Xây dựng phương pháp định lượng Pantoprazol trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ 

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI 

TRẦN THỊ THÚY DIỆU 

MSV: 1101077 

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 

PANTOPRAZOL TRONG HUYẾT TƯƠNG 

BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ 

HÀ NỘI - 2016

BỘ Y TẾ 

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI 

TRẦN THỊ THÚY DIỆU 

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 

PANTOPRAZOL TRONG HUYẾT TƯƠNG 

BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ 

Người hướng dẫn: 

1. Th.S Trần Thị Lan Hương 

2. Th.S Tạ Mạnh Hùng 

Nơi thực hiện: 

Bộ môn Hóa dược- ĐH Dược HN 

Trung tâm đánh giá TĐSH - VKN thuốc TW 

HÀ NỘI – 2016

www.twitter.com/daykemquynhon 

https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 

www.facebook.com/daykem.quynhon 

www.daykemquynhon.blogspot.com 

LỜI CẢM ƠN 

www.daykemquynhon.ucoz.com 

MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com 

Lời đầu tiên, em xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến 

Th.S Trần Thị Lan Hương - Giảng viên bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược 

Hà Nội và Th.S Tạ Mạnh Hùng - Giám đốc Trung tâm Tương đương sinh học - 

Phó Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương đã tận tình chỉ bảo, hướng 

dẫn em thực hiện khóa luận này. 

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược 

Hà Nội, Trung tâm Tương đương sinh học - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương, 

thầy cô và các anh, các chị đã tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong suốt thời 

gian thực hiện khóa luận. 

Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô, các cán bộ Trường Đại học Dược 

Hà Nội, những người đã trang bị cho em rất nhiều kiến thức trong suốt quá trình 

học tập để em có được thành quả ngày hôm nay. 

Xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè - những người đã luôn ở bên 

động viên, cổ vũ và giúp đỡ em trong cuộc sống. 

Em xin chân thành cảm ơn! 

Hà Nội, tháng 5 năm 2016 

Sinh viên 

Trần Thị Thúy Diệu 

DIỄN ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN 

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn 

Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú 

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú 

www.facebook.com/daykemquynhonofficial 

www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial





MỤC LỤC 



ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................. 1 

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ....................................................................................... 2 

1.1. Tổng quan về <strong>Pantoprazol</strong> ................................................................................... 2 

1.1.1. Công thức hóa học ............................................................................................ 2 

1.1.2. Tính chất hóa lý ................................................................................................. 2 

1.1.3. Cơ chế tác dụng, dược động học, chỉ <strong>định</strong> của PAN ........................................ 2 

1.1.4. Một số chế phẩm trên thị trường ....................................................................... 3 

1.1.5. Một số <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> PAN trong dịch sinh học .............................. 4 

1.2. Tổng quan về HPLC và thẩm <strong>định</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> thuốc 

trong dịch sinh học ...................................................................................................... 5 

1.2.1. Tổng quan về HPLC.......................................................................................... 5 

1.2.2. Thẩm <strong>định</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> thuốc trong dịch sinh học ....................... 9 

CHƯƠNG 2: ĐIỀU KIỆN THỰC NGHIỆM, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 

NGHIÊN CỨU .......................................................................................................... 11 

2.1. Điều kiện thực nghiệm ....................................................................................... 11 

2.2. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 13 

2.3. Phương <strong>pháp</strong> nghiên cứu .................................................................................... 13 

2.4. Phương <strong>pháp</strong> xử lí kết quả ................................................................................. 19 

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT ............................................................... 20 

3.1. Kết quả xây <strong>dựng</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> ....................................................... 20 

3.2. Kết quả thẩm <strong>định</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> phân tích ........................................................ 27 

3.3. Bàn luận ............................................................................................................. 40 

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 41 


4.1. Kết luận .............................................................................................................. 41 

4.2. Kiến nghị ............................................................................................................ 42 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 










DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 



PAN 

CV 

HPLC 

: <strong>Pantoprazol</strong> 

: Hệ số biến thiên (Coefficient of Variation) 

: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) 

IS : Chất nội chuẩn (Internal standand ) 

LLOQ 

ULOQ 

QC 

LQC 

MQC 

HQC 

MeCN 

MeOH 

SKĐ 

Cmax 

: Nồng độ giới hạn <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> dưới (Lower Limit of Quantification) 

: Nồng độ giới hạn <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> trên (Upper Limit of Quantification) 

: Mẫu kiểm tra chất <strong>lượng</strong> (Quality Control Samples) 

: Mẫu kiểm tra nồng độ thấp (Lower Quality Control Samples) 

: Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình (Middle Quality Control Samples) 

: Mẫu kiểm tra nồng độ cao (High Quality Control Samples) 

: Acetonitril 

: Methanol 

: Sắc ký đồ 

: Nồng độ đỉnh 

T1/2 : Thời gian bán thải 

UV–VIS : Tử ngoại – khả kiến (Ultra violet – Visble) 

US–FDA : Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ 

EMA 

(United States of American Food and Drug Administration) 

: Cơ quan quản lý thuốc Châu âu (European Medicine Agency) 











DANH MỤC CÁC BẢNG 



Bảng Nội dung Trang 

1.1 Một số chế phẩm pantoprazol trên thị trường 3 

1.2 Một số nghiên cứu <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> pantoprazol trong dịch sinh học 4 

2.1 Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu 11 

2.2 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu 11 

2.3 Các mẫu huyết tương trắng trong nghiên cứu 12 

2.4 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu 12 

2.5 Chuẩn bị đường chuẩn 14 

2.6 Chuẩn bị mẫu kiểm tra 14 

3.1 Kết quả đáp ứng mẫu trắng 28 

3.2 Kết quả thẩm <strong>định</strong> đường chuẩn 29 

3.3 Kết quả thẩm <strong>định</strong> giới hạn <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> dưới 30 

3.4 Kết quả thẩm <strong>định</strong> độ đúng, độ chính xác trong ngày 31 

3.5 Kết quả thẩm <strong>định</strong> độ đúng, độ chính xác khác ngày 32 

3.6 Kết quả thẩm <strong>định</strong> tỷ lệ thu hồi nội chuẩn 33 

3.7 Kết quả thẩm <strong>định</strong> tỷ lệ thu hồi pantoprazol 34 

3.8 Độ ổn <strong>định</strong> dung dịch nội chuẩn trong thời gian ngắn 35 

3.9 Độ ổn <strong>định</strong> dung dịch chuẩn pantoprazol gốc dài ngày 35 

3.10 Độ ổn <strong>định</strong> của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông – rã 36 

3.11 Độ ổn <strong>định</strong> của mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn 37 

3.12 Độ ổn <strong>định</strong> của nồng độ 90 ng/mL ở nhiệt độ phòng trong thời gian 

dài 

3.13 Độ ổn <strong>định</strong> của nồng độ 3500 ng/mL ở nhiệt độ phòng trong thời gian 

dài 

3.14 Độ ổn <strong>định</strong> của mẫu trong auto – sampler 39 


38 

38 










DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ 



Hình Nội dung Trang 

3.1 Phổ hấp thụ UV-VIS của PAN 20 

3.2 SKĐ PAN và omeprazol 21 

3.3 SKĐ PAN và rabeprazol 21 

3.4 SKĐ PAN và lansoprazol 22 

3.5 SKĐ của PAN và IS với tỷ lệ pha động 30:70 23 

3.6 SKĐ của PAN và IS với tỷ lệ pha động 36:64 23 

3.7 

3.8 

SKĐ của PAN và IS trong pha động MeCN: đệm phosphat pH 7,3 

(36:64) với tốc độ dòng 1,3 mL 

SKĐ của PAN và IS trong pha động MeCN: đệm phosphat pH 7,3 

(36:64) với tốc độ dòng 1,5 mL 24 

3.9 Quy trình xử lý mẫu 25 

3.10 

SKĐ mẫu chuẩn PAN (4000 ng/ml) và IS với quy trình xử lý mẫu 

được chọn 26 

3.11 SKĐ mẫu huyết tương trắng 27 

3.12 SKĐ mẫu huyết tương trắng có chứa nội chuẩn 27 

3.13 SKĐ mẫu huyết tương trắng chứa PAN 27 

3.14 SKĐ mẫu huyết tương trắng chứa IS và PAN nồng độ 30 ng/ml. 27 


24 










1 



ĐẶT VẤN ĐỀ 

Loét dạ dày - tá tràng là bệnh khá phổ biến ở nước ta và trên thế giới. Hiện 

nay, đây đang là bệnh đứng đầu về tỉ lệ mắc trong số các bệnh về đường tiêu hóa. 

Trên thế giới, ước tính khoảng 10% dân số mắc bệnh ở mọi lứa tuổi, không phân 

biệt giới tính, tỉ lệ mắc bệnh ở người lớn cao hơn trẻ em và hàng năm tăng khoảng 

0,2% [18]. Có nhiều nhóm thuốc điều trị loét dạ dày - tá tràng như nhóm thuốc 

kháng acid, nhóm thuốc kháng H2, nhóm thuốc ức chế bơm proton... Trong đó, 

nhóm thuốc ức chế bơm proton tác dụng nhanh, hiệu quả, tỷ lệ làm lành vết loét có 

thể đạt tới 95% sau tám tuần điều trị. Thuốc ít ảnh hưởng đến khối <strong>lượng</strong> dịch vị, sự 

bài tiết pepsin, yếu tố nội dạ dày và sự co bóp dạ dày[1]. Do đó, nhóm thuốc này 

được sử dụng rất nhiều trong các phác đồ điều trị loét dạ dày - tá tràng. 

<strong>Pantoprazol</strong> là thuốc thuộc nhóm ức chế bơm proton, thuốc dung nạp tốt, ít 

để lại tác dụng phụ nên là một trong những thuốc đang được sử dụng phổ biến tại 

Việt Nam. Để có được liều sử dụng hợp lý cho từng đối tượng bệnh nhân thì việc 

kiểm soát nồng độ hoạt chất này trong huyết tương là rất cần thiết. Ngoài ra, việc 

giám sát chất <strong>lượng</strong> thuốc cũng như đánh giá tương đương sinh học thuốc chứa 

pantoprazol là vô cùng quan trọng nhằm nâng cao chất <strong>lượng</strong> thuốc và giúp bác sĩ 

lựa chọn được các thuốc an toàn, hiệu quả, kinh tế. Tuy vậy, hiện nay ở nước ta vẫn 

chưa có một quy trình chuẩn, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm để <strong>định</strong> 

<strong>lượng</strong> pantoprazol trong huyết tương. 

Xuất phát từ yêu cầu thực tế và với mong muốn xây <strong>dựng</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> xác 

<strong>định</strong> nồng độ pantoprazol trong huyết tương nhằm phục vụ cho công tác điều trị và 

đánh giá tương đương sinh học các chế phẩm chứa hoạt chất pantoprazol chúng tôi 

tiến hành thực hiện đề tài : “<strong>Xây</strong> <strong>dựng</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> <strong>Pantoprazol</strong> 

trong huyết tương bằng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> sắc ký lỏng hiệu năng cao” với 2 nội dung 

chính: 

1. <strong>Xây</strong> <strong>dựng</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> pantoprazol trong huyết tương bằng 

<strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> HPLC. 

2. Thẩm <strong>định</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> đã xây <strong>dựng</strong>, đề ra quy trình phân tích thường quy 

để <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> pantoprazol trong huyết tương theo tiêu chuẩn US-FDA và 

EMA. 











