Preview Nghiên cứu khảo sát hàm lượng apigenin trong cúc hoa vàng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ 

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI 

TRẦN THỊ HIỀN 

Mã sinh viên: 1101180 

NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT HÀM LƢỢNG 

APIGENIN TRONG CÚC HOA VÀNG 

BẰNG PHƢƠNG PHÁP 

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ 

HÀ NỘI - 2016 

HÀ NỘI – 2016

BỘ Y TẾ 

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI 

TRẦN THỊ HIỀN 

Mã sinh viên: 1101180 

NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT HÀM LƢỢNG 

APIGENIN TRONG CÚC HOA VÀNG 

BẰNG PHƢƠNG PHÁP 

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ 

Người hướng dẫn: 

1. TS. Trần Nguyên Hà 

2. ThS. Nguyễn Thị Hằng 

Nơi thực hiện: 

Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ƣơng 

LỜI CẢM ƠN 

HÀ NỘI - 2016

www.twitter.com/daykemquynhon 

https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 

www.facebook.com/daykem.quynhon 

www.daykemquynhon.blogspot.com 

LỜI CẢM ƠN 

www.daykemquynhon.ucoz.com 

MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com 

Trong quá trình thực hiện đề tài “<strong>Nghiên</strong> <strong>cứu</strong> <strong>khảo</strong> <strong>sát</strong> <strong>hàm</strong> lƣợng Apigenin 

trong Cúc hoa vàng bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”, ngoài sự làm 

việc nghiêm túc, nỗ lực hết mình của bản thân, em đã nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ 

từ phía nhà trƣờng, thầy cô, gia đình và bạn bè. 

Trƣớc hết, em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Trần Việt 

Hùng - Phó Viện Trƣởng Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ƣơng, ngƣời đã tạo rất 

nhiều điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. 

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Trần Nguyên Hà - Phó Trƣởng bộ môn 

Hóa phân tích - Độc chất, ThS. Đặng Thị Ngọc Lan - GV Bộ môn Hóa phân tích - 

Độc chất đã đóng góp ý kiến, tận tình sửa chữa giúp em hoàn thành khóa luận này. 

Đồng thời, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Nguyễn Thị Hằng - Khoa 

<strong>Nghiên</strong> <strong>cứu</strong> phát triển - Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ƣơng, ngƣời đã tận tình 

hƣớng dẫn em trong quá trình thực hiện đề tài. 

Em xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị trong Viện Pháp Y Quốc Gia, Khoa 

<strong>Nghiên</strong> <strong>cứu</strong> phát triển, Khoa Vật lý đo lƣờng Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ƣơng đã 

hỗ trợ em trong quá trình nghiên <strong>cứu</strong>. 

Xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, đặc biệt là 

những thầy cô đã trực tiếp giảng dạy em suốt thời gian học tập tại trƣờng. 

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên và giúp đỡ em trong quá 

trình học tập, nghiên <strong>cứu</strong>. 

Em xin chân thành cảm ơn! 

Hà Nội, tháng 05 năm 2016 

DIỄN ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN 

Trần Thị Hiền 

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú 

www.facebook.com/daykemquynhonofficial 

www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial





MỤC LỤC 



DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 

DANH MỤC CÁC BẢNG 

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ 

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................. 1 

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ....................................................................................... 3 

1.1. Tổng quan về cúc hoa vàng ........................................................................... 3 

1.1.1. Đặc điểm thực vật ...................................................................................... 3 

1.1.2. Phân bố ...................................................................................................... 3 

1.1.3. Thành phần ................................................................................................ 4 

1.1.4. Tác dụng của Cúc hoa vàng ...................................................................... 5 

1.2. Tổng quan về Apigenin ................................................................................. 5 

1.2.1. Tính chất .................................................................................................... 5 

1.2.2. Tác dụng của Apigenin.............................................................................. 6 

1.3. Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao ....................................................... 7 

1.3.1. Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao ................................................ 7 

1.3.2. Máy HPLC ................................................................................................ 7 

1.3.3. Các thông số đặc trƣng của quá trình sắc ký ............................................. 8 

1.3.4. Ứng dụng của HPLC ................................................................................. 9 

1.3.5. Kỹ thuật HPLC với detector DAD (diod array detector) ........................ 11 

1.3.6. Một số nghiên <strong>cứu</strong> đã thực hiện về Cúc hoa vàng và Apigenin .............. 12 


CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 14 

2.1. Đối tƣợng, nguyên liệu, thiết bị nghiên <strong>cứu</strong> ................................................ 14 










2.1.1. Đối tƣợng nghiên <strong>cứu</strong> .............................................................................. 14 

2.1.2. Hóa chất, dung môi ................................................................................. 14 

2.1.3. Dụng cụ, thiết bị ...................................................................................... 14 

2.2. Nội dung nghiên <strong>cứu</strong> ................................................................................... 15 

2.3. Phƣơng pháp nghiên <strong>cứu</strong> ............................................................................. 15 

2.3.1. Chuẩn bị mẫu thử .................................................................................... 15 

2.3.2. Pha dung dịch chuẩn................................................................................ 15 

2.3.3. Khảo <strong>sát</strong> và tìm điều kiện sắc ký ............................................................. 15 

2.3.4. Thẩm định phƣơng pháp phân tích theo tiêu chuẩn AOAC .................... 16 

2.3.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu ....................................................................... 19 

CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................ 21 

3.1. Khảo <strong>sát</strong> điều kiện sắc ký và chuẩn bị các dung dịch tiêm sắc ký ................. 21 

3.1.1. Chiết xuất ................................................................................................. 21 

3.1.2. Pha dung dịch thử ..................................................................................... 22 

3.1.3. Pha dung dich chuẩn ................................................................................. 22 

3.1.4. Lựa chọn cột sắc ký .................................................................................. 22 

3.1.5. Lựa chọn bƣớc sóng phát hiện ................................................................. 22 

3.1.6. Lựa chọn tốc độ dòng ............................................................................... 23 

3.1.7. Lựa chọn pha động ................................................................................... 23 

3.2. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng Apigenin trong Cúc hoa vàng theo tiêu 

chuẩn AOAC.......................................................................................................... 27 

3.2.1. Độ đặc hiệu ............................................................................................... 27 


3.2.2. Độ tƣơng thích của hệ thống sắc ký ......................................................... 28 

3.2.3. Độ lặp lại của phƣơng pháp ...................................................................... 29 








3.2.4. Độ tuyến tính ............................................................................................ 30 



