Sicile vào Châu âu và được trồng ở Pháp, Anh và

Đức. Cho đến đầu thế kỷ 20 thì mới thấy có những báo cáo sử dụng cây Actisô làm

thuốc [29].

.

12 .

Thực vật học: là loại cây thân thảo lâu năm có nguồn gốc từ vùng Địa trung hải.

Phần dưới đất là một thân rễ to với một hệ thống rễ chằng chịt. Thân cây thẳng

đứng, có rãnh, phân nhánh và dài từ 1m đến 1,5 m. Trong năm đầu tiên, các lá xếp

theo hình hoa thị, lá to rộng, xanh xám, xẻ thùy sâu, gân lá nổi, không có gai,

trắng và có lông ở mặt dưới. Năm thứ hai xuất hiện thân cây, phía trên thân có

những lá to hoàn chỉnh, các lá nhỏ dần từ gốc đến ngọn và tận cùng là những lá

không có cuống. Lá có thể dài đến 1 m. Các hoa màu xanh tím, hình ống, đặt trên

một cụm hoa màu xanh lá cây hoặc màu tím (hoa đầu). Các hoa lưỡng tính và

thường xuất hiện trong năm thứ hai. Đầu cụm hoa rất lớn, có đường kính hơn 10 cm

bao gồm một đế hoa, với sợi lông tua tủa, tụm lại ở đế hoa và tủa ra ở đầu. Quả hình

trứng, nhẵn bóng, màu nâu sẫm, có mào lông trắng. Hạt không có nội nhũ [7], [29].

Hình thái thực vật của Actisô rất đa dạng tùy theo giống và kiểu gen khác nhau.

Sara Lombardo và cộng sự (2010) đã nghiên cứu về mặt sinh học và hình thái sinh

học của loài dựa trên 9 kiểu gen. Bảng 1.2 cho thấy các kiểu gen ảnh hưởng đến

kích thước, hình dạng (chỉ số chiều dài/ đường kính) của hoa và màu sắc bên trong

ngoài của lá bắc. [43]

Kiểu gen

Bảng 1.2. Các đặc điểm hình thái của 9 kiểu gen của loài Actisô trồng

Khối

lượng tươi

tỉ lệ chiều

dài/ đường

kính

Màu lá

bắc ngoài

Concerto 201 ± 4 1,25 ± 0,08 tím đậm

Màu lá

bắc trong

vàng lá

mạ

Harmony F1 225 ± 17 1,15 ± 0,01 xanh lá vàng

Lá bắc

không gai

không gai

nhưng có đầu

nhọn

Madrigal F1 219 ± 37 1,15 ± 0,03 xanh lá vàng không gai

vàng lá

Romanesco clone

tím ánh

144 ± 5 1,05 ± 0,03

mạ ánh không gai

C3

xanh lá

tím

Tema 2000 167 ± 3 1,25 ± 0,03 tím đậm

Tempo 176 ± 66 1,30 ± 0,03

Tondo di

Paestum

Violet de

Provence

210 ± 50 1,00 ± 0,02

125 ± 1 1,45 ± 0,10

Violetto di Sicilia 122 ± 22 1,45 ± 0,05

tím ánh

xanh lá

tím ánh

xanh lá

nhạt

tím ánh

xanh lá

xanh lá ánh

tím

vàng ánh

tím

vàng tím

vàng tím

vàng tím

vàng lá

mạ

không gai

nhưng có đầu

nhọn

không gai

không gai

không gai

không gai

.

13 .

Trên thế giới, có 3 cây phổ biến là Actisô trồng var. scolymus (globe Artichoke-hoa

tròn), rau ca đông trồng var. altilis (cultivated cardoon – hoa dài) và tổ tiên của

chúng var. sylvestris. Trong đó, Actisô hoa tròn (globe Artichoke) thường được

trồng để lấy hoa trưởng thành còn Actisô hoa dài (cultivated cardoon) thường lấy lá

tươi và thân. Ngày nay, xuất hiện nhiều thế hệ lai F1 của chúng đa dạng về hình

dạng và có giống tốt (xem Hình 1.3) [10].

Cynara cardunculus

x

var. scolymus ‘Romanesco C3’

(Globe artichoke)

var. altilis ‘Altilis 41’

(cultivated cardoon)

Các thế hệ lai F1

Hình 1.3. Các thế hệ lai F1 của Cynara Cardunculus L.

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

14

1.1.3. Phân bố sinh thái

Phân bố: Actisô là giống cây tự nhiên của lưu vực Địa Trung Hải và được biết đến

từ thế kỷ thứ tư trước công nguyên như thức ăn và còn được sử dụng làm thuốc.

Người Ả Rập đóng vai trò quan trọng trong việc di thực loài này đến vùng Nam Địa

Trung Hải vào thời Trung Cổ. Actisô có vị trí quan trọng trong ngành nông nghiệp

của vùng Địa Trung Hải với hơn 800.000 ha đất trồng trọt và sản lượng thu họach

hàng năm lên đến khoảng 770.000 tấn (chiếm 70% sản lượng toàn cầu). Italia dẫn

đầu thế giới về sản lượng Actisô (474.000 tấn/năm), tiếp đến là Tây Ban Nha

(215.000 tấn/năm), Pháp (55.000 tấn/năm), Hy Lạp (25.000 tấn/năm). Actisô cũng

được trồng ở vùng Cận Đông (Thổ Nhĩ Kỳ và Iran), Bắc Phi (Ai Cập, Morocco,

Algeria, Tunisia), Nam Mỹ (Argentina, Chilê và Pêru), Hoa Kỳ (chủ yếu là ở vùng

California) và còn được trồng ở Trung Quốc [25]. Ở Việt Nam, Actisô được người

Pháp di thực vào thế kỷ thứ 19 và được trồng ở Sapa (Lào Cai), Tam Đảo (Vĩnh

Phúc) và Đà Lạt (Lâm Đồng).

Trồng trọt: Actisô ưa khí hậu ẩm mát quanh năm. Nhiệt độ thích hợp khoảng 15–18

ºC. Ở Việt nam, thường trồng ở độ cao 1.000–1.500 m so với mặt biển. Actisô là

cây sinh trưởng mạnh, cho nên cần chọn đất dày màu, thoát nước và bón nhiều phân.

Ở Việt nam, Actisô chủ yếu được trồng bằng chồi nhánh và hiện nay chưa thể thu

hoạch hạt và trồng bằng hạt.

Sau khi làm đất nhỏ, lên luống cao 20-25 cm, mặt luống rộng 40 cm, bổ hốc cách

nhau 70-80 cm thành một hàng giữa luống. Dùng 10-15 tấn phân chuồng mục để

bón lót cho 1 ha, thúc bằng nước phân chuồng hoặc phân đạm 2-3 lần tùy tình hình

sinh trưởng của cây. Tưới thúc lần thứ nhất 15 ngày sau khi trồng, lần thứ hai cách

lần trước khoảng 20 ngày. Nếu tưới thúc bằng đạm thì dùng 80-100 kg urê/ha pha

thành dung dịch 2%, tưới vào lúc sáng sớm hoặc chiều mát. Cần làm cỏ vun xới kết

hợp khi tưới thúc [3].

1.1.4. Bộ phận dùng, thu hái, chế biến, bảo quản

Ngoài việc dùng đế hoa và lá bắc để ăn người ta còn dùng thân và lá tươi của Actisô

.


15

làm thuốc. Lá tươi được thu hái lúc sắp hoặc đang ra hoa, rọc bỏ sống lá, sấy hay

phơi khô. Lá tươi và khô dùng dưới hình thức thuốc sắc 5 – 10%, hoặc cao lòng 2 –

10 g / ngày. Có khi chế thành cao mềm hay cao khô để làm thuốc viên, thuốc tiêm

dưới da, tiêm tĩnh mạch. Ngoài ra, còn dùng dưới dạng cao lỏng đặc biệt với hình

thức nhỏ giọt, ngày uống 1 – 3 lần, mỗi lần 10 – 40 giọt [4]. Actisô được bảo quản ở

nhiệt độ khoảng 5 o C trong 10 ngày, nếu sau 10 ngày thì hàm lượng các chất sẽ

giảm đáng kể [4].

1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CHI CYNARA

1.2.1. Dẫn xuất caffeoylquinic

Dẫn xuất acid caffeoylquinic được biết đến nhiều nhất trong Actisô là cynarin (acid

1,3-dicaffeylquinic), dù không phải là chất chiếm hàm lượng cao nhất. Hợp chất

này được phân lập từ dịch chiết lá Actisô và được mô tả lần đầu tiên bởi Panizzi và

Scarpati (1954) [25].

Cynarin (acid 1,3 – dicaffeoylquinic): cynarin là diester caffeic của acid quinic, là

dẫn xuất acid caffeoylquinic được biết đến nhiều nhất và được xem là hoạt chất

chính trong Actisô mặc dù không phải là chất chiếm hàm lượng cao nhất (Hàm

lượng cynarin trong dịch chiết methanol rất thấp chỉ khoảng 1,5%). Hợp chất này

được phân lập từ dịch chiết lá Actisô và được mô tả lần đầu tiên bởi Panizzi và

Scarpati, đã được các tác giả người Ý phân lập ở dạng tinh khiết (1954) [25].

Trong một số tài liệu trước đây cho rằng cynarin tồn tại trong lá tươi là acid 1,3-

dicaffeoylquinic rất dễ bị chuyển thành 1,5-dicaffeoylquinic trong quá trình sắc với

nước và các sản phẩm phân hủy của cynarin như acid caffeic (acid 3,4-dihydroxy

cinnamic), acid clorogenic (acid 5-O-caffeylquinic) và acid neo-clorogenic (acid 3-

O- caffeylquinic) [7]. Tuy nhiên, rất nhiều nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng

cynarin không phải là chất nguyên thủy trong cây mà nó là chất artifact được hình

thành trong quá trình chiết xuất với nước nóng [24], [26], [33].

Dẫn xuất acid caffeoylquinic là thành phần polyphenol chính với acid clorogenic là

.


16

chất có hàm lượng cao nhất (39%), tiếp đến là acid 1,5–O–dicaffeoylquinic (21%) và

acid 3,4-O–dicaffeoylquinic (11%) tính trên tổng hàm lượng acid caffeoylquinic. Hàm

lượng các chất này phụ thuộc dung môi, pH, nhiệt độ trong quá trình chiết xuất [25].

OH

HO

OR 5

4

5

R 4 O COOH

R =

3

2

1

OR 3

OR 1

O

R1 R3 R4 R5 Tên hợp chất

R H H H acid pseudoclorogenic

H R H H acid neoclorogenic

H H H R acid clorogenic

H H R H acid cryptoclorogenic

R R H H cynarin

H R R H acid 3,4-di-O-caffeoylquinic

R H H R acid 1,5-di-O-caffeoylquinic

H R H R acid 3,5-di-O-caffeoylquinic

H H R R acid 4,5-di-O-caffeoylquinic

Hình 1.4. Dẫn xuất của acid caffeoylquinic

1.2.2. Flavonoid

Trong Actisô có chứa các dẫn chất của nhóm flavon như apigenin, luteolin và các

dẫn chất của nhóm anthocyanidin như cyanidin, peonidin và delphinidin. Apigenin

và luteolin glycosid được tìm thấy ở cả lá và hoa trong khi đó các sắc tố

anthocyanidin chỉ tìm thấy ở hoa. Những chất này được xem là thành phần chính

trong tổng lượng các chất phenolic (khoảng 10% hoặc ít hơn) trong mô Actisô.

Luteolin là chất chống oxy hóa mạnh có tác dụng bảo vệ các lipoprotein trọng

lượng phân tử thấp khỏi các tác nhân oxy hóa trong khi đó các sắc tố anthocyanin

ngoài tác dụng cải thiện sức khỏe còn đóng vai trò quan trọng trong các thực vật

dùng làm thức ăn do đó được chấp nhận làm màu thực phẩm [25].

.


17

R1 R2 Tên hợp chất

Rutinose OH Luteolin – O – 7 rutinosid

Glucose OH Luteolin – O – 7 glucosid

Ruttinose H Apigenin – O – 7 rutinosid

Glucose H Apigenin – O – 7 glucosid

Hình 1.5. Dẫn xuất Flavonoid.

Các dẫn chất của luteolin bao gồm:

– Cynarosid (luteolin 7-O-β-glycopyranosid).

– Scolymosid [luteolin-7-O-[β-D-glucopyranosyl-(2→1)-α-L-rhamnopyranosyl].

– Cynarotriosid (luteolin-7- rutinosid, 3’-glucose).

Ngoài ra, tùy theo loài còn có dẫn chất khác luteolin như apigenin 7-O-rutinosid,

apigenin 7-O-glucosid hay các dẫn chất của naringenin (narirutin) như narigenin 7-

O- glucosid [23].

1.2.3. Sesquiterpen lacton

Cynaropicrin

R =

O

OH

Aguerin

R =

O

Grosheimin

Hình 1.6. Dẫn xuất Sesquiterpen lacton.

.


18

Sesquiterpen lacton là hợp chất chính tạo nên vị đắng của cây. Schneider và Thiele

đã báo cáo rằng hợp chất này chỉ có trong các phần màu xanh của cây như lá, mà

hoàn toàn không có trong rễ. Lượng sesquiterpen lacton chiếm 2,55% (trọng lượng

khô) trong dịch chiết lá Actisô [22]. Gồm 2 Sesquiterpen lacton chính là

cynaropicrin và grosheimin. Ngoài ra, còn có sesequiterpen B- selinen và

caryphyllen [28].

1.2.4. Inulin

Inulin chủ yếu được tìm thấy trong cây hai lá mầm thuộc họ Asteraceae gồm những

loài phổ biến như rau Diếp xoăn (Cichorium intybus L.), Actisô (C. scolymus), Bồ

công anh (Taraxacum officinale), Thược dược (Dalia variabilis), Lê đất (Polymia

sonchifolia). Inulin trong Actisô có chiều dài chuỗi lên đến 200 phân tử fructose

(thuộc nhóm fructan) liên kết với nhau theo liên kết β-2,1 và β-2,6 dưới dạng mạch

thẳng hoặc mạch nhánh. Inulin trong Actisô được xem là chất có mức độ trùng hợp

phân tử cao nhất trong giới thực vật [25].

Các dược liệu giàu inulin đang trở thành loại thực phẩm chức năng được ưa thích

nhờ những lợi ích tiềm năng đối với sức khỏe con người. Vì con người không có

enzym tiêu hóa fructan nên khi xuống đại tràng, chất này đóng vai trò như chất nền

cho sự phát triển của hệ vi khuẩn. Chế độ ăn giàu fructan có tác dụng kích thích

bifidobacteria một cách chọn lọc, giúp chúng phát triển và nhờ đó làm giảm sự tạo

thành những chất gây khối u. Một lí do khác khiến inulin được ưa dùng là nhờ có

ảnh hưởng nhất định đến thành phần hệ vi sinh vật trong ruột và có hiệu quả tốt đối

với việc hấp thu chất khoáng, lipid trong máu và ngăn ngừa ung thư đại tràng.

Ngoài ra, inulin là chất có lượng calori thấp nên còn được sử dụng để sản xuất thực

phẩm giảm béo [25].

1.2.5. Các thành phần khác

Actisô cũng có chứa chất xơ, calcium, phosphor, kali, acid folic, vitamin C, niacin,

thiamin, nguyên tố vi lượng và carrotenoid.

.


19

Trong Actisô còn có một số loại enzym như oxidase, peroxidase, cynarase,

ascorbinase và ribulose-1,5-diphosphate carboxylase. Đặc biệt, Actisô có chứa

nhiều polyphenol oxidase. Các enzym hoạt động mạnh ở pH 4-7,6 và dễ phá hủy

hoạt chất trong quá trình phơi, sấy và chế biến.

Tinh dầu với các thành phần như beta – selinen, caryophyllen, eugenol,

phenylacetaldehyd và decanal.