2 



1.1. TỔNG QUAN VỀ PANTOPRAZOL 

1.1.1. Công thức hóa học 

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 

- <strong>Pantoprazol</strong> (PAN) có công thức phân tử : C16H14F2N3O4S 

- Khối <strong>lượng</strong> phân tử : 383,37 

- Công thức cấu tạo : 

- Tên khoa học : 5- (Diflomethoxy) – 2 – [( 3, 4- dimethoxypyridin – 2- yl) 

methanesulfinyl] – 1H- 1,3 – benzodiazole [9,11,12]. 

1.1.2. Tính chất hóa lý 

- Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng. 

- Khó tan trong nước, log P = 2,18. 

- Rất dễ bị phân hủy trong môi trường acid, thường thấy ở dạng muối natri 

ngậm 1,5 phân tử nước. 

- Hấp thu UV do có liên kết đôi liên hợp [3,12,14]. 

1.1.3. Cơ chế tác dụng, dược động học, chỉ <strong>định</strong> của pantoprazol 

* Cơ chế tác dụng: 

Sau khi được hấp thu, PAN tích lũy trong ống tiết acid của tế bào thành dạ dày. 

Ở đây, nó gắn kết với nhóm sulfhydryl của hệ enzyme H+/ K+ - ATPase trên bề 

mặt tiết gastrin của tế bào vách, gây ra sự ức chế tiết acid cơ bản và tiết acid do kích 

thích. PAN có thể ức chế sự tiết acid dạ dày mà không kể đến bản chất của kích 

thích (acetylcholin, histamin, gastrin…) [1,2,20]. 

* Dược động học: 

- Hấp thu: PAN được hấp thu nhanh. Nồng độ đỉnh Cmax của PAN là 2400 

ng/mL đạt được sau khoảng 2 – 2,5 giờ khi dùng PAN liều 40mg chia liều hoặc 











3 



dùng liều duy nhất. Thức ăn làm tăng thời gian hấp thu nhưng không làm thay đổi 

Cmax và diện tích dưới đường cong AUC của PAN. 

- Phân bố: 98% PAN gắn kết với protein huyết tương. Thể tích phân bố 

khoảng 0,17 l/kg, phân bố chủ yếu trong dịch ngoại bào. 

- Chuyển hoá: PAN được chuyển hoá chủ yếu ở gan nhờ enzym CYP2C19 

của cytochrom P450 để thành demethylpantoprazol. 

- Thải trừ: Chất chuyển hoá bài tiết chủ yếu qua nước tiểu (80%), <strong>lượng</strong> còn lại 

thải trừ qua mật và phân. T1/2 khoảng 1 giờ và kéo dài trong suy gan, ở bệnh nhân 

xơ gan là 3 - 6 giờ.Vì vậy, cần xem xét hiệu chỉnh liều cho bệnh nhân suy gan 

[1,2,14,20]. 

* Chỉ <strong>định</strong> 

- Loét dạ dày - tá tràng. 

- Bệnh trào ngược dạ dày - thực quản. 

- Hội chứng tăng tiết acid (hội chứng Zollinger Ellison). 

- Dự phòng loét dạ dày - tá tràng do dùng thuốc chống viêm không steroid, do 

stress [1,2,20]. 

1.1.4. Một số chế phẩm trên thị trường 

Các chế phẩm có chứa PAN trên thị trường chủ yếu ở dạng: bột pha tiêm 

truyền tĩnh mạch, viên nang tan trong ruột hàm <strong>lượng</strong> 40mg [1]. Ngoài ra còn một 

số dạng như viên nén, viên giải phóng kéo dài... đáp ứng nhu cầu đa dạng của người 

sử dụng. Một số chế phẩm chứa PAN trên thị trường được trình bày cụ thể tại bảng 

1.1 [19]. 

Bảng 1.1: Một số chế phẩm PAN trên thị trường 

STT Dạng bào chế Tên biệt dược H/<strong>lượng</strong> Nhà sản xuất 

1 Viên nén bao tan 

trong ruột 

2 

Bột đông khô pha 

tiêm 

Bio-panto 40mg Biodeal Laboratories 

Hasanloc 40mg Hasan- Dermapharm 

Pantoloc 40mg Nycomed 

Pantostad 40mg STADA- VN J.V 

SP Extream 40mg Shinpoong Daewoo 

Sozol 40mg Atlantic Pharma 

Pantoloc 40mg Nycomed 

Pantosec 40mg Cipla 











4 



PMS-<strong>Pantoprazol</strong> 40mg Pharmascience Inc 

3 Viên nén GPKD Proton-P 40 mg Aristopharma 

4 Viên nén Nolpaza 40mg KRKA 

1.1.5. Một số <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> pantoprazol trong dịch sinh học 

Hiện nay, <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> PAN nguyên liệu có thể sử dụng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> đo quang 

hoặc <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Định <strong>lượng</strong> PAN trong dịch 

sinh học có thể sử dụng nhiều <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> khác nhau như HPLC, điện di mao 

quản, phóng xạ miễn dịch. Tuy nhiên, <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> bằng HPLC vẫn 

được nhiều nghiên cứu sử dụng nhất do có nhiều ưu điểm. Một số <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> 

<strong>định</strong> <strong>lượng</strong> PAN trong huyết tương bằng HPLC được trình bày ở bảng 1.2. 

Bảng 1.2: Một số nghiên cứu <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> PAN trong dịch sinh học 

PP Mẫu Xử lý mẫu IS 

1 

[17] 

2 

[6] 

3 

[10] 

Huyết 

tương 

chó 

Huyết 


người 

Huyết 


người 

Tủa 

protein 

bằng 

acetonitril 

Tủa 

protein 


acetonitrilmethanol= 

50:50 (v:v) 

Tủa 

protein 


methanol 

(MeOH) 

Omeprazol 

Rofecoxib 

Omeprazol 

Điều kiện sắc ký 

Cột Pha động Detector 

Diamosil 

C18 

(250 

mm×4 

mm) 

Chromasil 

C18 

(250 mm x 

4.6 mm) 

Diamosil 

ODS C18 

(150mm×4 

,6mm) 

Acetonitril: 

10mM amoni 

acetat pH 6,0 

Tốc độ dòng: 

1ml/phút 

Acetonitril : 

đệm phosphat 

pH 3,15 = 

42 :58 (v/v) 


1ml/phút 

Acetonitril: 

đệm phosphat 

pH 6,8 = 

32:68 (v/v) 


1,5 ml/phút 

UV, 

λ 290nm 

UV, 

λ 272nm 

UV, 

λ 288nm 











5 



Nhận xét: 

Phương <strong>pháp</strong> 1, 2 và 3: Xử lý mẫu bằng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> tủa protein trong dung 

môi MeCN, MeOH đơn giản, dễ thực hiện. Tuy nhiên, nền mẫu phức tạp, mẫu chưa 

sạch, pic của chuẩn không tách được hoàn toàn pic tạp trên sắc ký đồ, không thuận 

lợi cho quá trình phân tích mẫu. 

Ngoài ra, với <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> 2 dùng nội chuẩn là rofecoxib, là một thuốc 

NSAID cấu trúc không có nhiều điểm tương đồng với pantoprazol nên dùng làm nội 

chuẩn là chưa thực sự hợp lý. 

Dựa trên sự tham khảo các tài liệu đã được công bố và dựa vào tính chất lý 

hóa của PAN, chúng tôi dự kiến xây <strong>dựng</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> PAN trong 

huyết tương bằng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> HPLC với detector UV-VIS có sử dụng chất nội 

chuẩn phù hợp đáp ứng yêu cầu độ đúng, độ chính xác cao của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> phân 

tích trong dịch sinh học, dễ thực hiện với điều kiện hiện có tại các phòng kiểm 

nghiệm của Việt Nam. 

1.2. TỔNG QUAN VỀ HPLC VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH 

LƯỢNG THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC 

1.2.1. Tổng quan về HPLC 

1.2.1.1. Khái niệm chung 

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự 

phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha 

động lỏng ở áp suất cao. Quá trình sắc ký xảy ra theo cơ chếphân bố [4,5]. 

* Pha tĩnh: 

Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột, là yếu tố quan trọng quyết <strong>định</strong> sự tách 

của hỗn hợp các chất. 

Loại pha tĩnh phổ biến được chế tạo trên nền Silica. Nhóm OH trên bề mặt hạt 

silica phản ứng với dẫn chất clorosilan tạo ra dẫn chất siloxan: 


Ở đây, R có thể là mạch thẳng có 18 hoạc 8 carbon hoặc nhóm hữu cơ khác 

như hydrocarbon thơm... Tính phân cực của pha thay đổi tùy thuộc gốc R [4,5]. 










6 



* Pha động: 

Pha động là dung môi rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký. Yêu cầu của 

pha động: 

- Trơ với pha tĩnh và bền vững theo thời gian. 

- Hòa tan chất cần phân tích. 

- Có độ tinh khiết cao. 

- Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký. 

- Có tính kinh tế và đảm bảo môi trường [5,16]. 

* Phân loại sắc ký: dựa theo độ phân cực của pha động và pha tĩnh mà chia làm 

2 loại: 

- Sắc ký pha thuận: Pha tĩnh phân cực, pha động là dung môi ít phân cực hơn. 

Trong sắc ký pha thuận thì chất ít phân cực nhất được rửa giải đầu tiên. Khi tăng độ 

phân cực của pha động, thời gian lưu giảm dần. 

- Sắc ký pha đảo: Pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực hơn. Trong sắc 

ký pha đảo thì các chất phân cực nhất được rửa giải đầu tiên. Khi tăng độ phân cực 

của pha động thì thời gian lưu tăng dần [4,5]. 

1.2.1.2. Cấu tạo máy HPLC 

Hệ thống HPLC đơn giản, bao gồm các bộ phận chính sau: 

* Hệ thống cấp dung môi: 

Hệ thống cấp dung môi thường bằng thủy tinh, đôi khi bằng thép không gỉ. 

Dung môi chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường dùng màng lọc cỡ 0,45 µm) 

và đuổi khí hòa tan. 

* Bơm: 

Để bơm pha động vào cột sắc ký, bơm này phải điều chỉnh được áp suất 

(thường 0– 400 bar) để đẩy pha động qua hệ thống với một tốc độ dòng ổn <strong>định</strong>, 

phù hợp với quá trình sắc ký. 

* Bộ phận tiêm mẫu: 

Để đưa mẫu phân tích vào cột, có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu bằng 

hệ thống tiêm tự động. 

* Cột sắc ký: 

Quá trình tách các chất diễn ra ở cột. Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ 

với hóa chất, chịu được áp suất cao đến vài trăm bar. Cột sắc ký có nhiều cỡ khác 

nhau tùy thuộc vào mức độ và mục đích của quá trính sắc ký. 

* Detector: 











7 



Là bộ phận phát hiện chất phân tích. Tùy theo bản chất của các chất cần phân 

tích mà sử dụng detector thích hợp bao gồm các loại sau: Detector hấp thụ UV - 

VIS, detector phổ phát xạ nguyên tử, detector huỳnh quang [4,5]. 

1.2.1.3. Một số thông số đặc trưng trong phân tích pic của HPLC 

* Thời gian lưu tR 

Là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến detector. 

Thời gian lưu càng lớn, chất tan càng bị lưu giữ mạnh, thời gian phân tích kéo 

dài. Nếu tR quá nhỏ thì khả năng tách kém [4,5]. 

* Hệ số chọn lọc α 

Đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B, người ta dùng hệ số 

chọn lọc α : 

α = = = 

Qui ước : Chất B là chất bị lưu giữ mạnh hơn chất A nên α >1 

Để tách riêng 2 chất thường chọn 1,05 ≤ α ≤ 2,0 [4,5]. 

* Hệ số đối xứng của pic F 

F = 

Trong đó: W: chiều rộng của pic đo ở 1/20 chiều cao của pic 

a: khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép 

đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic [4,5]. 

* Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N 

Hiệu lực cột được đo bằng thông số số đĩa lý thuyết N của cột: 

Trong đó: W1/2 là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh pic. 

W là chiều rộng của pic đo ở đáy pic [4,5]. 

* Hệ số bất đối AF 

Để đánh giá tính bất đối xứng của pic người ta dùng hệ số bất đối: 

AF = 


Trong đó: b là nửa chiều rộng sau pic đo ở chiều cao bằng 1/10 chiều cao pic 

a là nửa chiều rộng trước pic đo ở chiều cao bằng 1/10 chiều cao 

pic[4,5] 










8 



* Độ phân giải Rs 

Là đại <strong>lượng</strong> đo mức độ tách của hai chất trên một cột sắc ký (ví dụ A và B) 

Trong đó: 

Rs = 

t(R)A; t(R)B 

WA; WB 

hoặc 

: thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (A và B). 

: độ rộng pic đo ở các đáy pic. 

W1/2A; W1/2B: độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic. 

Yêu cầu: RS > 1; giá trị tối ưu Rs = 1,5 [4,5]. 

1.2.1.4. Một số <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> bằng HPLC 

Tất cả các <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng 

độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic. Có 4 <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> 

thường được sử dụng trong sắc ký: <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> chuẩn ngoại, <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> chuẩn 

nội, <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> thêm chuẩn và <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> chuẩn hóa diện tích. 

Do đặc điểm của nền mẫu huyết tương có chứa nhiều thành phần khác nhau 

nên các <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> hoạt chất trong huyết tương thường có giai đoạn 

xử lý chiết tách hoạt chất, loại bỏ các yếu tố ảnh hưởng nên gây ra rất nhiều sai số. 

Hiện nay, <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> chuẩn nội được sử dụng nhiều nhất để <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> thuốc 

trong huyết tương do <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> này có thể hạn chế được các sai số vừa nêu trên 

và các sai số gây ra do máy móc và kỹ thuật. 

Phương <strong>pháp</strong> chuẩn nội: 

* Nguyên tắc: thêm vào cả mẫu chuẩn và mẫu thử <strong>lượng</strong> bằng nhau của một 

chất tinh khiết rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Chất được thêm này gọi là 

nội chuẩn. 

* Yêu cầu với chất nội chuẩn: 

- Trong cùng điều kiện sắc ký, chất nội chuẩn phải được tách hoàn toàn và có 

thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử. 

- Có cấu trúc hóa học tương tự chất thử. 

- Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ chất thử. 

- Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử. 

- Phải có độ tinh khiết cao và dễ kiếm. 

* Phương <strong>pháp</strong> chuẩn hóa nhiều điểm: 

Chuẩn bị một dãy chuẩn có chứa <strong>lượng</strong> chất chuẩn khác nhau nhưng cùng 

chứa một <strong>lượng</strong> nội chuẩn. Tiến hành sắc ký và ghi lại đáp ứng pic, từ đó vẽ đường 











9 



chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa tỷ số diện tích (chiều cao) pic của chuẩn trên 

nội chuẩn với tỷ số nồng độ chuẩn trên nội chuẩn. Song song tiến hành sắc ký mẫu 

thử cũng được thêm chuẩn với <strong>lượng</strong> như trên. Tính tỷ số diện tích ( chiều cao ) pic 

của chất thử trên diện tích ( chiều cao ) pic của chất nội chuẩn rồi dựa vào đường 

chuẩn tìm nồng độ của chất thử [4,5]. 

1.2.2. Thẩm <strong>định</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> thuốc trong dịch sinh học 

1.2.2.1. Khái niệm 

Thẩm <strong>định</strong> một <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> phân tích dược chất trong dịch sinh học là quá 

trình xác <strong>định</strong> bằng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc điểm đặc trưng 

của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> để đảm bảo <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> đó đạt yêu cầu khi ứng dụng phân tích 

thực tế. 

1.2.2.2. Một số <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> chiết tách thường dùng cho <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> thuốc trong 

dịch sinh học 

Do dịch sinh học chứa nhiều thành phần khác nhau nên khác với <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> 

các dạng bào chế hay <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> nguyên liệu, <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> dược chất trong dịch sinh 

học thì khâu xử lý mẫu đóng vai trò rất quan trọng, nó có tính quyết <strong>định</strong> đến kết 

quả phân tích. Hiện nay thường áp dụng 3 <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> chính để xử lí mẫu huyết 

tương là : 

- Phương <strong>pháp</strong> chiết pha rắn: là quá trình tách chất phân tích từ mẫu bằng chất 

rắn, sau đó rửa giải bằng dung môi thích hợp. 

- Phương <strong>pháp</strong> kết tủa protein: là quá trình loại protein trong mẫu bằng tác 

nhân gây tủa protein như acid mạnh (percloric, tricloracetic, trifluoracetic) hoặc 

dung môi (MeOH, MeCN). 

- Phương <strong>pháp</strong> chiết lỏng - lỏng: là kỹ thuật chuyển chất phân tích hòa tan 

trong một dung môi sang dung môi thứ hai không hòa tan trong dung môi thứ nhất. 

1.2.2.3. Nội dung thẩm <strong>định</strong> 

* Tính chọn lọc – đặc hiệu 

Độ chọn lọc hay tính đặc hiệu thể hiện khả năng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> phân tích có thể 

xác <strong>định</strong> (<strong>định</strong> tính - <strong>định</strong> <strong>lượng</strong>) chất cần phân tích, không bị nhầm lẫn bởi các 

thành phần khác có trong mẫu thử như các chất nội sinh, chuyển hóa, sản phẩm 

phân hủy hay các thuốc uống cùng [7,8,13,15]. 

* Đường chuẩn và khoảng tuyến tính 

Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng của pic (diện tích hay chiều 

cao) và nồng độ thuốc trong dịch sinh học. Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ 











10 



thấp nhất đến cao nhất trong đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính. Đường chuẩn phải 

gồm ít nhất 6 nồng độ chất chuẩn pha trên cùng một mẫu dịch sinh học [7,8,13,15]. 

* Giới hạn <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> dưới ( LLOQ) 

Mẫu chuẩn có nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn (1/30-1/10 Cmax) thường 

được chấp nhận là LLOQ [7,8,13,15]. 

* Độ đúng 

Độ đúng: giá trị phản ánh độ sát gần của kết quả phân tích với giá trị thực của 

mẫu đã biết [7,8,13,15]. 

* Độ chính xác 

Độ chính xác: là độ chụm giữa các kết quả riêng biệt khi lặp lại quy trình phân 

tích nhiều lần trên cùng một mẫu thử đồng nhất, được biểu thị bằng giá trị CV 

(%)[7,8,13,15]. 

* Tỷ lệ thu hồi 

Tỷ lệ thu hồi là tỷ lệ hoạt chất thu được sau khi mẫu được chiết tách theo qui 

trình đã chọn so với mẫu có cùng nồng độ không qua chiết tách, được pha trong 

dung môi phù hợp [7,8,13,15]. 

* Độ ổn <strong>định</strong> 

Độ ổn <strong>định</strong> của mẫu phân tích trong dịch sinh học cần được đánh giá 

trong quá trình xử lý và bảo quản mẫu. Mẫu phân tích phải đảm bảo ổn <strong>định</strong> trong 

thời gian dự kiến đủ cho phân tích hết mẫu thử. 

Đánh giá độ ổn <strong>định</strong> gồm: 

- Độ ổn <strong>định</strong> của dung dịch nội chuẩn gốc và dung dịch gốc: Độ ổn <strong>định</strong> thời 

gian ngắn ở nhiệt độ phòng, độ ổn <strong>định</strong> thời gian dài. 

- Độ ổn <strong>định</strong> của dung dịch làm việc: Độ ổn <strong>định</strong> thời gian ngắn ở nhiệt độ 

phòng, độ ổn <strong>định</strong> thời gian dài. 

- Độ ổn <strong>định</strong> của mẫu dịch huyết tương: sau 3 chu kỳ đông - rã, ở nhiệt 

độ phòng trong thời gian ngắn, trong thời gian dài, sau xử lý [7,8,13,15]. 











11 

CHƯƠNG 2 : PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 



2.1. ĐIỀU KIỆN THỰC NGHIỆM 

2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất, dung môi 

Các hóa chất, dung môi, mẫu huyết tương trắng dùng trong nghiên cứu được 

trình bày ở bảng 2.1, bảng 2.2, bảng 2.3. 

Bảng 2.1: Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu 

Tên Nơi sản xuất Số kiểm soát Hàm <strong>lượng</strong> 

<strong>Pantoprazol</strong> VKNT TP HCM QT219011212 93,87% 

<strong>Pantoprazol</strong> natri VKNTTW 0114306.01 93,72% 

Lansoprazol VKNTTW WS. 0106203 99,5% 

Bảng 2.2: Các hóa chất dùng trong nghiên cứu 

Hóa chất Độ tinh khiết Nơi sản xuất 

Acetonitril HPLC Merck, Đức 

Methanol HPLC Merck, Đức 

Dikali hydrophosphat P.A Merck, Đức 

Tertbutyl methyl ether P.A Merck, Đức 

Triethyelamin P.A Merck, Đức 











12 

Bảng 2.3: Các mẫu huyết tương trắng trong nghiên cứu 



Mẫu Lô Nơi cung cấp Bảo quản 

01 13PN00493 Viện huyết học – truyền máu TW -35 o C ± 5 o C 






07 15P006178 Viện huyết học – truyền máu TW -35 o C ± 5 o C 

2.1.2. Dụng cụ, thiết bị 

Các máy móc, thiết bị dùng trong nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.4. 

Thiết bị 

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao 

Cân phân tích 

Máy ly tâm lạnh 

Tủ lạnh sâu -35 o C ± 5 o C 

Tủ lạnh bảo quản chất chuẩn 

Thiết bị lọc nước 

Máy lắc xoáy 

Máy lắc cơ học 

Micropipet 

Đầu típ cho micropipet 

Ống chiết thủy tinh 15 mL 

Bình <strong>định</strong> mức, pipet class A 

Bảng 2.4: Các thiết bị dùng trong nghiên cứu 

Shimadzu, Nhật 

Nhà sản xuất 

Sartorius-CP224S, Đức 

Sartorius Sigma 2 – 16K, Đức 

Sanyo MDF – 236, Nhật 

Haier, Trung Quốc 

TKA, Đức 

Velp, Ý 

GFL, Đức 

Eppendorf, Đức 

Isolab, Đức 


SUPELCO, Đức 

Prolabo, Pháp 










13 



Hệ thống máy sắc ký lỏng HPLC - Shimadzu gồm: Interface CBM - 2A; bơm 

cao áp LC - 20AT; bộ phận tiêm mẫu tự động SIL - 20AC; Detector DAD SPD - 

M20A; buồng ổn nhiệt cột CTO - 20A; phần mềm điều khiển và xử lý kết quả LC 

Solution Shimadzu. 

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 

- <strong>Xây</strong> <strong>dựng</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> pantoprazol trong huyết tương bằng 

HPLC: lựa chọn <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> xử lí mẫu, điều kiện sắc ký, lựa chọn nội chuẩn cho 

phép <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> PAN trong mẫu với độ chính xác thích hợp. 

- Thẩm <strong>định</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> về các chỉ tiêu: Tính chọn lọc - đặc hiệu, đường 

chuẩn và khoảng tuyến tính, giới hạn <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> dưới, độ đúng, độ chính xác, hiệu 

suất chiết, độ ổn <strong>định</strong>. 

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 

2.3.1. Chuẩn bị các mẫu huyết tương tự tạo 

2.3.1.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc, nội chuẩn gốc 

- Dung dịch chuẩn gốc: hòa tan chất chuẩn PAN trong methanol (MeOH) để 

thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ PAN chính xác khoảng 1000 µg/mL. 

