Vol.20 No.4

05.02.2020 Views
Journal of the Arab Board of Health Specializations Vol. 20, No. 4, 2019الخاليا(.‏ حُ‏ فِظ معلق الخاليا حتى صباح اليوم التالي بحرارة 4° C.تفعيل خاليا :CD4+ أُضيف إلى كل 1 مل من معلقالخاليا في 2 RPMI ميكرولتراً‏ من مزيج تفعيل الخالياeBioscience) (cell stimulation cocktail, المؤلف من:‏(PMA) phorbol myristate acetate وionomycin‏،‏ باإلضافةإلى brefeldin A وmonensin‏.‏ وُضِ‏ ع األنبوب الحاوي علىCO 2CO 2 مع ضبط الحرارة على 37° C وتركيزالمعلق في حاضنةعلى %5 وذلك مدة 4 ساعات.‏ يعمل المزيج المضاف على تفعيل خالياT إلى جانب تثبيط تحرير السيتوكينات من هذه الخاليا.‏تلوين سطوح الخاليا:‏ بعد انتهاء الحضن ثُفِّل األنبوب بسرعةg 400 مدة 5 دقائق بحرارة الغرفة،‏ ثمّ‏ أضيف 3 مل من محلول(Bovine serum albumin، Sigma) BSA بتركيز ،%1 ثمّ‏حُ‏ ضِ‏ نت الخاليا مدة 10 دقائق بحرارة الغرفة،‏ وذلك لحجب االرتباطاتغير النوعية.‏ ثُفِّل األنبوب ثمّ‏ غُ‏ سلت الخاليا باستخدام 10 مل منDPBS والتخلص من الطافي.‏ بُعثرَت الخاليا من جديد في 1 مل منDPBS لتقييم تعداد الخاليا وحيويتها مرة أخرى.‏ تُبِع ذلك بتثفيل األنبوبوبعثرة الخاليا في حجم مناسب من DPBS بحيث يحتوي كل 100ميكرولتر على x10(1-2) 6 خلية/مل.‏ نُقِل 100 مكل من المعلق الناتجإلى أنبوب ايبندورف وأُضيف 5 مكروليتر من أضداد CD4( CD4)Monoclonal Antibody FITC، eBioscience لتلوين سطوحالخاليا التائية المساعدة،‏ مع المزج الجيد والحضن مدة 30 دقيقة بحرارةC 4° في الظالم.‏التلوين داخل الخلوي:‏ بعد انتهاء الحضن غُ‏ سِ‏ لت الخاليا مرتين بإضافة2 مل DPBS إلى األنبوب،‏ وبُعثرت الخاليا في 100 مكل من ،DPBSثم أضيف 100 مكل من وقاء التثبيت Fixation( Intracellular)buffer, invirogen مع المزج الجيد وذلك بغرض تثبيت الخاليا،‏ وحُ‏ فِظالمزيج في الظالم بحرارة 4° C حتى صباح اليوم التالي.‏ في اليوم التاليأُضيف إلى كل أنبوب 2 مل من وقاء زيادة النفاذية permeabilization(،)buffer, invirogen وبعد الحضن 15 دقيقة بحرارة الغرفة في الظالمثُفِّل األنبوب )400 g لمدة 5 دقائق بحرارة الغرفة(،‏ ثمّ‏ غُ‏ سِ‏ لت الخاليامرة أخرى باستخدام 2 مل من وقاء النفاذية.‏ جرى بعد ذلك بعثرة الخاليافي 100 مكروليتر من وقاء النفاذية،‏ ثمّ‏ أضيف 5 مكروليتر من كل مناألضداد داخل الخلوية Antibody( IFN gamma Monoclonalو-‏IL و-‏PerCP‏(‏ IL-4 Monoclonal Antibody و(‏PE‏)‏ (APC))Cyanine5.5( 17A Monoclonal Antibody وكلها من إنتاجشركة ،)eBioscience( وحُ‏ ضن األنبوب مدة 60 دقيقة بحرارة الغرفةفي الظالم.