3.2.5. Độ đúng của phƣơng pháp ....................................................................... 31 

3.2.6. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lƣợng LOQ ............................ 33 

3.3. Xác định <strong>hàm</strong> lƣợng Apigenin trong Cúc hoa vàng ....................................... 35 

3.4. Bàn luận .......................................................................................................... 36 

3.4.1. Lựa chọn phƣơng pháp ............................................................................. 36 

3.4.2. Điều kiện xử lý mẫu ................................................................................. 37 

3.4.3. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng.......................................................... 37 

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ...................................................................................... 39 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 

PHỤ LỤC 











DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 

TT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ 

1. DAD Detector mảng diod (Diod Array Detector) 

2. DĐTQ Dƣợc điển Trung Quốc 

3. DĐVN Dƣợc điển Việt Nam 

4. EtOH Ethanol 

5. HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-Performance Liquid 

Chromatography) 

6. IR Phổ hồng ngoại (Infra-red) 

7. LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) 

8. LOQ Giới hạn định lƣợng (Limit of Qualification) 

9. MeOH Methanol 

10. MS Phổ khối lƣợng (Mass Spectrometry) 

11. RSD Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative Standard Deviation) 

12. SKĐ Sắc ký đồ 

13. S/N Tín hiệu/nhiễu đƣờng nền (Signal/Noise) 

14. STT Số thứ tự 

15. UV-VIS Phổ tử ngoại - khả kiến (Ultraviolet Visible) 











DANH MỤC CÁC BẢNG 

Bảng Tên bảng Trang 

3.1 Khối lƣợng các mẫu thử Cúc hoa vàng 21 

3.2 Tỷ lệ dung môi ACN : H 2 O chạy gradient tại các thời điểm 23 

3.3 Thời gian lƣu của mẫu chuẩn và mẫu thử số 1 27 

3.4 Giá trị thời gian lƣu và diện tích pic của mẫu chuẩn 29 

3.5 Giá trị <strong>hàm</strong> lƣợng của mẫu thử số 1 30 

3.6 Bảng biểu thị giữa nồng độ và diện tích pic của mẫu chuẩn 31 

3.7 Kết quả biểu thị % tìm lại của khối lƣợng chuẩn thêm vào 33 

3.8 Kết quả LOD và LOQ 34 

3.9 Giá trị diện tích pic và thời gian lƣu LOD 34 

3.10 Kết quả xác định <strong>hàm</strong> lƣợng của Apigenin trong các mẫu thử 36 











DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ 

Hình Tên ảnh, sơ đồ Trang 

1.1 Cúc hoa vàng 3 

1.2 Công thức cấu tạo Apigenin 5 

1.3 Sơ đồ nguyên lý máy HPLC 8 

1.4 Cấu tạo detector mảng diod (DAD) 11 

3.1 SKĐ Apigenin mẫu chuẩn ở tỷ lệ MeOH : H 3 PO 4 = 52 : 48 24 

3.2 SKĐ Apigenin mẫu chuẩn điều kiện (1) ở tốc độ 0,8 ml/phút 24 




3.6 SKĐ Apigenin mẫu thử 27 

3.7 Phổ của Apigenin chuẩn (đƣờng màu đỏ) và phổ Apigenin thử 

(đƣờng màu xanh) 

3.8 Đồ thị tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ Apigenin 31 


28 






1 





ĐẶT VẤN ĐỀ 

Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là trong lĩnh vực 

y, dƣợc học, ngày càng có nhiều nghiên <strong>cứu</strong> các thành phần hoạt chất mang hoạt tính 

sinh học trong dƣợc liệu có tác dụng phòng, chữa bệnh, mang lại tiềm năng rất lớn cho 

việc sử dụng dƣợc liệu làm nguyên liệu làm thuốc chữa các bệnh nan y. Xu thế tất yếu 

là kết hợp hai nền y học cổ truyền và y học hiện đại nhằm giải quyết những khó khăn 

của Y học. Trong những năm gần đây, xu hƣớng quay trở lại sử dụng các sản phẩm 

thuốc có nguồn gốc thảo dƣợc để phòng và điều trị bệnh đang ngày càng trở nên thịnh 

hành trên thế giới. 

Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thƣờng gặp trong dƣợc liệu có tác dụng 

chống oxy hóa và các gốc tự do. Apigenin là một flavonoid thiên nhiên có hoạt tính 

sinh học đƣợc chiết xuất từ cúc hoa vàng. Các nghiên <strong>cứu</strong> gần đây cho thấy <strong>apigenin</strong> là 

một chất chống oxy hóa, có đặc tính chống viêm và chống ung thƣ [13], [18]. Nó có 

thể ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thƣ bằng cách bắt giữ các chu kỳ tế bào ở giai 

đoạn G2/M. Apigenin có khả năng gây ảnh hƣởng trên nhiều loại phân tử. Hầu hết tác 

dụng qua trung gian ức chế nitric oxid synthase-2 (NOS2), yếu tố cảm ứng tăng áp oxy 

(hypoxia inducible factor 1α HIF-1α), lipoxygenase, cyclooxygenase-2 (COX-2) và 

yếu tố tăng sinh mạch máu (vascular endothelial growth factor - VEGF) [5], [18]. 

Cây cúc hoa vàng đƣợc trồng nhiều ở nƣớc ta từ hàng nghìn năm trƣớc lấy hoa 

dùng chữa các chứng nhức đầu, đau mắt, chảy nƣớc mắt, cao huyết áp, sốt… [6], [13], 

[17]. Ngoài ra, cúc hoa vàng đƣợc sử dụng kết hợp trong cái bài thuốc chữa hƣ nhƣợc 

thần kinh, chữa đinh râu, viêm màng tiếp hợp dị ứng… [6]. Trong DĐVN, DĐTQ 

cũng có chuyên luận riêng về cúc hoa vàng, tuy nhiên lại không đề cập đến thành phần 

<strong>apigenin</strong>. Hiện nay, nguồn gốc và chất lƣợng dƣợc liệu đang rất khó quản lý do còn 


gặp rất nhiều khó khăn, thiếu những dữ liệu chuẩn làm cơ sở nhận biết, xác định dƣợc 

liệu. 