- Dung dịch nội chuẩn gốc: hòa tan chất chuẩn lansoprazol trong MeOH để thu 

được dung dịch nội chuẩn gốc có nồng độ khoảng 1 mg/mL. 

2.3.1.2. Chuẩn bị mẫu đường chuẩn 

- Từ dung dịch chuẩn gốc trong MeOH, chuẩn bị 2 dung dịch chuẩn làm việc 

trong huyết tương (CC1 và CC2) có nồng độ PAN lần lượt khoảng 4000 ng/mL và 

1000 ng/mL. 

- Từ dung dịch nội chuẩn gốc, chuẩn bị dung dịch nội chuẩn làm việc trong 

hỗn hợp MeOH : H2O (1:1) có nồng độ chính xác khoảng 20 µg/mL. 

Đường chuẩn bao gồm: 01 mẫu huyết tương trắng (blank), 01 mẫu huyết 

tương trắng có pha nội chuẩn (zero) và 08 mẫu huyết tương có pha chuẩn PAN và 

IS. Tiến hành pha loãng CC1 VÀ CC2 với huyết tương trắng để thu được các mẫu 

chuẩn có nồng độ từ 30 – 4000 ng/mL như ở bảng 2.5. 











14 

Bảng 2.5: Chuẩn bị đường chuẩn 



Mẫu Nồng độ (ng/mL) VHTtrắng (L) VCC1 (L) VCC2 (L) 

Blank - 1000 - - 

Zero - 1000 - - 

S1 30 970 - 30 

S2 100 900 - 100 

S3 500 500 - 500 

S4 1000 0 - 1000 

S5 2000 500 500 - 

S6 2500 375 625 - 

S7 3000 250 750 - 

S8 4000 - 1000 - 

2.3.1.3. Chuẩn bị mẫu kiểm tra 

Chuẩn bị một dung dịch chuẩn gốc khác có nồng độ PAN chính xác khoảng 

1000 µg/mL. Từ dung dịch chuẩn gốc, chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc (QC1, 

QC2) trong huyết tương có nồng độ PAN chính xác khoảng 4000 ng/mL và 1000 

ng/mL. 

Tiến hành pha loãng QC1 và QC2 với huyết tương trắng để thu được các mẫu 

LQC (90 ng/mL), MQC (1800 ng/mL), HQC (3500 ng/mL) như ở bảng 2.6. 

Bảng 2.6: Chuẩn bị mẫu kiểm tra 

Ký hiệu LQC MQC HQC 

Nồng độ (ng/mL) 90 1800 3500 

VHT trắng (µL) 910 550 125 

VQC1 (µL) - 450 875 

VQC2 (µL) 90 - - 

2.3.2. <strong>Xây</strong> <strong>dựng</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> phân tích 

2.3.2.1. Xác <strong>định</strong> điều kiện sắc ký 

Khảo sát <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> phân tích trên hệ thống máy sắc ký lỏng HPLC - 

Shimadzu detector UV-VIS, với các điều kiện sắc ký khác nhau như: 











15 



- Lựa chọn bước sóng phát hiện 

- Lựa chọn cột sắc ký 

- Lựa chọn pha động 

- Lựa chọn tốc độ dòng 

- Lựa chọn chất nội chuẩn 

Từ kết quả khảo sát, lựa chọn những điều kiện sắc ký thích hợp để có thể tiến 

hành <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> PAN trong huyết tương bằng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> HPLC với detector 

DAD. 

2.3.2.2. <strong>Xây</strong> <strong>dựng</strong> quy trình xử lý mẫu huyết tương 

Dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> xử lí mẫu, 

chiết tách PAN từ huyết tương trên các mẫu chuẩn PAN hòa tan trong huyết tương 

trắng bằng các <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> như: 

- Tủa protein với các tác nhân gây tủa là các dung môi hữu cơ như: MeOH, 

MeCN, acid perclorid 

- Chiết lỏng - lỏng với các dung môi khác nhau: chloroform, tert butyl methyl 

ether. 

2.3.3. Thẩm <strong>định</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> phân tích 

2.3.3.1. Tính đặc hiệu - chọn lọc 

Tiến hành phân tích sắc ký các mẫu: Huyết tương trắng với 6 mẫu có nguồn 

gốc khác nhau và huyết tương trắng có pha chuẩn PAN ở nồng độ 30 ng/mL và IS. 

So sánh các sắc ký đồ thu được từ việc phân tích các mẫu trên. 

Phương <strong>pháp</strong> đạt yêu cầu khi thỏa mãn điều kiện sau: 

- Pic của chất phân tích và IS phải đảm bảo được nhận diện rõ ràng, tách hoàn 

toàn khỏi các pic tạp có trong mẫu ( hệ số bất đối ~ 1; độ phân giải (Rs) giữa pic của 

chất phân tích, pic IS với pic gần nhất phải lớn hơn 1,5). 

- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng pic của 

từng mẫu phải gấp ít nhất 5 lần đáp ứng pic của mẫu trắng tương ứng. 

- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS, đáp ứng pic của từng mẫu phải 

gấp ít nhất 20 lần đáp ứng pic của mẫu trắng tương ứng [7,8,13,15]. 

2.3.3.2. Đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính 

Pha loãng dung dịch chuẩn làm việc với huyết tương trắng để được các dung 

dịch có nồng độ như sau: 30 - 100 - 500 - 1000 - 2000 - 2500 - 3000 - 4000 ng/mL. 











16 



Tiến hành phân tích các mẫu, mỗi nồng độ phân tích 5 lần. Từ đáp ứng pic của 

các chất tại các nồng độ, xác <strong>định</strong> tương quan giữa đáp ứng pic với nồng độ đã pha. 

<strong>Xây</strong> <strong>dựng</strong> <strong>phương</strong> trình hồi quy và xác <strong>định</strong> hệ số tương quan r. Từ <strong>phương</strong> trình 

hồi quy đã xây <strong>dựng</strong>, tính lại nồng độ của từng mẫu, xác <strong>định</strong> độ đúng của mỗi 

nồng độ. 


- Độ đúng so với giá trị thực của các nồng độ phải từ 85% - 115%, trừ tại điểm 

LLOQ được chấp nhận 80% - 120%. 

- Có ít nhất 75% số điểm trong dãy chuẩn đạt được tiêu chuẩn trên, trong đó 

LLOQ và ULOQ phải đạt tiêu chuẩn. 

- Khoảng tuyến tính: có hệ số tương quan r ≥ 0,98 [7,8,13,15]. 

2.3.3.3. Giới hạn <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> dưới 

Tiến hành khảo sát mẫu chuẩn PAN ở nồng độ khoảng 30 ng/mL. Dựa theo 

đường chuẩn pha trong huyết tương trắng tiến hành trong cùng điều kiện, tính lại 

nồng độ của các mẫu vừa khảo sát. 

sau: 

Nồng độ chuẩn thấp nhất được chấp nhận là LLOQ nếu thoả mãn điều kiện 

- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng pic trung 

bình của mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 5 lần đáp ứng pic trung bình của mẫu trắng. 

- Độ đúng của từng mẫu phải đạt từ 80% - 120% so với nồng độ thực. 

- Độ chính xác CV ≤ 20% [7,8,13,15]. 

2.3.3.4. Độ đúng 

Chuẩn bị các mẫu QC trong huyết tương có nồng độ theo bảng 2.6. 

Chuẩn bị một đường chuẩn trong cùng điều kiện. Phân tích các mẫu theo 

<strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> cần đánh giá. Ghi lại sắc ký đồ và đáp ứng pic. Tính lại nồng độ 

các mẫu QC theo đường chuẩn. Xác <strong>định</strong> độ đúng của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> bằng cách so 

sánh nồng độ phân tích được so với nồng độ thực đã pha. 

Phương <strong>pháp</strong> đạt yêu cầu khi thỏa mãn điều kiện sau: Độ đúng trung bình của 

từng lô mẫu phải nằm trong khoảng 85% - 115% nồng độ thực đã pha 

[7,8,13,15]. 

2.3.3.5. Độ lặp lại trong ngày và giữa các ngày( độ chính xác) 

Chuẩn bị các lô mẫu QC tương tự như ở mục xác <strong>định</strong> độ đúng. Xác <strong>định</strong> kết 

quả <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> các mẫu QC theo đường chuẩn tiến hành trong cùng điều kiện. 











17 



Xác <strong>định</strong> độ lặp lại trong ngày bằng cách tính toán độ lệch CV giữa giá trị các 

lần <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> của mỗi nồng độ được phân tích trong cùng một ngày. 

Xác <strong>định</strong> độ lặp lại giữa các ngày bằng cách tính toán độ lệch CV giữa giá trị 

các lần <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> của mỗi nồng độ được phân tích trong ít nhất 3 ngày khác nhau. 

Phương <strong>pháp</strong> đạt yêu cầu khi thỏa mãn điều kiện sau: Độ lặp lại giữa các nồng 

độ phân tích được của mỗi lô mẫu có giá trị CV ≤ 15% [7,8,13,15]. 

2.3.3.6. Tỷ lệ thu hồi 

Tiến hành sắc ký các lô mẫu QC bao gồm LQC, MQC, HQC trong dịch sinh 

học, mỗi lô mẫu gồm ít nhất 6 mẫu độc lập. Song song tiến hành sắc ký các lô mẫu 

QC trong pha động (phân tích <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> trực tiếp không qua giai đoạn chiết tách). 

Tỷ lệ thu hồi của nội chuẩn được xác <strong>định</strong> bằng cách so sánh đáp ứng của 

PAN và IS trong các mẫu QC pha trong dịch sinh học (có qua chiết tách) với đáp 

ứng của PAN và IS trong các mẫu QC pha trong pha động (không qua chiết tách). 


- Tỷ lệ thu hồi tại các nồng độ khác nhau không được quá 15%. 

- Giá trị CV giữa các đáp ứng của chất phân tích và IS trong các mẫu QC có 

qua chiết tách ở mỗi nồng độ phải ≤ 15%. 

- Giá trị CV giữa các đáp ứng của chất phân tích và IS trong các mẫu QC 

không qua chiết tách ở mỗi nồng độ phải ≤ 5% [7,8,13,15]. 

2.3.3.7. Độ ổn <strong>định</strong> 

Độ ổn <strong>định</strong> dung dịch nội chuẩn làm việc thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng 

Chuẩn bị dung dịch nội chuẩn làm việc và bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 

một thời gian nhất <strong>định</strong> (khoảng 5 giờ). Phân tích, so sánh nồng độ của dung 

dịch nội chuẩn sau bảo quản với nồng độ của dung dịch mới pha tương ứng. 

Nồng độ dung dịch sau bảo quản phải sai khác với nồng độ dung dịch mới pha 

không quá 2%. 

Độ ổn <strong>định</strong> dung dịch chuẩn gốc dài ngày 

Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc và bảo quản ở nhiệt độ 2 o C - 8 o C trong một 

thời gian nhất <strong>định</strong> (khoảng 6 ngày). Phân tích, so sánh nồng độ của dung dịch 

chuẩn PAN gốc sau khi bảo quản ở nhiệt độ 2 o C - 8 o C những khoảng thời gian 

nhất <strong>định</strong> (khoảng 6 ngày) với nồng độ của dung dịch mới pha tương ứng. 

Nồng độ dung dịch sau bảo quản phải sai khác với nồng độ dung dịch mới pha 

không quá 2%. 