Acid béo no và không no như acid stearic, acid palmitic, acid oleic và acid linoleic.

Ngoài ra, nghiên cứu cũng cho thấy lá Actisô còn chứa các carbohydrat như:

fructose, saccarose, glucose, hemicellulose…[35].

Tổng cộng có 15 axit amin được tìm thấy trong lá Actisô. Chín trong số này là rất

cần thiết gồm: valin, threonin, methionin, isoleucin, leucin, lysin, phenylalanin,

histidin, arginin. Hàm lượng các axit amin toàn phần là 58,29%, trong đó axit amin

thiết yếu chiếm 4,71%) [36].

1.3. TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA ACTISÔ

1.3.1. Tác dụng chống oxy hóa

Một nghiên cứu được thực hiện trên bạch cầu của những người thường xuyên chịu

tác động oxy hóa cao, đã xác định được dịch chiết của lá Actisô có tính chống oxy

hóa ở nồng độ từ 1 – 10 mg/ml, quá nồng độ này hoạt tính chống oxy hóa sẽ giảm.

Nghiên cứu tương tự khác vào năm 2002 trên các tế bào nội mạc mạch máu trong

ống nghiệm cũng đã chứng minh tác dụng chống oxy hóa của Actisô. Ngoài ra, thử

nghiệm cho thấy, phân đoạn n-butanol của dịch chiết lá có tác dụng chống oxy hóa

mạnh nhất [27].

1.3.2. Tác dụng trên gan mật

Trên in vitro, dịch chiết Actisô có tác dụng bảo vệ tế bào gan chuột khỏi sự phá hủy

màng tế bào. Ngoài ra, ở nồng độ 100 g/ml, dịch chiết lá Actisô (có chứa 27% acid

caffeoylquinic và 7% flavonoid) còn giúp làm tăng đáng kể hoạt động của tế bào

.


20

gan HepG2 sau khi ủ 48 giờ. Cũng tại nồng độ này dịch chiết Actisô được chứng

minh làm giảm tổn thương tế bào do ethanol gây ra (nồng độ 50 milimol) [17].

Ngoài ra, ở nồng độ 250 mg/kg/ngày (đường uống) Actisô đã được chứng minh có

khả năng bảo vệ tế bào gan khỏi tác hại của paracetamol [34].

1.3.3. Tác dụng làm giảm cholesterol

Dịch chiết lá Actisô có tác dụng ngăn cản sinh tổng hợp cholesterol ở gan. Tác dụng

này là nhờ luteolin làm giảm đặc tính của HMG-CoA (enzym xúc tác quá trình sinh

tổng hợp cholesterol). Hơn nữa, acid clorogenic và luteolin có thể ngăn cản quá

trình gây xơ cứng động mạch nhờ ngăn cản sự oxy hoá LDL. Nói chung, Actisô làm

giảm cholesterol theo 2 cơ chế song song là giảm sinh tổng hợp cholesterol và ngăn chặn

sự oxy hoá LDL khi sử dụng 1280 mg dịch chiết Actisô đã được tiêu chuẩn hóa

trong 12 tuần [30].

1.3.4. Tác dụng kháng khuẩn – kháng nấm

Ba dịch chiết chloroform, Ethyl acetat, và n – butanol của lá Actisô đều có tác dụng

kháng khuẩn và kháng nấm. Trong đó, có 4 vi khuẩn gram dương là: Bacillus

subtilis, Staphylococcus aureus, Agrobacterium tumefaciens, và Micrococcus luteus,

2 vi khuẩn gram âm là: Escherichia coli, Salmonella typhimurium. Cùng 3 nấm men

là: Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, và

2 nấm mốc Aspergillus niger, Penicillium oxalicum. Trong số đó, axit chlorogenic,

cynarin, luteolin-7-rutinoside, và cynaroside có tác dụng tương đối cao hơn so với

các hợp chất khác; và có hiệu quả hơn với nấm. Nồng độ ức chế tối thiểu của các

hợp chất này là từ 50 đến 200 g/mL. [38].

1.3.5. Tác dụng trên tim mạch

Rossoni và cộng sự (2005) đã chứng minh Cynara cardunculus có thể làm tăng sự

sản xuất nitric oxid nên làm giãn mạch máu ở các tế bào nội mô động mạch chủ của

thú vật thí nghiệm. Các tác giả cũng chứng minh được rằng luteolin và apigenin có

tác dụng trên sự giãn động mạch chủ khi thêm vào thành phần để tắm xông hơi. Li

và cộng sự (2004) đã nghiên cứu và chứng minh được sở dĩ có sự tăng hàm lượng

.


21

nitric oxid là do enzym tổng hợp nitric oxid (nitric oxide synthase: eNOS). Các

flavonoid trong Actisô đã làm tăng hoạt tính của eNOS. Thử nghiệm cũng đã chứng

minh rằng chỉ có luteolin và cynarosid có tác dụng làm tăng hoạt tính của eNOS

nhưng cynarin và acid clorogenic lại không có tác dụng này.

Tác dụng làm hạ lipid huyết, chống oxy hóa và làm tăng quá trình sao chép của các gen

tổng hợp nitric-oxid của Actisô giúp ích cho việc điều trị các bệnh về tim mạch [25].

1.3.6. Tác dụng trên hệ tiêu hóa

Với liều 125 – 500 mg/kg, Actisô được chứng minh có khả năng chống lại tác hại

của ethanol trên hệ tiêu hóa. Mặt khác, ở liều 1000 – 2000 mg/kg, Actisô có thể

ngăn cản tổn thương niêm mạc dạ dày do stress gây ra [21].

Nghiên cứu cho thấy dịch chiết Actisô có lợi ích trong việc điều trị các bệnh rối

loạn tiêu hóa. Các hợp chất cynarosid trong Actisô có tác dụng tăng co thắt hồi

tràng, thông qua thụ thể của chất trung gian hóa học là serotonin [39].

Dịch chiết lá Actisô được sử dụng để điều trị các bệnh dạ dày – ruột chủ yếu dựa

vào tác động chống lại chứng khó tiêu gián tiếp thông qua đặc tính tẩy xổ. Tác dụng

tấy xổ của Actisô tương tự các hợp chất acid dehydrocholic [25].

1.3.7. Tác dụng kháng viêm

Luteolin có tính kháng viêm và kháng dị ứng do có tác dụng ức chế sự thành lập

COX – 2, PGE2 và lipopolysaccaride (LPS). Luteolin còn ức chế xanthin oxidase ở

liều 100 µmol/L, ức chế lipoxygenase, ức chế sự sản sinh quá mức của α – TNF là

những chất gây viêm và gây chết tế bào [32].

1.3.8. Tác dụng kháng ung thư

Với nồng độ từ 10 – 100 M, acid clorogenic có tác dụng ức chế mạnh glucose-6-

phosphattranslocase (một yếu tố liên quan đến kiểu hình xâm lấn của các tế bào u

não). Hơn nữa, acid clorogenic còn có tác dụng ức chế sự di căn của tế bào gây ra

bởi sphingosin – 1 phosphat (S1P) – chất gây gián phân cho tế bào u nguyên bào xốp [14].

1.3.9. Tác dụng kháng HIV

.


22

Nghiên cứu trước đây cũng chỉ ra rằng hợp chất 1,5 – dicaffeoylquinic acid có trong

Actisô có khả năng ức chế mạnh mẽ và không độc hại HIV – 1 intergrase, một

enzym cần thiết cho sự xâm nhập của bộ gen HIV vào tế bào vật chủ [15].

1.4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KIỂM NGHIỆM ACTISÔ

1.4.1. Tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV

Định lượng bằng phương pháp đo quang UV-Vis

Cân chính xác khoảng 3 g dược liệu và cắt nhỏ hoặc xay thành bột thô. Làm ẩm với

ethanol 96% (TT) trong 30 phút, cho vào bình Soxhlet chiết với ethanol 70% (TT)

trên cách thuỷ cho tới hết hoạt chất (thử bằng phản ứng định tính A: dịch thử không

xuất hiện màu hồng cánh sen). Cất thu hồi dung môi. Cắn còn lại thêm 20 ml nước

cất, lọc qua giấy lọc. Cho dịch lọc vào ống quay ly tâm và thêm 20 ml dung dịch chì

acetat 10% (TT), khuấy đều. Ly tâm với vận tốc 3000 vòng/phút, trong 15 phút.

Gạn bỏ lớp nước. Thêm vào cắn 5 ml dung dịch acid acetic 10% (TT) và 25 ml

dung dịch acid sulfuric 0,05 M (TT) .Chuyển hỗn hợp vào bình định mức 100 ml,

lắc đều trong 30 phút. Thêm nước cất đến vạch . Lấy 20 ml hỗn hợp vào ống ly tâm

và ly tâm như trên. Lấy chính xác 1 ml dung dịch trong ở phía trên, cho vào bình

định mức 50 ml. Thêm methanol (TT) đến vạch. Đo độ hấp thu cực đại ở bước sóng

325 nm. Mẫu trắng là methanol (TT).

Hàm lượng hoạt chất trong dược liệu được tính theo công thức sau:

A x 10000/616 x P

A: Độ hấp thu của mẫu đo.

616: Độ hấp thu của dung dịch cynarin 1% trong methanol (TT) ở bước sóng 325 nm.

P: Khối lượng dược liệu thô (đã trừ độ ẩm).

Dược liệu phải chứa không ít hơn 0,1% hoạt chất tính theo cynarin [6].

1.4.2. Tiêu chuẩn Dược điển Anh, Dược điển Châu Âu

Phải chứa tối thiểu 0,8% acid chlorogenic (C16H18O9) (thuốc khô).

.


23

Định lượng bằng phương pháp HPLC-UV

Chuẩn bị mẫu thử:

Dung dịch thử: Để 0,500 g thuốc bột (1000), thêm 50 ml methanol và đun hồi lưu

trên cách thủy ở 70 °C trong 1 giờ. Ly tâm và chuyển phần nổi vào bình định mức

200 ml. Lặp lại và pha loãng thành 200 ml với nước cất.

Dung dịch đối chiếu: Hòa tan 5,0 mg acid clorogenic trong 50 ml methanol. Chuyển

5,0 ml dung dịch này vào bình định mức, thêm 5 ml methanol và pha loãng thành

20 ml bằng nước.

Điều kiện sắc ký:

– Cột sắc ký: 250 mm x 4,6 mm; 5 µm.

– Nhiệt độ cột 40 o C.

– Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút.

– Bước sóng phát hiện: 330 nm.

– Pha động: acid phosphoric – nước (0,5: 99,5) (Kênh A); acid phosphoric:

acetonitril (0,5: 99,5) (Kênh B).

– Phát hiện: ở bước sóng 330 nm.

– Thể tích tiêm: 25 ml.

– Chương trình chạy:

Thời gian Kênh A Kênh B

0 -1 92 8

1 -20 9275 825

20-33 75 25

33 -35 750 25100

35 - 37 092 1008

37 - 47 92 8

Dung dịch thử: Sắc ký đồ thu được là tương tự như trên sắc ký đồ của mẫu đối chiếu.

Tính hàm lượng phần trăm của axit chlorogenic sử dụng các biểu thức sau đây:

.


24

A1: diện tích của pic acit clorogenic của mẫu thử

A2: diện tích của pic acid clorogenic của dung dịch đối chiếu

m1: khối lượng của thuốc được kiểm tra trong các dung dịch thử (gam)

m2: khối lượng của acid clorogenic trong dung dịch đối chiếu (gam)

p: hàm lượng phần trăm của acid clorogenic của dung dịch đối chiếu [14].

1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CÁC HỢP

CHẤT PHENOL TRONG ACTISÔ BẰNG HPLC

Hiện nay có nhiều phương pháp định tính và định lượng polyphenol từ Actisô và

chế phẩm bằng phương pháp HPLC:

Katrin Schutz và cộng sự (2004) [20] đã xây dựng phương pháp định tính, định lượng

acid caffeoyquinic và flavonoid trong hoa đầu Actisô như sau: 4 g hoa đầu đông lạnh

được cắt nhỏ, chiết xuất bằng MeOH 60%, khuấy trộn trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng.

Dịch chiết được lọc qua giấy lọc rồi bốc hơi ở 30 o C, hòa tan cắn trong nước và điều

chỉnh đến pH 7. Chuyển toàn bộ dịch chiết vào bình định mức 25 ml và điều chỉnh

đến vạch, chỉnh pH đến 7 trước khi mẫu được tinh khiết hoá bằng cột SPE-C18.

Hoạt hoá cột với 5 ml methanol và rửa lại 10 ml nước, sau đó nạp 4 ml mẫu. Các

dẫn xuất của acid hydroxycinnamic lần lượt được rửa giải với 50 ml methanol 10%

(phân đoạn 1), rồi đến 50 ml methanol 100% (phân đoạn 2). Các phân đoạn được

loại hết dung môi đến cắn rồi hoà lại với methanol 50%. Khai triển trên HPLC với

cột Phenomenex ODS, Hydro-Synergi C18 (150 × 3 mm; 4 µm), thể tích tiêm mẫu

là 5 μl, phát hiện ở bước sóng 280 nm (narirutin), 320 nm (acid hydroxy cinnamic),

330 nm (dẫn xuất của apigenin) và 350 nm (dẫn xuất luteolin), nhiệt độ cột 25 o C,

với điều kiện được nêu ở Bảng 1.3.

Kết quả phân tích được trình bày ở Hình 1.7.

.


25

Phân đoạn II

Phân đoạn I

Đỉnh:

1. acid 1-O-caffeoylquinic


3. acid clorogenic


5. acid caffeic

6. cynarin

7. luteolin 7-O-glucuronide

8. acid dicaffeoylquinic

9. acid 3,4-di-O-caffeoylquinic



12. apigenin 7-O-glucuronide


14. ni a

15. luteolin 7-O-rutinoside

16. luteolin 7-O-glucoside

17. ni a

18. ni a

19. narirutin

20. naringenin 7-O-glucoside

21. apigenin 7-O-rutinoside

22. apigenin 7-O-glucoside

a

not indentified: chưa xác định

Hình 1.7. Sắc ký đồ dịch chiết hoa đầu của Actisô

Bảng 1.3. Chương trình HPLC phân tích các hợp chất phenol

trong dịch chiết hoa đầu của Actisô

Thời gian

(phút)

Tốc dộ dòng

(ml/phút)

2% AA/ H2O (%) 0,5% AA/H2O-ACN

(50:50) (%)

0 0,4 90 10

20 0,4 82 18

30 0,4 76 24

45 0,4 70 30

65 0,4 70 30

70 0,4 45 55

75 0,4 45 55

83 0,4 0 100

85 0,4 0 100

James E. Simon và cộng sự (2003) [25] đã định tính và định lượng thành phần

polyphenol trong Actisô như sau: cân chính xác khoảng 500-1000 mg lá khô hoặc

.


26

hoa đầu vào bình định mức 100 ml, thêm 70 ml methanol 60%, siêu âm 25 phút, sau

đó để ổn định ở nhiệt độ phòng và điều chỉnh bằng methanol 60% cho đủ thể tích,

lọc qua màng lọc milipore 0,45 μm. Khai triển HPLC được thực hiện trên cột

Phenomenex ODS3 (150× 3,2 mm; 5µm), phát hiện ở bước sóng 330 nm, pha động

gồm 0,2% H3PO4/H2O (A) và acetonitril (B) với chương trình gradient như sau: 6%

B (0’), 6-30% B (20’), 30% B (5’). Chạy thêm 10 phút để ổn định cột. Tổng thời

gian phân tích là 35 phút, tốc độ dòng 1,2 ml/phút.

A

B

Dịch chiết lá (A); Dịch chiết hoa đầu (B)

Hình 1.8. Sắc ký đồ dịch chiết lá và hoa Actisô

Một số điều kiện HPLC trong phân tích các hợp hợp chất phenol trong Actisô được

trình bày tóm tắt trong Bảng 1.4.