2 





Để góp phần bổ sung bộ dữ liệu chuẩn dƣợc liệu cho Dƣợc điển Việt Nam phục 

vụ công tác kiểm nghiệm thuốc, chúng tôi thực hiện đề tài: “<strong>Nghiên</strong> <strong>cứu</strong> <strong>khảo</strong> <strong>sát</strong> 

<strong>hàm</strong> lƣợng Apigenin trong Cúc hoa vàng bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu 

năng cao” nhằm các mục tiêu: 

1. Khảo <strong>sát</strong> và thẩm định phương pháp định <strong>lượng</strong> Apigenin bằng HPLC. 

2. Khảo <strong>sát</strong> sơ bộ <strong>hàm</strong> <strong>lượng</strong> Apigenin trong các mẫu Cúc hoa vàng trên thị 

trường hiện nay. 







3 



CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 



1.1. Tổng quan về cúc hoa vàng 

1.1.1. Đặc điểm thực vật 

Tên khác: kim cúc, hoàng cúc, dã cúc, cam 

cúc, khổ ý, bioóc kim (Tày). 

Tên khoa học: Chrysanthemum indicum L. 

Tên đồng nghĩa: Chrysanthemum procumbens 

Lour. 

Họ: Cúc (Asteraceae) 

Đặc điểm thực vật: Cây thảo, sống hàng 

năm hay sống dai, cao 20-50 cm. Thân mọc 

thẳng, nhẵn, có khía dọc, phân cành ở ngọn. 

Lá thơm, mọc so le, hình bầu dục, có thùy sâu, không lông, mép có răng cƣa nhọn, 

không đều, mặt trên màu lục đen sẫm, mặt dƣới nhạt, cuống lá ngắn, có tai ở gốc. 

Cụm hoa hình đầu, màu vàng hơi nâu, đôi khi còn đính cuống; đƣờng kính 0,5 

cm đến 1,2 cm. Tổng bao gồm 4 đến 5 hàng lá bắc, mặt ngoài màu xanh hơi xám 

hoặc nâu nhạt, ở giữa hai bên mép rất nhạt và khô xác. Có 2 loại hoa: Hoa hình 

lƣỡi nhỏ một vòng, đơn tính, không đều ở phía ngoài; nhiều hoa hình ống, đều, 

mẫu năm, lƣỡng tính ở phía trong. Chất nhẹ, mùi thơm, vị đắng. Quả bế trụi. Hoa 

thu hái vào đầu tháng 10 đến tháng 1-2 năm sau. Hoa hái về đem đổ rồi phơi 3 - 4 

nắng đến khô. Nếu trời râm, phải sấy than hoặc lửa nhẹ [3], [5], [6], [18]. 

1.1.2. Phân bố 

Cúc hoa vàng phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới ẩm và cận nhiệt đới Bắc bán cầu: 

Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Việt Nam, Lào, Thái Lan, Ấn Độ, Cúc hoa vàng 

đƣợc trồng làm cây cảnh, và từ lâu đƣợc trồng làm thuốc ở Trung Quốc, Nhật Bản 

[16], [22]. 

Hình 1.1: Cúc hoa vàng 







4 





Ở Việt Nam, Cúc hoa vàng đƣợc trồng từ lâu đời. Cúc hoa vàng đƣợc dùng làm 

thuốc hay ƣớp chè, nấu rƣợu và đƣợc trồng nhiều ở các làng Nghĩa Trai (Hƣng 

Yên), Nhật Tân và Tế Tiêu (Hà Nội)… [16], [17]. 

1.1.3. Thành phần 

Trong cúc hoa vàng có chứa tinh dầu, carotenoid, các acid amin, vitamin A, 

flavonoid và một số loại sesquiterpen. 

- Tinh dầu: α-pinen, β-pinen, sabinen, mycren, α-terpinen, p.cymen, cineol, α- 

thuyon, chrysanthenon, borneol, chrysanthetriol, linalyl acetat, germacren D, 

nerolidol, γ-cadinen, α-selinen, caryophyllen, mourolol [13], [17]. 

- Thành phần chủ yếu tinh dầu cúc hoa vàng một số vùng Trung Quốc: 1,8-cineol 

(0,62-7,34%), (+)-(1R,4R)-camphor (0,17-27,56%), caryophyllen oxid (0,54-5,8%), 

beta-phellandren (0,72-1,87%), (-)-(1S,2R,4S)-borneol acetat (0,33-8,46%), 2- 

methyl-6-(p-tolyl)hept-2-en (0,3-8,6%), 4,6,6-trimethylbicyclo[3.1.1]hept-3-en-2- 

ylacetat (0,17-26,48%) và hexadecanoic acid (0,72-15,97%) [13], [17]. 

- Carotenoid: chrysanthemoxanthin [13], [17]. 

- Sesquiterpen: arteglasin A, yejuhua lacton, handelin, chrysetunon, cumambrin A, 

angeloylajadin, tuncfulin [17]. 

- Flavonoid: luteolin, quercetin, <strong>apigenin</strong>, luteolin-7-O-beta-D-glucopyranosid, 

<strong>apigenin</strong>-7-O-β-D-galactopyranosid, chrysanthemin, <strong>apigenin</strong>-7-O-glucosid, 

acacilin, baicalin, luteolin-7-O-β-D-glucopuranosid, 4’-methoxyluteolin-7-O-β-Dglucopyranosid, 

cyanidin-3-O-(6-O-malonyl-β-D-glucopyranosid) [17]. 

- Acid phenol: acid clorogenic, acid quinic-4-O-cafeciat, acid quinic-3,4-di-Ocafciat 

[17]. 

- Acid amin: adenin, cholin, stachydrin [17]. 

- Thành phần khác: indicumenon, β- sitosterol, α- amyrin, friedelin, sesamin, adenin, 

cholin, stachydrin và vitamin A [17]. 







5 



1.1.4. Tác dụng của Cúc hoa vàng 



Cúc hoa vàng có vị ngọt, hơi đắng, tính bình hơi mát, có tác dụng thanh nhiệt, 

giải cảm, tán phong thấp, giáng hỏa, giải độc [6]. Cúc hoa vàng có nhiều tác dụng 

dƣợc lý nhƣ tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, chống gốc tự do, kháng khuẩn, 

hạ huyết áp và có hoạt tính gây phản vệ [6], [10]. Cúc hoa vàng có tác dụng chống 

viêm thực nghiệm trên chuột cống trắng [10]. Dịch chiết ethanol cúc hoa vàng có 

tác dụng chống viêm, điều hòa miễn dịch dịch thể và tế bào và hoạt động thực bào 

đơn nhân [6]. 