‏ بعد انتهاء مدة الحضن أُضيف 2 مل من وقاء النفاذية وثُفِّلاألنبوب )400 g، 5 دقائق بحرارة الغرفة(.‏ أُضيف بعد التخلص منالطافي 2 مل من DPBS وأُعيد التثفيل،‏ ثمّ‏ بُعثرت الخاليا في 500مكرولتر من .DPBSتحليل أنواع الخاليا التائية المساعدة باستخدام جهاز التدفق الخلوي:‏جرى تحليل العينات باستخدام جهاز التدفق الخلوي®‏MACSQuantBiotec) ،Analyzer 10 Flow Cytometer (Miltenyi وتمّ‏تبويب gating اللمفاويات ثمّ‏ تبويب خاليا Th باعتبارها اللمفاوياتإيجابية التعبير عن ،CD4 ثمّ‏ حُ‏ دِّدت نسبة خاليا Th17 ‏)ضمن خاليا.CD4+ IL-17+ باعتبارها الخاليا )Thطريقة المقايسة المناعية االمتزازية المرتبطة باألنزيم :ELISAجرى قياس تركيز اإلنترلوكين IL-17 في المصل باستخدام مجموعةالعمل الخاص به Austria( )IL-17 ELISA kits, Invitrogen,وذلك تبعاً‏ إلرشادات المصنِّع،‏ وتمت قراءة االمتصاصية عند طول موجة450 نانومتر.‏التحليل اإلحصائي:‏ استُخدم في التحليل اإلحصائي برنامج SPSS‏)اإلصدار 23(، واستُخدم كل من اختبار ،Student t واختبار التباين)0.05( p الختبار الفروق في المتوسطات،‏ مع اعتبار قيمة ANOVAكمستوى داللة على األهمية اإلحصائية.‏النتائجسُ‏ جّ‏ ل لكل عينة النسبة المئوية لخاليا Th17 من مجمل الخاليا ،Thحيث تراوحت هذه النسبة بين %2.54 و‎%98.32‎‏،‏ حيث كان متوسطنسبة هذه الخاليا عند مجموعة مريضات سرطان الثدي )%48.86(أقل من المتوسط المالحظ لدى مجموعة مريضات األورام الحميدة)%52.81(، إال أن هذا الفارق لم يكن ذو داللة إحصائية هامة ‏)قيمة،)0.402=p الجدول 2 والشكل .1تراوح تركيز اإلنترلوكين IL-17 بين 0 و‎18.9‎ بيكوغرام/مل،‏ حيثكان متوسط التركيز عند مجموعة مريضات سرطان الثدي(‏‎1.53‎بيكوغرام/مل(‏ أعلى من المتوسط المالحظ لدى مجموعة مريضات األورامالحميدة )0 بيكوغرام/مل(،‏ لم يكن هذا الفارق أيضاً‏ ذو داللة إحصائيةهامة ‏)قيمة p=0.057(، الجدول 2.تم حساب متوسط نسبة الخاليا Th17 عند مريضات سرطان الثدي،‏حيث بلغ في حال عدم وجود نقائل %44.49، وهو أقل من المتوسطالمالحظ في حال وجود نقائل %54.44. تناقص متوسط نسبة خالياTh17 بازدياد درجة Nott في األورام،‏ فكان المتوسط ضمن المجال 9-8)%48.2( بينما بلغ في األورام ذات المجال 7-5 )%48.54(، كذلك كانمتوسط نسبة الخاليا Th17 في األورام غير المترافقة مع تشكل أوعيةجديدة %48.91، بينما تناقص المتوسط عند ترافق الورم مع تشكل أوعيةجديدة %48.74، وفيما يخص حجم الورم فقد ازداد متوسط نسبة الخالياTh17 بازدياد حجم الورم،‏ حيث بلغ القيمتين %41.64 و‎%47.89‎ في23