Bảng 1.4. Một số điều kiện định lượng các hợp chất trong Actisô bằng HPLC

Máy

Cột sắc ký

Pha động Chế độ chạy

Tốc độ

λmax

Tài

(t o cột)

Tổng thời gian

dòng

(nm)

liệu

phân tích (TRT)

Shimadzu

LiChrospher

C18

Dung môi A: 0,3%

Gradient: 8-48% B

1,0

254,

[11]

HPLC-DAD

(250 x 4,6 mm,

FA/H2O

(35’). TRT: 35’

ml/phút

320

5µm, 100A o )

Dung môi B: iPro-

(25 o C)

ACN-MeOH-0,3%

FA/H2O

(18:30:12:40)

Hewlett-

Phenomenex C18

Dung môi A: 0,2%

Gradient: 6% -30%

1,2

330 [22]

Packard HP-

(150 x 3,2 mm,

H3PO4/H2O

B (20’), 30% B

ml/phút

DAD

5µm, 100 A o )

Dung môi B: ACN

(15’). TRT: 35’

(25 o C)

Hewlett-

Luna C18

Dung môi A:

Gradient: 10-36%

0,2

330

[23]

Packard HP-

(250 x 2 mm, 5

0,03% TFA/H2O

B (35’). TRT: 35’

ml/phút

và

DAD

µm). (25 o C)

Dung môi B: ACN

210

.


27

Agilent 1100-

Zorbax Eclipse

Dung môi A:

Gradient: 8-15% B

1,0

330 [13]

DAD

(250 x 4,6 mm,

0,1% AA/H2O

(20’), 15-30% B

ml/phút

5µm) (25 o C)

Dung môi B: ACN

(10’) TRT: 30’

1100 HPLC

Phenomenex C18

Dung môi A:

Gradient: 10-18%

0,4

280;

[14]

(Hewlett-

ODS

(Torrance,

2% AA/ H2O

B (20’), 18-24% B

ml/phút

320;

Packard,

CA) (150 x 3,0

Dung môi B:

(10’), 24-30% B

330;

Waldbronn,

mm, 4 µm) (25 o C)

0,5 % AA/ACN (1:1)

(15’), 30% B (20’),

350

Germany)

+ tiền cột ODS

30-55 % B (5’), 55-

C18 (4 x 3 mm)

100% B (5’), 100%

(25 o C)

B (8’), 100-10% B

(2’).

TRT: 90’

Perkin-Elmer,

Phenomenex

Dung môi A:

Gradient: 20-30%

0,8

330,

[16]

HPLC-UV/Vis

Prodigy

ODS3

0,2% FA/H2O

B (6’), 30-40% B

ml/phút

280

200

(Torrance,

CA)

Dung môi B:

(10’), 40-50% B

(250 cm x 4,6

ACN/MeOH (60:40)

(8’), 50-90% B (8’),

mm, 5 µm) (25 o C)

90% B (3’), 90-

20% B (3’)

TRT: 38’

Beckman

Khromasil

KR

Dung môi A:

Gradient: 10-50%

1

280 [23]

Gold.

100-5 C18 (250

0,1% TFA

B (30’), 50-100% B

ml/phút

HPLC-UV

cm x 4,6 mm)

Dung môi B:

(5’), 100% B (2’),

(25 o C)

0,1%TFA/ACN

100-10% B (10’).

95%/H2O

TRT: 54’

Waters 2695

Fused core C18

Dung môi A:

Gradient: 5% B

0,8

[27]

UPLC-ESI-

(Halo 50 x 2,1

0,1% FA/H2O

(0’), 12% B (1’),

ml/phút

MS/MS

mm; 2,7 μm)

Dung môi B:

18% B (3’), 90% B

(25 o C)

ACN

(4’), 60% B (5’).

TRT: 14’

Perkin-Elmer

LiChrosorb

C18

Dung môi A:

Gradient 1: 15-

1

325;

[29]

HPLC-PDA

(Merck) (250 x 4

AA-H2O (5:95)

40% B (20’), 40%

ml/phút

265

HPLC-FL

mm, 7 μm) (25 o C)

Dung môi B:

B (25’-30’), 40-63%

(λex)

MeOH

B (30’-45’), 63% B

345

(47’), 63-99% (47’-

(λem).

51’) TRT: 51’

Gradient 2: 10% B,

10-40% B(25’), 40-

99% B (25’-40’).

TRT: 40’

Gilson HPLC-

Platinum EPS C18

Dung môi:

Đẳng

môi:

0,5

254 [28]

UV/Vis

100 metallic (250

MeOH-H2O-H3PO4

400:600:5

ml/phút

x 4,6 mm; 5 μm)

TRT: 170’

.


28

HP 1090 L

LiChrosorb

C18

Dung môi A:

Gradient: 12% B

1,3

[21]

LC-PDA

(250 x 4 mm;

H2O

(0,1’), 12-18% B

ml/phút

LC-DAD

Merck) + tiền cột

Dung môi B:

(9,9’), 18% B (5’), 18-

LC-API-MS

LiChrosorb

C18

ACN

45% B (15’), 45-

(10 x 4 mm,

100% B (5’), 100% B

Merck)

(7’), 100-12% B (8’).

TRT: 50’

Merck-Hitachi

LiChroCART

Dung môi A:

Gradient: 5-20% B

1

330 [25]

L-7420

(Hewlett-Packard)

H2O:FA (95:5)

(5’), 20-25% B

ml/phút

HPLC-UV/Vis

C18 (250 x 4 mm;

Dung môi B:

(45’), 25-30% B

5 μm).

MeOH

(10’), 80% B (2’);

TRT: 62’

Merck-Hitachi

Lichrospher

C18

Dung môi A:

Gradient: 8-70% B

0,4

326 [32]

Lachrom

(250 x 4 mm; 5

AA/H2O (pH 2)

(50’). TRT: 50’

ml/phút

HPLC-UV/Vis

μm), (30 o C)

Dung môi B: ACN

Agilent Hypersil ODS C18 Dung môi A: Gradient: 15% 0,5 280 [28]

Technologies

1100

HPLC/UV/Vis

(250 x 4,6 mm; 4

μm)

0,2% H2SO4/H2O

Dung môi B:

ACN

B(12’), 15-40% B

(2’), 40-60% B (4’),

60-80% B (2’), 80-

90% B (4’), 90-100%

B (4’). TRT: 28’

ml/phút

Chú thích: λex (bước sóng kích thích); λem (bước sóng phát xạ); TRT: total running time

1.5. MỘT SỐ CHẾ PHẨM TRÀ TÚI LỌC TRÊN THỊ TRƯỜNG

ATISO

Cơ sở sản xuất Tâm Châu

ATISÔ

Cơ sở sản xuất trà Hùng Phát

TRÀ ATISÔ

Sản phẩm của Big C

Trà LadoActiso

Công ty cổ phần dược phẩm Lâm

Đồng

Trà Atisô

Cơ sở sản xuất Vĩnh Tiến

Trà Atisô

Công ty TNHH thương mại và

dịch vụ Đại Gia

Actisô nhân sâm Trà tươi Actiso Trà Atisô

.


29

Cơ sở trà Hoàng Duy

Công ty cổ phần dược phẩm Lâm

Đồng

Hình 1.9. Một số chế phẩm trên thị trường

Cơ sở trà Trâm Anh

.


30

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1.6. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

1.6.1. Nguyên liệu

Các chất đối chiếu là: cynarin (CY), acid clorogenic (AC), scolymosid (SCO),

cynarosid (CR) đã được phân lập từ các đề tài trước của nhóm nghiên cứu [1], [8].

Trong đó CY, AC, CR đã được thiết lập chất chuẩn với hàm lượng tính trên nguyên

trạng lần lượt là: 94,26%; 92,39%; 91,53%.

Lá Actisô: Lá tươi của 2 giống lá tím và trắng được thu hái ở phường 5, Tp. Đà lạt

vào tháng 3/2017, các lá được chọn là những lá to, già nằm ở gốc của thân cây. Sau

khi thu hái lá được rửa sạch, làm khô bằng 3 phương pháp khác nhau gồm phơi âm

can, phơi trực tiếp dưới ánh nắng, sấy ở 50-60 o C. Trong đó, giống lá trắng phơi âm

can được dùng làm nguyên liệu để xây dựng quy trình định lượng. Ngoài ra, lá trắng

và tím thu hái vào tháng 3, 4, 5, 6 tương ứng với độ tuổi của cây là 6, 7, 8, 9 tháng

tuổi được dùng để đánh giá hàm lượng hoạt chất theo từng thời vụ thu hái.

Rễ và Hoa: được thu hái ở phường 5, Tp. Đà lạt vào tháng 3/2017, sau đó rửa sạch,

phơi âm can đến khô (độ ẩm dược liệu dưới 13%).

Tất cả các nguyên liệu trên được xay nhỏ, rây qua 2 cỡ rây 0,3 mm và 0,125 mm,

lấy phần bột qua rây 0,3 mm nhưng không qua rây 0,125 mm.

Một số chế phẩm dạng trà được mua trên thị trường có các thành phần được trình

bày ở Bảng 2.3

Bảng 2.5. Một số chế phẩm trên thị trường

STT Ký hiệu mẫu Thành phẩn

1 HP Actisô 100%

2 HD 70% Actisô, 30%sâm

3 DG Atisô, cỏ ngọt

4 VT 40 %Rễ, 40% thân, 10%hoa, cam thảo

5 LDX Lá tươi 100%

6 LDD Cao Actisô, Lá Actisô, thảo quyết minh

.


31

7 TC Hoa Actisô

8 TA 60% Hoa, 20% thân, 20% rễ Actisô

9 BC Rễ, thân Actisô

10 TB Thân và lá 50%, rễ 35%, hoa 7%, cỏ ngọt 8%

1.6.2. Dung môi, hóa chất

Dung môi HPLC: acetonitril (Merck), methanol (Merck), acid formic (Merck),

nước cất 2 lần.

Dung môi khác: methanol, ethanol, ethyl acetat, nước cất

1.6.3. Thiết bị, dụng cụ

Các thiết bị trong nghiên cứu hóa học

- Cân phân tích 5 số lẻ CP-2250 (Sartorius).

- Máy xác định độ ẩm MA-45 (Sartorius).

- Bể siêu âm Sonorex RK - 1028H (Bandelin, Đức).

- Bếp cách thủy Memmert WB -14 (Đức).

Các thiết bị sắc ký

− Máy sắc ký lỏng siêu hiệu năng Acquity UPLC (Waters), đầu dò PDA (Waters).

− Cột sắc ký: CORTECS C18 (100 × 4,6 mm; 2,7 μm)

− Phần mềm EMPOWER truy xuất hình ảnh, số liệu cho định tính, định lượng trên

máy UPLC.

Dụng cụ nghiên cứu

Bình lắng gạn, bình định mức, bình nón nút mài, micro pipette, pipette chính xác,

vial thuỷ tinh 20 ml, ống eppendorf (1,5 ml và 15 ml)...và các dụng cụ thông thường

khác trong phòng thí nghiệm.

Xử lý số liệu: Phần mềm SBSS, Microsoft Excel 2007 để phân tích thống kê, kiểm

định sự khác nhau giữa các biến bằng phân tích phương sai (anova), dùng t-test để

kiểm định 2 giá trị trung bình.

.


32

1.7. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1.7.1. Xây dựng quy trình định tính, định lượng đồng thời cynarin, acid

clorogenic, scolymosid, cynarosid trong lá Actisô bằng UPLC

1.7.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký

Tiêu chí lựa chọn chương trình rửa giải:

So sánh các sắc ký đồ và các thông số sắc ký của mẫu thử và mẫu chuẩn để lựa

chọn điều kiện pha động tối ưu nhất. Lựa chọn chương trình dung môi dựa trên các

tiêu chí sau:

Pic tách tốt (Rs ≥ 1,5); cân đối và ít kéo đuôi (0,8 ≤ As ≤ 1,5)

Đỉnh cần định lượng đạt độ tinh khiết pic (giá trị purity angle < purity thresold)

Thời gian lưu ngắn

Tổng thời gian phân tích ngắn (bao gồm thời gian phân tích, rửa và cân bằng cột)

Độ lặp lại tốt

Bước sóng phát hiện: khai triển mẫu chuẩn cynarin, acid clorogenic, scolymosid,

và cynarosid trên UPLC-PDA với dải bước sóng phát hiện từ 200 - 400 nm. Chọn

bước sóng có đỉnh hấp thu cực đại và ổn định..

Khảo sát hệ dung môi: tiến hành thăm dò nồng độ acid thêm vào trong pha động

để cho các pic tách gọn và hạn chế kéo đuôi

Nước acid formic 0,1% ( D) – ACN (C)

Nước acid formic 0,2% ( D) – ACN (C)

Chương trình rửa giải: khai triển trên mẫu thử, khảo sát chế độ rửa giải sao cho các

pic của cynarin, acid clorogenic, scolymosid, và cynarosid tách rõ so với pic kế cận,

ngoài ra pic cần định lượng phải đạt các thông số sắc ký như độ tinh khiết pic, hệ số

kéo đuôi (As), độ phân giải, hệ số dung lượng, số đĩa lý thuyết…

Tốc độ dòng: triển khai trên mẫu thử với chương trình đã được lựa chọn như trên ở

tốc độ dòng khác nhau (0,3 ml/phút; 0,35 ml/phút; 0,4 ml/phút; 0,45 ml/phút và 0,5

ml/phút). So sánh sắc ký đồ UPLC để chọn tốc độ dòng thích hợp.

.


33

Nhiệt độ cột: triển khai trên mẫu thử với chương trình rửa giải và tốc độ dòng đã

được lựa chọn với các nhiệt độ cột là 27 o C, 30 o C, 35 o C, 40 o C và lựa chọn nhiệt

độ cột theo những tiêu chí đã đặt ra.

1.7.1.2. Khảo sát quy trình chiết xuất trên mẫu thử

a. Khảo sát dung môi chiết xuất

Lựa chọn dung môi chiết được nhiều hoạt chất cần định lượng và ít tạp chất nhất. Vì

hợp chất cần chiết ở đây là polyphenol nên lựa chọn 4 loại dung môi là: nước,

ethanol, methanol với nồng độ khác nhau và ethyl acetat.

Tiến hành: cân chính xác 100 mg bột lá Actisô vào vial 20 ml, thêm 10 ml dung môi

khảo sát (methanol 40%, 70%, 100%; ethanol 40%, 70%, 96%; ethyl acetat và

nước), lắc đều. Đun cách thủy trong 45 phút (các vial ngập trong nước ở 100 o C).

Lấy vial ra để nguội ở nhiệt độ phòng, lọc dịch chiết qua bông vào bình định mức

25 ml. Thêm dung môi cho đủ thể tích bình, lọc qua màng lọc milipore cellulose

acetat 0,22 μm trước khi khai triển trên UPLC theo điều kiện đã lựa chọn. Thể tích tiêm

mẫu 3 μl. So sánh diện tích pic của AC, CY, SCO, CR trong dung môi khảo sát.

b. Khảo sát nhiệt độ chiết

Tiến hành: cân chính xác 100 mg bột lá actisô vào vial 20 ml, thêm 10 ml dung môi

đã được khảo sát lắc đều. Đun trong bếp cách thủy ở 60 o C, 80 o C và 100 o C trong

45 phút. Lấy vial ra để nguội ở nhiệt độ phòng, lọc dịch chiết qua bông vào bình

định mức 25 ml. Thêm dung môi cho đủ thể tích bình, lọc qua màng lọc milipore

cellulose acetat 0,22 μm trước khi khai triển trên UPLC theo điều kiện đã lựa chọn.

Thể tích tiêm mẫu 3 μl. So sánh diện tích pic của AC, CY, SCO, CR ở các nhiệt độ

chiết xuất cần khảo sát.

c. Khảo sát thời gian chiết


đã được khảo sát lắc đều. Đun trong bếp cách thủy ở nhiệt độ đã khảo sát ở trên

trong 30 phút, 45 phút, 1 giờ, 1 giờ 30 phút, 2 giờ, 2 giờ 30 phút. Lấy vial ra để

.