Cúc hoa vàng có tác dụng hạ huyết áp trên động vật thí nghiệm (chó), cũng 

nhƣ có tác dụng tốt đối với bệnh nhân cao huyết áp. Khả năng làm hạ huyết áp của 

cúc hoa vàng có thể là hiệu quả của tác dụng ức chế phản xạ vận mạch có nguồn 

gốc trung tâm và tác dụng ức chế adrenalin [6]. 

Bài thuốc chứa cúc hoa vàng cũng đƣợc dùng để điều trị cho bệnh nhân suy 

nhƣợc thần kinh loại hƣng phấn tăng, đa số có nguyên nhân do sang chấn tinh thần. 

Phƣơng pháp chữa là hạ hƣng phấn, an thần, phối hợp với châm <strong>cứu</strong> đã đạt kết quả 

tốt [6]. 

Cúc hoa vàng thƣờng đƣợc dùng để chữa: phong cảm lạnh, cúm, viêm não, 

viêm mủ da, viêm vú, chóng mặt, cao huyết áp, đau mắt đỏ, chảy nhiều nƣớc mắt, 

viêm gan. Dùng ngoài chữa trị đinh nhọt, rắn cắn, chấn thƣơng bầm dập [5], [6]. 

1.2. Tổng quan về Apigenin 

1.2.1. Tính chất 

Công thức phân tử C 15 H 10 O 5 

Phần trăm thành phần: C 66,67%, H 

3,73%, O 29,60% [13]. 


Hình 1.2: Công thức cấu tạo Apigenin 

Tên khoa học theo hệ thống IUPAC: 5,7- 

Dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-1- 






6 



benzopyran-4-on [13]. 



Tên khác: 4',5,7-Trihydroxyflavon; 2-(p-hydroxyphenyl) -5,7- dihydroxychromon 

Trọng lƣợng phân tử: 270,24 

Điểm nóng chảy: 345-350°C. Điểm sôi: 555,51°C ở 760 mmHg 

Hấp thụ tối đa: UV tối đa (Ethanol): 340 nm 

Apigenin (4',5,7-trihydroxyflavon) là một flavonoid tự nhiên, thuộc nhóm flavon 

đƣợc tìm thấy trong nhiều loài thực vật, nhƣng rau mùi tây, cần tây và cúc hoa là 

những nguồn phổ biến nhất. Nó là một chất rắn kết tinh màu vàng [6], [17], [18]. 

Độ hòa tan: Hòa tan trong dimethylsulfoxid (27 mg/ml) hoặc dung dịch KOH 

1M (50mg/ml). Thực tế không tan trong nƣớc, tan vừa phải trong rƣợu nóng. Hệ số 

phân bố (log K) đƣợc tính từ tỷ lệ hòa tan của <strong>apigenin</strong> trong n-octanol và nƣớc là 

2,87 [6], [17], [18]. 

Một số glycosid tự nhiên hình thành bởi sự kết hợp của <strong>apigenin</strong> với đƣờng 

bao gồm: Apiin, Apigetrin (<strong>apigenin</strong>-7-glucosid), Vitexin (<strong>apigenin</strong>-8-C-glucosid), 

Isovitexin (<strong>apigenin</strong>-6-C-glucosid hoặc homovitexin, saponaretin), Rhoifolin 

(<strong>apigenin</strong>-7-O-neohesperidosid)... Có thể thu đƣợc <strong>apigenin</strong> từ apiin bằng cách đun 

sôi với axid, từ <strong>apigenin</strong>-7-glucosid thủy phân bằng enzyme với emulsin hoặc đun 

với H 2 SO 4 15% [6], [17], [18]. 

1.2.2. Tác dụng của Apigenin 

Apigenin ức chế sự hoạt động của collagenase liên quan đến viêm khớp dạng 

thấp (RA) và nội độc tố tạo nitric oxid (NO) trong đại thực bào.Apigenin cũng giảm 

nội độc tố biểu hiện trên cyclooxygenase-2 (COX-2). Tóm lại, những kết quả cho 

thấy <strong>apigenin</strong> có hoạt tính chống viêm quan trọng có liên quan đến ngăn chặn nitric 

oxide qua trung gian COX-2 và các bạch cầu đơn nhân, <strong>apigenin</strong> có thể điều trị các 

bệnh viêm nhiễm [18], [9]. 


Apigenin có hiệu quả ức chế sự tiến triển ung thƣ tuyến tiền liệt ở chuột bởi 

suy giảm IGF-I (Insulin - like growth factors - các yếu tố sinh trƣởng tƣơng tự 

insulin). Nồng độ IGF-I trong máu cao sẽ làm giảm tiết GH qua cơ chế điều hòa 






7 





ngƣợc. IGF-I đóng vai trò quan trọng đối với việc điều tiết các hoạt động của tế bào 

không những trong trạng thái sinh lý mà còn trong các quá trình bệnh lý kể cả ung 

thƣ [9]. 

Apigenin hoạt động hoạt hóa vận chuyển monoamin, một trong số ít các chất 

có tác dụng này, đã cải thiện nhiều rối loạn bệnh học thần kinh, đặc biệt là phụ 

thuộc cocain, thông qua cách điều chỉnh các hoạt động vận chuyển oxidase [9], [18]. 

Apigenin cũng có thể kích thích tế bào thần kinh ngƣời trƣởng thành, bằng 

cách thúc đẩy sự phân hóa tế bào thần kinh, có thể điều trị các bệnh thần kinh, rối 

loạn và bị tổn thƣơng, nghiên <strong>cứu</strong> trên chuột và ảnh hƣởng trên ngƣời vẫn chƣa 

đƣợc chứng minh [9]. 

1.3. Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao 

1.3.1. Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao 

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự 

phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha 

động lỏng dƣới áp suất cao. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân 

bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tƣơng đối của các chất này với 

pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các 

yếu tố đó. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đƣợc phát hiện bởi detector và đƣợc ghi 

lại nhờ máy ghi và bộ phận xử lý số liệu thành SKĐ với các thông tin về pic của 

chất phân tích [1]. 

Tùy thuộc vào cơ chế của quá trình tách sắc ký mà ta có những kỹ thuật sắc ký 

khác nhau: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ, sắc 

ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học [1]. 

1.3.2. Máy HPLC 

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận sau: Bình chứa pha động, 

bơm đẩy pha động qua hệ thống sắc ký ở áp suất cao, hệ tiêm mẫu để đƣa mẫu vào 


pha động, cột sắc ký, detector, máy tính hay máy phân tích hoặc máy ghi [1]. 