Journal of the Arab Board of Health Specializations Vol. 20, No. 4, 2019الشكل 1. النسبة المئوية لخاليا Th17 ضمن خاليا CD4+T ‏)في خاليا )PBMCs في الدم المحيطي لدى كل من مريضة سرطان الثدي،CD4+T يظهر تبويب اللمفاويات ثم تبويب الخاليا .)benign( ومريضة بورم حميد في الثدي )malignant(ثم نسبة خاليا Th17 ضمن خاليا .CD4+T(PBMC: Peripheral blood mononuclear cells):FITC، PerCP المواد المتألقة المرتبطة بأضداد كل من CD4 وIL-17‎ على الترتيب.‏قيمة F قيمة pالعنصر المدروسنوع الورمالعددالمتوسطاالنحراف المعياريالخطأ المعياري0.4020.843-3.053.5019.5518.5148.8652.814128ورم خبيثورم حميدTh170.0571.9360.650.004.160.001.530.004128ورم خبيثورم حميدIL-17الجدول 2. متوسط كل من نسبة Th17 وتركيز IL-17 بين مجموعتي أفراد الدراسة.‏حالتي حجم الورم دون 3.3 سم وأكبر من 3.3 سم على الترتيب.‏ تبيّنعند استخدام اختبار Student t الختبار الفروقات في متوسط نسبةالخاليا Th17 أن قيمة p أكبر من 0.05، وبالتالي ال توجد فروق ذاتداللة إحصائية بين متوسطات نسبة هذه الخاليا ضمن مجموعة مريضاتالسرطان باختالف حالة النقائل أو درجة Nott أو حالة تشكل أوعيةجديدة أو حجم الورم،‏ الجدول 3.تم حساب متوسط تركيز اإلنترلوكين IL-17 عند مريضات سرطانالثدي،‏ حيث بلغ في حال عدم وجود نقائل 0.35 بيكوغرام/م،‏ وهو أقلمن المتوسط المالحظ في حاالت وجود نقائل )3.04 بيكوغرام/مل(،‏كذلك كان متوسط تركيز اإلنترلوكين IL-17 في األورام غير المترافقةمع تشكل أوعية جديدة )0 بيكوغرام/مل(،‏ بينما بلغ المتوسط المالحظعند ترافق الورم مع أوعية جديدة )4.46 بيكوغرام/مل(،‏ وتبين باستخداماختبار Student t أن هذه الفروق في قيم المتوسط ذات داللة إحصائيةهامة،‏ حيث بلغت p=0.038 في اختالف حالة النقائل،‏ و‎0.001‎ فياختالف تشكل أوعية جديدة.‏ ازداد متوسط تركيز اإلنترلوكين IL-17بازدياد درجة Nott. في األورام،‏ فكان المتوسط ضمن األورام ذات المجال)3.25 9-8 بيكوغرام/مل(،‏ بينما بلغ في األورام ذات المجال 7-5)1.91 بيكوغرام/مل(،‏ وفيما يخص حجم الورم فقد تناقص متوسطتركيز اإلنترلوكين IL-17 بازدياد حجم الورم حيث بلغ القيم 2.51بيكوغرام/مل و‎2.49‎ بيكوغرام/مل في حالتي حجم الورم دون 3.3 سموأكبر من 3.3 على الترتيب.‏ تبيّن عند استخدام اختبار Student tلتقييم الفروقات في متوسط تركيز اإلنترلوكين IL-17 أن قيم األهميةp<0.05، وبالتالي ال توجد فروق ذات داللة إحصائية بين متوسطاتتركيز اإلنترلوكين IL-17 ضمن مجموعة مريضات السرطان باختالفدرجة Nott. أو حجم الورم،‏ الجدول 4.24

Page 2 and 3: Journal of the Arab Board of Health










































Page 88 and 89: arab-board

artery

acute

clinical

pulmonary

dialysis

thyroid

thyroidectomy

hypocalcemia

specializations

arab

Vol.20 No.4

Delete template?

Save as template ?