34

nguội ở nhiệt độ phòng, lọc dịch chiết qua bông vào bình định mức 25 ml. Thêm

dung môi cho đủ thể tích bình, lọc qua màng lọc milipore cellulose acetat 0,22 μm

trước khi khai triển trên UPLC theo điều kiện đã lựa chọn. Thể tích tiêm mẫu 3 μl.

So sánh diện tích pic của AC, CY, SCO, CR ở các thời gian chiết xuất cần khảo sát.

d. Khảo sát số lần chiết để chiết kiệt hoạt chất


đã được khảo sát lắc đều. Đun trong bếp cách thủy ở nhiệt độ và thời gian đã khảo

sát ở trên. Lấy vial ra để nguội ở nhiệt độ phòng, lọc dịch chiết qua bông vào bình

định mức 25 ml. Thêm dung môi cho đủ thể tích bình, lọc qua màng lọc milipore

cellulose acetat 0,22 μm trước khi khai triển trên UPLC theo điều kiện đã lựa chọn.

Bã dược liệu dược chiết tiếp 3 lần nữa, mỗi lần 5 ml nước cất, thực hiện điều kiện

tương tự như trên thu được dịch chiết 2, dịch chiết 3, dịch chiết 4. Thể tích tiêm

mẫu 3 μl. So sánh diện tích pic của AC, CY, SCO, CR của 4 lần chiết.

1.7.1.3. Quy trình định lượng được xây dựng

Chiết xuất:

Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 100 mg bột lá khô Actisô cho vào vial 20 ml. Thêm

khoảng 10 ml nước sôi. Chiết trong cách thủy ở 100 o C trong 90 phút. Lọc dịch

chiết qua bông vào bình định mức 25 ml. Bã dược liệu được chiết tiếp lần 1 lần nữa

với 5 ml nước sôi với cùng điều kiện như trên, lọc dịch chiết cho vào bình định mức,

bổ sung nước đến vạch, lọc mẫu qua màng lọc milipore cellulose acetat 0,22 µm trước

khi tiến hành triển khai UPLC.

Mẫu chuẩn: Hỗn hợp chuẩn CY, AC, SCO với nồng độ mỗi chất là 25 ppm trong

methanol, riêng CR (25 ppm) được pha trong methanol 60%, siêu âm ở 80 o C.

Định lượng:

Mẫu thử và chuẩn (n = 3) sau khi lọc được tiêm vào hệ thống UPLC với điều kiện

sắc ký như sau

Máy sắc ký lỏng siêu hiệu năng Acquity UPLC (Waters)

Đầu dò PDA, bước sóng phát hiện là 323 nm (CY, AC) và 349 nm (SCO, CR)

.


35

Cột sắc ký: CORTECS C18 (100 × 4,6 mm; 2,7 μm)

Pha động: nước acid fomic 0,2% (D) – ACN (C). Chương trình rửa giải tiệm tiến

như sau: 10-14% C (2 phút); 14% C (4 phút); 14-17% C (0,5 phút); 17-19% C (2

phút); 19-20% C (5 phút); 20-21% C (1 phút); 21-22% C (6 phút); 20-10% C (0,5

phút);10% C (2,5 phút).

Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút.

Lượng mẫu tiêm: 3 μl

Nhiệt độ cột: 27 o C

Thời gian phân tích: 23 phút.

Hàm lượng của CY, AC, SCO và CR trong lá và các chế phẩm Actisô được tính

theo công thức:

X

St

Sc

Cc

k

p 100

m (1 h)

Trong đó: X : Hàm lượng của chất định lượng có trong dược liệu (%)

Sc: Diện tích đỉnh thu được của mẫu chuẩn (μV × s)

St: Diện tích đỉnh thu được của mẫu thử (μV × s)

Cc: Nồng độ của mẫu chuẩn (mg/ml)

k: Độ pha loãng của mẫu đo (ml)

m: Khối lượng cao (mg)

h : độ ẩm của dược liệu

p : độ tinh khiết của chất chuẩn (%)

1.7.2. Đánh giá quy trình định lượng

1.7.2.1. Kiểm tinh khiết chất đối chiếu

Các chất đối chiếu được pha với methanol và tiến hành HPLC với điều kiện là: 5-

95% ACN (20 phút); 95% ACN (5 phút), 95-5% ACN (5 phút), 5% ACN (5 phút).

Sử dụng công cụ tính tích phân tự động để tính hàm lượng % của chất đối chiếu dựa

vào phần trăm diện tích đỉnh và các đỉnh này phải đạt độ tinh khiết pic.

1.7.2.2. Tính tương thích hệ thống

.


36

Mục đích: để đảm bảo hệ thống sắc ký có hiệu năng phù hợp có thể xác định độ

phân giải và độ lặp lại của hệ thống sắc ký đối với phép phân tích thực hiện.

Tính tương thích được thực hiện bằng cách chạy lặp lại 6 lần trên 1 mẫu chuẩn và 1

mẫu thử theo các điều kiện đã được xác định. Ghi nhận các thông số sau:

− Rt : thời gian lưu (phút)

− S: diện tích đỉnh

− N: số đĩa lý thuyết biểu kiến của cột sắc ký = hiệu năng cột

− k’: hệ số dung lượng (capacity factor)

− α : hệ số chọn lọc (seperation factor)

− As: hệ số đối xứng = hệ số kéo đuôi (Asymmetry factor)

− Rs: độ phân giải (resolution)

Tính tương thích hệ thống đạt yêu cầu khi:

− Rt, S: RSD% ≤ 2

− k’ ≥ 1,0

− 1,05 ≤ α ≤ 2,0

− 0,8 ≤ As≤ 1,5

− Rs >1,5

− N ≥ 2000

1.7.2.3. Khảo sát khoảng tuyến tính

Pha các dung dịch mẹ:

- Dung dịch chuẩn acid clorogenic 1 mg/ml: cân chính xác khoảng 5 mg acid

clorogenic vào bình định mức 5 ml, hòa tan và điền vừa đủ thể tích bằng

methanol .

- Dung dịch chuẩn cynarin 1 mg/ml: cân chính xác khoảng 5 mg cynarin vào bình

định mức 5 ml, thêm methanol đến vạch .

- Dung dịch chuẩn scolymosid 1 mg/ml: cân chính xác khoảng 5 mg scolymosid

vào bình định mức 5 ml, bổ sung thể tích vừa đủ bằng methanol .

.


37

- Dung dịch chuẩn cynarosid 1 mg/ml: cân chính xác khoảng 5 mg cynarosid vào

bình định mức 5 ml, thêm methanol 60%, siêu âm ở 80 o C đến khi tan hoàn toàn,

và điền đủ thể tích bằng methanol 60% .

Pha dung dịch hỗn hợp chất đối chiếu (dung dịch 1): Lấy 1 ml dung dịch mẹ đã pha

ở trên cho vào bình định mức 5 ml, điền vừa đủ thể tích bằng methanol thu được

dung dịch có nồng độ mỗi chất là 0,2 mg/ml (dung dịch 1). Từ dung dịch 1, pha các

giai mẫu có nồng độ (ppm) của acid clorogenic, cynarin, scolymosid, và cynarosid

tương ứng như sau:

Chất đối chiếu dd 2 dd 3 dd 4 dd 5 dd 6 dd 7 dd 8

Acid clorogenic 100 50 25 10 5 2,5 0,1

Cynarin 100 50 25 10 5 2,5 0,1

Scolymosid 100 50 25 10 5 2,5 0,1

Cynarosid 100 50 25 10 5 2,5 0,1

Ghi chú: dd là dung dịch, đơn vị là ppm

Tiến hành triển khai trên UPLC 3 lần cho mỗi dung dịch chuẩn đối chiếu với điều

kiện sắc ký đã khảo sát. Xác định sự tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh của

các dung dịch. Dùng phần mềm Excel để biện luận và đưa ra phương trình hồi qui

tuyến tính.

1.7.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Tiến hành đo tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn có nồng độ xác định. Giả sử tín hiệu

tạp nhiễu đường nền thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu của pic chuẩn trong mẫu

chuẩn A có nồng độ nhất định thu được là S. Thiết lập tỷ lệ S/N. LOD có S/N = 2/1

hay 3/1 và LOQ có S/N = 9/1 hay 10/1 là chấp nhận được. Từ tín hiệu S tính nồng

độ đem đo và suy ra LOD, LOQ.

1.7.2.5. Khảo sát tính chọn lọc

Qui trình được tiến hành xác định tính đặc hiệu như sau:

− Dung dịch mẫu trắng: dung dịch methanol 60 % .

− Dung dịch hỗn hợp chất đối chiếu: cynarin, acid clorogenic, scolymosid,

cynarosid.

.


38

− Dung dịch mẫu thử: tiến hành như qui trình chiết xuất đã khảo sát .

− Dung dịch thử thêm chuẩn: thêm 100 µl hỗn hợp chuẩn vào 100 µl dung dịch thử.

Triển khai trên HPLC 4 dung dịch trên với điều kiện đã khảo sát, quan sát và so sánh

thời gian lưu, phổ UV và pic của các chất định lượng trong các mẫu trên. Yêu cầu:

− Thời gian lưu của thành phần cần định lượng trong mẫu thử phải tương

đương thời gian lưu của mẫu đối chiếu, đồng thời mẫu trắng không có đỉnh

trùng với đỉnh của thành phần cần định lượng.

− Phổ UV của cynarin, acid clorogenic, scolymosid và cynarosid trong mẫu

chuẩn, mẫu thử và thử thêm chuẩn phải tương đương nhau.

− Khi thêm 1 lượng chất đối chiếu vào mẫu thử, diện tích đỉnh của hợp chất

cần định lượng phải tăng lên so với trước khi thêm chất đối chiếu và pic của

chất cần định lượng phải đạt độ tinh khiết pic.

1.7.2.6. Khảo sát độ lặp lại

Độ lặp lại để đánh giá mức độ phù hợp giữa các kết quả kiểm nghiệm khi phương

pháp được áp dụng lặp lại nhiều lần trên cùng 1 mẫu. Độ lặp lại của phương pháp

phân tích thường được thể hiện bằng độ lệch chuẩn (standard deviation-SD) hay độ

lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation-RSD) của 1 loạt các lần đo mẫu.

Để xác định độ lặp lại, người ta thường tiến hành định lượng 6 lần trong cùng 1 điều

kiện và tính độ lệch chuẩn tương đối RSD%. Giá trị RSD thay đổi tuỳ theo hàm

lượng % chất phân tích có trong mẫu thử [19] (xem Bảng 2.9).

Bảng 2.6. Đánh giá độ chính xác theo nồng độ chất phân tích

Hàm lượng

Tỷ số Đơn vị

chất phân tích (%) nồng độ tương ứng

RSD%

100 1 100% 1,3

10 10 -1 10% 2,8

1 10 -2 1% 2,7

0,1 10 -3 0,1% 3,7

0,01 10 -4 100 ppm 5,3

.


39

Hàm lượng

chất phân tích (%)

Tỷ số

nồng độ

Đơn vị

tương ứng

RSD%

0,001 10 -5 10 ppm 7,3

0,0001 10 -6 1 ppm 11

0,00001 10 -7 100 ppb 15

0,000001 10 -8 10 ppb 21

1.7.2.7. Khảo sát độ đúng hay độ phục hồi

Xác định hàm lượng cynarin, acid clorogenic, scolymosid và cynarosid trong mẫu

thử bằng phương pháp đã khảo sát và sau đó thêm chất đối chiếu vào dược liệu.

Lượng chuẩn thêm vào bằng 80%, 100% và 120% hàm lượng các chất này so với

nồng độ định lượng, thực hiện 3 lần cho mỗi nồng độ. Các mẫu được xử lý và phân tích

theo điều kiện sắc ký đã chọn. Từ đó xác định tỉ lệ phục hồi Y. Tỉ lệ phục hồi tính theo

công thức:

Y

X

X

r

a

100

Trong đó: Xr: lượng tìm thấy. Xa: lượng thêm vào.

Tỷ lệ phục hồi được đánh giá tuỳ theo hàm lượng của chất định lượng có trong mẫu

thử [19] (xem Bảng 2.10)

Bảng 2.7. Mối liên quan giữa tỷ lệ phục hồi và nồng độ chất phân tích

Nồng độ

chất phân tích (%)

Tỷ số

nồng độ

Đơn vị

tương ứng

Tỷ lệ

phục hồi (%)

100 1 100 % 98 – 102

10 10 -1 10 % 98 – 102

1 10 -2 1 % 97 – 103

0,1 10 -3 0,1 % 95 – 105

0,01 10 -4 100 ppm 90 – 107

0,001 10 -5 10 ppm 80 – 110

0,0001 10 -6 1 ppm 80 – 110

0,00001 10 -7 100 ppb 80 – 110

0,000001 10 -8 10 pb 60 – 115

.


40

1.7.2.8. Định lượng cynarin, acid clorogenic, scolymosid, và cynarosid

Lá, gân lá, hoa, rễ của cây Actisô được tiến hành định lượng theo quy trình đã xây

dựng. Hàm lượng của cynarin, acid clorogenic, scolymosid và cynarosid trong lá và

các chế phẩm Actisô được tính theo công thức:

X

St

Sc

Cc

k

p 100

m (1 h)









.


41

CHƯƠNG 2. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

2.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CY, AC,

SCO, CR TRONG LÁ ACTISÔ BẰNG UPLC-PDA

2.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký UPLC

Khảo sát bước sóng phát hiện

Tiến hành như mục 2.2.1.1. Kết quả trình bày ở Hình 3.12. – Hình 3.14.

323 nm

Hình 3.10. Sắc ký đồ của AC, CY, SCO, CYR chuẩn ở bước sóng 323 nm

349 nm

Hình 3.11. Sắc ký đồ của AC,CY,SCO,CYR chuẩn ở bước sóng 349 nm

.


42

Hình 3.12. Phổ hấp thu UV của acid clorogenic, cynarin, scolymosid và cynarosid

Nhận xét:

- Acid clorogenic có đỉnh hấp thu cực đại tại 217,5; 241,2; và 325,7 nm.

- Cynarin có đỉnh hấp thu cực đại tại 217,5; 242,4; và 322,1 nm.

- Scolymosid có đỉnh hấp thu cực đại tại 254,2 và 349,1 nm.

- Cynarosid có đỉnh hấp thu cực đại tại 254,2 và 349,1 nm.

Nhận thấy, ở bước sóng 347 – 349nm, scolymosid va cynarosid đạt độ hấp thu cao

nhất nhưng 2 pic acid clorogenic và cynarin khá thấp trong khi ở bước sóng 320 –

326 nm, cynarin và acid clorogenic đều có độ hấp thu cao nhất. Do vậy, để định

lượng chính xác hàm lượng các chất trong lá, chọn bước sóng 323 nm làm bước

sóng phát hiện đồng thời acid clorogenic, cynarin và bước sóng 349 nm làm bước

sóng phát hiện đồng thời scolymosid và cynarosid.

Khảo sát hệ dung môi pha động

Tiến hành như mục 2.2.1.1. Kết quả trình bày ở Hình 3.15.

Acid formic 0,1% Acid formic 0,2%

4

8

4

8

Hình 3.13. SKĐ khảo sát dung môi pha động

Nhận xét: acid fomic 0,1% không tách được pic CR với pic 8. Hơn nữa, khả năng

tách của pic AC với pic 4 kém hơn so với acid formic 0,2%. Do vậy, chọn pha động

.


43

có chứa acid formic 0,2%.

Khảo sát chương trình chạy


Điều kiện A

AC

A

CY

4

SCO

CR

8

\

Điều kiện B:

AC

B

4

CY

SCO CR

8

Điều kiện C:

AC

C

C

4

CY

SCO

CR

8

Điều kiện D:

AC

D

4

CY

SCO

CR

8

.