8 





Hệ thống cấp 

dung môi 

Hệ thu nhận xử lý dữ 

liệu (máy ghi, máy tính) 

Hình 1.3: Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC 

1.3.3. Các thông số đặc trƣng của quá trình sắc ký 

1.3.3.1. Thời gian lưu t R 

Thời gian lƣu t R là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến 

detector.Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lƣu của mỗi chất là 

hằng định, vì vậy có thể dùng thời gian lƣu để phát hiện định tính các chất [1]. 

Thời gian chết t M là thời gian lƣu của chất không bị lƣu giữ. 

Thời gian lƣu hiệu chỉnh t’ R = t R – t M . 

1.3.3.2. Hệ số dung <strong>lượng</strong> k’ 

Hệ số k’ mô tả tốc độ di chuyển của chất phân tích qua cột. Hệ số k’ còn đƣợc 

gọi là hệ số phân bố khối lƣợng giữa 2 pha: 

k’ = t' R 

= t R - t M 

t M 

k’ phụ thuộc vào bản chất chất phân tích, bản chất của hai pha và tỷ lệ V S /V M . 

Thƣờng lựa chọn điều kiện sắc ký để k’ = 1 – 5 là tốt nhất [1]. 

1.3.3.3. Hệ số chọn lọc α 

Bơm 

Detector 

Thải 

Hệ số chọn lọc đặc trƣng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B. 

t M 

= k' 2 

k' 1 

= t R2 - t M 

t R1 - t M 

Bộ phận 

tiêm mẫu 

Cột sắc ký 


Thƣờng chọn dao động từ 1,05 – 2. Nếu quá lớn, thời gian phân tích sẽ dài [1]. 






9 



1.3.3.4. Độ phân giải R s 



ký: 

Độ phân giải của cột đánh giá khả năng tách hai chất trong hỗn hợp trên cột sắc 

Trong đó: 

R S : độ phân giải 

t R,A , t R,B : thời gian lƣu chất A, B 

R S = 2(t R,B - t R,A ) 

[1] 

W B + W A 

W A , W B : lần lƣợt là độ rộng pic A, B ở các đáy pic 

1.3.3.5. Hệ số bất đối AF 

R S 1,5 thì 2 pic coi nhƣ tách nhau hoàn toàn 

Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, đƣợc tính theo công thức: 

AF = W 1/20 

2a 

Trong đó: W 1/20 : là chiều rộng của pic đƣợc đo ở 1/20 chiều cao của pic 

a: khoảng cách từ đƣờng hạ vuông góc từ đỉnh pic đến mép đƣờng 

cong phía trƣớc tại vị trí 1/20 chiều cao của pic [1]. 

Trong định lƣợng yêu cầu 0,9 ≤ AF ≤ 2 

1.3.3.6. Số đĩa lý thuyết 

Mỗi cột sắc ký có thể phân thành nhiều lớp mỏng xếp <strong>sát</strong> nhau gọi là đĩa lý 

thuyết. Ở mỗi đĩa lý thuyết sẽ diễn ra sự phân bố cân bằng tức thời của chất tan giữa 

pha tĩnh và pha động. Số đĩa lý thuyết là đại lƣợng đặc trƣng cho hiệu lực cột sắc ký 

[1]. 

N = 16 [ t R 

W ]2 = 5,54 [ t R 

] 

W 2 

1/2 

Trong đó: W: là chiều rộng pic ở đáy pic 

W 1/2 : là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của pic 


1.3.4. Ứng dụng của HPLC 

1.3.4.1. Định tính 

Ngƣời ta có thể dùng HPLC để định tính bằng một số cách sau: 






10 





So sánh thời gian lƣu của các chất phân tích trong dung dịch thử với thời gian 

lƣu của chất chuẩn chạy cùng điều kiện sắc ký [1]. 

So sánh sắc ký đồ của mẫu phân tích với sắc ký đồ của mẫu phân tích đã thêm 

chuẩn đối chiếu [1]. 

So sánh phổ (chồng phổ) UV-VIS của chất thử với chất chuẩn trên detector 

DAD (có hệ số match 0,995) [1]. 

Có thể kết nối HPLC – phổ IR hoặc HPLC – MS định tính dựa vào nhóm chức 

(IR) hoặc số khối (MS) [1]. 

1.3.4.2. Định <strong>lượng</strong> 

Tất cả các phƣơng pháp định lƣợng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng 

độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó. 

Có 3 phƣơng pháp định lƣợng thƣờng đƣợc sử dụng trong sắc ký: 

- Phƣơng pháp chuẩn ngoại 

- Phƣơng pháp chuẩn nội 

- Phƣơng pháp thêm chuẩn 

chuẩn. 

Trong khuôn khổ khóa luận này tôi xin trình bày cụ thể về phƣơng phápthêm 

Ƣu điểm của phƣơng pháp thêm chuẩn là có độ chính xác cao vì nó loại trừ 

đƣợc sai số do các yếu tố ảnh hƣởng, đặc biệt là ảnh hƣởng của quá trình xử lý mẫu 

(chiết xuất, tinh chế các chất từ dạng bào chế…) [1]. 

Tiến hành : 

Xử lý mẫu rồi tiến hành sắc ký. 

Thêm vào mẫu thử những lƣợng đã biết của chất chuẩn tƣơng ứng với các 

thành phần có trong mẫu thử rồi lại tiến hành xử lý mẫu và sắc ký trong cùng điều 

kiện. Nồng độ chƣa biết C X của mẫu thử đƣợc tính dựa vào sự chênh lệch nồng độ 

ΔC (lƣợng chất chuẩn thêm vào) và sự tăng của diện tích (hoặc chiều cao) pic ΔS 


theo công thức : 






11 



C X = S X 

ΔC 

ΔS 



Có thể tính toán nồng độ C X của mẫu thử theo một công thức khác: Tiến hành 

sắc ký một mẫu thử và mẫu thử đã đƣợc thêm chuẩn nhƣ trên.Sử dụng một pic 

không muốn định lƣợng của mẫu thử nhƣ là một chuẩn nội [1]. 