18 



Độ ổn <strong>định</strong> của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông - rã 

Khảo sát độ ổn <strong>định</strong> sau ba chu kỳ đông - rã thực hiện trên 2 nồng độ LQC và 

HQC. Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -35 o C ± 5 o C và để rã đông ở nhiệt độ phòng. Sau 

khi tan chảy hoàn toàn, để mẫu trở lại đông lạnh trong 12-24 giờ. Lặp lại chu kì 

đông - rã 2 lần nữa. Sau 3 chu kỳ đông - rã, tiến hành phân tích xác <strong>định</strong> nồng độ 

PAN có trong mẫu. So sánh với kết quả xác <strong>định</strong> nồng độ PAN có trong các mẫu 

tiến hành phân tích ngay sau khi pha (nồng độ ban đầu). 

Nồng độ PAN trong mẫu sau 3 chu kỳ đông - rã phải sai khác với nồng độ ban 

đầu không quá 15% và giá trị CV giữa các kết quả <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> ở mỗi nồng độ phải 

nhỏ hơn hoặc bằng 15%. 

Độ ổn <strong>định</strong> của mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn 

Phân tích mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC sau khi đã rã đông và để 

ở nhiệt độ phòng một thời gian nhất <strong>định</strong> (khoảng 5 giờ), so sánh với nồng độ mẫu 

được xử lý ngay sau khi rã đông. 

Nồng độ PAN trong mẫu được xử lý sau khi bảo quản một thời gian nhất <strong>định</strong> 

ở nhiệt độ phòng phải sai khác với nồng độ mẫu xử lý ngay không quá 15% và giá 

trị CV giữa các kết quả <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%. 

* Độ ổn <strong>định</strong> của mẫu huyết tương thời gian dài 

Bảo quản mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC ở nhiệt độ -35 o C ± 

5 o C, phân tích mẫu tại thời điểm ban đầu và sau từng khoảng thời gian bảo 

quản nhất <strong>định</strong> khoảng sau 30, 53, 68 ngày. So sánh nồng độ của mẫu huyết 

tương sau khi bảo quản với nồng độ của mẫu tại thời điểm ban đầu. 

Nồng độ PAN trong mẫu sau khi bảo quản một thời gian nhất <strong>định</strong> phải sai 

khác với nồng độ ban đầu không quá 15% và giá trị CV giữa các kết quả <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> 

ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%. 

Độ ổn <strong>định</strong> của mẫu sau xử lý (trong auto-sampler) 

So sánh nồng độ của mẫu ở nồng độ LQC và HQC bảo quản trong autosampler 

sau một thời gian xác <strong>định</strong> (khoảng 25 giờ) và nồng độ của mẫu tiêm ngay 

sau xử lý. 

Nồng độ mẫu sau khi bảo quản một thời gian xác <strong>định</strong> trong auto-sampler sai 

khác với nồng độ mẫu tiêm ngay không quá 15% và giá trị CV giữa các kết quả 

<strong>định</strong> <strong>lượng</strong> ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%. 











19 



2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ KẾT QUẢ 

- Giá trị trung bình, độ đúng, độ lệch chuẩn tương đối, <strong>phương</strong> trình hồi quy, 

hệ số tương quan hồi quy xác <strong>định</strong> bằng phần mềm Microsoft Excel 2010. 

- Nồng độ của PAN trong huyết tương được xác <strong>định</strong> dựa vào <strong>phương</strong> trình 

hồi quy biểu diễn mối tương quan giữa tỉ lệ diện tích pic và nồng độ của mỗi chất 

được xây <strong>dựng</strong> trong mỗi ngày phân tích. 











20 



CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT 

3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 

3.1.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký và nội chuẩn 

3.1.1.1. Khảo sát bước sóng hấp thụ 

Quét phổ hấp thụ của mẫu chuẩn PAN dung dịch trong MeOH, ta được phổ 

của PAN như hình 3.1 sau: 

mAU 

200 5.11/ 1.00 

175 

150 

125 

100 

75 

50 

25 

0 

201 

250 

291 

362 

200 300 400 500 600 700 nm 

Hình 3.1.Phổ hấp thụ UV-VIS của PAN 

Trên phổ UV, PAN có 2 cực đại hấp thụ ở các bước sóng λ = 201 nm và 291 

nm. Trong hai cực đại, PAN có độ hấp thu cao hơn ở bước sóng λ = 201 nm. Tuy 

nhiên, đây là vùng bước sóng ngắn, cực đại hấp thụ không đặc trưng cho hoạt chất, 

có nhiều chất kể cả một số dung môi hữu cơ như MeOH cũng hấp thụ mạnh ánh 

sánh tử ngoại. Do vậy, kết quả phân tích độ hấp thụ UV của hoạt chất có thể bị ảnh 

hưởng và trên SKĐ cũng sẽ xuất hiện nhiều pic tạp, đường nền không “phẳng” ảnh 

hưởng đến kết quả tích phân xác <strong>định</strong> diện tích hay chiều cao của pic. Kết hợp tham 

khảo một số tài liệu về <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> PAN và điều kiện phòng thí 


518 

556 

608 

645 

740 

784 










21 



nghiệm, chúng tôi lựa chọn bước sóng phù hợp tiến hành chạy sắc ký là λ = 291± 2 

nm. 

3.1.1.2. Lựa chọn nội chuẩn 

Chất được lựa chọn làm nội chuẩn cần có cấu trúc và tính chất vật lý gần 

giống với chất phân tích. Dựa trên cấu trúc phân tử và tính chất hóa lý của chất phân 

tích và các chuẩn sẵn có ở phòng thí nghiệm chúng tôi khảo sát một số chất làm nội 

chuẩn như: omeprazol, rabeprazol, lansoprazol. 

Sau đây là các sắc ký đồ thu được trong quá trình khảo sát IS: 

Hình 3.2: SKĐ PAN và omeprazol 




Hình 3.3: SKĐ PAN và rabeprazol 








22 



70 mAU 

290nm,4nm (1.00) 

60 

50 

40 

30 

20 

10 

0 

-10 

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min 

Hình 3.4: SKĐ PAN và lansoprazol 

Với nội chuẩn là omeprazol và rabeprazol ta thu được sắc ký đồ có thời gian 

lưu của chất phân tích và nội chuẩn gần nhau làm cho sắc ký đồ chồng lên nhau 

không tách ra được nên việc <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> PAN với nội chuẩn omeprazol và 

rabeprazol sẽ gây khó khăn trong quá trình <strong>định</strong> <strong>lượng</strong>. 

Với nội chuẩn là lansoprazol, ta thấy thời gian chạy sắc ký phù hợp(nhỏ hơn 

10 phút), pic chất phân tích và nội chuẩn tách nhau rõ ràng. Do đó ta lựa chọn 

lansoprazol làm chất nội chuẩn cho việc <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> PAN trong huyết tương. 

3.1.1.3. Lựa chọn cột sắc ký 

Do PAN là chất ít phân cực nên nếu tiến hành sắc ký pha thuận sẽ làm thời 

gian chạy sắc ký kéo dài gây khó khăn cho quá trình phân tích. 

Tiến hành phân tích trên hệ sắc ký pha đảo: chất phân tích ít phân cực và pha 

động phân cực. Trong pha đảo, sử dụng hai loại cột chủ yếu là cột C8 và C18. Tuy 

nhiên, trong điều kiện phòng thí nghiệm của chúng tôi chỉ có cột C18 nên chúng tôi 

lựa chọn sử dụng cột C18. Ta tiến hành khảo sát cột C18 với các độ dài cột khác 

nhau: 100 mm, 150 mm, 250 mm. Với loại cột dài 100 mm, 150 mm, do chiều dài 

cột ngắn nên khi phân tích mẫu, pic chất phân tích và nội chuẩn không tách nhau 

hoàn toàn (Rs < 1,5). 

Kết hợp tham khảo một số tài liệu <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> PAN trong dịch sinh học, chúng 

tôi tiến hành khảo sát trên cột sắc ký Rp18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) với bảo vệ cột 

Rp18 (4 x 3 mm; 5µm) kết quả thực nghiệm thấy cột Rp18 có khả năng tách tốt và 

chọn lọc PAN ra khỏi mẫu phân tích (hình 3.4). 


<strong>Pantoprazol</strong>/5.430 

IS/8.796 










23 



3.1.1.4. Lựa chọn pha động và tốc độ dòng 

- Tiến hành khảo sát pH của hệ đệm: do PAN có 2 pKa lần lượt là 9,15 và 

3,55 nằm ở hai vùng pH acid và base nên chúng tôi chỉ tiến hành khảo sát pH nằm 

trong vùng pH trung tính. Trong vùng pH trung tính chúng tôi khảo sát các pH từ 

7,0 đến 7,5. Từ kết quả thực nghiệm, chúng tôi chọn pH hệ đệm phosphat 0,01M là 

7,3 cho quy trình <strong>định</strong> lương PAN trong huyết tương. 

- Tiến hành khảo sát với pha động MeCN: đệm phosphat 0,01M pH 7,3 với 

các tỉ lệ khác nhau: ta thấy khi giảm tỉ lệ MeCN sẽ làm cho thời gian lưu của chất 

phân tích bị kéo dài hơn, gây kéo dài quá trình phân tích. Để đảm bảo phù hợp với 

quy trình phân tích ta lựa chọn tỉ lệ pha động MeCN : đệm phosphat 0,01M pH 7,3 

(36 :64) . 

- Khảo sát hệ pha động MeCN : đệm phosphat 0,01M pH 7,3 (36 : 64) với tốc 

độ dòng là 1,3 mL/phút và 1,5 mL/phút, kết quả sắc ký cho thấy ở tốc độ dòng 1,5 

mL/phút, thời gian lưu tương ứng của chuẩn và nội chuẩn lần lượt là 5,5 và 8,8 

phút, pic cân xứng, đáp ứng tốt. Do đó, chúng tôi lựa chọn tốc độ dòng của hệ sắc 

ký là 1,5 mL/phút. 

Sau đây là một số sắc ký đồ thu được từ quá trình khảo sát: 

Hình 3.5: SKĐ của PAN và IS với 

pha động MECN: đệm tỷ lệ 30:70 

Hình 3.6: SKĐ của PAN và IS với pha 

động MECN: đệm tỷ lệ 36:64 











24 



60 

50 

40 

30 

20 

10 

0 

mAU 

290nm,4nm (1.00) 

-10 

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min 

Hình 3.7: SKĐ của PAN và IS trong 

pha động MeCN: đệm phosphat (36:64) 

với tốc độ dòng 1,3 mL 


IS/9.210 

mAU 

290nm,4nm (1.00) 

35 

30 

25 

20 

15 

10 

5 

0 

-5 

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min 

Hình 3.8: SKĐ của PAN và IS trong pha 

động MeCN: đệm phosphat (36:64) với 

tốc độ dòng 1,5 mL 

Như vậy, để tách hoàn toàn và chọn lọc PAN và IS ra khỏi mẫu phân tích đồng 

thời đảm bảo thời gian phân tích một mẫu không quá dài chúng tôi thấy hệ pha 

động MeCN - đệm phosphat 0,01M pH 7,3 với tỷ lệ 36:64 (v/v) cùng với tốc độ 

dòng 1,5 ml/phút là phù hợp. 

3.1.2. Khảo sát và tìm điều kiện xử lý mẫu chứa pantoprazol 

- Phương <strong>pháp</strong> tủa protein: PAN có tính thân dầu ( log P = 2,18) nên mặc dù 

việc chiết mẫu bằng tủa protein tiến hành đơn giản nhưng rất khó thu được chất cần 

phân tích nên chúng tôi không sử dụng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> này. 

- Phương <strong>pháp</strong> chiết pha rắn (SPE): <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> này có ưu điểm là khá chọn 

lọc với chất phân tích, thích hợp với việc phân tích <strong>lượng</strong> mẫu nhỏ, thao tác đơn 

giản, dễ thực hiện so với các <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> khác. Tuy nhiên, <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> này gây 

tốn kém về mặt kinh tế và chưa có sẵn ở các phòng thí nghiệm ở nước ta nên chưa 

được áp dụng rộng rãi. 