44

Điều kiện E:

E

AC

4

CY SCO CR

8

Hình 3.14. SKĐ khảo sát chương trình chạy

Pha động là nước acid formic 0,2% (D) - ACN (C). Các chương trình tiệm tiến khảo

sát bao gồm:

- Điều kiện A: 10-12% C (2 phút); 12-15% C (5 phút); 15-17% C (1 phút); 17% C (7 phút); 17-

25% C (1 phút); 25% C (4 phút); 25-10% C ( 0,5 phút); 10% C (4,5 phút)

- Điều kiện B: 10-14% C (2 phút); 14% C (4 phút); 14-17% C (1 phút); 17% C (8 phút); 17-25%

C (1 phút); 25-10% C ( 0,5 phút); 10% C (2,5 phút).

- Điều kiện C: 10-15% C (2 phút); 15% C (4 phút); 15-18% C (1 phút); 18% C (6 phút); 18-25%

C (1 phút); 25% C (3 phút); 25-10% C ( 0,5 phút); 10% C (4,5 phút)

- Điều kiện D: 10-12% C (2 phút); 12-14% C (4 phút); 14-15% C (0,5 phút); 15-19% C (1,5

phút phút); 19% C (11 phút); 19-22% C (1 phút); 22-10% C (0,5 phút); 10% C (3,5 phút).

- Điều kiện E: 10-14% C (2 phút); 14% C (4 phút); 14-17% C (0,5 phút); 17-19% C (1,5 phút); 19-

20% C (5 phút); 20-21% C (1 phút); 21-22% C (6 phút); 22-10% C (0,5 phút); 10% C (2,5 phút).

Nhận xét:

- Điều kiện A: pic AC tách rõ với pic 4. Tuy nhiên, các pic có thời gian lưu tương

đối dài và pic CR chưa tách được với pic 8.

- Điều kiện B, C, D: pic AC và pic 4 tách rõ, thời gian lưu của các pic phía sau đã

được cải thiện. Tuy nhiên pic CR và pic 8 vẫn chưa tách được.

- Điều kiện E:tất cả các pic định lượng đều tách khá tốt với pic kế cận (Rs > 1,5),

các thông số sắc ký gồm hệ số kéo đuôi, độ tinh khiết pic đều đạt yêu cầu. .

Kết luận: chọn điều kiện E, chương trình tiệm tiến được mô tả ở Bảng 3.11.

.


45

Bảng 3.8. Chương trình chạy tiệm tiến được lựa chọn

Phút

Tốc độ

dòng

(ml/phút)

Kênh C (%)

Acetonitril acid

formic 0,1%

Kênh D (%)

Nước acid

formic 0,2%

0 0,4 10 90

2 0,4 14 86

6 0,4 14 86

6,5 0,4 17 83

8 0,4 19 81

13 0,4 20 80

14 0,4 21 79

20 0,4 22 78

20,5 0,4 10 90

23 0,4 10 90

Khảo sát tốc độ dòng


AC

0,3 ml/phút AC

0,35 ml/phút

CY

SCO

CR

CY

SCO

CR

AC

0,4 ml/phút

AC

0,45 ml/phút

CY

SCO CR

CY

CR

SCO

Hình 3.15. SKĐ khảo sát tốc độ dòng

Nhận xét: tốc độ dòng càng thấp (0,3 ml/phút) thì thời gian lưu càng tăng. Ở tốc độ

dòng càng cao (0,45 hay 0,5 ml/phút) pic CR càng khó tách với pic 8. Tốc độ dòng

.


46

0,35 và 0,4ml/phút tách khá tốt pic tuy nhiên 0,4 ml/phút cho thời gian lưu ngắn

hơn, tiêt kiệm thời gian. Vì thế chọn tốc độ dòng 0,4 ml/phút.

Khảo sát nhiệt độ cột


AC

27 o C

AC

30 o C

CY

SCO CR

CY SCO CR 40 o C

AC

35 o C

AC

CY

SCO CR

CY

SCO CR

Hình 3.16. SKĐ khảo sát nhiệt độ cột

Nhận xét: mặc dù ở 30 o C, 35 o C, 40 o C thì thời gian lưu được rút ngắn lại nhưng

không đáng kể. ở nhiệt độ cao làm khó việc tách pic CYR với pic 8 hơn.

Kết luận: lựa chọn nhiệt độ cột 27 o C.

Kết quả khảo sát điều kiện sắc ký:


Đầu dò PDA

Bước sóng phát hiện: 323 nm và 349 nm





phút);10% C (2,5 phút).

.


47





So sánh HPLC và UPLC ứng dụng trong định tính, định lượng AC, CY, SCO,

CR trong lá Actisô:

Điều kiện phân tích và SKĐ định lượng AC, CY, SCO và CR bằng phương pháp

HPLC của nhóm nghiên cứu đã thực hiện năm 2011 [5]:

Máy HPLC Waters 2695 (Alliance), Đầu dò PDA 2996

Bước sóng phát hiện: 323 nm (AC và CY), 349 nm (SCO và CR).

Cột sắc ký Sunfire C 18 (250 × 4,6 mm; 5 µm)

Pha động: nước acid formic 0,1% (A) – ACN (B). Chương trình rửa giải: 8-15% B (20 phút);

15% B (1 phút); 15-30% B (9 phút); 30% B (5 phút); 30-8% B (1 phút); 8% (9 phút).

Tốc độ dòng: 1 ml/phút.



Thời gian phân tích: 45 phút

HPLC

AC

CY

SCO

CR

Hình 3.17. SKĐ định lượng AC, CY,SCO, CR bằng phương pháp HPLC

UPLC

AC

CY SCO CR

Hình 3.18. SKĐ định lượng AC, CY,SCO, CR bằng phương pháp UPLC

.


48

Nhận xét: Phương pháp định lượng bằng UPLC có thời gian phân tích nhanh hơn

(23 phút so với HPLC là 45 phút). Ngoài ra, tốc độ dòng UPLC (0,4 ml/phút) thấp

hơn HPLC (1 ml/phút) do đó tiết kiệm được dung môi hơn. Bên cạnh đó, phương

pháp UPLC có độ nhạy và độ phân giải tốt hơn nên tách các chất tốt hơn. Cụ thể, ở

điều kiện HPLC pic cynarosid không tách được với pic 8 (xem Hình 3.19-20) là

một dẫn xuất của luteolin vì cho phổ UV tương tự luteolin. Trong khi đó, điều kiện

UPLC đã tách được 2 pic này do đó kết quả định lượng sẽ chính xác hơn.

Bảng 3.9. Bảng so sánh 2 điều kiện HPLC và UPLC

HPLC

UPLC

Khả năng tách pic pic CR chưa tách ra được pic 8 pic CR đã tách hoàn toàn với pic 8

Thời gian phân tích 45 phút 23 phút

Tốc độ dòng 1 ml/phút 0,4 ml/phút

Lượng tiêm mẫu 30 μl 3 μl

2.1.2. Khảo sát điều kiện chiết xuất lá Actisô

2.1.2.1. Khảo sát dung môi chiết

Tiến hành như mục 2.2.1.1. Kết quả được trình bày ở Hình 3.21-3.22. và Bảng 3.13.

Hình 3.19. Biểu đồ độ tan của AC, CY, SCO và CR

.


49

Bảng 3.10. Bảng độ tan của AC, CY, SCO, CR

Dung môi AC CY SCO CR

MeOH 40% 965262 28791 166483 261317

MeOH 70% 1115768 11697 202251 345587

MeOH 100% 675368 9768 176082 292887

EtOH 40% 985080 13941 176309 286870

EtOH 70% 974344 15833 183871 298059

EtOH 96% 828104 16497 189404 285026

EA 92937 0 22559 14130

Nước 727934 140069 146280 209853

AC

SCO

CR

CY

Hình 3.20. SKĐ của 2 dung môi chiết EtOH 70% và Nước

*đường màu đỏ: dung môi chiết là nước

*đường màu xanh lá: dung môi chiết là EtOH 70%

Nhận xét: methanol 70% chiết được nhiều nhất 3 chất là AC, SCO và CR nhưng lại

chiết được rất ít CY, tín hiệu pic CY gần như không thấy trên sắc ký đồ (Hình 3.22)

nên rất khó định lượng. Trong khi đó nước là dung môi chiết tốt nhất đối với CY

nên cho tín hiệu pic khá rõ. Mặc dù nước không phải là dung môi chiết tốt nhất cho

3 chất còn lại nhưng 3 chất này tan cũng tương đối tốt trong nước và cho tín hiệu

pic rõ trên sắc ký đồ. Do đó chọn dung môi chiết xuất là nước.

2.1.2.2. Khảo sát nhiệt độ chiết

Tiến hành như mục 2.2.1.1. Kết quả được trình bày ở Hình 3.23-3.24 và Bảng 3.14.

Kết quả cho thấy ở 3 nhiệt độ khảo sát (60 o C, 80 o C và 100 o C) cho thấy hàm lượng

SCO và CR chiết được gần như nhau. Ở 60 o C, hàm lượng AC chiết được nhiều

.


50

nhất nhưng lại chiết được CY ít nhất vì thế tín hiệu pic không rõ trên sắc ký đồ nên

rất khó định lượng. Trong khi đó, ở 100 o C cho tín hiệu pic của CY khá cao và pic

của AC cũng tương đối rõ (Hình 3.24). Do đó chọn nhiệt độ chiết ở 100 o C.

Bảng 3.11. Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết của AC, CY, SCO, CR

Nhiệt độ AC CY SCO CR

60 độ 934623 27588 148737 178087

80 độ 714838 59083 147630 179904

100 độ 727934 140069 146280 209854

Hình 3.21. Biểu đồ nhiệt độ chiết AC, CY,SCO và CR

AC

CY

SCO

CR

Hình 3.22. SKĐ của 2 nhiệt độ chiết 60 o C và 100 o C

*đường xanh: chiết 100 o C – đường đỏ: chiết 60 o C

2.1.2.3. Khảo sát thời gian chiết

Tiến hành như mục 2.2.1.1. Kết quả được trình bày ở Hình 3.25. và Bảng 3.15.

.


51

Bảng 3.12. Bảng khảo sát thời gian chiết của AC, CY, SCO, CR

Thời gian

(phút)

AC CY SCO CR

30 788687 114098 145589 198504

45 727934 140069 146280 209854

60 735565 213016 149949 210846

90 643841 289338 148779 219783

120 612213 364595 149437 223340

150 552364 392267 145022 218444

Hình 3.23. Biểu đồ thời gian chiết AC, CY, SCO và CR

Nhận xét:

SCO và CR: hàm lượng chiết gần như không thay đổi theo thời gian từ 30-150p

AC và CY: có sự thay đổi hàm lượng chiết ngược nhau theo thời gian (xem Hình

3.25). Thời gian chiết càng lâu thì hàm lượng CY càng tăng nhưng AC càng giảm.

Ở thời gian 45 và 60 phút hàm lượng AC bắt đầu giảm và hàm lượng cynarin tăng

nhưng chưa nhiều, diện tích đỉnh còn rất thấp do đó quy trình định lượng sẽ có độ

đúng và độ chính xác không cao. Ở thời gian chiết 90 phút cho diện tích đỉnh của

CY cao gấp 3 lần so với 30 phút, do đó chọn 90 phút là thời gian chiết xuất định

lượng. Các thời gian sau 90 phút mặc dù hàm lượng CY cao nhưng không chọn do

tốn nhiều thời gian.

.


52

2.1.2.4. Khảo sát số lần chiết

Tiến hành như mục 2.2.1.1. Kết quả cho thấy, sau 2 lần chiết cho hàm lượng acid

clorogenic, cynarin, scolymosid chiết được trên 97% và cynarosid trên 94%. Do đó

chọn số lần chiết là 2 lần (xem Hình 3.26 và Bảng 3.16)

Bảng 3.13. Bảng khảo sát số lần chiết của AC, CY, SCO và CR

Lần chiết AC CY SCO CR

lần 1 630013 328379 149905 242909

lần 2 27010 31032 17383 39616

lần 3 6754 2448 4680 14959

lần 4 3983 597 873 2451

% lần 1 94,35 90,60 86,73 80,99

% lần 2 4,04 8,56 10,06 13,21

% lần 3 1,01 0,67 2,71 5,00

% lần 4 0,60 0,16 0,51 0,82

Tổng (%) lần chiết 1 và 2 98,35 99,16 96,79 94,2

Hình 3.24. Biêu đồ các lần chiết AC, CY, SCO và CR

Quy trình chiết xuất đã khảo sát: Cân chính xác khoảng 100 mg bột lá khô

Actisô cho vào vial 20 ml. Thêm khoảng 10 ml nước sôi. Chiết trong cách thủy

ở 100 o C trong 90 phút. Lọc dịch chiết qua bông vào bình định mức 25 ml. Bã

dược liệu được chiết tiếp lần 1 lần nữa với 5 ml nước sôi với cùng điều kiện như

trên, lọc dịch chiết cho vào bình định mức, bổ sung nước đến vạch, lọc mẫu qua

màng lọc milipore cellulose acetat 0,22 µm trước khi tiến hành triển khai UPLC.

.


53

2.1.3. Quy trình định lượng CY, AC, CR và SCO

Chiết xuất:

Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 100 mg bột lá khô Actisô cho vào vial 20 ml. Thêm

khoảng 10 ml nước sôi. Chiết trong cách thủy ở 100 o C trong 90 phút. Lọc dịch

chiết qua bông vào bình định mức 25 ml. Bã dược liệu được chiết tiếp lần 1 lần nữa

với 5 ml nước sôi với cùng điều kiện như trên, lọc dịch chiết cho vào bình định mức,

bổ sung nước đến vạch, lọc mẫu qua màng lọc milipore cellulose acetat 0,22 µm trước

khi tiến hành triển khai UPLC.

Mẫu chuẩn: Hỗn hợp chuẩn CY, AC, SCO với nồng độ mỗi chất là 25 ppm trong

methanol, riêng CR (25 ppm) được pha trong methanol 60%, siêu âm ở 80 o C.

Định lượng:

Mẫu thử và chuẩn (n = 3) sau khi lọc được tiêm vào hệ thống UPLC với điều kiện

sắc ký như sau


Đầu dò PDA, bước sóng phát hiện là 323 nm (CY, AC) và 349 nm (SCO, CR)





phút);10% C (2,5 phút).





Hàm lượng của CY, AC, SCO và CR trong lá và các chế phẩm Actisô được tính

theo công thức:

X

St

Sc

Cc

k

p 100

m (1 h)

.


54









2.2. ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG

2.2.1. Khảo sát độ tinh khiết của các chất đối chiếu

Các chất đối chiếu cynarin (CY), acid clorogenic (AC), scolymosid (SCO),

cynarosid (CR) đã được thử tinh khiết trên UPLC với hàm lượng lần lượt là:

98,24%; 99,55%; 98,89%, 91,53%.

Khảo sát độ tinh khiết của cynarin

Hình 2.19. Sắc ký đồ HPLC kiểm tra độ tinh khiết của chất phân lập được

.


55

Bảng 2.10. Kết quả đánh giá độ tinh khiết của hợp chất đã phân lập

STT Tên pic t R Diện tích đỉnh % Diện tích đỉnh

1 Cynarin 9,082 6537273 98,24

2 9,479 67520 1,01

3 30,436 49866 0,75

Nhận xét: hàm lượng tạp có trong cynarin điều chế tính theo % diện tích pic là 1,76 %.

Khảo sát độ tinh khiết của acid chlorogenic

Hình 2.25. Sắc ký đồ HPLC kiểm tra độ tinh khiết của acid clorogenic phân lập

Bảng 2.14. Kết quả đánh giá độ tinh khiết của hợp chất đã phân lập

STT Tên pic tR Diện tích đỉnh % diện tích đỉnh

1

Acid clorogenic

11,788

14660699

99,55

2

Tạp

12,356

66773

0,45

Kết luận: độ tinh khiết của acid chlorogenic trên HPLC là 99,55%.