1.3.5. Kỹ thuật HPLC với detector DAD (diod array detector) 

Detector mảng diod (DAD) là một loại detector hấp thụ UV – VIS, đƣợc dùng 

phổ biến trong sắc ký lỏng dựa trên sự hấp thụ bức xạ UV – VIS (trong khoảng 190 

– 800 nm) của các chất phân tích. Tế bào đo ở trong detector là một ống hình trụ 

đƣờng kính 1 mm, chiều dài 10 mm. Một chùm sáng có phổ rộng đi qua mẫu, sau 

đó đƣợc tách ra thành các bƣớc sóng đơn. Detector có mảng diod để nhận bức xạ đã 

tán sắc từ một cách tử kẻ vạch bằng laser.Mỗi diod nhạy với một bƣớc sóng nhất 

định, do đó detector DAD cho phép đo nhiều bƣớc sóng khác nhau cùng một lúc. 

Thông thƣờng, chỉ có một hoặc hai bƣớc sóng đƣợc theo dõi trong quá trình chạy 

sắc ký. Theo dõi hai pic có thể cung cấp thông tin về độ tinh khiết của pic [1]. 

Hình 1.4: Cấu tạo detector mảng diod (DAD) 

Quang phổ và sắc ký đồ có thể đƣợc biểu thị trên màn hình nhờ phần mềm của hệ 

thống xử lý tín hiệu bằng máy tính. Có thể gọi DAD là detector sóng quét bên cạnh 

detector đo ở bƣớc sóng cố định hoặc thay đổi. Mặt khác, hệ thống này có thể cho 


đồ thị 3D: độ hấp thụ, bƣớc sóng và thời gian [1]. 






12 





Ứng dụng: Đầu dò DAD cho phép lựa chọn bƣớc sóng phù hợp nhất cho phân 

tích, có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thụ cực đại của 

các chất, ngoài ra detector DAD dùng để xác định độ tinh khiết của pic [1]. 

1.3.6. Một số nghiên <strong>cứu</strong> đã thực hiện về Cúc hoa vàng và Apigenin 

- Các nghiên <strong>cứu</strong> đã thực hiện: 

STT Tên nghiên <strong>cứu</strong> Nội dung TLTK 

1 <strong>Nghiên</strong> <strong>cứu</strong> chiết 

xuất, phân lập, tinh 

chế Linarin trong 

Cúc hoa vàng 

2 Định tính, định 

lƣợng Linarin trong 

Cúc hoa vàng bằng 

HPLC 

3 <strong>Nghiên</strong> <strong>cứu</strong> chiết 

xuất Flavonoid toàn 

phần trong Cúc hoa 

vàng 

- Chiết xuất bằng EtOH 

- Định tính bằng sắc ký lớp mỏng 

với pha động khai triển Cloroform: 

MeOH: H 2 0 (5 : 1 : 0,1) 

- Phân lập: bằng sắc ký cột 

- Tinh chế: bằng phƣơng pháp kết 

tinh 

- Cột: RP 18 (250mm x 4mm; 5µm) 

- λ = 334 nm 

- Pha động: MeOH : acid acetic 4% 

( 52 : 48) 

- Thể tích tiêm: 20 µL 

- Chiết siêu âm tần số 60 MHz; dung 

môi: ethanol 50%; nhiệt độ: 600C; 

chiết 2 lần với tỷ lệ dung môi/dựợc 

liệu mỗi lần 10/1; thời gian chiết: 60 

phút/lần 

- Hàm lƣợng flavonoid toàn phần đạt 


12,54 mg/g 

[14] 

[10] 

[8] 






13 





4 Định lƣợng 

Apigenin trong Cúc 

hoa vàng bằng 

HPLC 

5 Xây dựng quy trình 

định lƣợng 

Apigenin trong 

dƣợc liệu Bán chi 

liên bằng phƣơng 

pháp điện di mao 

quản 

- Cột: Phenomenex GenimiRP - C18 

- λ = 338 nm 

- Pha động: Acetonitril: acid formic 

0,1 % (40:60) 

- Thể tích tiêm: 20 µL 

- Hàm lƣợng Apigenin: 0,0178 % 

- Dung dịch đệm borat kiềm pH = 

8,8, nồng độ đệm 40 mM, điện thế 

15 kV, thời gian tiêm mẫu 2 s, nhiệt 

độ cột mao quản 25 o C, thời gian điện 

di 15 phút 

- λ = 268 nm 

- Hàm lƣợng Apigenin: 1,80 – 3,10 

mg/g 

Hiện nay các tài liệu dƣợc điển: Việt Nam, Trung Quốc, Mỹ, Nhật…chúng tôi 

nhận thấy chƣa có tài liệu nào công bố bổ sung phƣơng pháp định lƣợng Apigenin 

trong Dƣợc liệu. Vì vậy cần thực hiện <strong>khảo</strong> <strong>sát</strong> để có phƣơng pháp định lƣợng phù 

hợp, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Dựa trên nghiên <strong>cứu</strong> “Định <strong>lượng</strong> Apigenin 

trong Cúc hoa vàng bằng HPLC” của nhóm tác giả Nguyễn Minh Chính, Nguyễn 

Trọng Điệp, Đào Văn Đôn, Hoàng Việt Dũng, Nguyễn Văn Long, Đoàn Cao Sơn 

[5] vừa là tiền đề vừa làm cơ sở cho chúng tôi phát triển và mở rộng nội dung của 

nghiên <strong>cứu</strong> này. Chúng tôi <strong>khảo</strong> <strong>sát</strong> <strong>hàm</strong> lƣợng Apigenin trong Cúc hoa vàng ở các 

mẫu đang lƣu hành trên thị trƣờng Hà Nội bằng các điều kiện sắc ký khác nhau. Từ 

đó, có thể thu đƣợc kết quả chính xác, có ý nghĩa thực tiễn để bổ sung vào tiêu 

chuẩn định lƣợng Apigenin trong chuyên luận Cúc hoa vàng của DĐVN. 


[7] 

[9] 






14 





CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 

2.1. Đối tƣợng, nguyên liệu, thiết bị nghiên <strong>cứu</strong> 

2.1.1. Đối tượng nghiên <strong>cứu</strong> 

Mẫu nghiên <strong>cứu</strong>: Hoa của cây Cúc hoa vàng (Chryranthemum indicium Lour) 

đã đƣợc phơi khô. Nguyên liệu đƣợc bảo quản nơi khô ráo, đƣợc định tính về hóa 

học và sơ bộ kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn DĐVN IV, sau đó đƣợc nghiền thành bột 

thô mịn hoặc bột nửa mịn theo quy định của DĐVN IV trƣớc khi tiến hành chiết lấy 

Apigenin. Các mẫu đƣợc mua tại cơ sở chế biến dƣợc liệu An Bình, cơ sở Nguyễn 

Thế Viễn – Huyện Văn Lâm Hƣng Yên và tại các cửa hàng khác nhau trên phố Lãn 

Ông – Hà Nội vào tháng 03/2016. 