- Phương <strong>pháp</strong> chiết lỏng - lỏng: <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> phù hợp với điều kiện các 

phòng thí nghiệm nước ta, mẫu xử lí sạch, ít tạp nên được áp dụng phổ biến trong 

xử lí mẫu.Ta tiến hành xử lí mẫu: chiết bằng các dung môi khác nhau theo qui trình 

xử lý mẫu như sau: 



IS/8.825 










25 



7 mL dung môi chiết (*) 

Lắc cơ học, ly tâm 

Lắc 

Cô bằng khí N2 ở 37 0 C 

0,5 – 1 mL pha động 

Hình 3.9: Quy trình xử lý mẫu 

- Với dung môi chiết là chloroform: Do chloroform dễ tạo thành nhũ tương nên 

mẫu sau khi chiết có khá nhiều tạp. Ngoài ra, chloroform nặng hơn nước nên lớp 

dung môi nằm ở bên dưới gây khó khăn cho quá trình hút mẫu. 

- Với dung môi chiết là TBME : mẫu chiết tốt, tiến hành đơn giản. Dựa vào 

thực nghiệm tiến hành, xử lý mẫu với dung môi TBME, đáp ứng pic lớn, pic thu 

được cân đối, tách nhau hoàn toàn nên ta lưa chọn <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> chiết lỏng- lỏng với 

dung môi TBME để xử lý mẫu. 

1 mL mẫu huyết tương 

Ly tâm 3000 vòng/phút x 5 phút 

(*) Dung môi chiết: 

1. Chloroform 

2. TBME 

Hút 5 mL lớp dung môi 

Cắn 

Lắc xoáy 1 phút và tiêm sắc ký 

Sắc ký đồ chuẩn PAN và IS trong huyết tương được chiết bằng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> 

chiết lỏng - lỏng với dung môi TBME được trình bày ở hình 3.10 sau: 











26 



70 mAU 

290nm,4nm (1.00) 

60 

50 

40 

30 

20 

10 

0 

-10 

0.0 2.5 5.0 7.5 min 

Hình 3.10: SKĐ mẫu chuẩn PAN (4000 ng/ml) và IS 

3.1.3. Qui trình phân tích pantoprazol trong huyết tương 


Từ kết quả thực nghiệm, chúng tôi đã lựa chọn được qui trình xử lý mẫu và 

điều kiện sắc ký có thể tách được PAN khỏi các pic tạp có trong mẫu huyết tương 

như sau: 

Quy trình xử lý mẫu: 

- Mẫu huyết tương để rã đông ở nhiệt độ phòng. 

- Ngay sau khi rã đông, lấy 1,0 mL huyết tương và 100 L dung dịch IS , 

lắc xoáy 15 giây. 

- Thêm 7 ml TBME, lắc cơ học ngang 5 phút. 

- Ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút. 

- Hút 5ml lớp dịch trên, cô N2 37 ° C. 

- Hoà tan cắn trong 0,5 ml pha động, lắc xoáy 60 giây, tiêm sắc ký. 

* Điều kiện sắc ký: 

- Thiết bị : HPLC, Shimadzu. 

- Cột sắc ký: Rp18; 250 x 4,6 mm; 5 µm. 

- Bảo vệ cột: Rp18; 4 x 3 mm; 5µm. 

- Nhiệt độ cột: 40 o C, nhiệt độ autosampler: 4 0 C 

- Pha động: Đệm phosphat 0,01M pH 7,3 - MeCN (64:36). 

- Tốc độ dòng: 1,5 mL/phút, thể tích tiêm: 50 µL 

- Bước sóng phát hiện: 290 nm. 


IS/8.796 










27 



3.2. KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 

3.2.1. Tính chọn lọc - đặc hiệu 

Tiến hành như mục 2.3.3.1, xử lý mẫu và phân tích với điều kiện sắc ký như 

mục 3.1.3. Kết quả thu được như sau: 

Hình 3.11: SKĐ mẫu huyết tương trắng. 

Hình 3.13: SKĐ mẫu huyết tương trắng 

chứa PAN 


có chứa IS. 


chứa IS và PAN nồng độ 30 ng/ml. 

Nhận xét: Từ sắc ký đồ : 

- Hình 3.11: ta thấy trong khoảng thời gian từ 5 – 9 phút trong mẫu huyết 

tương trắng không thấy xuất hiện pic. 











28 



- Hình 3.14: ta thấy mẫu PAN chuẩn nồng độ 30 ng/mL trong huyết tương 

trắng xuất hiện 1 pic có thời gian lưu khoảng 5,7 phút và mẫu IS trong huyết tương 

trắng xuất hiện 1 pic có thời gian lưu khoảng 8,4 phút 

Pic PAN trên sắc ký đồ cân đối, rõ nét, có thời gian lưu khoảng 5,7 phút và 

tách riêng biệt với IS và các thành phần tạp có trong mẫu. Phương <strong>pháp</strong> phân tích 

đã đảm bảo nhận diện, phân biệt được PAN và không bị ảnh hưởng bởi các tạp có 

trong huyết tương. 

Theo qui <strong>định</strong>, <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> có độ chọn lọc-đặc hiệu thì ngoài khả năng nhận 

diện và phân biệt được hoạt chất như đã xác <strong>định</strong> ở trên, đáp ứng của mẫu trắng tại 

thời điểm trùng với thời gian lưu của PAN và IS phải đạt các yêu cầu như đã nêu ở 

mục 2.3.3.1. Kết quả xác <strong>định</strong> ảnh hưởng của mẫu trắng tại thời điểm trùng thời 

gian lưu của PAN và IS được trình bày ở bảng 3.1. 

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của đáp ứng mẫu trắng 

Đáp ứng mẫu trắng tại tR = tPAN Đáp ứng mẫu trắng tại tR = tIS 

TT Mẫu trắng 

(mAU.s) 

Mẫu LLOQ 

(mAU.s) 

Mẫu trắng 

(mAU.s) 

Mẫu IS 

(mAU.s) 

1 0 3421 0 217732 

2 0 3159 0 204639 

3 0 3396 0 211326 

4 0 3283 0 216345 

5 0 3683 0 210752 

6 0 3835 0 228179 

Tỷ lệ đáp ứng pic (%) 0 0 

Kết quả cho thấy, tại thời điểm trùng với thời gian lưu của PAN ( 5,7 phút) và 

IS (8,4 phút) đáp ứng của mẫu trắng đều là 0%. Như vậy, các số liệu thực nghiệm 

đã chứng minh <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> có độ đặc hiệu và chọn lọc đối với PAN. 

3.2.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính 

Tiến hành như mục 2.3.3.2 và xử lí mẫu với điều kiện sắc ký như mục 3.1.3 

thu được kết quả ở bảng 3.2. 











29 



Mẫu 

Bảng 3.2: Kết quả thẩm <strong>định</strong> đường chuẩn 

Nồng độ 

Độ đúng (%) 

(ng/mL) 

CC1 CC2 CC3 CC4 CC5 

S1 26,8 99,1 100,1 96,8 98,5 99,2 

S2 89,4 104,2 100,0 111,5 105,3 103,2 

S3 446,8 94,5 96,5 97,9 99,6 97,3 

S4 893,7 98,9 102,1 97,1 99,8 102,4 

S5 1787,3 101,3 100,6 97,3 98,5 97,3 

S6 2234,2 101,6 100,7 101,2 98,3 101,3 

S7 2681,0 102,1 98,8 99,7 99,3 98,0 

S8 3574,7 98,4 101,2 98,4 100,7 101,4 

Phương trình hồi 

quy 

(Y = aX + b) 

a = 0,0005 a = 0,0005 a = 0,0005 a = 0,0005 a = 0,0005 

b = 0,0007 b= -0,0015 b = 0,0023 b = -0,0021 b= -0,0042 

r = 0,9996 r = 0,9998 r = 0,9996 r = 0,9999 r = 0,9996 

(Y: tỷ lệ đáp ứng pic PAN/IS; X: nồng độ PAN trong mẫu huyết tương) 

Như vậy, tất cả các điểm của đường chuẩn đều có độ đúng so với giá trị thực 

của các nồng độ từ 85-115% và hệ số tương quan R của cả 5 đường chuẩn đều lớn 

hơn 0,98. Do đó, trong khoảng nồng độ từ 30 – 4000 ng/mL có sự tương quan tuyến 

tính chặt chẽ giữa nồng độ PAN trong huyết tương với tỷ lệ diện tích pic PAN/IS 

thu được. 

3.2.3. Giới hạn <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> dưới 

Tiến hành khảo sát mẫu chuẩn PAN ở nồng độ khoảng 30 ng/mL với 6 mẫu 

độc lập. Tiến hành như mục 2.3.3.3. Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 . 











30 



STT 

Bảng 3.3: Kết quả thẩm <strong>định</strong> giới hạn <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> dưới 

Mẫu trắng 

Mẫu chuẩn (≈ 30 ng/mL) 

PAN 

(mAu.s) 

PAN 

(mAu.s) 

IS 

(mAu.s) 

Nồng độ 

tìm thấy (a) 

(ng/mL) 

Độ 

đúng (b) 

(%) 

Đạt/Không 

1 0 3421 217732 27,0 90,0 Đạt 

2 0 3159 204639 26,46 88,2 Đạt 

3 0 3396 211326 27,72 92,4 Đạt 

4 0 3283 216345 26,5 88,3 Đạt 

5 0 3683 210752 30,48 101,6 Đạt 

6 0 3835 228179 29,16 97,2 Đạt 

TB 0 3463 214829 27,89 93,0 

CV (%) 5,8 5,8 

Đáp ứng TB của mẫu LLOQ/mẫu trắng + 

(a) : tính từ <strong>phương</strong> trình hồi quy (b) : % so với nồng độ thực, (+): không xác <strong>định</strong> 

101,6%). 

Kết quả cho thấy <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> có: 

- Độ đúng nằm trong khoảng từ 80 – 120% so với nồng độ thực (88,2– 

- Độ chính xác với giá trị CV ≤ 20% (5,8%). 

Như vậy, mẫu chuẩn chứa PAN có nồng độ 30 ng/mL đáp ứng yêu cầu LLOQ 

về độ đúng, độ chính xác của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> phân tích trong dịch sinh học. 

3.2.4. Độ đúng – độ chính xác trong ngày và khác ngày 

3.2.4.1. Độ đúng, độ chính xác trong ngày 

Pha các mẫu LQC, MQC, HQC như mục 2.3.1. Mỗi loại QC gồm 6 mẫu 

độc lập có cùng nồng độ. Tiến hành xử lý mẫu và sắc ký theo các điều kiện đã 

lựa chọn. Kết quả xác <strong>định</strong> độ đúng, độ lặp lại trong ngày được trình bày ở 

bảng 3.4: 


đạt 

Đạt 










31 

Bảng 3.4: Kết quả thẩm <strong>định</strong> độ đúng, độ chính xác trong ngày 



Mẫu LQC (90,0 ng/mL) MQC (1800,1 ng/mL) HQC (3500,2 ng/mL) 

Tỷ số 

diện 

tích pic 

PAN/IS 

Nồng độ (a) 

(ng/mL) 

Tỷ số 

Độ 

diện 

đúng (b) 

tích pic 

(%) 

PAN/IS 


(ng/mL) 

Tỷ số 

Độ 

diện 

đúng (b) 

tích pic 

(%) 

PAN/IS 


(ng/mL) 

Độ 

đúng (b) 

(%) 

1 0,044 89,5 99,4 0,843 1706,8 94,8 1,597 3232,0 92,3 

2 0,048 98,3 109,2 0,851 1722,1 95,6 1,607 3252,7 92,9 

3 0,043 86,7 96,3 0,828 1675,9 93,1 1,586 3211,2 91,7 

4 0,044 88,8 98,6 0,852 1724,3 95,8 1,608 3254,4 92,9 

5 0,043 87,3 97,0 0.851 1722,2 95,6 1,605 3250,2 92,8 

6 0,040 82,5 91,6 0,845 1710,7 95,0 1,651 3342,4 95,5 

TB 88,9 98,7 1710,3 95,0 3257,1 93,0 

CV (%) 5,4 1,0 1,3 

(a) tính từ <strong>phương</strong> trình hồi qui, (b) % so với nồng độ thực 

Kết quả cho thấy, <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> có độ đúng nằm trong khoảng 91,6 

– 109,2%, độ lệch nằm trong giới hạn cho phép ± 15%, độ lặp lại trong ngày với giá 

trị CV% nhỏ (1,0 – 5,4%), đáp ứng yêu cầu về độ đúng, chính xác của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> 

phân tích trong dịch sinh học. 