Khảo sát độ tinh khiết của cynarosid

.


56

Hình 2.26. Sắc ký đồ HPLC kiểm tra độ tinh khiết của cynarosid phân lập

Bảng 2.15. Kết quả đánh giá độ tinh khiết của cynarosid phân lập

STT Tên pic tR Diện tích đỉnh % diện tích đỉnh

1

Cynarosid

15,853

12959063

98,89

2

Tạp

15,237

145135

1,11

Kết luận: độ tinh khiết của cynarosid phân lập là 98,89 %.

Khảo sát độ tinh khiết của scolymosid

.


57

Hình 3.27. SKĐ kiểm tra độ tinh khiết của scolymosid

Bảng 3.16. Độ tinh khiết của các chất chuẩn

acid clorogenic cynarin scolymosid cynarosid

Độ tinh khiết 99,55% 98,24% 98,89% 91,53%

2.2.2. Tính tương thích của hệ thống

Tiến hành: mẫu chuẩn và mẫu thử được chuẩn bị như ở Mục 2.2.2.1. Triển khai trên

UPLC như điều kiện đã khảo sát, bơm 6 lần liên tiếp trên cùng một mẫu chuẩn và

mẫu thử. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.17 – 3.18, Hình 3.27 – 3.28, phụ lục 1

và phụ lục 2.

Hình 3.28. Sắc ký đồ khảo sát tính tương

thích hệ thống của mẫu thử

Hình 3.29. Sắc ký đồ khảo sát tính tương

thích hệ thống của mẫu chuẩn

Bảng 3.17. Kết quả giá trị trung bình của thông số các pic trong mẫu thử

Rt S k’ Rs As α N

A.clorogenic 5,6 774333 2,7 11,8 1,4 1,4 41284

Cynarin 8,5 180756 4,7 18,0 1,1 1,6 33730

Scolymosid 11,8 155092 6,9 22,4 1,1 1,5 176959

Cynarosid 12,7 210675 7,5 6,9 1,1 1,1 118398

Yêu cầu RSD ≤ 2 RSD ≤ 2 k’ ≥ 1 Rs > 1,5

0,8 ≤ As

≤1,5

1,05 ≤ α ≤

2,0

N ≥

2000

.


58

Bảng 3.18. Kết quả giá trị trung bình của thông số các pic trong mẫu chuẩn

Rt S k’ Rs As α N

A.clorogenic 5,7 668078 2,8 1,5 33098

Cynarin 9,0 935151 5,0 20,4 1,1 1,8 29809

Scolymosid 12,0 366852 7,0 18,9 1,2 1,4 185083

Cynarosid 13,0 470240 7,7 7,4 1,1 1,1 128090

Yêu cầu RSD ≤ 2 RSD ≤ 2 k’ ≥ 1 Rs > 1,5

0,8 ≤ As

≤1,5

1,05 ≤ α ≤

2,0

N ≥

2000

Nhận xét: RSD của các thông số diện tích đỉnh (S), thời gian lưu (tR) đều < 2%, các

thông số khác đều đạt yêu cầu định lượng.

Khảo sát độ ổn định của chương trình rửa giải:

Mẫu thử và mẫu chuẩn được tiêm lặp lại 6 lần và triển khai rửa giải với điều kiện

sắc ký đã khảo sát. Kết quả được trình bày ở bảng sau:

STT

Bảng 19. Khảo sát độ ổn định của chương trình rửa giải trên mẫu thử

Thời gian lưu (tR)

Diện tích đỉnh (S)

AC CY SCO CR AC CY SCO CR

1. 5,59 8,60 11,84 12,74 773.404 178.963 154.003 209.965

2. 5,56 8,53 11,83 12,73 777.087 181.076 154.367 211.568

3. 5,56 8,51 11,82 12,71 774.404 181.141 157.446 211.277

4. 5,56 8,52 11,81 12,70 771.054 180.546 156.783 210.664

5. 5,55 8,48 11,81 12,70 776.915 181.662 154.075 210.258

6. 5,55 8,48 11,79 12,67 773.137 181.148 153.880 210.320

TB 5,56 8,52 11,82 12,71 774.334 180756 155.092 210.675

Std.Dev. 0,013 0,045 0,018 0,025 2337,8 947,2 1588,6 626,6

RSD 0,2 0,5 0,2 0,2 0,3 0,5 1,0 0,3

Bảng 20. Khảo sát độ ổn định của chương trình rửa giải trên mẫu chuẩn

STT

Thời gian lưu (tR)

Diện tích đỉnh (S) (C = 0,25 mg/ml)

AC CY SCO CR AC CY SCO CR

1. 5,70 9,07 12,05 13,00 665.864 936.096 366.819 470.688

2. 5,71 9,09 12,05 13,00 661.851 931.423 365.316 467.496

3. 5,68 9,02 12,04 12,99 668.965 932.135 365.235 468.196

4. 5,69 9,03 12,05 13,00 669.823 931.605 365.896 469.206

5. 5,69 9,02 12,03 12,97 671.848 935.974 367.675 470.745

6. 5,66 8,95 12,00 12,94 670.118 943.672 370.174 475.106

.


59

TB 5,69 9,03 12,04 12,98 668.078 935.151 366.852 470.240

Std.Dev. 0,015 0,049 0,021 0,027 3630,1 4684,8 1876,3 2716,7

RSD 0,3 0,5 0,2 0,2 0,5 0,5 0,5 0,6

Kết luận: thời gian lưu và diện tích đỉnh của CY, AC, SCO, CR trong mẫu thử và

mẫu chuẩn của 6 lần tiêm có độ lặp lại cao với RSD trong khoảng từ 0,2-1.

2.2.3. Tính tuyến tính

Tiến hành như Mục 3.2.2. Kết quả được trình bày ở Hình 3.29 – 3.32

Đường tuyến tính của acid clorogenic:

Nồng độ

(ug/ml)

S đỉnh

1 22792

2,5 63362

5 129474

10 265368

25 634589

50 1213620

100 2382295

200 4565796

Hình 3.30. Đường tuyến tính của acid clorogenic

Dùng phần mềm Excel để tính toán:

Phương trình tương quan hồi quy: y = 228634x + 35104 R 2 = 0,9994

Trắc nghiệm F: tính tương thích của phương trình hồi quy:

F 0,05= 5,98737761

F = 10668 > F 0.05: phương trình tương thích với độ tin cậy 95%.

Trắc nghiệm t: ý nghĩa của các hệ số: t 0,05 = 2,4469119

Hệ số b có t = 1,943698 < t 0,05: hệ số b không có ý nghĩa.

Hệ số a có t = 103,286 > t 0,05: hệ số a có ý nghĩa.

Vậy phương trình tuyến tính của acid clorogenic là: ŷ = 22863x

Đường tuyến tính của cynarin:

Nồng độ

(ug/ml)

S đỉnh

1 25491

2,5 88831

5 181755

.


60

10 372343 Hình 3.31. Đường tuyến tính của cynarin

25 887701

50 1671152

100 3265820

200 6226377



Trắc nghiệm F: tính tương thích của phương trình hồi quy

F 0,05= 5,98737761

F = 7787,408 > F 0.05: phương trình tương thích với độ tin cậy 95%.

Trắc nghiệm t: ý nghĩa của các hệ số

t 0,05 = 2,44691185



Vậy phương trình tuyến tính của cynarin là: ŷ = 31174x

Đường tuyến tính của scolymosid:

Nồng độ

(ug/ml)

S đỉnh

1 21166

2,5 53891

5 107695

10 216935

25 509788

50 955247

100 1867258

200 3548279

Hình 3.32. Đường tuyến tính của scolymosid




F 0,05= 5,98737761

F = 7487,52 > F 0.05: phương trình tương thích với độ tin cậy 95%.


.


61

t 0,05 = 2,44691185



Vậy phương trình tuyến tính của scolymosid là: ŷ = 17747x

Đường tuyến tính của cynarosid:

Nồng độ

(ug/ml)

S đỉnh

1 27192

2,5 68510

5 136913

10 277426

25 653179

50 1221937

100 2388065

200 4540301

Hình 3.33. Đường tuyến tính của cynarosid




F 0,05= 5,98737761

F = 7527,809 > F 0,05: phương trình tương thích với độ tin cậy 95%.


t 0,05 = 2,44691185



Vậy phương trình tuyến tính của acid clorogenic là: ŷ = 22708x

2.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Tiến hành như Mục 3.2.3. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.19 và Hình 3.33– 3.36.

.


62

Hình 3.34. sắc ký đồ của acid clorogenic ở

nồng độ LOD

Hình 3.35. Sắc ký đồ của cynarin ở nồng

độ LOD

Hình 3.36. Sắc ký đồ của cynarosid ở nồng

độ LOD

Hình 3.37. Sắc ký đồ của acid scolymosid

ở nồng độ LOD

Bảng 3.21. Kết quả khảo sát LOD và LOQ của AC, CY, SCO, CR

Acid clorgenic Cynarin Scolymosid cynarosid

LOD (ppm) 0,03 0,03 0,06 0,06

LOQ (ppm) 0,13 0,13 0,25 0,25

2.2.5. Khảo sát tính chọn lọc

Thực hiện theo Mục 3.2.5. Kết quả được trình bày ở Hình 3.37 – 3.41

Mẫu thử

Mẫu chuẩn

Mẫu thử thêm chuẩn

Mẫu trắng

Hình 3.38. Sắc ký đồ khảo sát tính chọn lọc

.


63

A B C

Hình 3.39 Phổ UV khảo sát tính chọn lọc của acid clorogenic

A

B

Hình 3.40 Phổ UV khảo sát tính chọn lọc của cynarin

C

A B C

Hình 3.41 Phổ UV khảo sát tính chọn lọc của scolymosid

A B C

Hình 3.42 Phổ UV khảo sát tính chọn lọc của cynarosid

(A) Mẫu thử (B) Mẫu chuẩn

(C) Mẫu thử thêm chuẩn

Nhận xét: Qui trình đạt độ chọn lọc do thời gian lưu, phổ UV của pic cynarin, acid

clorogenic, scolymosid, cynarosid trong các dung dịch chuẩn, thử và thử thêm

chuẩn tương đương nhau. Mẫu trắng không có tín hiệu của 4 pic này. Pic của

cynarin, acid clorogenic, scolymosid, cynarosid không có thành phần nào khác khi

sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết pic.

2.2.6. Khảo sát độ lặp lại

.


64

Tiến hành với 6 mẫu thử như Mục 2.2.2.4. Mỗi mẫu tiến hành sắc ký 1 lần ở điều

kiện đã chọn. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.21 – 3.24 và Hình 3.42 – 3.43.

323 nm 349 nm

Hình 3.43. Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại của acid

clorogenic và cynarin

Hình 3.44. Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại của

scolymosid và cynarosid

Bảng 3.22. Độ lặp lại acid clorogenic

STT mẫu

(Mn)

Khối lượng

mẫu cân (g)

Diện tích

đỉnh

Hàm

lượng %

M1 100,12 703558 0,706

M2 100,17 694259 0,696

M3 100,2 691291 0,693

M4 100,07 677854 0,681

M5 100,16 680256 0,682

M6 100,00 685600 0,689

TB 100,12 688803 0,691

SD % 9559 0,009

RSD % 1,39 1,367

Xử lý kết quả

n = 6

TB = 0,701%

SD = 0,010%

RSD = 1,37%

P = 0,95; t = 2,57

e = ± 0,024

Khoảng tin cậy:

X% = 0,691 ± 0,024

Bảng 3.23. Độ lặp lại của cynarin

STT mẫu

(Mn)

Khối lượng

mẫu cân (g)

Diện tích

đỉnh

Hàm

lượng %


M1 100,12 334391 0,233 n = 6

M2 100,17 340872 0,238 TB = 0,232%

M3 100,20 324297 0,226 SD = 0,005

M4 100,07 334367 0,233 RSD = 2,16 %

M5 100,16 323670 0,226 P = 0,95; t = 2,57

M6 100,00 337718 0,236

e = ± 0,013

TB 100,12 332552 0,232

Khoảng tin cậy:

SD % 7066 0,005

X% = 0,232 ± 0,013

.


65

STT mẫu

(Mn)

Khối lượng

mẫu cân (g)

Diện tích

đỉnh

Hàm

lượng %

RSD % 2,12 2,16


Bảng 3.24. Độ lặp lại của scolymosid

STT mẫu

(Mn)

Khối lượng

mẫu cân (g)

Diện tích

đỉnh

Hàm

lượng %

M1 100,12 275480 0,350

M2 100,17 266091 0,338

M3 100,20 260600 0,331

M4 100,07 257117 0,327

M5 100,16 259447 0,330

M6 100,00 260853 0,332

TB 100,12 263265 0,335

SD % 6671 0,008

RSD % 2,53 2,52


n = 6

TB = 0,335 %

SD = 0,008 %

RSD = 2,52 %

P = 0,95; t = 2,57

e = ± 0,022

Khoảng tin cậy:

X% = 0,335 ± 0,022

Bảng 3.25. Độ lặp lại của cynarosid

STT mẫu

(Mn)

Khối lượng

mẫu cân (g)

Diện tích

đỉnh

Hàm

lượng %

M1 100,12 424248 0,416

M2 100,17 423768 0,415

M3 100,20 417865 0,409

M4 100,07 412864 0,405

M5 100,16 417800 0,409

M6 100,00 405460 0,398

TB 100,12 417001 0,409

SD % 7071 0,007

RSD % 1,70 1,64


n = 6

TB = 0,409 %

SD = 0,007 %

RSD = 1,64 %

P = 0,95; t = 2,57

e = ± 0,017

Khoảng tin cậy:

X% = 0,409 ± 0,017

Tóm tắt kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình định lượng như sau:

Bảng 3.26. Tóm tắt độ lặp lại và hàm lượng của các chất định lượng

.


66

Acid clorogenic Cynarin Scolymosid Cynarosid

RSD % 1,37 2,16 2,52 1,64

Yêu cầu ≤ 3,7 % ≤ 3,7 % ≤ 3,7 % ≤ 3,7 %

Đánh giá Đạt Đạt Đạt Đạt

Hàm lượng % 0,691 ± 0,024 0,232 ± 0,013 0,335 ± 0,022 0,409 ± 0,017

Nhận xét: Đánh giá độ lặp lại của quy trình định lượng các chất có nồng độ từ 0,1%

- 1% có giá trị RSD% từ 3,7% - 2,7% là phù hợp. [2]

2.2.7. Khảo sát độ đúng

Tiến hành như Mục 3.2.6. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.26 – 3.29

Bảng 3.27. Kết quả độ đúng của acid clorogenic

% Chuẩn

thêm vào

KL cân

(mg)

KL (mg)

sẵn có

KL (mg)

thêm vào

KL (mg)

tìm thấy

(LT)

KL (mg)

tìm thấy

(TT)

Tỉ lệ (%)

phục hồi

80

100

120

100,23 0,691 0,553 1,244 1,172 94,23

100,21 0,691 0,553 1,244 1,182 95,00

100,13 0,691 0,552 1,243 1,176 94,65

100,3 0,692 0,692 1,383 1,315 95,07

100,31 0,692 0,693 1,385 1,329 95,99

100,5 0,693 0,690 1,384 1,361 98,38

100,12 0,690 0,829 1,519 1,437 94,59

100,2 0,691 0,829 1,520 1,443 94,94

100,5 0,693 0,832 1,525 1,482 97,19

Bảng 3.28. Kết quả độ đúng của cynarin

Chuẩn

thêm vào

(%)

80

100

120

KL

cân

(mg)

KL (mg)

sẵn có

KL (mg)

thêm vào

KL (mg)

tìm thấy

(LT)

KL (mg)

tìm thấy

(TT)

Tỉ lệ (%)

phục hồi

100,23 0,335 0,268 0,602 0,598 99,29

100,21 0,335 0,268 0,602 0,603 100,05

100,13 0,335 0,268 0,603 0,600 99,54

100,3 0,334 0,334 0,669 0,656 98,16

100,31 0,334 0,334 0,668 0,659 98,71

100,5 0,334 0,335 0,669 0,660 98,75

100,12 0,335 0,402 0,737 0,701 95,05

100,2 0,335 0,402 0,736 0,706 95,93

100,5 0,334 0,400 0,734 0,707 96,30

.