2.1.2. Hóa chất, dung môi 

Các hóa chất, thuốc thử dùng trong nghiên <strong>cứu</strong> đạt tiêu chuẩn độ tinh khiết 

phân tích hoặc HPLC. 

- Dung môi và hóa chất: ethanol, methanol, aceton, nƣớc cất, acetonitril, acid 

phosphoric… 

- Chất chuẩn: chuẩn làm việc Apigenin – <strong>hàm</strong> lƣợng 98,5% (do Viện Hóa sinh 

biển thiết lập). 

2.1.3. Dụng cụ, thiết bị 

- Nồi cách thủy 

- Máy li tâm EBA 21 

- Máy chiết siêu âm Elma 

- Máy cất thu hồi dung môi 

- Cân phân tích Sartorius 0,1 mg 

- Máy lọc hút chân không, màng lọc 0,45 µm 

- Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1200 series kết nối 


DAD/FLD 

- Tủ sấy, phễu lọc thủy tinh, giấy lọc 






15 





- Pipet chính xác các loại, đũa thủy tinh, lọ đựng mẫu, bơm tiêm 

- Bộ lọc dung môi hút chân không, màng lọc 0,45 µm 

- Bình định mức các loại: 10 ml, 20 ml, 25 ml, 100 ml, 1000 ml 

- Cốc có mỏ các loại: 50 ml, 100 ml, 200 ml, 1000 ml 

2.2. Nội dung nghiên <strong>cứu</strong> 

- Khảo <strong>sát</strong> các điều kiện sắc ký với HPLC để có thể tách hoàn toàn Apigenin với 

các hợp chất khác trong dịch chiết Cúc hoa vàng. 

- Thẩm định các điều kiện định lƣợng Apigenin trong các mẫu Cúc hoa vàng. 

- Áp dụng để sơ bộ xác định <strong>hàm</strong> lƣợng Apigenin có trong các mẫu Cúc hoa vàng 

trên thị thƣờng. 

2.3. Phƣơng pháp nghiên <strong>cứu</strong> 

2.3.1. Chuẩn bị mẫu thử 

2.3.1.1. Chiết xuất 

Vì Apigenin tan tốt trong MeOH nên chúng tôi quyết định chọn MeOH làm dung 

môi chiết và pha mẫu chuẩn, mẫu thử. 

Qua thử nghiệm với nhiều biện pháp xử lý mẫu khác nhau, chúng tôi chọn xử 

lý mẫu theo phƣơng pháp chiết siêu âm. 

2.3.1.2. Pha dung dịch thử 

Bổ sung MeOH vào cốc có mỏ chứa cắn sau khi bốc hơi dung môi, sau đó 

chuyển sang bình định mức bổ sung MeOH vừa đủ tới vạch. 

2.3.2. Pha dung dịch chuẩn 

Pha dung dịch chuẩn gốc Apigenin, từ chuẩn gốc pha dung dịch chuẩn Apigein 

ở nồng độ phù hợp, pha các dung dịch chuẩn thứ cấp từ dung dịch chuẩn gốc để 

thẩm định độ tuyến tính. 

2.3.3. Khảo <strong>sát</strong> và tìm điều kiện sắc ký 

2.3.3.1. Dung môi chạy pha động 


Pha động là một trong những yếu tố quyết định hiệu suất tách sắc ký, nó quyết 

định thời gian lƣu giữ của chất phân tích và hiệu quả tách sắc ký. 






16 





Cặp dung môi đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong sắc ký pha đảo là MeOH : 

H 2 O; ACN : H 2 O. Mặt khác Apigenin có 2 nhóm –OH gắn vào nhân benzo - γ - 

pyron ở vị trí 5, 7 và một nhóm –OH phenol nên Apigenin có tính acid. Do đó, để 

định lƣợng tốt thì pha động cần bổ sung thêm acid (H 3 PO 4 ) sẽ giảm thiểu đƣợc hiện 

tƣợng kéo đuôi. 

2.3.3.2. Chọn cột sắc ký 

Hiện nay sắc ký phân bố pha đảo là phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến với 

nhiều tính ƣu việt. Dựa trên tính chất của các hợp chất phân lập đƣợc từ Cúc hoa 

vàng, đồng thời qua tham <strong>khảo</strong> tài liệu nghiên <strong>cứu</strong> về phƣơng pháp tách chiết, định 

lƣợng một số thành phần trong Cúc hoa vàng, chúng tôi đã lựa chọn sắc ký phân bố 

pha đảo trong nghiên <strong>cứu</strong> này. 

Trong định lƣợng sắc ký pha đảo, cột thƣờng dùng là C 8 và C 18 , có kích thƣớc 

hạt nhồi là 5 µm hoặc 10 µm, với chiều dài cột là 15 cm hoặc 25 cm. Chúng tôi tiến 

hành <strong>khảo</strong> <strong>sát</strong> trên các loại cột trên. 

2.3.3.3. Chọn tốc độ dòng 

Qua các tài liệu tham <strong>khảo</strong> [5], [6], [9], [10], [21] chúng tôi thƣờng thấy tốc độ 

dòng đƣợc <strong>khảo</strong> <strong>sát</strong> là 0,8 ml/phút và 1,0 ml/phút. Vì vậy chúng tôi tiến hành <strong>khảo</strong> 

<strong>sát</strong> trong khoảng 0,7 - 1,2 mL/phút để xác định tốc độ dòng phù hợp cho một thời 

gian lƣu tối ƣu. 

2.3.3.4. Chọn bước sóng phát hiện 

Do cấu trúc Apigenin có vòng thơm nên có khả năng hấp thu quang phổ tử 

ngoại. Xác định cực đại hấp thụ dựa vào phổ UV trong khoảng 190 – 800 nm. 