3.2.4.2. Độ đúng, độ chính xác khác ngày 

Tiến hành phân tích các mẫu LQC, MQC, HQC được chuẩn bị tương tự như 

xác <strong>định</strong> độ đúng, độ lặp lại trong ngày theo <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> đã xây <strong>dựng</strong> tại các ngày 

khác nhau. Xác <strong>định</strong> nồng độ PAN trong các mẫu QC dựa vào đường chuẩn tiến 

hành song song trong từng ngày. Kết quả xác <strong>định</strong> độ đúng, độ lặp lại khác ngày 

của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> được trình bày ở bảng 3.5. 











32 

Bảng 3.5: Kết quả thẩm <strong>định</strong> độ đúng, độ chính xác khác ngày 



Ngày 

I 

II 

III 

LQC ( 90 ng/mL) MQC ( 1800 ng/mL) HQC ( 3500 ng/mL) 


(ng/mL) 

Độ đúng (b) Nồng độ (a) 

(%) (ng/mL) 

Độ đúng (b) Nồng độ (a) 

(%) (ng/mL) 

Độ đúng (b) 

(%) 

89,5 99,4 1706,8 94,8 3232,0 92,3 

98,3 109,2 1722,1 95,6 3252,7 92,9 

86,7 96,4 1675,9 93,1 3211,2 91,7 

88,8 98,7 1724,3 95,8 3254,4 92,9 

87,3 97,0 1722,2 95,6 3250,2 92,8 

82,5 91,6 1710,7 95,0 3342,4 95,5 

80,2 89,1 1849,2 102,6 3524,3 100,6 

84,1 93,4 1818,9 101,0 3573,3 102,0 

81,6 90,7 1804,3 100,2 3501,3 100,0 

77,2 85,8 1776,3 98,6 3364,2 96,0 

83,8 93,1 1835,2 101,9 3516,3 100,4 

86,9 96,5 1859,1 103,2 3488,6 99,6 

86,1 95,7 1774,8 98,6 3421,7 97,7 

86,1 95,7 1727,6 96,0 3402,8 97,2 

86,1 95,7 1760,2 97,8 3434,3 98,1 

85,5 95,0 1803,0 100,1 3297,4 94,2 

87,2 96,9 1752,4 97,3 3483,3 99,5 

85,9 95,4 1759,0 97,7 3418,2 97,6 

TB 95,3 98,1 96,7 

CV (%) 5,0 3,0 3,4 

(a) tính từ <strong>phương</strong> trình hồi qui, (b) % so với nồng độ thực 

Kết quả thực nghiệm cho thấy ở cả 3 nồng độ (90, 1800, 3500 ng/mL), 

<strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> đều cho độ đúng trong khoảng 85% đến 115%, độ lặp lại khác ngày 

với giá trị CV ≤ 15% (3,0 – 5,0%) chứng tỏ <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> được nghiên cứu có 

độ đúng, độ chính xác cao, đáp ứng yêu cầu đối với <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> dùng trong 

dịch sinh học. 











33 



3.2.5. Tỷ lệ thu hồi của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> 

3.2.5.1. Tỷ lệ thu hồi nội chuẩn 

Xử lý các lô mẫu QC theo qui trình đã lựa chọn. Tiến hành phân tích xác <strong>định</strong> 

diện tích pic của IS trong huyết tương. Song song, xác <strong>định</strong> diện tích pic của IS 

trong mẫu chuẩn pha trong dung môi pha mẫu (không qua xử lý). Kết quả xác <strong>định</strong> 

tỷ lệ thu hồi của IS được trình bày ở bảng 3.6. 

Bảng 3.6: Kết quả thẩm <strong>định</strong> tỷ lệ thu hồi IS 

STT 

Đáp ứng của IS/huyết tương Đáp ứng của IS/pha động 

(mAU.s) 

(mAU.s) 

1 219153 138029 

2 215987 137641 

3 221362 137809 

4 225837 140936 

5 225289 140712 

6 228284 138874 

7 222756 142224 

8 221527 139068 

9 226001 142448 

10 217320 139726 

11 214449 143592 

12 218248 143690 

13 203578 139516 

14 214774 139907 

15 219806 139659 

16 211146 141115 

17 204469 140374 

18 219947 139338 

TB 218330 140259 

CV (%) 3,1 1,3 

Tỷ lệ thu hồi * 99,1 

(*): Giá trị đã được hiệu chỉnh theo hệ số pha loãng 

Kết quả thực nghiệm cho thấy, tỷ lệ thu hồi của nội chuẩn đạt 99,1% (thỏa 

mãn điều kiện nằm trong khoảng 30 – 110%) và CV ở nồng độ của IS đều ≤ 15% 











34 



(3,1 và 1,3%). Do vậy qui trình xử lý mẫu huyết tương đã được nghiên cứu là phù 

hợp để chiết tách chất nội chuẩn. 

3.2.5.2. Tỷ lệ thu hồi PAN 

Chuẩn bị các lô mẫu QC như mục 2.3.1 và xử lý mẫu chuẩn PAN pha trong 

huyết tương theo <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> đã xây <strong>dựng</strong>. Tiến hành sắc ký, xác <strong>định</strong> nồng độ 

PAN có trong các mẫu. Song song, <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> mẫu chuẩn pha trong dung môi pha 

mẫu (không qua xử lý). Kết quả xác <strong>định</strong> tỷ lệ thu hồi của PAN được trình bày ở 

bảng 3.7. 

Bảng 3.7: Kết quả thẩm <strong>định</strong> tỷ lệ thu hồi PAN 

STT 

LQC (≈ 90 ng/mL) 

Huyết 


Pha động 

Đáp ứng PAN (mAu.s) 

MQC (≈ 1800 ng/mL) 

Huyết 


Pha động 

HQC (≈ 3500 

ng/mL) 

Huyết 


Pha 

động 

1 9614 6664 187772 132853 325013 257581 

2 10415 6742 188414 133227 345086 256564 

3 9409 6785 187056 132899 348659 257966 

4 9830 6848 185064 132993 339432 257805 

5 9639 6665 182395 132449 328273 256979 

6 9224 6787 184390 133243 363146 258886 

TB 9689 6749 185849 132944 341602 257630 

CV(%) 4,3 1,1 1,2 0,2 4,1 0,3 

Tỷ lệ thu 

hồi *(%) 

91,4 89,0 84,4 

(*): Giá trị đã được hiệu chỉnh theo hệ số pha loãng 

Kết quả thực nghiệm cho thấy ở cả 3 khoảng nồng độ (90, 1800, 3500 ng/mL), 

<strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> đều cho hiệu suất chiết nằm trong khoảng 30 – 110% ( 91,4; 89,0; 

84,4%), giá trị CV mỗi nồng độ của PAN đều ≤ 15% (từ 0,2 – 4,3%). Do đó <strong>phương</strong> 

<strong>pháp</strong> xử lý mẫu đã được xây <strong>dựng</strong> là phù hợp để chiết tách PAN từ huyết tương. 











35 



3.2.6. Độ ổn <strong>định</strong> 

3.2.6.1. Độ ổn <strong>định</strong> dung dịch nội chuẩn làm việc thời gian ngắn ở nhiệt độ 

phòng 

Pha dung dịch nội chuẩn gốc như mục 2.3.1 và tiến hành như mục 2.3.3.7. 

Kết quả độ ổn <strong>định</strong> dung dịch nội chuẩn làm việc thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng 

được trình bày ở bảng 3.8. 

Bảng 3.8: Độ ổn <strong>định</strong> dung dịch nội chuẩn làm việc thời gian ngắn 

Mẫu Đáp ứng IS ban đầu Đáp ứng IS sau 5 giờ 

1 743160 738252 

2 740169 750460 

3 738216 750764 

TB 740515 746492 

CV (%) 0,3 1,0 

Độ lệch so với ban đầu 0,8 

Kết quả cho thấy, nồng độ dung dịch nội chuẩn làm việc trong thời gian ngắn 

ở nhiệt độ phòng lệch so với nồng độ ban đầu 0,8% (< 2%), và có CV lần lượt là 

0,3%, 1,0 % (





36 



Kết quả cho thấy, nồng độ dung dịch chuẩn gốc sau bảo quản 6 ngày ở 

nhiệt độ 2 o C - 8 o C sai khác với nồng độ dung dịch mới pha là 1,1% (





37 



Mẫu 

Bảng 3.11: Độ ổn <strong>định</strong> của mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn 

Nồng độ (ng/mL) 

Mẫu LQC ( 90 ng/mL) 

Mẫu HQC ( 3500 ng/mL) 

Xử lý ngay Sau 5 giờ Xử lý ngay Sau 5 giờ 

1 99,6 91,8 3871,9 3496,8 

2 98,3 91,1 3887,0 3505,6 

3 97,8 86,1 3877,4 3304,0 

4 97,9 89,4 3896,1 3315,4 

5 96,6 90,0 3658,2 3380,7 

6 97,2 91,8 3654,3 3304,6 

TB 97,9 90,0 3807,5 3384,5 

CV (%) 1,0 2,2 2,8 2,6 

Độ lệch -8,1 -11,1 

Kết quả cho thấy, nồng độ PAN trong mẫu được xử lí sau khi để 5 giờ ở nhiệt 

độ phòng đều sai khác so với nồng độ mẫu xử lí ngay không quá 15% (LQC: -8,1% 

và HQC: -11,1%) và giá trị CV giữa các kết quả <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> đều ≤ 15%. Như vậy, 

mẫu huyết tương ổn <strong>định</strong> ở nhiệt độ phòng sau 5 giờ. 

* Độ ổn <strong>định</strong> của mẫu huyết tương thời gian dài 

Pha các mẫu LQC và HQC như mục 2.3.1 và tiến hành như mục 2.3.3.7. Kết 

quả độ ổn <strong>định</strong> dài ngày của mẫu huyết tương được trình bày ở bàng 3.12, 3.13. 