67

Bảng 3.29. Kết quả độ đúng của scolymosid

Chuẩn

thêm vào

(%)

80

100

120

KL cân

(mg)

KL (mg)

sẵn có

KL (mg)

thêm vào

KL (mg)

tìm thấy

(LT)

KL (mg)

tìm thấy

(TT)

Tỉ lệ (%)

phục hồi

100,23 0,335 0,268 0,602 0,598 99,29

100,21 0,335 0,268 0,602 0,603 100,05

100,13 0,335 0,268 0,603 0,600 99,54

100,3 0,334 0,334 0,669 0,656 98,16

100,31 0,334 0,334 0,668 0,659 98,71

100,5 0,334 0,335 0,669 0,660 98,75

100,12 0,335 0,402 0,737 0,701 95,05

100,2 0,335 0,402 0,736 0,706 95,93

100,5 0,334 0,400 0,734 0,707 96,30

Bảng 3.30. Kết quả độ đúng của cynarosid

Chuẩn thêm

vào (%)

80

KL cân

(mg)

KL (mg)

sẵn có

KL (mg)

thêm vào

KL (mg)

tìm thấy

(LT)

KL (mg)

tìm thấy

(TT)

Tỉ lệ (%)

phục hồi

100,23 0,409 0,328 0,737 0,779 105,69

100,21 0,409 0,327 0,737 0,785 106,53

100

120

100,13 0,409 0,327 0,736 0,783 106,31

100,3 0,410 0,410 0,820 0,829 101,12

100,31 0,410 0,411 0,820 0,832 101,40

100,5 0,411 0,409 0,820 0,834 101,79

100,12 0,409 0,491 0,900 0,897 99,66

100,2 0,409 0,491 0,901 0,900 99,93

100,5 0,411 0,493 0,903 0,902 99,91

Chú thích: KL: khối lượng, LT: lý thuyết, TT: thực tế.

Kết quả tỷ lệ phục hồi của quy trình định lượng đồng thời acid clorogenic, cynarin,

scolymosid và cynarosid được tóm tắt như sau:

Bảng 31. Tóm tắt tỷ lệ phục hồi của quy trình định lượng

Acid clorogenic Cynarin Scolymosid Cynarosid

Tỷ lệ phục hồi (%) 95,56 98,23 97,98 102,48

Yêu cầu (%) 95 – 105 95 – 105 95 – 105 95 – 105

Đánh giá Đạt Đạt Đạt Đạt

Phương pháp định lượng đạt các yêu cầu sau đây:

- Đạt tính tương thích hệ thống.

- Khoảng tuyến tính của acid clorogenic, cynarin, scolymosid, cynarosid thuộc

.


68

khoảng từ 1 – 200 g/ml.

- Giới hạn phát hiện (LOD) của acid clorogenic là 0,03125 g/ml; cynarin là

0,03125 g/ml tại bước sóng 323 nm; scolymosid là 0,0625 g/ml; cynarosid

là 0,0625g/ml tại bước sóng 349 nm.

- Giới hạn định lượng là (LOQ) của acid clorogenic là 0,125 g/ml; cynarin là

0,125 g/ml; scolymosid là 0,25 g/ml; cynarosid là 0,25 g/ml.

- Có độ lặp lại và độ đúng đạt yêu cầu.

Do đó, phương pháp xây dựng chính xác, đáng tin cậy khi dùng để đánh giá hàm

lượng acid clorogenic, cynarin, scolymosid, và cynarosid trong lá khô Actisô.

2.3. ỨNG DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỂ ĐÁNH GIÁ HÀM

LƯỢNG AC, CY, SCO, CR TRONG ACTISÔ

Tiến hành như Mục 3.3.1., mỗi mẫu được chiết 6 lần và tiến hành phân tích trên

UPLC với điều kiện đã khảo sát. Kết quả được xử lý thống kê với phép kiểm

ANOVA bằng phần mềm SPSS để kiểm định sự khác nhau giữa các biến, dùng t-

test trong Microsoft excel 2007 để so sánh 2 giá trị trung bình.

Kết quả định lượng hàm lượng AC, CY, SCO và CR được thể hiện Bảng 3.31

Bảng 3.32. Kết quả định lượng CY, AC, SCO, CR trong các mẫu thử

giống STT Mẫu thử độ ẩm %AC %CY %SCO %CR

1 tháng 3 9,43 0,691 ± 0,005 0,232 ± 0,001 0,335 ± 0,005 0,409 ± 0,005

2 tháng 4 11,46 0,537 ± 0,014 0,237 ± 0,002 0,345 ± 0,004 0,322 ± 0,004

3 tháng 5 12,09 0,508 ± 0,035 0,121 ± 0,006 0,399 ± 0,011 0,278 ± 0,006

Lá

trắng

4 tháng 6 12,69 0,724 ± 0,031 0,341 ± 0,013 0,506 ± 0,005 0,411 ± 0,004

5 phơi âm can 9,43 0,691 ± 0,004 0,232 ± 0,002 0,335 ± 0,003 0,409 ± 0,003

6 phơi nắng 12,28 0,739 ± 0,010 0,175 ± 0,002 0,406 ± 0,006 0,49 ± 0,006

7 sấy 50 độ 12,77 0,604 ± 0,005 0,034 ± 0,000 0,253 ± 0,001 0,075 ± 0,000

8 lá 9,43 0,691 ± 0,005 0,232 ± 0,001 0,335 ± 0,005 0,409 ± 0,005

.


69

giống STT Mẫu thử độ ẩm %AC %CY %SCO %CR

9 rễ 12,83 0,044 ± 0,001 0,013 ± 0,001 nd nd

10 hoa 12,82 0,382 ± 0,028 0,104 ± 0,004 nd nd

11 tháng 3 12,09 0,792 ± 0,005 0,141 ± 0,001 0,489 ± 0,005 0,259 ± 0,002

12 tháng 4 10,57 0,413 ± 0,014 0,049 ± 0,002 0,54 ± 0,004 0,237 ± 0,002

13 tháng 5 12,22 0,756 ± 0,035 0,084 ± 0,006 0,524 ± 0,011 0,208 ± 0,006

14 tháng 6 12,33 1,535 ± 0,031 0,25 ± 0,013 0,692 ± 0,005 0,326 ± 0,004

Lá

tím

15 phơi âm can 12,09 0,792 ± 0,005 0,141 ± 0,001 0,489 ± 0,005 0,259 ± 0,002

16 phơi nắng 12,52 1,139 ± 0,006 0,099 ± 0,002 0,467 ± 0,006 0,246 ± 0,002

17 sấy 50 độ 12,34 0,158 ± 0,001 0,014 ± 0,000 0,185 ± 0,001 0,095 ± 0,001

18 lá 12,09 0,792 ± 0,005 0,141 ± 0,001 0,489 ± 0,005 0,259 ± 0,002

19 rễ 12,82 0,055 ± 0,001 0,02 ± 0,001 nd nd

20 hoa 11,92 0,161 ± 0,028 0,072 ± 0,004 nd nd

* n.d.: không phát hiện được

So sánh hàm lượng CY, AC, SCO, CR trong các bộ phận dùng khác nhau

của Actisô

Xét trên các bộ phận dùng khác nhau (lá, rễ, hoa) của Actisô trắng và Actisô tím

phơi âm can ở tháng 3, hàm lượng các chất trong các bộ phận của cây khác nhau có

ý nghĩa (sig < 0,05). Trong đó, hàm lượng các chất AC, CY, SCO và CR đạt cao

nhất ở lá, sau đó đến hoa và cuối cùng là rễ (Xem Hình 3.44-3.45). Hai flavonoid

cynarosid và scolymosid không phát hiện được trong rễ và hoa có thể do hàm lượng

quá thấp.

Lá tím

Lá trắng

Hình 3.45. Ảnh hưởng của bộ phận dùng lên

hàm lượng lá tím

Hình 3.46. Ảnh hưởng của bộ phận dùng lên

lá trắng

.


70

Anova P < 0,05 Anova P < 0,05

So sánh sự thay đổi hàm lượng CY, AC, SCO, CR trong lá Actisô theo các

điều kiện làm khô khác nhau.

Xét trên các mẫu lá tím và lá trắng tháng 3 được làm khô ở các điều kiện khác nhau

(phơi âm can, phơi nắng, sấy ở 50 o C), kết quả thể hiện các điều kiện này có ảnh

hưởng đến hàm lượng các chất trong Actisô (sig < 0,05). Cynarin đạt cao nhất khi

phơi âm can, trong khi đó hàm lượng acid clorogenic nhiều nhất khi phơi nắng.

Hàm lượng hai flavonoid là cynarosid và scolymosid không bị ảnh hưởng bởi điều

kiện phơi vì còn phụ thuộc vào giống lá trắng hay tím. Phương pháp sấy trong tủ

sấy 50 o C cho hàm lượng thấp nhất (xem Hình 3.46 và 3.47).

Lá tím

Lá trắng

Hình 3.47. Ảnh hưởng của điều kiện phơi đến


Hình 3.48. Ảnh hưởng của điều kiện phơi đến

hàm lượng lá trắng

So sánh sự thay đổi hàm lượng CY, AC, SCO, CR trong lá Actisô theo

từng thời vụ thu hái

Lá tím

Lá trắng

.


71

Hình 3.49. Ảnh hưởng của tháng thu hoạch đến


Hình 3.50. Ảnh hưởng của tháng thu hoạch đến

hàm lượng lá trắng

Xét trên các mẫu lá tím và lá trắng được phơi âm can thu hoạch ở các tháng khác

nhau, kết quả cho thấy thời vụ thu hái ảnh hưởng có ý nghĩa đến hàm lượng các

chất trong lá Actisô. Nhìn chung, hàm lượng AC, CY, SCO, CR đều đạt cao nhất

vào tháng 3, tháng 6, thấp hơn ở tháng 4 và tháng 5 (xem Hình 3.48 và 3.49). Tuy

nhiên vẫn chưa thể kết luận chắc chắn tháng nào thu hái cho hàm lượng các chất cao

nhất vì chưa đủ cơ sở dữ liệu.

Định lượng các chế phẩm trên thị trường bằng phương pháp định lượng

đã xây dựng

Chuẩn bị mẫu: Tiến hành như Mục 3.3.1. Kết quả được thể hiện ở Hình 3.54-3.55

và Bảng 3.32

Hình 3.54. Biểu đồ kiểm nghiệm một số chế phẩm trên thị trường

STT

Chế

phẩm

Bảng 3.333. Kết quả định lượng 1 số chế phẩm

Thành phần

ĐỘ

ẨM

%

% AC % CY % SCO

1 HP Actisô 100% 12,16 0,09 0,06 n.d n.d

2 HD Actisô, sâm 8,57 n.d n.d n.d n.d

%

CR

.


72

3 DG Atisô, cỏ ngọt 5,26 0,03 0,06 n.d n.d

4 VT Rễ, thân, hoa, cam thảo 7,06 0,03 0,02 n.d n.d

5 LDX Lá tươi 100% 6,52 0,42 0,06 0,37 0,21

6 LDD Cao Actisô, Lá Actisô, thảo quyết minh 7,54 0,09 0,11 n.d n.d

7 TC Hoa Actisô 7,09 0,02 n.d n.d n.d

8 TA Hoa, thân, rễ Actisô 7,69 0,03 0,01 n.d n.d

9 BC Rễ, thân Actisô 6,93 0,01 n.d n.d n.d

10 TB Thân và lá , rễ, hoa, cỏ ngọt 6,18 0,07 0,02 0,01 0,01

11 WL3 (*) Actisô 100% 9,80 0,87 0,47 0,54 0,32

(*)

: Lá khô Actisô được thu hái vào tháng 3 năm 2015 n.d.: không phát hiện được

HP

HD

DG

VT

LDX

LDD

.


73

TC

TA

BC

TB

Hình 3.55. Sắc ký đồ kiểm nghiệm một số chế phẩm trên thị trường

Nhận xét: Tóm tắt các bộ phận dùng trong thành phần của các chế phẩm như sau:

Hoa: TC

Lá: HD, HP, DG, LDX, TB

Thân, rễ, hoa: VT, TA, TB

Thân và rễ: BC

Qua Bảng 3.32 rút ra một số nhận xét sau:

Đa số các chế phẩm đều chứa acid clorogenic (trừ HD). Tuy nhiên, hàm lượng acid

clorogenic rất thấp. Nhóm chế phẩm mà trong thành phần công thức không có lá

Actisô, thì hàm lượng acid clorogenic thấp hơn các chế phẩm còn lại (VT 0,03%;

TC 0,02%; TA 0,03%; BC 0,01%). Trong khi đó, các sản phẩm trong thành phần

công thức có lá Actisô cho hàm lượng acid clorogenic cao hơn (LDX 0,42%; HP

0,09%; TB 0,07%). Riêng chế phẩm LDD, có hàm lượng acid clorogenic 0,09 %, có

thể là do trong công thức có chứa cao đặc Actisô, sản phẩm của DG chỉ chứa 0,03%

acid clorogenic và HD không phát hiện pic acid clorogenic cũng như các pic

cynarin scolymosid, cynarosid (tuy trong công thức có lá Actisô) có thể do chất

.


74

lượng hay việc xử lý, bảo quản nguyên liệu không đạt yêu cầu.

Hàm lượng cynarin trong các chế phẩm là rất thấp (dưới 0,1%), một số sản phẩm

không phát hiện pic cynarin (HD, TC, BC). Trong các sản phẩm có cynarin, thì đa

số trong thành phần đều có lá Actisô, chỉ có sản phẩm của TA không có lá và hàm

lượng cynarin chỉ chứa 0,01 %. Riêng sản phẩm của LDD chứa 0,11% cynarin,

nguyên nhân có thể do trong thành phần công thức có chứa cao Actisô.

Scolymosid và cynarosid hầu như không phát hiện trong các chế phẩm, trừ sản

phẩm của LDX (scolymosid 0,37%; cynarosid 0,21%) và TB (scolymosid 0,01%;

cynarosid 0,01%). Nguyên nhân có thể do LDX có thành phần 100% là lá Actisô,

TB trong công thức còn có các thành phần khác. Các chế phẩm khác tuy trong thành

phần công thức cũng có lá Actisô (HP, LDD) nhưng không phát hiện được pic

scolymosid và cynarosid có thể do quá trình thu hái, bảo quản cũng như sơ chế chưa

phù hợp nênkhông có scolymosid và cynarosid.

Vậy, các chế phẩm có thành phần là lá cho hàm lượng acid clorogenic, cynarin,

scolymosid, và cynarosid cao hơn các chế phẩm có thành phần là hoa. Kết quả này

phù hợp với kết quả nghiên cứu của Hanen Falleh và cộng sự [15].

Chế phẩm có nguồn gốc từ lá là LDX chứa hàm lượng acid clorogenic, scolymosid

và cynarosid cao nhất so với các chế phẩm khác. Tuy nhiên, so với mẫu lá khô

Actisô (WL3) – là nguyên liệu của đề tài này, thì hàm lượng acid clorogenic trong

LDX kém hơn 2 lần, cynarin kém gần 8 lần, scolymosid và cynarosid kém 1,5 lần.

Nguyên nhân là mẫu nguyên liệu của đề tài đã qua quá trình xử lý sau khi thu hái.

Trong khi đó mẫu LDX có thể do nguồn nguyên liệu chưa được xử lý hoặc quá

trình phơi sấy, xử lý, và bảo quản nguyên liệu không đạt yêu cầu.