2.3.4. Thẩm định phương pháp phân tích theo tiêu chuẩn AOAC 

Phép định lƣợng các hợp chất phân lập đƣợc từ Cúc hoa vàng bằng phƣơng 

pháp HPLC đƣợc thẩm định thông qua các chỉ tiêu: 

- Độ đặc hiệu 


- Độ tƣơng thích hệ thống sắc ký 

- Độ lặp lại của phƣơng pháp 

- Độ tuyến tính và khoảng xác định 






17 





- Độ đúng 

- Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lƣợng LOQ 

2.3.4.1. Độ đặc hiệu 

Là khả năng phát hiện đƣợc chất phân tích khi có mặt của các tạp chất khác 

nhƣ tiền chất, chất tƣơng tự, chất chuyển hóa…trong phép thử định lƣợng, độ đặc 

hiệu là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hƣởng bởi 

tất cả các yếu tố khác nhằm hƣớng đến kết quả chính xác. 

Cách xác định: tiến hành chạy sắc ký mẫu chuẩn và mẫu thử. Ghi lại các thông 

số về thời gian lƣu và diện tích pic. 

Yêu cầu: thời gian lƣu của mẫu chuẩn và mẫu thử phải tƣơng đƣơng nhau. 

Hình ảnh chồng phổ của 2 mẫu phải có hình dạng giống nhau về số đỉnh cực đại 

hấp thụ. 

2.3.4.2. Độ tương thích của hệ thống sắc ký 

Độ tƣơng thích của hệ thống phân tích là độ chính xác của thiết bị, đƣợc xác 

định bằng cách đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã đƣợc xử lý xong. 

Cách xác định: Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn đã chuẩn bịở trên, 

ghi lại các giá trị về thời gian lƣu, diện tích pic. Độ tƣơng thích của hệ thống đƣợc 

biểu thị bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD của các đáp ứng phân tích. 

Yêu cầu: RSD 2,0 %. 

2.3.4.3. Độ lặp lại 

Độ lặp lại của một phƣơng pháp phân tích (độ chính xác của tổng thể quy trình 

phân tích) là mức độ thống nhất giữa các kết quả thử riêng biệt theo quy trình thử 

nghiệm đƣợc áp dụng lặp đi lặp lại trên cùng một mẫu, đƣợc xác định bằng cách 

phân tích lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu thử nhƣng các lần lặp lại phải đƣợc 

thực hiện từcông đoạn đầu tiên (cân, pha, xử lý mẫu...) đến công đoạn cuối cùng 

của quy trình phân tích. 







18 





Cách tiến hành: Pha 6 mẫu thử riêng biệt theo quy trình chuẩn bị mẫu thử rồi 

tiêm vào hệ thống sắc ký, tiêm lặp lại nhiều lần, lấy giá trị trung bình. Độ lặp lại 

đƣợc biểu thị bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD của các đáp ứng phân tích. 

Trong đó: 

Hàm lƣợng Apigenin trong Cúc hoa vàng đƣợc tính theo công thức: 

X% = (*) 

S t , S c là diện tích pic mẫu thử và mẫu chuẩn 

m t , m c là khối lƣợng của mẫu thử và mẫu chuẩn 

HL % là <strong>hàm</strong> lƣợng thực của Apigenin trong mẫu chuẩn (= 98,5 %) 

Yêu cầu: RSD 2,0 %. 

2.3.4.4. Độ tuyến tính và khoảng xác định 

Độ tuyến tính của một phƣơng pháp phân tích là sự phụ thuộc tuyến tính giữa 

đại lƣợng đo đƣợc (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác định. Nó 

đƣợc biểu thị bằng phƣơng trình hồi quy y = ax + b và hệ sốtƣơng quan R. 

Khoảng xác định: Là khoảng nồng độ đã đƣợc <strong>khảo</strong> <strong>sát</strong> đảm bảo tuyến tính 

(gọi là khoảng tuyến tính). Khảo <strong>sát</strong> nồng độ từ 50 % đến 150 % nồng độ lý thuyết 

của mẫu. 

Cách xác định: Chuẩn bị một dãy chất chuẩn gồm 6 mẫu có nồng độ tăng dần 

trong khoảng xác định. Xác định sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích 

pic bằng phƣơng trình hồi quy tuyến tính. 

Yêu cầu: R 2 0,99 (R 0,995). 

2.3.4.5. Độ đúng 

thực. 

Độ đúng là mức độ gần <strong>sát</strong> của các giá trị tìm thấy trong phân tích so với giá trị 


Cách xác định: tiến hành pha 1 dung dịch chuẩn và 3 dung dịch thử riêng biệt 

theo quy trình pha dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Thêm vào mỗi mẫu thử một 

lƣợng chất chuẩn (10%, 20%, 30% so với lƣợng hoạt chất có sẵn). Tổng nồng độ 






19 





của chúng vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã <strong>khảo</strong> <strong>sát</strong>. Độ đúng sẽ đƣợc tính bằng 

tỷ lệ phần trăm giữa lƣợng chất đối chiếu tìm đƣợc so với lƣợng chất đối chiếu 

thêm vào. 

Yêu cầu: Độ tìm lại nằm trong khoảng 98,0 – 102,0 %. 

2.3.4.6. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định <strong>lượng</strong> LOQ 

LOD: Là nồng độ tối thiểu của chất phân tích tại đó có tín hiệu bằng 3 lần 

nhiễu đƣờng nền (S/N = 3/1). 

LOQ: Là nồng độ tối thiểu chất phân tích tại đó có tín hiệu bằng 10 lần nhiễu 

đƣờng nền (S/N = 10/1). 

Cách xác định: Xác định LOD và LOQ dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu 

đƣờng nền (S/N). Pha loãng dung dịch chuẩn từ nồng độ ban đầu đến nồng độ thấp 

nhất có thể phát hiện đƣợc bằng sắc ký. Đo tín hiệu liên tục từ mẫu trắng (B) và 

mẫu thử (S). Thiết lập tỷ số S/N. 

Yêu cầu: RSD diện tích pic LOD < 10,0 % 

2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu 

Sử dụng các phƣơng pháp xử lý thống kê trong phân tích với các đại lƣợng đặc 

trƣng kết hợp với sự hỗ trợ tính toán của Microsoft Excel. 

- Tính giá trị trung bình: 

- Tính độ lệch chuẩn: 

- Tính độ lệch chuẩn tƣơng đối: 

̅ 

∑ 

√ ∑ ̅ 

RSD 

X 

S 

100% 







20 





- Phƣơng tình hồi quy tuyến tính bậc nhất thể hiện quan hệ giữa diện tích pic sắc 

ký và nồng độ chất phân tích: y = ax + b, sử dụng phần mềm Microsoft Excel 

để xử lý và vẽ đồ thị.

Preview Nghiên cứu khảo sát hàm lượng apigenin trong cúc hoa vàng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?