38 

Bảng 3.12: Kết quả độ ổn <strong>định</strong> dài ngày của mẫu nồng độ 90 ng/mL 



Mẫu LQC 

( 90 ng/mL) 


Ngày đầu Sau 30 ngày Sau 53 ngày Sau 68 ngày 

1 86,7 86,6 89,6 96,4 

2 85,9 85,3 94,2 100,6 

3 86,1 84,4 99,1 98,0 

4 85,6 85,8 95,5 102,6 

5 87,4 86,1 98,5 101,0 

6 89,9 85,6 94,8 100,7 

TB 86,9 85,6 95,3 99,9 

CV (%) 1,7 0,8 3,3 2,3 

Độ lệch so với ban 

đầu 

-1,5 9,6 15,0 

Bảng 3.13: Kết quả độ ổn <strong>định</strong> dài ngày của mẫu nồng độ 3500 ng/mL 

Mẫu HQC 

( 3500 ng/mL) 


Ngày đầu Sau 30 ngày Sau 53 ngày Sau 68 ngày 

1 3438,0 3205,8 3281,5 3706,4 

2 3404,6 3334,4 3512,2 3913,0 

3 3709,0 3522,2 3537,6 4049,7 

4 3666,1 3334,0 3743,0 4069,3 

5 3660,4 3214,0 3700,2 4034,0 

6 3654,2 3448,6 3663,1 3994,7 

TB 3588,7 3343,2 3572,9 3961,2 

CV (%) 3,3 3,4 4,3 3,4 

Độ lệch so với ban 

đầu 

-6,8 -0,4 10,4 


Kết quả cho thấy, nồng độ LQC, HQC của PAN trong mẫu sau khi bảo quản 

30, 53 và 68 ngày sai khác với nồng độ ban đầu không quá 15% và giá trị CV giữa 










39 



các kết quả <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> ở mỗi nồng độ đều nhỏ hơn 15%. Như vậy mẫu huyết tương 

đạt chỉ tiêu độ ổn <strong>định</strong> dài ngày. 

* Độ ổn <strong>định</strong> của mẫu sau xử lý (trong auto-sampler) 

Pha các mẫu LQC và HQC như mục 2.3.1 và tiến hành như mục 2.3.3.7. Kết 

quả độ ổn <strong>định</strong> trong auto-sampler ở 4 o C được trình bày trong bảng 3.14. 

Mẫu 

Bảng 3.14: Kết quả độ ổn <strong>định</strong> của mẫu sau xử lý trong auto-sampler 

Mẫu LQC ( 90 ng/mL) 


Mẫu HQC ( 3500 ng/mL) 

Tiêm ngay Sau 25 giờ/4 o C Tiêm ngay Sau 25 giờ/4 o C 

1 89,5 80,0 3232,0 3237,7 

2 98,3 81,5 3252,7 3321,7 

3 86,7 81,8 3211,2 3451,2 

4 88,7 80,2 3251,7 3437,2 

5 87,3 83,8 3248,2 3430,2 

6 82,5 83,5 3342,4 3423,2 

TB 88,8 81,8 3256,4 3383,5 

CV (%) 5,4 1,8 1,3 2,3 

Độ lệch (%) -7,9 3,9 

Kết quả cho thấy, nồng độ mẫu LQC, HQC của PAN sau khi bảo quản 25 giờ 

trong auto-sampler sai khác với nồng độ mẫu LQC, HQC tiêm ngay không quá 15% 

và giá trị CV giữa các kết quả <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> ở mỗi nồng độ đều nhỏ hơn hoặc bằng 

15%. Như vậy, mẫu huyết tương đạt độ ổn <strong>định</strong> của mẫu sau xử lý (trong autosampler). 

* Nhận xét chung 

Từ những kết quả thẩm <strong>định</strong> độ đặc hiệu - chọn lọc, khoảng tuyến tính, giới 

hạn <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> dưới, độ đúng - độ chính xác, tỷ lệ thu hồi, nghiên cứu độ ổn <strong>định</strong> 

thu được ở trên cho thấy <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> đã được xây <strong>dựng</strong> đáp ứng các yêu cầu của 

một <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> phân tích dùng trong sinh học. 











40 



3.3. BÀN LUẬN 

3.3.1. Phương <strong>pháp</strong> xử lý mẫu PAN trong huyết tương 

Xử lý mẫu giúp loại bỏ một hoặc nhiều thành phần tạp chất có trong mẫu, tạo 

điều kiện thuận lợi cho quá trình phân tách, <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> PAN bằng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> 

HPLC. Dựa vào đặc tính của PAN, tham khảo một số tài liệu và khảo sát thực tế 

chúng tôi đã xây <strong>dựng</strong> được một <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> xử lý mẫu dùng <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> PAN 

trong huyết tương. 

So với <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> tủa protein, <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> xử lý mẫu sử dụng trong khóa 

luận - chiết lỏng lỏng với dung môi TBME - hiệu suất chiết cao, mẫu thu được ít tạp 

nên tạo điều kiện tối ưu cho <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> PAN trong huyết tương. 

3.3.2. Phương <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> PAN trong huyết tương 

Phương <strong>pháp</strong> HPLC <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> PAN trong huyết tương sử dụng trong nghiên 

cứu này đã được thẩm <strong>định</strong> theo các chỉ tiêu của US - FDA và EMA bao gồm: độ 

đặc hiệu - chọn lọc, khoảng tuyến tính, giới hạn <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> dưới, độ đúng - độ 

chính xác, tỷ lệ thu hồi, nghiên cứu độ ổn <strong>định</strong>. 

Với một điều kiện sắc ký không quá phức tạp, dễ dàng triển khai tại các phòng 

thí nghiệm của Việt Nam, chất phân tích PAN đã tách hoàn toàn khỏi các thành 

phần tạp có trong huyết tương với thời gian triển khai sắc ký là 10 phút. Thời gian 

triển khai sắc ký không quá dài cho phép <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> được một số <strong>lượng</strong> mẫu lớn 

trong một ngày, giúp tiết kiệm được thời gian và chi phí, đặc biệt là trong điều kiện 

hạn hẹp về thiết bị hiện đại và tài chính. 

Độ ổn <strong>định</strong> của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong>: chúng tôi đã tiến hành đánh giá được chỉ tiêu 

căn bản về độ ổn <strong>định</strong> của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong>, cho thấy sự sai khác rất nhỏ giữa nồng độ 

PAN sau 3 chu kỳ đông rã, sau thời gian 5 giờ ở nhiệt độ phòng và sau thời gian 

30, 53, 68 ngày so với dung dịch ngay sau khi pha, đáp ứng yêu cầu <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> 

phân tích dịch sinh học. 











41 



4.1 KẾT LUẬN 

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 

Qua quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi đã đạt được 2 mục tiêu đề ra như sau: 

1. <strong>Xây</strong> <strong>dựng</strong> được quy trình phân tích PAN trong huyết tương một cách tương 

đối hoàn thiện bao gồm xử lý mẫu và điều kiện sắc ký. Cụ thể là: 

Quy trình xử lý mẫu: 

- Mẫu huyết tương để rã đông ở nhiệt độ phòng. 

- Ngay sau khi rã đông, lấy 1,0 mL huyết tương và 100 L dung dịch IS, lắc 

xoáy 15 giây. 

- Thêm 7 ml TBME, lắc cơ học ngang 5 phút. 

- Ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút. 

- Hút 5ml lớp dịch trên, cô N2 37 ° C. 

- Hoà tan cắn trong 0,5 ml pha động, lắc xoáy 60 giây, tiêm sắc ký. 

Điều kiện sắc ký: 

- Thiết bị : HPLC, Shimadzu. 

- Cột sắc ký: Rp18, 250 x 4,6 mm, 5 µm. 

- Bảo vệ cột: Rp18, 4 x 3 mm, 5µm. 

- Nhiệt độ cột: 40 o C, nhiệt độ autosampler: 4 0 C 

- Pha động: Đệm phosphat 0,01M pH 7,3 - MeCN (64:36). 

- Tốc độ dòng: 1,5 mL/phút, thể tích tiêm: 50 µL 

- Bước sóng phát hiện: 290 nm. 

2. Tiến hành thẩm <strong>định</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> PAN với các chỉ tiêu: độ đặc 

hiệu/chọn lọc, khoảng tuyến tính, giới hạn <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> dưới, độ đúng - độ lặp lại, tỷ 

lệ thu hồi, nghiên cứu độ ổn <strong>định</strong>. Kết quả cho thấy: 

- Phương <strong>pháp</strong> có độ đặc hiệu - chọn lọc với PAN. 

- Có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa đáp ứng phân tích và nồng độ 

PAN trong khoảng nồng độ khảo sát với r > 0,999. 

- Phương <strong>pháp</strong> có độ đúng tốt (88,2% - 103,2%), độ lặp lại với giá trị CV 

≤ 15%. 











42 



- Đáp ứng yêu cầu của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> phân tích các chất trong dịch sinh học của 

US – FDA và EMA. 

4.2 KIẾN NGHỊ 

Ứng dụng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> để tiến hành <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> PAN trong huyết tương nhằm 

theo dõi hiệu quả điều trị và đánh giá tương đương sinh học của chế phẩm chứa 

PAN trên thị trường. 











43 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 



TIẾNG VIỆT 

1. Bộ Y tế (2007), Dược lý học, trường Đại học Dược Hà Nội, tập 2, Nhà xuất bản 

Y học, tr.106 – 108 

2. Bộ y tế (2015), Dược thư quốc gia, nhà xuất bản Y học, tr.1115 

3. Bộ Y tế (2007), Hóa dược, Trường Đại học Dược Hà Nội, tập 2, Nhà xuất bản Y 

học, tr. 18 

4. Bộ y tế (2007), Hóa phân tích, Trường đại học Dược Hà Nội, tập 2, nhà xuất bản 

Y học, tr.123-142, tr.168-200 

5. Bộ y tế (2011), Kiểm nghiệm, Trường đại học Dược Hà Nội, nhà xuất bản Y học, 

tr.84-110 

TIẾNG ANH 

6. B. Koc¸ yig˘it-Kaymakc¸og˘ lu, S. nsalan, S. Rollas (2006), “Determination and 

validation of ketoprofen, pantoprazole and valsartan together in human plasma by 

high performance liquid chromatography”, Pharmazie 61: 586–589. 

7. Dong M., Ahuja S. (2005), Handbook of pharmaceutical analysis by HPLC, 

Academic Press - United Kingdom, p.19-45 

8. European Medicine Agency (2011), Guideline on bioanalytical method 

validation. 

9. European Union (2008), European Pharmacopoeia 6 th edition, p. 3518-3519 

10. Honggang Lou, Hong Yuan, Zourong Ruan, Donghang Xu, Quan Zhou (2008) 

“LC Determination and Bioequivalence Study of <strong>Pantoprazol</strong>e in Human Plasma” 

Chromatographia, 67, p. 795–799 

11. Medicine and Healthcare products Regulatory Agency (2010), British 

Pharmacopoeia 2010, p.1607-1609. 

12. Merck and Company Incorporated (2006), Merck index (14 th edition) 

13. Riley C., Rosanske T. (1996), Development and Validication of Analytical 

Methods, Elsevier Science Ltd; pp.3-99, 249-282 

14. Royal Pharmaceutical Society (2012), Martindale The Complete Drug 

Reference 36 th edition, Pharmaceutical Press, p. 1760. 











44 



15. U.S Department of Health and Human Services Food and Drug administration 

(2001), Guidance for Industry – Bioanalytical Method Validation, page 5 – 101 

16. Yuri V. Kazakevich, Rosario LoBrutto (2007), HPLC for Pharmaceutical 

Scientists , Wiley & Sons. Publisher, p.75-132, 139-188. 

17. Zhiyong Xie, Xiaoyan Chen, Fengdan Jin, Dafang Zhong (2005), 

“Simultaneous Determination of <strong>Pantoprazol</strong>e and Its Two Metabolites in Dog 

Plasma by HPLC”, Journal of Chromatographic Science, Vol. 43. 

Trang web: 

18. http://www.giaoduc.edu.vn/loet-da-day-ta-trang-co-chua-dut.htm 

19. https://www.mims.com/Vietnam/drug/search?q=pantoprazol 

20. http://www.vietphupharma.com/pantalek-40/ 











45 



PHỤ LỤC

Xây dựng phương pháp định lượng Pantoprazol trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?