Kết luận: Trong sản xuất trà và cao thuốc Actisô, chỉ nên sử dụng nguyên liệu lá

Actisô, vì các bộ phận khác cho hàm lượng acid clorogenic, cynarin, scolymosid, và

cynarosid rất thấp. Ngoài ra, thì lá sau khi thu hái phải qua xử lý thích hợp mới cho

hàm lượng hoạt chất cao.

.


75

CHƯƠNG 3. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

3.1. KẾT LUẬN

Qua quá trình thực hiện, đề tài đã thu được các kết quả như sau:

a. Đã xây dựng được quy trình chiết xuất acid clorogenic, cynarin, scolymosid, và

cynarosid trong Actisô.

Phương pháp định tính, định lượng đồng thời acid clorogenic, cynarin,

scolymosid, và cynarosid trong lá khô Actisô đạt các kết quả sau:

- Có tính tương thích hệ thống.

- Khoảng tuyến tính của acid clorogenic, cynarin, scolymosid, cynarosid thuộc khoảng

từ 1 – 100 g/ml.

- Giới hạn phát hiện (LOD) của acid clorogenic là 0,03125 g/ml; cynarin là 0,03125

g/ml; scolymosid là 0,0625 g/ml; cynarosid là 0,0625g/ml.

- Giới hạn định lượng là (LOQ) của acid clorogenic là 0,125 g/ml; cynarin là 0,125

g/ml; scolymosid là 0,25 g/ml; cynarosid là 0,25 g/ml.

- Có độ lặp lại và độ đúng đạt yêu cầu.

b. Đã ứng dụng quy trình định lượng để khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm

lượng AC, CY, SCO và CR trong lá Actisô.

- Hàm lượng các chất AC, CY, SCO và CR đạt cao nhất ở lá, sau đó đến hoa và

cuối cùng là rễ.

- Cynarin đạt cao nhất khi phơi âm can, trong khi đó hàm lượng acid clorogenic

nhiều nhất khi phơi nắng. Hàm lượng hai flavonoid là cynarosid và scolymosid

không bị ảnh hưởng bởi điều kiện phơi vì còn phụ thuộc vào giống lá trắng hay

tím. Phương pháp sấy trong tủ sấy 50 o C cho hàm lượng các chất thấp nhất.

- Hàm lượng các chất AC, CY, SCO và CR hầu như rất thấp, đôi khi không tìm

thấy trong một số chế phẩm trên thị trường.

3.2. ĐỀ NGHỊ

Quy trình định lượng này có thể được ứng dụng cho những đề tài tiếp theo gồm:

.


76

- Tiếp tục khảo sát sự thay đổi hàm lượng của acid clorogenic, cynarin,

scolymosid và cynarosid vào các tháng tiếp theo.

- Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện bảo quản đến hàm lượng các chất.

- Định lượng hàm lượng các chất trong thân và gân lá.

.


77

TIẾNG VIỆT

CHƯƠNG 4. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyễn Thị Duyên Anh (2015), "Phân lập và thiết lập chất chuẩn cynarin từ lá

actisô", Khóa luận tốt nghiệp DSDH.

2. Vĩnh Định Đặng Văn HòaKiểm Nghiệm Thuốc, Nhà xuất bản giáo dục việt nam.

3. Viện Dược Liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa

học và Kỹ thuật, pp. 79-81.

4. Đỗ Tất Lợi Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội.

5. Nguyễn Thị Ánh Nguyệt (2011), Nghiên cứu phận lập và xây dựng phương pháp

đánh giá một vài polyphenol trong Actisô, ĐHYD TpHCM.

6. Bộ Y tế (2010), Dược Điển Việt Nam IV, NXB Y học, Hà Nội, pp. 681 - 682.

7. Ngô Văn Thu (1998), Bài giảng Dược Liệu, Đại học Y dược TpHCM, pp. 307-311.

8. Lê Phan Kim Trang (2016), "Phân lập và thiết lập chất chuẩn acid clorogenic và

cynarosid từ lá actisô (cynara scolymus l. Asteraceae)", Khóa luận tốt nghiệp

DSDH.

TIẾNG ANH

9. C. H. Blum-Silva et al. (2016), "Qualitative and quantitative analysis data of the

major constituents of Ilex paraguariensis leaves by UPLC-PDA and QTOF-MS",

Data Brief. 8, pp. 295-299.

10. E. Portis et al. (2012), "Genetic mapping and identification of QTL for earliness in

the globe artichoke/cultivated cardoon complex", BMC Res Notes. 5, pp. 252.

11. M. Wang et al. (2003), "Analysis of antioxidative phenolic compounds in artichoke

(Cynara scolymus L.)", J Agric Food Chem. 51 (3), pp. 601-608.

12. F. Ferreres A. Gil-Izquierdo, et al. (2001), "The effect of storage temperatures on

vitamin C and phenolics content of artichoke Cynara scolymus L. heads",

Innovative Food Science & Emerging Technologies. 2, pp. 199 - 202.

13. Sajid Ali (2011), Leaf Yield and Polyphenols of Artichoke (Cynara cardunculus L.)

Influenced by Harvest Frequency and Herbicide Stress Giessen.

14. Borhane Annabi Anissa Belkaid, et al. (2006), "The chemopreventive properties of

clorogenic acid reveal a potential new role for the microsomal glucose-6-phosphate

translocase in brain tumor progression", Cancer Cell International. 27, pp. 6-7.

15. Guifang Dou Bo Yang, et al. (2005), "Metabolic profile of 1,5-dicaffeoyquinic acid

in rats, an in vivo and in vitro study", Drug metabolism and disposition. 33 (7), pp.

930 -936.

16. Mabberley D.J. (1987), The Plant Book, A portable dictionary of the higher plants,

Cambridge University Press, pp. 706.

17. Andreas Hensel Gesine Löhr, et al. (2009), "In vitro investigations of Cynara

scolymus L. extract on cell physiology of HepG2 liver cells", Brazilian Journal of

Pharmaceutical Sciences. 45 (201 - 208).

18. Chedly Abdelly Hanen Falleh, et al. (2008), "Phenolic composition of Cynara

cardunculusL. organs, and their biological activities", C. R. Biologies. 331, pp.

372–379.

.


78

19. Ludwig Huber (2007), "Validation and qualification in analytical laboratories",

second edition, pp. pp. 144 - 146.

20. Giancarlo Colelli Ilde Ricci, et al. (2013), "Influence of pre-cutting operations

on quality of fresh-cut artichokes (Cynara scolymus L.): Effect of harvest

dates", Postharvest Biology and Technology, pp. 90–96.

21. Kazuo Ishida (2010), "Effects of Artichoke Leaf Extract on Acute Gastric Mucosal

Injury in Rats", Biol. Pharm. Bull. 33 (2), pp. pp. 223—229.

22. Jan G. Lammers Jan Fritsche, et al. (2002), "Isolation, characterization and

determination of minor artichoke (Cynara scolymus L.) leaf extract compounds",

Eur Food Res Technol. 215, pp. 149–157.

23. Anddresschieber Katrinschutz, et al. (2004), "Identification and Quantification of

Caffeoylquinic Acids and Flavonoids from Artichoke (Cynara scolymus L.) Heads,

Juice, and Pomace by HPLC-DAD-ESI/MS", Agric. Food Chem. 52 (13), pp. 4090

−4096.

24. Reasschieber Katrinschutz, et al. (2006), "Quantitative Determination of Phenolic

Compounds in Artichoke-Based Dietary Supplements and Pharmaceuticals by

High-Performance Liquid Chromatography", Agric. Food Chem. 2006. 54 (23), pp.

8812−8817.

25. Paul A.K. Lattanzio V., et al. (2009), "Globe artichoke: A functional food and source

of nutraceutical ingredients", Journal of functional food. I, pp. 131-144.

26. M. Escobar M. Lutz, et al. (2011), "Chemical composition and antioxidant properties

of mature and baby artichokes (Cynara scolymus L.), raw and cooked", Food

Composition and Analysis. 24, pp. 49–54.

27. Seyhan G.V. Meriçli A.H. (2006), "Constituents of Cynara syriaca leaves",

Pharmaceutical Biology. 44 (9), pp. 643-645.

28. Abdul Mutalib A.G Nasser (2012), "Phytochemical Study of Cynara scolymus L.

(Artichoke) (Asteraceae) Cultivated in Iraq, Detection and Identification of

Phenolic Acid Compounds Cynarin and Chlorogenic Acid ", Iraqi J Pharm Sci. 21

(1), pp. 6 - 13.

29. R Le Jeune P.Goetz (2007), "Artichaut, Cynara scoIymus", Phy t ot he´ r ap i e. 5,

pp. 219 - 222.

30. Hugh C. R. Simpson Rafe Bundy, et al. (2008), "Artichoke leaf extract (Cynara

scolymus) reduces plasma cholesterol in otherwise healthy hypercholesterolemic

adults: A randominzed, double blind placebo controlled tria", Phytomedicine. 15,

pp. 668-675.

31. James L. Reveal (2011), "Summary of recent systems of Angiosperm classification",

Kew Bulletin. 66, pp. 1-44.

32. M. K. Bellue Robbins W.W., W. S. Ball. (1970), Weeds of California, State of

California, Dept. of Agriculture, pp. 547.

33. Vincenzo Fogliano Rosalia Ferracane, et al. (2008), "Effects of Different Cooking

Methods on Antioxidant Profile, Antioxidant Capacity, and Physical Characteristics

of Artichoke", Agric. Food Chem. 56 (18), pp. 8601–8608.

34. Nancy H. Ibrahim Souria M. Donya (2012), "Antimutagenic Potential of Cynara

scolymus, Cupressus sempervirens and Eugenia jambolana Against Paracetamol-

Induced liver cytotoxicity. ", Journal of American Science. 8 (1), pp. 1 - 7.

35. V. A. Chelombit ′ko T. V. Orlovskaya, et al. (2007), "Carbohydrat from Cynara

scolymus", Chemistry of Natural Compounds. 43 (1), pp. 107 - 108.

.


79

36. V. A. Chelombit ′ko T. V. Orlovskaya, et al. (2007), "Chemical Composition of

Cynara scolymus Leaves", Chemistry of Natural Compounds. 43 (2), pp. 239 - 240.

37. Irene Morone V. Lattanzio (1979), "Variations of the orthodiphenol content of

Cynara scolymus L. during the plant growing seasons ", Experientia. 35, pp. 993 -

994.

38. Raymond Lo Xiangfeng Zhu, et al. (2004), "Phenolic Compounds from the Leaf

Extract of Artichoke (Cynara scolymus L.) and Their Antimicrobial Activities",

Agric. Food Chem. 52 (24), pp. 7272−7278.

39. K. Bauer E.J. Verspohl, et al. (2008), "Effect of two artichoke extracts (36_U and

36_EB) on rat ileum (with respect to bowel syndrome) and the peristaltic

threshold", Phytomedicine(1002-1009).

40. Jan Fritsche et al. (2002), "Isolation, characterization and determination of minor

artichoke (Cynara scolymus L.) leaf extract compounds", European food research

and technology. 215 (2), pp. 149-157.

41. Vincenzo Lattanzio et al. (2009), "Globe artichoke: a functional food and source of

nutraceutical ingredients", Journal of Functional Foods. 1 (2), pp. 131-144.

42. Tong Kwee Lim (2012), Edible medicinal and non-medicinal plants, Vol. 7, Springer.

43. Sara Lombardo et al. (2010), "Influence of genotype, harvest time and plant part on

polyphenolic composition of globe artichoke [Cynara cardunculus L. var. scolymus

(L.) Fiori]", Food Chem. 119 (3), pp. 1175-1181.

44. DT. Thoai Truc NT. Anh Nguyet, P. Dong Phuong (2015), "Simultaneous

quantification of chlorogenic acid, cynarin, scolymoside, cynaroside from

Artichoke leaves by HPLC-PDA", Proceeding of Asean Pharm Net I Conference.

45. Solvita Zeipiņa et al. (2015), Influence of agroecological factors on artichoke yield

and quality, Annual 21st International Scientific Conference:" Research for Rural

Development" Volume 1, Jelgava, Latvia, 13-15 May 2015, Latvia University of

Agriculture, pp. 77-81.

.


PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Tương thích hệ thống mẫu thử .................................................................... PL1

Phụ lục 2. Tương thích hệ thống mẫu chuẩn ................................................................ PL4

Phụ lục 3. Độ lặp lại .................................................................................................... PL6

Phụ lục 4. Độ đúng ...................................................................................................... PL8

Phụ lục 5. Tính tuyến tính ........................................................................................ PL10

Phụ lục 6. Dữ liệu uplc của mẫu lá trắng tháng 3 ...................................................... PL15




Phụ lục 10. Dữ liệu uplc của mẫu lá tím tháng 3.......................................................... PL19



Phụ lục 13. Dữ liệu uplc của mẫu lá tím tháng 6 .......................................................... PL22

Phụ lục 14. Dữ liệu uplc của mẫu hoa trắng ................................................................. PL23

Phụ lục 15. Dữ liệu uplc của mẫu hoa tím.................................................................... PL24

Phụ lục 16. Dữ liệu uplc của mẫu rễ trắng ................................................................... PL25

Phụ lục 17. Dữ liệu uplc của mẫu rễ tím ...................................................................... PL26

Phụ lục 18. Dữ liệu uplc của mẫu lá trắng phơi nắng................................................... PL27

Phụ lục 19. Dữ liệu uplc của mấu lá trắng sấy ở 50 độ ................................................ PL28

Phụ lục 20. Dữ liệu uplc của mẫu lá trắng phơi âm can ............................................... PL29

Phụ lục 21. Dữ liệu uplc của lá tím phơi nắng ............................................................. PL30

Phụ lục 22. Dữ liệu uplc của mẫu lá tím sấy 50 độ ........................................................... 31

Phụ lục 23. Dữ liệu uplc của lá tím phơi âm can ............................................................... 32

.

PL1


Phụ Lục 1.

Tương thích hệ thống mẫu thử

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL2

.


.

PL4


Phụ Lục 2.

Tương thích hệ thống mẫu chuẩn

.


.

PL6


Phụ Lục 3.

Độ lặp lại

SKĐ ở bước sóng 323 nm


.


.

PL8


Phụ Lục 4.

Độ đúng



.


.

PL10


Phụ Lục 5.

Tính tuyến tính



.


.


.


.

PL14


Phụ Lục 6.

Độ chọn lọc

.

PL15


Phụ Lục 7. Dữ liệu uplc của mẫu lá trắng tháng 3

SKĐ của mẫu ở bước sóng 323 nm


.

PL16





.

PL17



SKĐ của mẫu ở bước sóng 323nm


.

PL18





.

PL19


Phụ Lục 11. Dữ liệu uplc của mẫu lá tím tháng 3



.

PL20





.

PL21





.

PL22





.

PL23


Phụ Lục 15.

Dữ liệu uplc của mẫu hoa trắng



.

PL24


Phụ Lục 16.

Dữ liệu uplc của mẫu hoa tím



.

PL25


Phụ Lục 17.

Dữ liệu uplc của mẫu rễ trắng



.

PL26


Phụ Lục 18.

Dữ liệu uplc của mẫu rễ tím



.

PL27


Phụ Lục 19.

Dữ liệu uplc của mẫu lá trắng phơi nắng


SKĐ của mẫu ở bước 349 nm

.

PL28


Phụ Lục 20.

Dữ liệu uplc của mấu lá trắng sấy ở 50 độ



.

PL29


Phụ Lục 21.

Dữ liệu uplc của mẫu lá trắng phơi âm can



.

PL30


Phụ Lục 22.

Dữ liệu uplc của lá tím phơi nắng



.

PL31


Phụ Lục 23.

Dữ liệu uplc của mẫu lá tím sấy 50 độ



.

PL32


Phụ Lục 24.

Dữ liệu uplc của lá tím phơi âm can



.

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CYNARIN, ACID CLOROGENIC, CYNAROSID VÀ SCOLYMOSID TRONG LÁ ACTISÔ BẰNG PHƯƠNG PHÁP UHPLC-PDA

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?